Pretnovecošanas īpašību un mehānisma salīdzinošs pētījums: Resveratrols un kaloriju ierobežojums Ⅱ

Resveratrola un CR ietekme uz SIRT1, p53 un Foxo3a mRNS ekspresiju novecojošu žurku audos

Oksidatīvā stresa apstākļibieži izraisa SIRT1 ekspresiju un aktivitāti. SIRT1 modulē galveno izdzīvošanas faktoru, tostarp p53 un Foxo3a, funkcijas [9]. Lai noteiktu resveratrola un CR ietekmi uz SIRT1, p53 un Foxo3a mRNS līmeni D-Gal inducētās novecošanas žurkām, tika veikti kvantitatīvi RT-PCR testi. Salīdzinot ar atbilstošo negatīvās kontroles grupu, SIRT1 un Foxo3a mRNS ekspresijas līmeņi bija ievērojami pazemināti, bet p53 līmenis ievērojami palielinājās D-Gal grupā (P < 0.01; 9.A un 9B). Turklāt vienlaicīga ārstēšana ar resveratrolu vai CR ar D-gal žurkām izraisīja SIRT1 un Foxo3a mRNS ekspresiju līmeņa paaugstināšanos, bet samazināja p53 līmeni, salīdzinot ar modeļa kontroles grupu (P < 0.05). Tomēr, salīdzinot ar CR ārstēšanu, SIRT1 mRNS ekspresijas līmenis bija ievērojami paaugstināts lielas resveratrola devas plus D-gal grupas aknās, p53 mRNS ekspresijas līmenis bija ievērojami pazemināts aknās un smadzenēs, lietojot lielu resveratrola plus D-gal devu. gal grupa (P < 0,05).

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu Cistanche pretnovecošanās piedevas

Resveratrola un CR ietekme uz galvenā SIRT1-saistītā proteīna ekspresiju novecojošu žurku smadzeņu audos

FOXO3a un p53, ko regulē SIRT1, ir SIRT1 pakārtotās molekulas. Vienlaikus SIRT1 aktivitāti regulē tā augšpus molekulas, piemēram, DBC1 (pazīstams arī kā KIAA1967), AROS (pazīstams arī kā RPS19BP1) un audzēja nomācējs HuR (pazīstams arī kā ELAVL1) [9, 10] . Lai noteiktu resveratrola un CR ietekmi uz p53, FOXO3a, HuR, AROS un DBC1 proteīna līmeni D-Gal inducētās novecošanas žurkām, tika veikti Western blot testi. Salīdzinot ar atbilstošo negatīvās kontroles grupu, FOXO3a, AROS un HuR proteīnu ekspresijas līmenis bija ievērojami samazināts, bet p53 un DBC1 līmenis bija ievērojami paaugstināts D-gal grupā (P < 0.01 1. attēls0). Turklāt vienlaicīga ārstēšana ar resveratrolu vai CR ar D-gal žurkām izraisīja FOXO3a, AROS un HuR olbaltumvielu ekspresijas palielināšanos, bet samazināja p53 un DBC1 līmeni, salīdzinot ar modeļa kontroles grupu (P <0, 05). Tomēr, salīdzinot ar ārstēšanu ar CR, HuR proteīna ekspresijas līmenis bija ievērojami paaugstināts, bet DBC1 līmenis bija ievērojami pazemināts lielas resveratrola un D-gal grupas devas smadzenēs (P <0, 05). P53, FOXO3a un AROS proteīna ekspresijas līmeņos nebija atšķirību starp resveratrolu plus D-gal grupu un CR plus D-gal grupu (P > 0,05).

FOXO3a un p53 ekspresijas smadzeņu un aknu audos

FOXO3a un p53 ekspresijas statuss smadzeņu un aknu audos tika noteikts ar imūnhistoķīmiju. FOXO3a un p53 imūnhistoķīmiskā analīze atklāja, ka FOXO3a ekspresija smadzeņu un aknu audos bija ievērojami samazināta un p53 ekspresija ievērojami palielinājās D-Gal grupā, salīdzinot ar negatīvās kontroles grupu (P < 0).{13} }5, 11. attēls). Turklāt vienlaicīga ārstēšana ar resveratrolu vai CR ar D-gal žurkām izraisīja FOXO3a ekspresijas palielināšanos, bet samazināja p53 ekspresiju, salīdzinot ar modeļa kontroles grupu (P < 0.05). Tomēr p53 un FOXO3a izteiksmēs nebija atšķirību starp resveratrola plus D-gal grupu un CR plus D-gal grupu (P > 0, 05).

DISKUSIJA

Pamata ķīmisko procesu, kas ir novecošanās pamatā, pirmo reizi attīstījabrīvo radikāļu novecošanas teorija[11] unoksidatīvais stressTiek uzskatīts, ka tas ir galvenais faktors normālā novecošanās procesā.Brīvo radikāļu iniciators AAPHbija pieradisizraisīt oksidatīvo stresuun izveidot oksidatīvā modeļa modelistresa izraisīta šūnu novecošanāscilvēka IMR-90 šūnās [12, 13]. Šīs metodes priekšrocības ir tādas, ka AAPH termiski sadalās līdzradīt radikāļusbez biotransformācijām vai fermentiem, un ātrumsradikālā paaudzevar viegli kontrolēt, regulējot iniciatora koncentrāciju [12]. Tika konstatēts, ka AAPHkavē cilvēka vairošanosIMR- 90 šūnas koncentrācijas un laika atkarīgā veidā. Rezultāti parādīja, ka 2 dienu inkubācija ar AAPH (1 mM) ievērojami palielināja SA-Gal pozitīvās attiecības procentuālo daudzumu, apoptotisko šūnu populāciju, samazināja SIRT1 mRNS ekspresiju un izraisīja palielinātu un saplacinātu morfoloģiju. Tie norādīja, ka AAPH izraisītais oksidatīvais stress izraisīja IMR-90 šūnu novecošanos. Pamatojoties uz šo šūnu novecošanās modeli, apstrāde ar 10 μM resveratrolu efektīvāk inhibēja AAPH izraisītu novecošanos un apoptozi nekā CR ārstēšana.

D-gal dzīvnieku modelis ir starptautiski atzīts novecojošu dzīvnieku modelis, un tas ir plaši izmantots šajā jomāzāles pret novecošanos. D-gal ir fizioloģiska barības viela, ko dzīvniekiem parasti metabolizē D-galaktokināze un galaktozes -1-fosfāts. Tomēr pārmērīga D-gal piegāde, kas netiek metabolizēta ar iepriekš minēto fermentu palīdzību, bet uzkrājas šūnās, izraisa oksidatīvo stresu un šūnu bojājumus [14]. Tādējādi ilgstoša D-gal ievadīšana izraisa izmaiņas, kas atgādina dabisko novecošanos dzīvniekiem, piemēram, saīsinātu dzīves ilgumu, kognitīvo disfunkciju, neirodeģenerāciju, oksidatīvo stresu, samazinātas imūnās atbildes reakcijas un progresējošu glikācijas galaprodukta (AGE) veidošanos [15]. Šis pētījums norādīja uz veiksmīgu mimētiskā novecošanās modeļa izveidi, par ko liecina ievērojami mācīšanās un atmiņas traucējumi, MDA ražošana, lipofuscīna uzkrāšanās, T-AOC un SOD samazināšanās un telomerāzes aktivitātes pazemināšanās smadzenēs. Tikmēr resveratrola vai CR terapija aizsargāja D-gal izraisītās žurkas pret oksidatīvo stresu, paaugstinot antioksidantu enzīmu aktivitāti, samazinot lipīdu peroksidācijas produktu līmeni un saglabājot oksidatīvo un antioksidantu sistēmu līdzsvaru. Uzvedības un telomerāzes aktivitātes testos resveratrola vai CR ārstēšana var mainīt D-gal izraisītos kognitīvos traucējumus un telomerāzes aktivitāti. Turklāt novecojošām žurkām, kas tika ārstētas ar lielām resveratrola devām, bija salīdzinoši lielāka ietekme uz uzvedību nekā tām, kuras tika ārstētas ar CR.

11. attēls: p53 (A, B) un FOXO3a (C, D) ekspresiju imūnhistoķīmiskā analīze novecojošu žurku aknu (A, C) un smadzeņu (B, D) audos. Palielinājums bija 20x. NG, negatīvās kontroles grupa; MG, modeļa kontroles grupa; RESL, zemas devas resveratrola grupa; RESH, liela resveratrola grupas deva; CR, kaloriju ierobežojuma grupa

Pētījumi ir parādījuši, ka CR, barojoša uztura samazināšana par 10–40 procentiem, varētuaizkavē novecošanos un palielina dzīves ilgumu, tādējādi šajā pētījumā CR grupas žurkām tika piemērots viens bieži lietots CR līmenis (barības uzņemšanas samazinājums par 40 procentiem). Tomēr daži pētījumi atklāja, ka CR nav labvēlīgas ietekmes uz ilgmūžību dabiski veciem primātiem [16]. Līdzīgi, lai gan tika pierādīts, ka ārstēšana ar resveratrolu izraisīja CR līdzīgu iedarbību uzenerģijas metabolismsun vielmaiņas profilu cilvēkiem ar aptaukošanos [17], tas neuzlaboja vielmaiņas funkciju sievietēm bez aptaukošanās un normālu glikozes toleranci [18]. Šo pētījumu atšķirību iemesls nav skaidrs, taču varētu būt, ka CR un resveratrols palīdz atjaunot homeostāzi indivīdiem ar vielmaiņas traucējumiem un mazāk veseliem indivīdiem, kas atbilst zināmajām SIRT1 funkcijām pētījumos ar dzīvniekiem [19]. Tāpēc D-gal izraisīti novecošanas žurku modeļi tika izmantoti, lai salīdzinātu resveratrola vai CR pretnovecošanās aktivitātes, nevis dabiski veco žurku modeli.

SIRT1, no (NAD plus ) atkarīga deacetilāze, ir ieguvusi lielu uzmanību, jo tai ir vairākas lomas dzīves ilguma pagarināšanā, stresa rezistencē un apoptozes samazināšanā [20, 21]. Uzkrājošie pētījumi ir skaidri norādījuši, ka SIRT1 bija galvenais resveratrola un CR mērķis [22]. Ir milzīgs skaits pakārtoto SIRT1 molekulu, tostarp p53, Foxo1, Foxo3, Foxo4 un E2F1, kuras regulē SIRT1. Vienlaikus SIRT1 aktivitāti regulē tās augšup esošās molekulas, piemēram, p53, HIC1, E2F1, DBC1, HuR un AROS. Akūta barības vielu izņemšana aktivizē transkripcijas programmu SIRT1 promotorā, ko vada transkripcijas faktori Foxo3a un p53. Tā kā p53 nomāc SIRT1 gēna ekspresiju, tā noņemšana ar Foxo3a aktivizē SIRT1 transkripciju [23]. DBC1 un AROS nesen tika aprakstīti kā tieši negatīvi un pozitīvi SIRT1 aktivitātes regulatori, attiecīgi, HuR parāda SIRT1 ekspresijas līmeņa samazināšanas ietekmi novecojošās šūnās [9, 10].

CRaizkavē novecošanos un pagarina vidējo un maksimālo dzīves ilgumudažādām sugām, tostarp žurkām, pelēm, zivīm, mušām, tārpiem un raugiem. Tomēr šādas stingras uztura programmas brīvi dzīvojošiem cilvēkiem ir radījušas ētiskas un metodiskas problēmas [24]. Pašlaik veselības ilguma palielināšana varētu būt svarīgāka par vienkārši dzīves ilguma pagarināšanu. Jaunākie pētījumi liecina, ka resveratrols ir viens no spēcīgākajiem SIR2 aktivitātes ierosinātājiem starp visiem augu polifenoliem [25], un tas ietekmē ilgmūžību, izmantojot līdzīgus mehānismus, kā redzams kaloriju ierobežošanā. Šie rezultāti parādīja, ka CR un resveratrolam bija līdzīgas aktivitātes, atjaunojot SIRT1 mRNS ekspresijas līmeni, palielinot FOXO3a, AROS un HuR proteīnu ekspresiju un samazinot p53 un DBC1 līmeni. Tikmēr vairākas pārliecinošu pierādījumu līnijas norāda uz resveratrola labvēlīgo ietekmi uz neiroloģisko, aknu un sirds un asinsvadu sistēmu.

MATERIĀLI UN METODES

Šūnu kultūra, stress un ārstēšana

Cilvēka diploīdais fibroblastu celms IMR-90 tika iegūts no ATCC. Šūnas tika audzētas minimālajā ēteriskajā barotnē (MEM) (Gibco, Apvienotā Karaliste), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu (FBS) (Gibco) 37 grādu temperatūrā 5% CO2. Kad bija sasniegta saplūšana, šūnas tika iesētas 6-iedobju kultūras plāksnēs. Vienu dienu vēlāk šūnas 48 stundas apstrādāja ar 1 mM 2,2′-azobis (2-amidinopropāna) dihidrohlorīdu (AAPH) (Sigma, ASV), kas atšķaidīts ar MEM plus 10% FBS. 48 stundu inkubācija ar brīvo radikāļu iniciatoru AAPH izveido oksidatīvā stresa izraisītas šūnu novecošanās modeli [12, 13]. Kontroles šūnas tika inkubētas tikai barotnē. Pēc AAPH apstrādes IMR-90 tika mazgāti ar aukstu fosfāta buferšķīdumu (PBS) pH 7,4 un inkubēti ar svaigu barotni vai barotni, kas satur resveratrolu (resveratrola grupa) vai MEM, kas papildināta ar 3 procentiem FBS (CR grupa). papildus 48 h pirms ražas novākšanas.

SA -gal krāsošanas aktivitāte

Tika pārbaudīts novecošanās biomarķieru izskats (proliferācijas potenciāla samazināšanās un SA-gal iekrāsošanās palielināšanās) [26] no dienas pēc ārstēšanas. Pēc tam šūnas tika iekrāsotas, ievērojot ražotāja norādījumus par SA-gal krāsošanas komplektu (CST, ASV). Pēc krāsošanas tika pārbaudītas vismaz 300 šūnas vairākos laukos un saskaitītas SA-gal pozitīvās šūnas. Šie eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes, un rezultāti tika parādīti kā vidējās vērtības ar standarta novirzēm (SD). Lai izvairītos no nespecifiskas iekrāsošanās, iespējams, šūnu saplūšanas dēļ, SA-gal histoķīmiskā krāsošana tika veikta ar subkonfluentām šūnām.

Skenējošā elektronu mikroskopiskā analīze

Šūnas tika audzētas uz segstikliņiem 6-iedobju kultūras plāksnēs, kā aprakstīts iepriekš. Pēc resveratrola un CR apstrādes no plāksnēm tika noņemti segstikliņi, pēc tam šūnas tika fiksētas ar 2,5% fosfātu buferētu glutaraldehīdu un pēc tam fiksētas 1% buferētā osmija tetroksīdā. Fiksētie paraugi tika iegremdēti t-butilspirtā pēc dehidratācijas ar etanola šķirošanas sēriju. Paraugi tika liofilizēti no t-butilspirta, pēc tam pārklāti ar zeltu, izmantojot automātisko smalko pārklājumu (JFC{10}}, JEOC, Japāna), un pārbaudīti, izmantojot skenējošu elektronu mikroskopu (JEOL, JSM{11}). }LV, Japāna).

Apoptiskā analīze

Pēc resveratrola vai CR inkubācijas visas šūnas tika novāktas ar tripsīnu un divas reizes mazgātas ar PBS, pēc tam atkārtoti suspendētas 400 μL aneksīna V saistošajā buferšķīdumā. Pēc tam šūnas tika iekrāsotas, ievērojot ražotāja norādījumus par aneksīna V-FITC šūnu apoptozes noteikšanas komplektu (BestBio, Ķīna). Fluorescences noteikšanai tika izmantots FACSCalibur plūsmas citometrs (Becton-Dickinson, Sanhosē, CA), un apoptotisko šūnu procentuālo daudzumu aprēķināja FACSCalibur iekšējā programmatūras sistēma. Katrai takai tika analizētas aptuveni 104 šūnas.

Dzīvnieku procedūras

Albīnu Wistar žurku tēviņi, kas sver aptuveni 200 ± 10 g, tika iegūti no Huazhong Zinātnes un tehnoloģijas universitātes Tongji Medicīnas koledžas Eksperimentālo dzīvnieku centra (SCXK 2010-0009). Dzīvnieki tika aklimatizēti 2 nedēļas pirms dozēšanas Hubei Ķīniešu medicīnas universitātes Eksperimentālo dzīvnieku centrā, un šajā laikā viņiem bija brīva piekļuve pārtikai un ūdenim ad libitum. Pēc aklimatizācijas tika atlasītas 50 žurkas un sadalītas piecās grupās pa desmit. Dzīvnieki tika uzturēti saskaņā ar nacionālajām vadlīnijām un protokoliem, ko apstiprinājusi Institucionālā dzīvnieku ētikas komiteja (IAEC).

I grupas (negatīvā kontroles grupa) žurkas saņēma tikai nesēju (1 ml/kg ķermeņa svara 0,9 procenti fizioloģiskā šķīduma) 6 nedēļas. II grupas (modeļa kontroles grupa) žurkas saņēma D-gal (200 mg/kg ķermeņa svara, Sigma Chemical, St. Louis, MO) 6 nedēļas. III grupas (Zemas resveratrola devas grupas) žurkas saņēma D-gal un resveratrolu (50 mg/kg ķermeņa svara), kas izšķīdināts 5% dimetilsulfoksīdā (DMSO) 6 nedēļas. IV grupas (augstas resveratrola devas grupa) žurkas saņēma D-gal un resveratrolu (100 mg/kg ķermeņa svara). V grupas (CR grupa) žurkas saņēma D-gal un CR (baroja ar diētu, kas bija par 40 procentiem mazāk kaloriju nekā ad libitum barotas žurkas [27]) 6 nedēļas. D-gal tika ievadīts intraperitoneāli, savukārt resveratrols tika ievadīts iekšķīgi visu eksperimenta laiku. Žurkas tika nogalinātas pēdējā ārstēšanas dienā, pēc tam asinis, serumi un orgāni nekavējoties tika savākti bioloģiskai pārbaudei vai uzglabāti -80 grādu temperatūrā vēlākai lietošanai.

Uzvedības testi

Morisa ūdens labirinta tests tika izstrādāts, lai novērtētu žurku telpiskās mācīšanās un atmiņas spēju pēc 6 nedēļām pēc traumas [28]. Morisa ūdens labirinta tests sastāvēja no 4-dienas mācīšanās un atmiņas apmācības un zondes izmēģinājuma 5. dienā. Dzīvnieki tika apmācīti apļveida baseinā (155 cm diametrā) ar vizuālām norādēm. Evakuācijas platforma (90 cm diametrā) tika iegremdēta 10 cm zem baseina ūdens virsmas, kas tika uzturēta 25 ± 2 grādu temperatūrā. Platformas atrašanās vieta saglabājās ziemeļrietumu kvadranta centrā visu 4-dienas apmācību periodu. Katru dienu žurkas tika apmācītas vienam rīta blokam un vienam pēcpusdienas blokam. Žurka brīvi peldēja, līdz atrada platformu 120 sekunžu laikā. Ja neizdevās, tas tika novietots uz platformas uz 10 sekundēm. Tika reģistrēts bēgšanas latentums (iegremdētās evakuācijas platformas atrašana) un peldēšanas ātrums. Zondes izmēģinājums tika veikts, noņemot platformu un ļaujot katrai žurkai brīvi peldēt baseinā 120 sekundes. Peronu šķērsojumu skaits apmācītajā kvadrantā (kur platforma tika noņemta) tika fiksēts ar datorizētu videosistēmu. Ūdens labirinta redzamā platformas versija netika veikta pēc tam, kad tika novērota būtiska peldēšanas ātruma atšķirība starp žurkām, kas tika ārstētas ar D-gal un nesēju.

Ar oksidatīvo stresu saistīto bioloģisko indikatoru noteikšana

MDA, SOD un T-AOC līmenis asinīs un audos tika noteikts fotometriski saskaņā ar ražotāja protokolu, izmantojot komerciāli pieejamus fermentatīvo testu komplektus (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing City, PR China). Visi šajā sadaļā aprakstītie eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros, lai iegūtu līdzekļus un SD.

Lipofuscīna līmenis tika noteikts ar Sohal metodi [29]. Īsāk sakot, mēs nosvērām 200 mg smadzeņu garozas, pievienojām 2 ml hloroforma-metanola (2:1) ekstrakta, homogenizējām un filtrējām, pēc tam nomazgājām atlikumu ar ekstraktu, apvienojām filtrātus, pievienojām ekstraktu 5. ml un izmērīja fluorescences intensitāti fluorescences spektrometrā. Emisijas viļņa garums bija 435 nm, un ierosmes viļņa garums bija 365 nm. Spektrofluorometrs tika standartizēts, lai iegūtu novirzi 50 pie iepriekšminētajiem viļņu garumiem ar hinīna bisulfāta šķīdumu 1 ug/ml 0,1 M H2SO4. Rezultāti tika izteikti kā relatīvās fluorescējošās vienības/ml hloroforma/g mitru audu svara.

TE aktivitātes noteikšana

Telomerāzes ekstrakcijai aptuveni 30 mg audu divreiz nomazgāja ledusaukstā PBS un visbeidzot homogenizēja aptuveni 150 ml PBS. TE aktivitāte tika mērīta, izmantojot TE ELISA komplektus saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Nanjing Sen Beijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Ķīna). Pārbaužu jutības robežas TE bija 0,8 SV/L.

RT-PCR analīze

SIRT1, Foxo3 un p53 mRNS ekspresijas līmeņi aknās un smadzeņu audos tika analizēti, izmantojot RT PCR analīzi. Kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot Trizol, un to daudzums un tīrība tika novērtēta ar ultra mikrospektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, ASV), pamatojoties uz absorbcijas mērījumiem pie 260 un 280 nm. Pēc kvantitatīvās noteikšanas cDNS tika sintezēta, izmantojot FastQuant RT komplektu (Tiangen Biotech, Pekina, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. SIRT1, Foxo3, p53 mRNS ekspresijas līmeņi tika mērīti ar RT-PCR, izmantojot TIANGEN SuperReal PreMix Plus (Tiangen Biotech, Pekina, Ķīna) ar specifiskiem primeriem (2. tabula). Kvantitatīvā reāllaika PCR tika veikta ar LightCycler 480 grādu PCR sistēmu (Roche, Bāzele, Šveice), izmantojot 20 μL kā katras reakcijas kopējo tilpumu. PCR amplifikācija tika uzsākta ar 15 minūšu denaturāciju 95 grādos un pēc tam sekoja 40 cikli 95 grādos 10 s, 59–63 grādu (atlaidināšanas temperatūra) 20 s un 72 grādus 30 s, un galīgo inkubāciju 72 s. grādu 5 min. Iegūtais katra gēna cikla sliekšņa skaitlis (Ct vērtība) tika normalizēts relatīvo izmaiņu reizēs saskaņā ar 2-∆∆CT metodes vienādojumu [30].

2. tabula. Primer saraksts

Western blot analīze

P53, FOXO3a, HuR, RPS19BP1 un DBC1 proteīna ekspresijas līmeņi smadzeņu audos tika analizēti, izmantojot Western blot analīzi. Kopējais smadzeņu audu proteīns tika ekstrahēts, izmantojot RIPA līzes buferi (Beyotime, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Olbaltumvielu koncentrācijas tika noteiktas, izmantojot BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Ķīna). 5 mg proteīnu atdalīja, izmantojot 12% SDS-poliakrilamīda gēlus, un pārnesa uz PVDF membrānu (0.45 μm, Millipore, ASV). Bloti tika bloķēti ar 5% beztauku pienu TBS, pēc tam inkubēti nakti 4 grādu temperatūrā ar atbilstošu primāro antivielu atšķaidījumu: anti-p53 (SC- 6243, Santa Cruz Biotechnology), anti-FOXO3a (#12829, Cell). Signalizācijas tehnoloģija), anti-HuR (#12582, šūnu signalizācijas tehnoloģija), anti-AROS (Ab201091, abcam), anti-DBC1 (#5857, šūnu signalizācijas tehnoloģija), anti-- - darbība (AC004, ABklonālā tehnoloģija) . Pēc membrānu mazgāšanas, lai noņemtu liekās primārās antivielas, membrānas 1 stundu inkubēja istabas temperatūrā ar atbilstošām sekundārajām antivielām atšķaidījumā 1:2000-1: 5000 (AC004 vai AS003, ABklonālā tehnoloģija). Membrānas tika mazgātas 3 reizes un pēc tam vizualizētas, izmantojot Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). - darbība tika izmantota kā iekšējā kontrole.

Imūnhistoķīmija

Audu paraugi tika fiksēti 10% neitrāli buferētā formalīnā 1 stundas laikā pēc ķirurģiskas noņemšanas un iestrādāti parafīnā, izmantojot standarta procedūras. Pēc tam fiksētie parafīnā iestrādātie paraugi tika sagriezti 5- μm biezās daļās, kuras tika deparafinētas ksilolā, rehidrētas etanolā un apstrādātas mikroviļņu krāsnī, lai iegūtu antigēnu. Atbilstoši atšķaidītās primārās antivielas, anti-p53 (SC-6243, Santa Cruz Biotechnology) un anti-FOXO3a (#12829, Cell Signaling Technology), tika inkubētas 60 minūtes istabas temperatūrā mitruma kamerā. Pēc tam priekšmetstikliņus skaloja PBS un pēc tam inkubēja ar sekundāro antivielu pret anti-trušu antivielām un HRP vizualizāciju (koncentrācija 1:300, #074-1506, KPL). Pēc tam priekšmetstikliņus nomazgāja un sekcijas izstrādāja fermentu substrāta diaminobenzidīna (DAB, Sigma) šķīdumā. Imūnhistoķīmiski iekrāsotu sekciju attēli tika uzņemti ar Olympus digitālo mikroskopu (IX-73P1F, Olympus, Japāna).

Statistiskā analīze

Rezultāti tika izteikti kā vidējie ± SD vismaz trīs neatkarīgiem eksperimentiem un tika analizēti, izmantojot SPSS 18.{1}} programmatūru. Grupu atšķirības bēgšanas latentumā un peldēšanas ātrumā Morisa ūdens labirinta apmācības uzdevumā tika analizētas, izmantojot divvirzienu dispersijas analīzi (ANOVA) ar atkārtotiem mērījumiem, un faktori bija ārstēšanas un apmācības diena. Pārējie dati tika analizēti ar vienvirziena ANOVA, kam sekoja post-hoc Tukey tests. P vērtība, kas ir mazāka par 0,05, tika uzskatīta par nozīmīgu.

SECINĀJUMI

Resveratrolam un CR bija līdzīgas pretnovecošanās aktivitātes gan in vitro, gan in vivo, par ko liecina to spēja inhibēt AAPH izraisītu novecošanos un apoptozi un atjaunot ar vecumu saistītus kognitīvos traucējumus, ko izraisīja D-gal ievadīšana. Viņu pretnovecošanās mehānismi ietvēra TE aktivitātes regulēšanu, oksidatīvo bojājumu mazināšanu un SIRT1 ceļa regulēšanu. Kopumā 10 μM resveratrolam in vitro un lielai resveratrola devai in vivo bija salīdzinoši spēcīgākas pretnovecošanās un stimulējošas SIRT1 līmeņa aktivitātes. Šie rezultāti liecināja par resveratrola kā CR mimētikas potenciālu.

Saīsinājumi

AAPH, 2,2′-azobis (2-amidinopropāna) dihidrohlorīds; AMPK, adenozīna monofosfāta aktivēta proteīnkināze; ANOVA, dispersijas analīze; AROS, SIRT1 aktīvais regulators; CR, kaloriju ierobežojums; DBC1, dzēsts krūts vēža gadījumā 1; D-gal, D-galaktoze; FBS, liellopu augļa serums; Foxo3a, dakšas uzgaļa kaste 3a; HuR, Hu antigēns R; MEM, minimālais būtiskais medijs; PBS, fosfāta buferšķīdums; PGC-1, peroksisomu proliferatora aktivētais receptoru G koaktivators-1; RES, resveratrols; SA -gal, ar novecošanos saistītā -galaktozidāze; SD, standarta novirzes; SIRT1, trokšņa slāpēšanas informācijas regulators; TE, telomerāze.

Autoru ieguldījums

Pētījuma koncepcija un dizains: Gang Chen; datu iegūšana, analīze un interpretācija: Juan Li, Xia Chun Zhang, Yi-Mei Liu; finansējuma iegūšana un manuskripta kritiska pārskatīšana intelektuālajam saturam: Gang Chen, Ke-Li Chen; manuskripta rakstīšana: Huans Li. Visi autori ir izlasījuši un apstiprinājuši šī manuskripta publicēšanu. PATEICĪBAS UN FINANSĒJUMS

Šo darbu finansēja Ķīnas Pēcdoktorantūras zinātnes fonds (2016M601237), Dabaszinātņu fonda projekts (81373704, 30873292).

INTEREŠU KONFLIKTI

Nav interešu konflikta no visiem iesaistītajiem autoriem.

ATSAUCES

1. Ramis MR, Esteban S, Miralles A, Tan DX, Reiter RJ. Kalkora ierobežojums, resveratrols un melatonīns: SIRT1 loma un ietekme uz novecošanu un ar to saistītām slimībām. Meh Aging Dev. 2015. gads; 146–148:28–41.

2. Colman RJ, Beasley TM, Kemnitz JW, Johnson SC, Weindruch R, Anderson RM. Kaloriju ierobežojums samazina ar vecumu saistītu un visu cēloņu izraisīto mirstību rēzus pērtiķiem. Nat Commun. 2014. gads; 5:3557.

3. Sohal RS, Weindruch R. Oksidatīvais stress, kaloriju ierobežošana un novecošana. Zinātne. 1996. gads; 273:59–63.

4. Testa G, Biasi F, Poli G, Chiarpotto E. Kaloriju ierobežojums un uztura ierobežošanas atdarinājumi: stratēģija veselīgas novecošanas un ilgmūžības uzlabošanai. Curr Pharm Des. 2014. gads; 20:2950–77.

5. Lane MA, Roth GS, Ingram DK. Kaloriju ierobežošanas atdarinājumi: jauna pieeja biogerontoloģijai. Metodes Mol Biol. 2007. gads; 371:143–9.

6. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, Jamieson HA, Lerin C, Kalra A, Prabhu VV, Allard JS, Lopez-Lluch G, Lewis K, Pistell PJ, Poosala S, Becker KG u.c. Resveratrols uzlabo veselību un izdzīvošanu pelēm, kas ievēro augstas kaloritātes diētu. Daba. 2006. gads; 444:337–42.

7. Lagouge M, Argmann C, Gerhart-Hines Z, Meziane H, Lerin C, Daussin F, Messadeq N, Milne J, Lambert P, Elliott P, Geny B, Laakso M, Puigserver P u.c. Resveratrols uzlabo mitohondriju darbību un aizsargā pret vielmaiņas slimībām, aktivizējot SIRT1 un PGC-1alfa. Šūna. 2006. gads; 127:1109–22.

8. Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, Lamming DW, Lavu S, Wood JG, Zipkin RE, Chung P, Kisielewski A, Zhang LL, Scherer B, Sinclair DA. Sirtuīnu mazo molekulu aktivatori pagarina Saccharomyces cerevisiae dzīves ilgumu. Daba. 2003. gads; 425:191–6.

9. Kwon HS, Ott M. SIRT1 kāpumi un kritumi. Trends Biochem Sci. 2008. gads; 33:517–25.

10. Brooks CL, Gu W. Kā SIRT1 ietekmē vielmaiņu, novecošanos un vēzi? Nat Rev vēzis. 2009. gads; 9:123–8.

11. Harman D. Brīvo radikāļu novecošanas teorija. Mutat Re. 1992. gads; 275:257–66.

12. Mayo JC, Tan DX, Sainz RM, Lopez-Burillo S, Reiter RJ. Katalāzes oksidatīvs bojājums, ko izraisa peroksila radikāļi: funkcionālā aizsardzība ar melatonīnu un citiem antioksidantiem. Free Radic Res. 2003. gads; 37:543–53.

13. Hubackova S, Krejcikova K, Bartek J, Hodny Z. IL1- un TGF-Nox4 signalizācija, oksidatīvais stress un reakcija uz DNS bojājumiem ir kopīgas iezīmes replikatīvai, onkogēnu un zāļu izraisītai parakrīnai "bystander senescence" '. Novecošana (Albani, NY). 2012. gads; 4:932–51. https://doi.org/10.18632/aging.100520.

14. Cui X, Zuo P, Zhang Q, Li X, Hu Y, Long J, Packer L, Liu J. Hroniska sistēmiska D-galaktozes iedarbība pelēm izraisa atmiņas zudumu, neirodeģenerāciju un oksidatīvus bojājumus: R{{ aizsargājošā iedarbība 2}}liposkābe. J Neurosci Res. 2006. gads; 84:647–54.

Jautājiet vairāk:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950