Konservēta gara nekodējoša RNS, GAPLINC, modulē imūnreakciju endotoksiskā šoka laikā

Lai uzzinātu vairāk informācijas, lūdzu sazinietiesdavid.wan@wecistanche.com

Nozīme

Iekaisums lielā mērā ir pētīts proteīnus kodējošo gēnu kontekstā. Nesenie pētījumi ir atklājuši IncRNS kā svarīgus imunitātes regulatorus. Šo gēnu funkcionālais raksturojums joprojām ir aktīva pētniecības joma. Šajā pētījumā mēs identificējam GAPLINC kā funkcionāli konservētuIncRNAstarp cilvēkiem un pelēm. GAPLINC izsīkums izraisa pastiprinātu imūnās atbildes gēnu ekspresiju, kas ir tiešiNF-kBmērķi. Pārsteidzoši, mēs novērojam, ka Gaplinc knockout pelēm ir izturība pret LPS izraisītu endotoksisku šoku un atklājam, ka iekaisuma gēnu bazālā ekspresija novērš punktu veidošanos, lai aizsargātu pret vairāku orgānu mazspēju un nāvi. Šie atklājumi ietekmē sepses ārstēšanu, kurā jaunas terapijas, kas vērstas uz IncRNS, var sniegt vērtīgu informāciju, lai izprastu iekaisumu un uzlabotu pacienta rezultātus.

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par Cistanche

FG 1. Makrofāgiem raksturīgo identifikācija un raksturojumsIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) RNS-Seq analīzeGAPLNCekspresija diferenciācijas laikā no monocītiem uz makrofāgiem norādītajos laika punktos. GAPLINC ekspresija ir attēlota kā kopijas vienā šūnā (FPKM. (D) Siltuma karte attēlo gēnu ekspresiju no pielāgota Nanostring paneļa, kurā parādītas 10 populārākās InciNA diferenciāli izteiktās, salīdzinot monocītus ar makrofāgiem primārās cilvēka šūnas un THP-1 šūnas. Dati no Nanotring tika veikti bioloģiskos dublikātos. (E) Granulocītu-monocītu cilmes šūnu shēma, kas rada divas atšķirīgas populācijas: 1) MDDC un 2) MDM. UCSC genoma pārlūkprogrammas celiņš parāda RNS-Seq nolasījumus no monocītiem, makrofāgiem un dendrītiskajām šūnāmGAPLINClocus. () qPCR analīze RNS, kas attīrītas no kodola (baltā) un citoplazmas (pelēkā) frakcijām MDM (G qPCR analīze Russ, kas izolēts no dažādām MDM sistēmu polisomu frakcijām (10 līdz 50 procentu saharozes gradients, SW41, 40 K apgr./min, ~). 1,5 h).

Jaunākie pētījumi ir identificējuši tūkstošiem garu nekodējošu RNS (ncRNS) zīdītāju genomos, kas regulē gēnu ekspresiju dažādos bioloģiskos procesos. Lai gan IncRNS ir identificētas dažādās imūnās šūnās un ir saistītas ar imūnreakciju, lielākās daļas bioloģiskā funkcija un mehānisms joprojām nav izpētīts, īpaši sepses gadījumā. Šeit mēs identificējam lomu hdRNS — kuņģa adenokarcinomas prognozējošai garai starpgēnai nekodējošai RNS (GAPLINC), kas iepriekš tika raksturota ar tās lomu vēža ārstēšanā, tagad iedzimtas imunitātes, makrofāgu un LPS izraisīta endotoksiskā šoka kontekstā. Cilvēku un peļu makrofāgu transkripta analīze atklāj, ka GAPLINC ir konservēta IndRNS, kas ir ļoti izteikta pēc makrofāgu diferenciācijas. Pēc iekaisuma aktivācijas GAPLINC tiek strauji samazināts. Makrofāgi, kuriem ir izsmelts GAPLINC, sākotnēji uzrāda pastiprinātu iekaisuma gēnu ekspresiju, savukārt pārmērīga GAPLINC ekspresija nomāc šo reakciju. Atbilstoši GAPLINC noplicinātajām šūnām, Gaplinc knockout pelēm ir paaugstināts iekaisuma gēnu bazālais līmenis un ir izturība pretLPS izraisītsendotoksiskais šoks. Mehāniski izdzīvošana ir saistīta ar paaugstinātu kodola NF-xB līmeni Gaplinc knockout pelēm, kas veicina mērķa gēnu bazālo ekspresiju, kas parasti tiek aktivizēta tikai pēc iekaisuma stimulācijas. Mēs parādām, ka šī imūnās atbildes gēnu aktivizēšana pirms LPS iedarbības izraisa asins recekļu veidošanos, kas aizsargā Gaplinc nokautas peles no vairāku orgānu mazspējas un nāves. Mūsu rezultāti kopā identificē iepriekš nezināmu GAPLINC funkciju kā negatīvu iekaisuma regulatoru. un atklājiet šīs lncRNS galveno lomu endotoksiskā šoka modulēšanā.

2. att. GAPLINC ir negatīvs iekaisuma regulators un ir atkarīgs no Nf-sB signalizācijas. Monocīti, kas izolēti no cilvēka PBMC un diferencēti makrofāgos, tika transficēti ar kontroles vai GAPLINC siRNS. (A)RNS-Seqanalīzeuz GAPLINC kd vai kontroles siRNA MDM. RNA-Seq tika veikts bioloģiskos dublikātos. Rezultāti ir attēloti vulkāna diagrammā. Ievērojami paaugstināti regulēti gēni ar locījuma maiņu, kas ir lielāka par vai vienāda ar 2, ir iezīmēti sarkanā krāsā. (6) GO-Term analīze par ievērojami augstāk regulētiem gēniem. (C) Siltuma karte attēlo labāko ar imūnsistēmu saistīto gēnu gēnu ekspresiju, kas tiek regulēta pēc GAPLINC kd. Dati no RNA-Seq tika veikti bioloģiskos dublikātos. (D) GAPLINC izoformas MDM tika noteiktas ar Nanopore balstītu R2C2 sekvencēšanu. Dati no Nanopore sekvencēšanas tika veikti bioloģiskos dublikātos (neapstrādāti dati ir pieejami vietnē SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Tabula, kurā attēlots katras GAPLINC izoformas nolasījumu skaits un procenti. (F) Divvirzienu vektors, kas ekspresē GFP-Zetocin vienā pusē un GAPLINC otrā pusē. (G un H) GAPLINC ekspresijas qPCR analīze THP-1 šūnās, kas ekspresē ārpusdzemdes GAPLINC vai tukša vektora kontroli. IL6 līmenis tika kvantificēts pēc stimulācijas ar LPS (200 nal ml) 6 stundas; dati tika apkopoti no trim neatkarīgiem eksperimentiem.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), U qPCR analīze GAPLINC MDM (n=3) iepriekš apstrādāti ar DMSO vai BAY-7082 (10 μM), kam sekoja LPS stimulācija (200 ngmL) 6 h. Dati tika apkopoti no trim neatkarīgiem eksperimentiem. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

sepse ir dzīvībai bīstama slimība, ko izraisa pārmērīga ķermeņa reakcija uz infekciju, kas var ātri izraisīt vairāku orgānu mazspēju un nāvi. Imūnsistēma ir būtiska, lai nodrošinātu aizsardzību pret infekcijām; tomēr nekontrolēta aktivizēšana var radīt nopietnas sekas saimniekam. Saskaņā ar Slimību kontroles un profilakses centra datiem katram trešajam slimnīcā mirušajam pacientam ir sepse (1). un tomēr mēs joprojām nesaprotam pamatā esošos molekulāros mehānismus, kas izraisa letālu iznākumu. Klīniskās iespējas sepses ārstēšanai aprobežojas ar šķidruma, antibiotiku un atbalstošas ​​terapijas piegādi, un tās ir palikušas nemainīgas gadu desmitiem. Lai gan agrīna diagnostika un ātra ārstēšana ir uzlabojuši sepses iznākumu (2), ir ļoti svarīgi izstrādāt jaunas terapijas. Lai gan ir veikti gēnu ekspresijas pētījumi, lai pārbaudītu iespējamos sepses terapeitiskos mērķus, šie mērķi lielākoties nav raksturoti (3). Mēs esam identificējuši garu nekodējošu RNS (lncRNS) ar lomu imūnās atbildes un endotoksiskā šoka kontrolēšanā, kas nodrošina iespējas jaunu zāļu izstrādei, lai mērķētu uz sepsi.

Rezultāts

3. attēls. GAPLINC ir saglabājies pelēm un regulē reakciju uz endotoksisku šoku. (4) GAPLINC ir konservēts sintēzē. GAPLINC atrodas uz Chr18 cilvēkiem un uz Chr17 pelēm, starp proteīnu kodējošiem gēniem Dlgap1 un Gift. Dlgapil nav izteikts inmakrofāgi. (B) MCA parāda Gaplinc līmeņu sadalījumu dažādos imūno šūnu tipos (BM). (C) Gaplinc ekspresijas qPCR analīze B šūnās un BMDM; šie dati (vidējais ± SD) reprezentē trīs neatkarīgus eksperimentus, (D) qPCR analīze Gaping ekspresijai BMDME, kas stimulēta ar LPS (200 na/ml) 6 stundas; šie dati (vidēji ± SD) atspoguļo trīs neatkarīgus eksperimentus. (E) Gaplinc lokusa shēma pirms un pēc CRISPRCas9 izraisītās dzēšanas. Punktētas līnijas norāda aptuveno dzēšanas reģionu. Gels attēlo genoma datu PCR pastiprināšanu. Amplikonu garumi tiek salīdzināti WT un Gaping KO pelēm, (F) Gaplinc ekspresijas qPCR analīze WT un Gaplinc-KO BMDM, izmantojot primeru kombināciju, lai noteiktu Gaplinc transkripta Exon1, Exon2 un eksonus aptverošos reģionus; šie dati (vidējais ± SD) atspoguļo trīs neatkarīgus eksperimentus. (G)RNA-Seq analīze BMDM no WT un Gaplinc KO pelēm (n =3). Rezultāti ir attēloti vulkāna diagrammā. Ievērojami paaugstināti regulēti gēni ar locījuma maiņu, kas ir lielāka vai vienāda ar 2, ir parādīti sarkanā krāsā. (H) GO-Term analīze par ievērojami regulētiem gēniem. (I un J) WT un Gaplinc KO peļu izdzīvošanas dati ir parādīti, reaģējot uz E. coli LPS izaicinājumu (5 mg/kg/pelēm) (n =6 līdz 10). Atšķirību statistiskais tests tika skaitīts, izmantojot log-rank (Mantel-Cox) testu. "...P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Tā kā lncRNS ekspresija var regulēt imūnreakciju, ietekmējot imūno šūnu diferenciāciju un to attiecīgo funkciju (4-7), mēs vēlējāmies izpētīt ncRNS lomu makrofāgos. Makrofāgi ir svarīgas iedzimtas imūnās šūnas, kuras var iegūt no monocītiem un ir būtiskas patogēnu atpazīšanai, izmantojot Toll līdzīgus receptorus (TLR). Pēc aktivizācijas. TLR ierosina sarežģītus signalizācijas ceļus, kas aktivizē galvenos transkripcijas faktorus, piemēram, NF-kB. noved pie simtiem imūnās atbildes gēnu transkripcijas (8).

Lai identificētu makrofāgu diferenciācijā un funkcijā iesaistītās IncRNS, mēs veicām RNS sekvencēšanu (RNS-Seq) gan cilvēka primārajos monocītos iegūtajos makrofāgos (MDM), gan monocītu šūnu līnijā THP-1s (att. lA un SI pielikums. S1 att.). Mēs identificējām kuņģa adenokarcinomas prognozējošo garo starpgēnu nekodējošu RNS (GAPLINC) kā visvairāk regulēto IncRNS monocītu–makrofāgu diferenciācijas laikā (1. B att.). GAPLINC līmenis bija nosakāms 1. dienā un palielinājās līdz ~ 300 kopijām vienā šūnā (1. C attēls). Izmantojot RNS profilēšanas tehnoloģiju (nCounter, Nanostring), mēs apstiprinājām GAPLINC kā vienu no 10 labākajām mRNS, kas izteiktas diferencētos primārajos MDM un THP{10}}s (1. att.). Mēs arī apstiprinājām, ka GAPLINC ir ļoti izteikts MDM, bet nav izteikts cieši saistītās šūnu tipa monocītu atvasinātajās dendritiskajās šūnās (MDDC) (1. att. E), kas liecina, ka GAPLINC ekspresija ir specifiska šūnu tipam. Veicot šūnu frakcionēšanas eksperimentu un mērot GAPLINC līmeni makrofāgu citoplazmas un kodola nodalījumos, izmantojot qPCR, mēs atklājām, ka GAPLINC pārsvarā ir lokalizēts citozolā, salīdzinot ar CD14, citoplazmas mRNS un NEAT1, kodola IncRNS (att. 1F). Tas atbilst atklājumiem vēža šūnās, kurās GAPLINC galvenokārt lokalizējas citoplazmā (9). Lai nodrošinātu, ka GAPLINC nav kodēts, mēs veicām polisomu profilēšanu — metodi, ko izmanto, lai analizētu, vai gēns tiek aktīvi pārveidots proteīnā. Atšķirībā no CD14, ne NEATI, ne GAPLINC netika atrasti augsta polisomu frakcijā, kas liecina, ka GAPLINC nav tulkots (1G attēls).

4. att. Gaplnc KO pārregulē IRG un uzrāda paaugstinātu p65 līmeni kailā sākotnējā stāvoklī. (A) Citokīnu līmenis WT un Gaplinc KO peļu serumā pie basal.n=4 līdz 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Pēc tam mēs pētījām GAPLINC klusēšanas ietekmi uz diferencējošiem makrofāgiem. Tā kā diferenciācijas laikā GAPLINC līmenis palielinājās, mēs izvirzījām hipotēzi, ka GAPLINC notriekšana (KD) ietekmēs diferenciācijā iesaistītos gēnus. Izmantojot apvienoto mazo traucējošo RNS (siRNS), mēs sasniedzām ~ 55 līdz 65 procentus kd GAPLINC primārajos MDM (SIPielikums, S2 att.). Mēs veicām RNA-Seq un identificējām vairākus gēnus, kas tika disregulēti pēc GAPLINC kd (24. attēls). Mēs apstiprinājām populārākos trāpījumus, izmantojot Nanostring (SI pielikums, S3. att.). Gēnu ontoloģijas (GO) bagātināšanas analīze parādīja, ka imūnās atbildes gēni bija ievērojami pārspīlēti gēnos, kas tika regulēti pēc GAPLINC kd, nevis gēnos, kas iesaistīti makrofāgu diferenciācijā, pretēji mūsu sākotnējai hipotēzei. (2.B att.). Proti, GAPLINC-KD šūnās atšķirīgi ekspresēti gēni ietver proinflammatoriskus citokīnus un kemokīnus (IL6, CXCL10 un TNFSF10), IFN stimulētus gēnus (ISG) (IFIT2 un RSAD2) un guanilātus saistošos proteīnus (GBP) (GBP3 un GBP5). (2.C att. un SI pielikums. S4. att.). Lai pārbaudītu, vai GAPLINC kd neietekmēja makrofāgu diferenciāciju. CD11B.CD16 un CD14 līmeņi tika mērīti kontroles un signalizācijas apstrādātajos makrofāgos un tika konstatēti līdzīgi (SI pielikums. S5. attēls). Tālāk mēs izmantojām papildu kd pieeju, izmantojotCRISPRinhibīcija (CRISPRi), lai mērķētu uz transkripcijas sākuma vietu, izmantojot GAPLINIzmantojot trīs dažādas vadošās RNS (gRNS) THP{0}} šūnās, kas stimulētas ar forbola 12-miristāta 13-acetātu (PMA). Mēs sasniedzām vairāk nekā 80 procentus kd GAPLINC un atkal novērojām paaugstinātu proinflammatoriskā citokīna IL6 ekspresiju, kad GAPLINC tiek notriekts sākotnējā līmenī (SI pielikums. S6 A un B att.). Interesanti, ka pēc lipopolisaharīdu (LPS) aktivācijas IL6 līmenis bija līdzīgs kontroles un GAPLINC kd THP-1 šūnām (SIPielikums, S6C att.). Tā kā sākotnējie līmeņi atšķiras, kopējā IL6 indukcija tiek samazināta, kad GAPLINC tiek noņemts. (S7 pielikums, S6D att.).

Tā kā GAPLINC kd izraisīja imūnās atbildes gēnu regulēšanu, mēs izveidojām THP-1 šūnu līniju, kas pārmērīgi ekspresē GAPLINC, lai noteiktu, vai tas mediē pretēju efektu. Izmantojot ilgi lasītus secības datus. mēs identificējām dominējošās GAPLINC izoformas, kas izteiktas MDM (att. 2D). Visbiežāk sastopamā izoforma, kas atbilst atsauces secības (RefSeq) gēna anotācijai, tika iekļauta mūsu konstrukcijā (2. att. E). Mēs izmantojām lentivīrusu vektoru, kas satur divvirzienu promotoru, lai paralēli vadītu zaļo fluorescējošo proteīnu (GFP) / Zeocin un GAPLINC (2. att. F). Izmantojot qPCR, mēs apstiprinājām, ka GAPLINC bija stabili izteikts THP-1, salīdzinot ar kontroli (2. G. attēls). GAPLINC pārmērīga ekspresija samazināja IL6 RNS līmenī, salīdzinot ar kontroli pēc stimulācijas ar LPS, gramnegatīvo baktēriju sastāvdaļu (2. H attēls). Šie novērojumi liecina, ka GAPLINC darbojas kā negatīvs iekaisuma reakcijas regulators.

Pēc tam mēs pārbaudījām GAPLINC līmeni primārajos MDM, reaģējot uz iekaisumu. Pēc LPS stimulācijas mēs atklājām, ka GAPLINC tika strauji pazemināts (2. att. I). Turklāt, izmantojot qPCR, mēs parādām, ka GAPLINC tiek arī pazemināts pēc aktivizēšanas ar dažādiemTLRligandi (SI pielikums, S7A att.). Tika apstiprināta pozitīvās kontroles iekaisuma gēnu TNF-a, IL6 un CCL5 indukcija (SI pielikums, S7B att.). Šie dati liecina, ka pēc stimulācijas ir jāsamazina GAPLINC ekspresija, lai notiktu optimāla iekaisuma gēnu indukcija. Lai novērtētu NF-kB lomu GAPLINC ekspresijas kontrolē, MDM tika iepriekš apstrādāti ar dimetilsulfoksīdu (DMSO) vai BAY11-7082, NF-B inhibitoru,

kam sekoja stimulēšana ar LPS 6 h.BAY11-7082-ārstētajiem MDM.GAPLINC pazeminātā regulēšana bija traucēta salīdzinājumā ar kontroli (2. att./). kas liecina, ka GAPLINC regulēšana ir atkarīga no NF-KB signalizācijas. Tika apstiprināta pozitīvās kontroles iekaisuma gēnu TNF- un IL6 indukcija pēc LPS stimulācijas (SIpielikums, att., S7C). Lai saprastu, kā GAPLINC tiek regulēts, mēs izmantojām Transpozāzes pieejamā hromatīna testu, izmantojot sekvencēšanu (ATAC-seq) MDM. novērtēt GAPLINC lokusa hromatīna pieejamību. Mēs noskaidrojām, ka GAPLINC tiek aktīvi transkribēts miera stāvoklī esošajos makrofāgos, bet cieši izslēgts pēc LPS stimulācijas (2.K att.), kas liecina, ka GAPLINC tiek regulēts transkripcijas līmenī.

Izpētīt GAPLINC saglabāšanos starp cilvēkiem un pelēm. mēs centāmies identificēt sintēniskos lokusus, kuros gēni ir pozicionāli konservēti starp tiem pašiem diviem proteīnu kodējošiem gēniem. kam seko funkcionālās saglabāšanas novērtējums. Šeit mēs parādām, ka Gaplinc ir pozicionāli konservēts, atrodot transkriptu starp gēniem Dlgap1 un TgifI (3.A att.). Lai apstiprinātu šūnu tipa specifiku, mēs izmantojām Mouse Cell Atlas (MCA)

(10), lai novērtētu transkripta līmeņus visā imūnās šūnās kaulu smadzenēs (BM) un konstatēts, ka tas ir visaugstākais izteikts makrofāgos, ar zemāku ekspresijas līmeni neitrofilu priekštečos (3.B att.). Tālāk, lai noteiktu, vai ekspresijas modeļi saglabājās makrofāgu diferenciācijas laikā gan cilvēkiem, gan pelēm, mēs veicām RNS-Seq, salīdzinot BM šūnas ar kaulu smadzenēm iegūtiem makrofāgiem (BMDM), pabeidzām de novo transkripta montāžu un konstatējām, ka peles Gaplinc līmenis palielinājās pēc diferenciācijas. (SI pielikums, S8A att.). Mēs to apstiprinājām ar qPCR, salīdzinot Gaplinc līmeni BM šūnās ar BMDM (3. C att.). Salīdzināms ar cilvēka GAPLINC. peles Gaplinc tiek ātri pazemināts LPS stimulētajos BMDM (3D att.). Kā kontroli mēs apstiprinājām iekaisuma gēnu The-a un I6 indukciju (SI pielikums. S8B att.). Peles Gaplinc tiek ātri pazemināts arī pēc aktivizēšanas ar dažādiem TLR ligandiem. Tika apstiprināta arī pozitīvās kontroles gēnu ll6 un Ccl5 indukcija (SI pielikums, S8C att.).

Izmantojot CRISPR, mēs izveidojām Gaplinc knockout (KO) peli, kurā tika noņemts eksons I un lielākā daļa pirmā introna (3. att. E). Chaplin KO peles audzēja normāli, un tām nebija acīmredzamu attīstības defektu. Gaplīna dzēšana tika apstiprināta ar genoma DNS PCR amplifikāciju savvaļas tipa (WT) un Gaplinc KO pelēm ar amplikona izmēriem ~1300 bp WT un ~500 bp Gaplinc KO pelēm (3E. att.). Pilna genotipēšanas stratēģija. lai apstiprinātu WT un Gaplinc KO, ir izcelts SI pielikumā, S9. Mēs arī apstiprinājām Gaplinc deficītu BMDM, izmantojot qPCR (3.F attēls). Lai novērtētu, vai Gaplinc deficīts ietekmēja diferenciāciju, mēs iekrāsojām WT un Gaplinc-KO BMDM CD11B un F4/80; iekrāsošanās modeļi bija līdzīgi, kas liecina par normālu makrofāgu diferenciāciju (SI pielikums, S104. att.). Lai novērtētu, vai Gaplinc KO traucē makrofāgu darbību, mēs salīdzinājām fagocitozes aktivitāti WT un Gaplinc-KO BMDM un neatradām nekādas atšķirības (SI pielikums, S10B att.).

Lai novērtētu Gaplinc deficīta globālo ietekmi uz makrofāgiem, mēs veicām RNA-Seq WT un Gaplinc-KO BMDM; abi bija neārstēti un LPS stimulēti 6 stundas. Gaplinc-KO BMDM 23 gēnu ekspresija (parādīta sarkanā krāsā. 3.G. att.) sākotnēji bija ievērojami paaugstināta. Šie gēni ietver proinflammatoriskus citokīnus un kemokīnus (Il6.l1-a. I1-8 un Cxd10), ISG (Ifitlbl1), GBP ģimenes locekļus (Gbp5 un Gbp0) un šūnu virsmas marķieri, kas raksturīgi aktivizētiem makrofāgiem (Cd69). GO analīze apstiprināja, ka imūnās atbildes reakcijā iesaistītie gēni sākotnēji ir pārāk pārstāvēti Gaplinc-KO BMDM (3. att. H). Šie gēni parasti tiek regulēti pēc LPS stimulācijas (SI pielikums. S11. att.). Līdzīgi datiem, kas iegūti mūsu pētījumos ar cilvēkiem, šie dati liecina, kaGAPLINCir funkcionāli konservēts visās sugās, lai galvenokārt kontrolētu iekaisuma reakcijas gēnu (IRG) ekspresiju. Nebija būtisku atšķirību gēnos, kas tika regulēti pēc LPS stimulācijas starp WT un Gaplinc-KO BMDM (datu kopa S1).

Daudzi pētījumi ir parādījuši IncRNS spēju regulēt blakus esošo gēnu transkripciju (11). Tādējādi mēs izpētījām Gaplinc iespējamās cis-regulējošās lomas, jo tās blakus esošais gēns Tgif1 iepriekš ir bijis iesaistīts makrofāgu aktivācijas modulēšanā (12). Izmantojot mūsu RNA-Seq datus, mēs apstiprinājām, ka GaplincKO BMDM Tgifl ekspresija attiecībā pret T šūnām netika ietekmēta (SIAppendir.Fig.S124). Mēs arī apstiprinājām ar qPCR, ka Tgifl nebija mainīts Gaplinc-KO BMDM (SI pielikums, S12B att.). Tālāk mēs izpētījām iespēju, ka Gaplinc lokusa darbības traucējumi varētu noņemt svarīgu regulējošu elementu, piemēram, pastiprinātāju. Mēs izmantojām ATAC-seq datus no WT BMDM, lai novērtētu transkripcijas aktīvos reģionus Gaplinc lokusā (13). Mēs neidentificējām signālus Gaplinc dzēšanas reģionā, tikai tos, kas atbilst Gaplinc promotoram (SI pielikums. S13. att.). Kopumā šie dati liecina, ka IRG regulēšana Gaplinc deficīta gadījumā nav saistīta ar ietekmi uz blakus esošajiem gēniem vai regulējošā elementa izņemšanu.

Tā kā Gaplinc KO BMDM pārregulē IRG ekspresiju pamata apstākļos, mēs pēc tam vēlējāmies izaicināt Gaplinc KO dzīvniekus in vivo, lai novērotu atšķirības saimnieka reakcijā. Mēs izmantojām "endotoksiska šoka" modeli. kurā Escherichia coli LPS tika intraperitoneāli (ip) injicēts WT un Gaplinc KO pelēm, lai noteiktu izdzīvošanas atšķirības. Devā 5 mg/kg/pelei. WT pelēm pēc 2 dienām bija 0 procentu dzīvildze (30. att.. Tomēr 100 procenti Gaplinc KO peles izdzīvoja, kas liecina, ka Gaplinc KO pelēm ir rezistence pret LPS izraisītu endotoksisku šoku (31. att.). , tiek novērotas ievērojamas temperatūras atšķirības starp pelēm ar WT un Gaplinka deficītu (3. attēls). Pat tad, ja tiek izmantota daudz lielāka LPS deva 20 mg/kg, pelēm ar Gqplinc deficītu ir ievērojamas izdzīvošanas priekšrocības (3K. attēls). , šie dati liecina, ka Gaplinc ir svarīga loma imūnās atbildes regulēšanā in vivo.

No mūsu pētījumiem ar cilvēkiem mēs zinām, ka GAPLINC sākotnēji var regulēt imūno gēnus. Lai gan citokīnu ekspresija pēc iekaisuma aktivācijas neatšķiras, reakcijas lielums atšķiras, jo sākotnējie līmeņi atšķiras, tāpēc, lai labāk izprastu šīs izdzīvošanas atšķirības in vivo, mēs novērtējām citokīnu ekspresijas izmaiņas sākotnējā līmenī. Mēs izmantojām multipleksētu citokīnu masīvu, lai vienlaikus izmērītu biomarķierus, kas saistīti ar imūnās atbildes reakciju, sepsi un vēzi. Sākumā galvenie imūngēni, tostarp MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. un M-CSF bija ievērojami paaugstināts Gqplinc KO peļu serumā, salīdzinot ar WT (44. att.). Šie citokīni ir saistīti ar šūnu piesaisti: tomēr, izmantojot plūsmas citometriju, mēs apstiprinājām, ka neitrofilu, T šūnu, B šūnu, eozinofilu, monocītu un makrofāgu procentuālais daudzums bija salīdzināms starp WT un Gaplinc KOmice sākotnēji (SI pielikums, S14. attēls). . Interesanti, ka šie procenti bija arī salīdzināmi ar post-LPS izaicinājumiem 6 h un 18 h laika punktos (SI pielikums, S15 un S16 att.). Turklāt serumā no WT un Gaplinc KO pelēm, kas tika pārbaudītas attiecībā uz sepses klīniskajām pazīmēm, tostarp laktātam un C-reaktīvajam proteīnam (CRP) (S7 pielikums, S17. attēls), netika konstatētas atšķirības.

Tā kā iepriekš tika raksturots, ka paaugstinātam MDC vai IL-13(44. att.) līmenim ir aizsargājoša loma pret endotoksisku šoku, modulējot proinflammatoriskos citokīnus (14,15), mēs pēc tam pārbaudījām, vai nav atšķirības proinflammatorisko citokīnu līmeņos. , tostarp l6, Il1-, l1- un Cxcl10, pēc iekaisuma aktivācijas. Lai gan WT un Gaplinc KO līmeņi ir vienādi gan transkripta (4.B att.), gan proteīna līmenī (SI pielikums, S18A-C att.), izmaiņu apjoms ir daudz mazāks (4.C att.), kas liecina, ka šī samazinātā kroka. izmaiņām var būt nozīme, lai novērstu Gaplinc KO peļu uzņēmību pret LPS. izraisīts endotoksiskais šoks.

Kopā ar nikno citokīnu ražošanu. vēl viens endotoksiskā šoka klīniskais aspekts, kas var izraisīt mirstību, ir asins recekļu veidošanās mazākos traukos, kas izraisa vairāku orgānu mazspēju (16.17.). Lai to atrisinātu, mēs analizējām ar LPS ip. ārstētu peļu serumu, lai novērtētu koagulācijas atšķirības. Izmantojot aktivizētu daļēju tromboplastīna laika (a) testu, kas mēra laiku līdz trombu veidošanās, mēs atklājam, ka WT pelēm ir ievērojami ilgāks laiks, salīdzinot ar Gaplinc KO pelēm pēc LPS izaicinājuma (4. att.). Ilgstoši aPTT laiki liecina, ka WT pelēm jau ir veikta koagulācija un izsmelti galvenie koagulācijas faktori, tāpēc testēšanas, recēšanas uzsākšanas un mērīšanas laikā palielinās trombu veidošanās laiks. Dati liecina, ka izdzīvošanas atšķirības pēc LPS iedarbības ir saistītas ar WT pelēm, kurām ir pastiprināta recēšana, izraisot iespējamu orgānu mazspēju un nāvi.

Tālāk mēs mēģinājām mehāniski saprast, kā Gaplinc veicina šo efektu. Pirmkārt, mēs apstiprinājām tā lokalizāciju un analizējām Gaplinc līmeni gan BMDM citoplazmas, gan kodola nodalījumos ar qPCR. Līdzīgi kā cilvēka GAPLINC. peles Gaplinc pārsvarā bija citoplazmatisks (ST pielikums, S19. att.). Pēc tam mēs veicām modificētu RNS saistošo proteīnu (ChIRP) visaptverošu identifikāciju, kas apvienota ar masas spektrometriju un mazu RNS sekvencēšanu, jo iepriekš tika pierādīts, ka GAPLINC mijiedarbojas ar mikro RNS (18). Mēs nenovērojām mijiedarbību ar iepriekš identificētiem mērķiem (SIPielikums, S20 att.).

Tā kā mēs nevarējām identificēt tiešu saistīšanas partneri, mēs koncentrējāmies uz saglabātajām funkcijām starp cilvēkiem un pelēm, īpaši konservētajiem gēniem, kas tika ietekmēti mūsu cilvēka GAPLINC kd un peles Gaplinc KO pētījumos, no kuriem lielākā daļa ir NF-kB regulatori (4. E attēls). ). Visizplatītākā NF-KB forma, ko aktivizē LPS, ir p65:p50 heterodimērs, un septiņi no deviņiem konservētajiem gēniem ir tiešie p65 mērķi (19). Mēs izmantojām native RNS imūnprecipitāciju (RIP) un parādījām, ka nav tiešas mijiedarbības starp Gaplinc un p65 (S7 pielikums, S21. att.). Klasiskajā NF-kB signālu ceļā p6:p50 apakšvienības atrodas citozolā un ir saistītas. uz inhibējošu I-kB- miera stāvoklī esošajās šūnās. Pēc aktivizēšanas I-KB- tiek degradēts, ļaujot p65:p50 pārvietoties kodolā un aktivizēt mērķa gēnus (20). WT un Gaplinc-KO BMDM mēs izmērījām I-kB- noārdīšanos, izmantojot Western blot un neatradām nekādas atšķirības (Fig.4F). Pēc tam mēs salīdzinājām kopējo p65 līmeni BMDM. Mūsu RNS-Seg datos p65 (RelA) transkripta līmeņi gan pamata, gan LPS stimulētajos apstākļos WT un Gaplinc-KO BMDM ir salīdzināmi (SI pielikums, S22 att.). Tomēr, salīdzinot kopējo p65 proteīna līmeni ar Western blot metodi, mēs atklājām ievērojami paaugstinātu p65 līmeni Gaplinc-KO šūnās, salīdzinot ar WT (4G att.). Tas liek domāt, ka Gaplinc regulē kopējo p65 līmeni translācijas līmenī. Turklāt mēs novērtējām p65 līmeni citoplazmas un kodola nodalījumos un atklājām, ka kodola p65 ir daudz biežāk šūnās ar Gaplinc deficītu, salīdzinot ar WT (4. att.). Kopā šie dati liecina par GAPLINC mehānisko lomu kritisko IRG aktivizēšanā.

Diskusija

Šeit mēs esam identificējuši GAPLINC kā konservētu citozoliski ekspresētu IncRNS cilvēkiem un pelēm, kas darbojas, lai kontrolētu iekaisuma gēnu ekspresiju, regulējot NF-xB. Salīdzinājumā ar citosoliskām IncRNS, kas ietekmē translācijas efektivitāti, modulējot proteīna ekspresiju vai ribosomu komplektāciju (21-23), mēs atklājam, ka Gapline citosoliski veicina p65 translācijas spēju; tomēr tiešās vai netiešās mijiedarbības mehānisms vēl ir jānosaka. Mūsu atklājumi sniedz ieskatu par to, kā funkcionāli konservēta IncRNA regulē imūnreakciju un nodrošina izmeklēšanas iespējas endotoksiskā šoka terapijas izstrādei.