Hipoksijas izraisītā faktora atšķirīgais sadalījums-1 kultivētās nieru kanāliņu šūnās ar hipoperfūziju, kas simulēta ar pārklājuma izvietošanu

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Josuke Hirakava¹ | Kiiči Mizukami²| Tošitada Jošihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seidži Tobita²| Masaomi Nangaku

Abstrakts

Hroniska hipoksija nieru tubulointersticijā spēlē galveno lomu hroniskas slimības progresēšanā.nieresslimība(CKD). Tāpēc ir svarīgi izpētīt tubulāro hipoksiju un hipoksijas izraisītā faktora (HIF) -1 aktivitāti, reaģējot uz hipoksiju. Peritubulārā kapilāra retums izraisa hipoperfūziju HNS; tomēr reti ir pētīta hipoperfūzijas ietekme uz HIF. Mēs izraisījām hipoperfūziju, ko izraisīja segstikliņa novietošana cilvēkamnieres-2 šūnas un novēroja skābekļa gradientu zem pārklājuma. HIF-1 imūncitoķīmija parādīja virtuļa formas veidojumu pimonidazola pozitīvas zonas malā, ko nosaucām par "HIF gredzenu". Tika lēsts, ka HIF gredzena skābekļa spriegums ir no aptuveni 4 mmHg līdz 20 mmHg. Šis rezultāts nebija saderīgs ar iepriekšējo pētījumu rezultātiem, kas liecina par HIF-1 uzkrāšanos bezskābekļa diapazonā ar viendabīgu skābekļa spriegumu. Tālāk mēs novērojām pH gradienta klātbūtni zem pārklājuma stikla, kā arī HIF gredzena nobīdi barotnes pH izmaiņu dēļ, kas liecina, ka HIF gredzens tika izveidots, nomācot ar HIF-1 saistītu. līdz zemam pH līmenim. Šis pētījums parādīja, ka HIF{10}} aktivācija atdarina fizioloģisko stāvokli kultivētās šūnās ar hipoperfūziju.

ATSLĒGVĀRDIhipoperfūzija, hipoksija, hipoksijas izraisīts faktors, skābekļa gradients, pH

Cistanche herbanovērš nieru slimību, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu

1|IEVADS

Saslimstība ar hroniskunieresslimība(CKD) pieaug visā pasaulē, sabiedrībām novecojot (Tonelli & Riella, 2014). CKD progresēšana ir neatgriezeniska, tiklīdz nieru bojājums sasniedz noteiktu pakāpi un galu galā izraisa beigu stadijas nieru slimību (ESRD) neatkarīgi no pamatslimības. Šis rezultāts norāda uz "galīgā kopīgā ceļa" esamību. Saskaņā ar pagātnes patoloģiskajām analīzēm nieru funkcijas samazināšanās ir ciešāk saistīta ar tubulointersticiālu bojājumu nekā ar glomerulāriem bojājumiem. Ir bijuši vairāki ziņojumi, kas parāda, ka nieru fibroze izraisa hronisku hipoksiju tubulointerstitijā, un šī tubulointersticiālā hipoksija pasliktina CKD un izraisa ESRD. Šie pierādījumi liecina, ka tubulointersticiālajai hipoksijai ir nozīme galīgajā kopējā CKD ceļā (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Thenieresir ļoti jutīgs pret hipoksiju, jo tam ir augsts skābekļa pieprasījums un pastāv skābekļa šunts starp intrarenālajām artērijām un vēnām (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Tāpēc mēs uzskatām, ka ir svarīgi izpētīt hipoksiju un reakciju uz hipoksiju nieru tubulointersticijā.

Primārā bioloģiskā reakcija uz hipoksiju dzīvos organismos notiek, izmantojot hipoksijas izraisītā faktora (HIF) ceļu (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF sastāv no - un -apakšvienībām. Lai gan -apakšvienība ir konstitutīvi aktīva, -apakšvienība tiek noārdīta skābekļa klātbūtnē. Normoksiskos apstākļos HIF- tiek hidroksilēts ar prolilhidroksilāzes domēnu (Ph.D.), padarot to atpazīstamu ar fon Hipela-Lindau audzēja nomācēju (VHL). Šī atpazīšana izraisa ubikvitināciju un hidroksilētā HIF degradāciju proteasomā. Hipoksiskos apstākļos HIF uzkrājas citozolā, jo nehidroksilētais HIF izbēg no degradācijas. Uzkrātais HIF- tiek pārvietots no citozola uz kodolu, kur tas dimerizējas ar HIF- un darbojas kā transkripcijas faktors, veicinot pakārtoto gēnu ekspresiju. Ir zināms, ka no trim identificētajām HIF apakšvienību izoformām — HIF-1, HIF-2 un HIF-3 — nieru kanāliņu epitēlija šūnas ekspresē HIF-1 (Tanaka et al. ., 2016). Iepriekšējie pētījumi liecina par pārejošu vai reģionālu HIF uzkrāšanosnieresar CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), un šis HIF tiek aktivizēts samazinātā skābekļa spriedzē CKD vidē. Nepareizu adaptāciju hipoksijai HNS var izraisīt faktori, kas nomāc HIF ceļus (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Ir ziņots par HIF aktivācijas aizsargājošo iedarbību vairākos dzīvnieku modeļos, tostarp streptozotocīna izraisītām žurkām ar diabētu un 5/6 nefrektomijas žurkām (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). Ph.D. inhibitori nesen ir piesaistījuši uzmanību kā jaunas terapijas metodes nieru anēmijas ārstēšanai pacientiem ar hronisku nieru slimību (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Tomēr sīkāka informācija par nieru hipoksijas progresēšanu un to, kā notiek HIF uzkrāšanāsnieresar CKD, paliek neskaidrs. No skābekļa atkarīga HIF hidroksilēšana notiek citozolā, un tāpēc ir svarīgi izmērīt intracelulāro un ārpusšūnu skābekļa spriedzi. Skābekļa spriedzes mērīšanai tiek izmantotas vairākas metodes, tostarp mikroelektrodu vai no asins skābekļa līmeņa atkarīgās magnētiskās rezonanses attēlveidošanas (BOLD-MRI) izmantošana. Mēs izmantojām fosforescences mūža attēlveidošanas mikroskopiju (PLIM), lai kvantitatīvi noteiktu intracelulāro skābekļa stāvokli (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 ir fosforescējoša krāsviela, kuras pamatā ir irīdija (III) komplekss BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoāts-piridīns, aac=acetilacetons) ar katjonu dimetilaminogrupu, kas ir pasīvi. Izplatās intracelulārajās lizosomās. Tas tika sintezēts kā nesena fosfozonde, lai izmērītu intracelulāro skābekļa spiedienu (Yoshihara et al., 2015). PLIM ar BTPDM1 ļāva iegūt augstas izšķirtspējas attēlus ar skābekļa daļēju spiedienu nieru kanāliņu šūnās uz normālu peļu nieru virsmas, nodrošinot datus, kas norāda uz skābekļa gradienta klātbūtni pat normālās nierēs (Hirakawa et al., 2018). ).

Dzīvos orgānos ir skābekļa gradienti, tostarpnieres, pat normālos apstākļos (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), un tāpēc šādus gradientus var sagaidīt arī CKD. Hipoperfūziju izraisa HNS mikrovaskulārās sistēmas retums, kurā progresējoša glomerulāra bojājuma rezultātā samazinās peritubulārā kapilārā asins plūsma, pastiprinot intersticiālu fibrozi. Intersticiāla fibroze pasliktina cauruļveida šūnu difūziju un piegādi ar skābekli, kā arī izraisa mikrovaskulāras sistēmas retināšanu, vēl vairāk pasliktinot tubulointersticiālu hipoksiju (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Tomēr hipoperfūzijas bioloģiskā ietekme joprojām ir neskaidra, jo lielākajā daļā pētījumu ir pētīta hipoksijas un HIF-1 ietekme uz kultivētām šūnām homogēnas perfūzijas un skābekļa spriedzes apstākļos (Rexius-Hall et al., 2017). Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka vienslāņu kultivētās šūnas, kas pārklātas ar pārklājumu, nodrošina labu hipoperfūzijas modeli, ko izraisa barjera difūzijai barotnē. Modelētā hipoperfūzija ir saistīta ar skābekļa gradientu, jo pārklājošais stikls novērš skābekļa difūziju no barotnes augšdaļas uz šūnām (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). Kultivētu šūnu monoslānī, kas pārklāts ar segstikliņu, intracelulārais skābekļa spriegums samazinās līdz ar attālumu no pārklājuma malas ierobežotas skābekļa difūzijas dēļ kultivētajās šūnās. Rezultātā no pārklājuma malas līdz centram veidojas skābekļa gradients, un intracelulārais skābekļa spriegums var samazināties līdz anoksiskajam diapazonam pārklājuma centrā (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz HIF aktivizēšanu un pētījām, vai HIF ekspresijā ir no skābekļa neatkarīgas izmaiņas hipoperfūzijas ar skābekļa gradientu klātbūtnē. Tā kā nieru kanāliņos in vivo pastāv hipoperfūzija ar skābekļa gradientu, no skābekļa neatkarīgas ietekmes uz HIF ekspresiju novērošana segstikla modelī var sniegt ieskatu mehānismā, kas ir pamatā HIF uzkrāšanās nepietiekamībai HNS.

cistanche ekstraktsnierēm

2|MATERIĀLI UN METODES

2.1|Šūnu kultūra

Kultivētās šūnas tika inkubētas mitrinātā inkubatorā ar 5 procentiem CO2. Hipoksiskā inkubācija tika veikta personīgā CO2/vairāku gāzu inkubatorā APM-30D (Astec). Anoksija tika izraisīta ar anoksijas maisu, AnaeroPack un anaerobās kultivēšanas komplektiem #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

HK-2 šūnas (Homo sapiens, cilvēksnieres, vīrietis, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), iemūžināta proksimālā kanāliņu epitēlija šūnu līnija no normālas pieauguša cilvēka nieres, tika kultivēta Dulbecco modificētajā Ērgļa barotnes/uzturvielu maisījumā F{{2} } Šķiņķis (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich), kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) un penicilīna-streptomicīna šķīdumu (15070063, Thermo Fisher Scientific) 10 cm kultivēšanas traukā. Pasāžai HK-2 šūnas tika atdalītas ar tripsīnu (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) un centrifugētas pie 300 g 5 minūtes.

HeLa dzemdes kakla vēža šūnas un cilvēka embrijanieresšūnas 293 (HEK293) tika kultivētas DMEM ar zemu (1000 mg/l) glikozi (D6046, Sigma Aldrich), kas satur 5 procentus FBS 10 cm kultivēšanas traukā. Šīs šūnas tika pasētas kā HK-2 šūnas.

Nieru proksimālo kanāliņu epitēlija šūnas (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) tika uzturētas, izmantojot RenaLifeTM Comp komplektus (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Pasāžai RPTEC tika atdalīti, izmantojot tripsīnu, neitralizēti ar tripsīna neitralizējošu šķīdumu (CC-5002, Lonza Ltd.) un centrifugēti pie 200 g 5 minūtes.

2.2|Hipoperfūzijas modeļa izveide, novietojot pārklājuma stiklu

Apaļas formas segstikliņi ar diametru 15 mm (C015001, Matsunami) pirms lietošanas tika notīrīti ar ultraskaņu un uzglabāti 99,5% etanolā. Tika izmantotas divas metodes, kuru pamatā ir šūnu novērošana ārpus pārklājuma.

Viena slāņa kultivētās šūnas tika ievietotas starp segstikliņu un trauka dibenu (S1a, b attēls) vai alternatīvu metodi (S1c attēls), kā aprakstīts tālāk. Tika izvēlēta tradicionālā vai alternatīvā metode, lai izveidotu mūsu pārklājuma modeli tiešraides attēlveidošanai neatkarīgi no tā, vai tas ir skābekļa vai PH attēlveidošana. Imūncitoķīmijai (ICC) tika izvēlēta alternatīva metode, jo, izmantojot tradicionālo metodi, lielākā daļa šūnu bieži atdalījās no trauka apakšas, noņemot pārklājuma stiklu šūnu fiksēšanai (S2a attēls).

2.2.1|Tradicionālā metode

Pirmajā dienā šūnas tika novietotas uz 27 mm stikla trauka (3910-035, Iwaki) apakšā 100 procentu * (aptuveni 5,0 × 105 vienā traukā) saplūšanas vietā. Tos nakti kultivēja DMEM/F12, kas satur 10 procentus FBS bez antibiotiku šķīduma. 2. dienā kultivētajām šūnām uz norādīto laiku tika uzlikts pārklājums (S1b attēls).

2.2.2|Alternatīva metode

Šūnas tika iesētas uz pārklājuma 35 mm kultūras traukā ar 100 procentu saplūšanu (apmēram 5,0 × 105 vienā traukā) dienā.

1. Tie tika kultivēti DMEM/F12, kas satur 10 procentus FBS bez antibiotiku šķīduma nakti. Otrajā dienā pārklājums tika apgriezts otrādi, lai uz noteiktu laiku piestiprinātu tā šūnu virsmu jauna 27 mm stikla trauka apakšai (S1c attēls).

Mēs arī izveidojām segstikliņu modeli, izmantojot apaļas formas segstikliņus ar diametru 10 mm (CS01005, Matsunami) (S2b attēls).

2,3|Dzīvā skābekļa attēlveidošana ar BTPDM1

Kultivētās šūnas tika sagatavotas 1. dienā, kā aprakstīts iepriekš. 2. dienā šūnas divreiz izskaloja ar Henksa līdzsvaroto sāls šķīdumu (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) un inkubēja ar 500 nM BTPDM1, katjonu lipofīlo krāsvielu uz irīdija bāzes, ko izmanto kā intracelulāru fosforescējošu zondi (Yoshihara et al., . 2015), DMEM/F12 bez fenolsarkanā (21041-025, Thermo Fisher Scientific) 30 minūtes. Pēc tam, kad šūnas divas reizes tika mazgātas ar HBSS, tās tika ievietotas starp segstikliņu un trauka dibenu, kā aprakstīts iepriekš. Fosforescences intensitāte no BTPDM1 kultivētajās šūnās, kas pārklātas ar pārklājumu, tika novērota, izmantojot ierosmes un emisijas filtru, un BTPDM1 fosforescence (Hirakawa et al., 2015) tika noteikta, izmantojot fluorescences mikroskopu BZ-X710 (Keyence Corporation). Attēli, kas iegūti no apgrieztā fluorescējošā mikroskopa, tika pielāgoti spilgtumam un kontrastam, izmantojot BZ-X analīzes programmatūru.

2,4|Imūncitoķīmija

Šūnas uz pārklājuma tika kultivētas ar 200 µM pimonidazola HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) DMEM/F12 bez fenolsarkanā 1 stundu, pēc tam pārklājuma stikls tika pagriezts un piestiprināts pie vāka stikla trauka. aprakstīts iepriekš. Pēc tam šūnas noteiktu laiku kultivēja DMEM/F12 bez fenola sarkanā. Ja netika izmantota pimonidazola pretkrāsošana, pirmapstrāde ar pimonidazolu tika izlaista.

Pēc kultivēšanas perioda beigām katrs vāks tika savākts, un šūnas nekavējoties tika fiksētas ar metanolu / acetonu (1: 1) uz ledus, kur tās palika 30 minūtes. Pēc divreiz mazgāšanas ar Dulbecco fosfātu buferšķīdumu (PBS) (D5652, Sigma Aldrich) šūnu membrāna tika permeabilizēta 30 minūtes, inkubēta ar 5 procentiem liellopu seruma albumīna (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) 30 minūtes un pēc tam. ar serumu nesaturošu proteīnu bloku (X0909, DAKO) 10 min. Šūnas tika iekrāsotas ar pirmo antivielu un pēc tam ar otru, fluorescējošu antivielu. Pirmo antivielu saraksts ir dots S1 tabulā. FITC cūku poliklonālais prettrušu imūnglobulīns (F0205, 1:20 atšķaidījums, DAKO) tika izmantots kā pirmā antiviela, ja saimnieks bija trusis. Fluorescējošā antiviela Alexa Fluor 594 streptavidīns (S11227, atšķaidījums 1:500, Thermo Fisher Scientific) tika izmantota kā pirmā antiviela, ja saimnieks bija pele, kam sekoja biotinilēts anti-peles IgG (H plus L) (BA{{23} }, 1:1000 atšķaidījums, Vector Laboratories), kā otro antivielu. Kodolkrāsošana tika veikta, katram paraugam izmantojot bisBenzimide H 33342 trihidrohlorīdu (B2261, Sigma Aldrich).

Fluorescējošie signāli tika novēroti, izmantojot apgrieztu fluorescējošu mikroskopu BZ-X710 (Keyence Corporation) ar šādiem filtriem: Texas Red ar ierosmes viļņa garumu (Ex) 560/40 nm, emisijas viļņa garumu (Em) 630/75 nm, GFP ( Piemēram: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) un DAPI (piem.: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Attēli tika pielāgoti spilgtumam un kontrastam, izmantojot BZ-X analīzes programmatūru.

2,5|HK-2 šūnu HIF, kas apstrādātas ar kobalta hlorīdu, ICC

Alternatīvā metode tika modificēta, lai izveidotu ar kobalta hlorīdu apstrādātu HK-2 šūnu pārklājuma modeli. HK-2 šūnas tika iesētas daļēji saplūstošā blīvumā (2,5 × 105/trauciņā) uz pārklājuma 1. dienā un apstrādātas ar 300 µM kobalta hlorīda heksahidrātu (C 8661, Sigma Aldrich) 16 stundas 2. diena. 3. dienā pārklājošais stikls tika apgriezts otrādi, lai uz 3 stundām piestiprinātu šūnu virsmas jauna 27 mm stikla trauka apakšai, un tika veikta HIF ICC.

2,6|Western blotēšana

Lai izpētītu HIF{{0}} uzkrāšanos dažādos skābekļa spriegumos un dažādos pH līmeņos, 1.0 × 106 HK-2 šūnas uz 10 cm kultivēšanas trauciņu. tika inkubēti normoksijā, 2% skābekļa, 1% skābekļa vai anoksijas apstākļos 5 stundas vai DMEM/F12 pie pH 7,4, pH 6,0 vai pH 5,0 5 stundas.

Šīs šūnas tika lizētas RIPA buferšķīdumā, kas satur 50 mM Tris-buferšķīdumu (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0,5 w/v % nātrija. deoksiholāts, 0,1 m/v procents SDS un 1,0 m/v procents NP40.

Western blotēšanai izmanto SDS parauga buferšķīdumu, kas satur {{0}},35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 procentus SDS, 36 procentus glicerīna, 0,012 procentus bromfenolzilo un 0,1 M ditiotreitolu. (DTT) tika pievienots proteīniem. Olbaltumvielas, kas satur SDS parauga buferšķīdumu, tika eluētas, vārot 95 grādu temperatūrā 5 minūtes.

Olbaltumvielas tika atdalītas ar elektroforēzi uz 10 procentiem SDS poliakrilamīda gēliem. Pēc tam proteīni tika pārnesti uz AmershamTM HybondTM PVDF membrānu (10600023, GE Healthcare) pārneses buferšķīdumā (48 mM Tris bāzes buferis, 39 mM glicīns, 0,04 procenti SDS un 20 tilp./tilp. procenti metanola), izmantojot Trans-Blot®. TurboTM pārsūtīšanas sistēma (Bio-Rad). Membrānas inkubēja istabas temperatūrā ar primārajām antivielām, anti-HIF1 antivielām (NB100-134, atšķaidījums 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) un anti-aktīna antivielu (A2066). , 1:2000 atšķaidījums, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), un pēc tam sekundārajā antivielā poliklonālais kazas anti-trušu imūnglobulīns/HRP (P0448, 1:10000 atšķaidījums, DAKO, RRID: AB{26). }}). Noteikšanai tika izmantots PierceTM ECL Plus Western blotēšanas substrāts (32132, ThermoFisher Scientific). Ķīmiluminiscence tika novērota, izmantojot Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Reproducējamība tika apstiprināta, veicot vismaz trīs neatkarīgus eksperimentus. Joslu intensitāte tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot National Institutes of Health ImageJ programmatūru (Schneider et al., 2012).

2,7|Luciferāzes reportiera tests

Tika veikts luciferāzes reportiera tests, lai izmērītu HIF1 uzkrāšanos homogēnās hipoksiskās kultūras inkubācijā. Iepriekš mēs izveidojām marķētu luciferāzes gēnu, ko virza uz hipoksiju reaģējošs elements (HRE), un izstrādājām uz hipoksiju reaģējošu reportiera vektoru (transgēnu konstrukcija). Tas tika izveidots no HRE tandēma kopijām no žurku asinsvadu endotēlija augšanas faktora gēna, kas subklonēts am CMV promotora-luciferāzes transkripcijas vienības 5' reģionā (pirms Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

HK{{0}} šūnas ar koncentrāciju 1,0 × 105 vienā iedobē tika sagatavotas 12-iedobju kultūras plāksnēs (150628, Thermo Fisher Scientific). Šūnas tika kotransfektētas ar 500 ng pGL3-Basic HRE-luciferāzes vektoriem un 30 ng pRL-SV40 Renilla luciferāzes kontroles vektoriem (Promega), izmantojot 2 µl FuGENE® HD transfekcijas reaģenta (E2311, Promega) labi. Kā negatīva kontrole tika izmantotas HK-2 šūnas, kas kotransfektētas ar 500 ng ofpGL3-Basic firefly luciferāzes vektoriem un 30 ng ofpRL-SV40 Renilla luciferāzes kontroles vektoriem (Promega).

Transfektētās šūnas tika inkubētas normoksijā, 2% hipoksijā, 1% hipoksijā vai anoksijas maisā 5 stundas. Pēc tam šūnas tika novāktas, izmantojot 100 µl pasīvā proteīna līzes bufera, lai veiktu dubulto luciferāzes testu. Mērījumiem tika izmantots LB9507 luminometrs (EG un Berthold). Lai koriģētu transfekcijas efektivitāti, ugunskura luciferāzes gaismas vienības relatīvā vērtība tika dalīta ar Renilla luciferāzes vērtību.

cistanche izd

2,8|Apoptozes analīze

Kultivētās šūnas tika pārklātas ar segstikliņu 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h un 24 h, un pēc tam savāca, izmantojot tripsīnu. Šūnas, kas apstrādātas ar 3% ūdeņraža peroksīdu (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 30 minūtes, tika sagatavotas kā apoptotiska kontrole. Apoptozes kvantitatīvā analīze tika veikta, izmantojot Muse Annexin V un Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) Muse™ šūnu analizatorā (Millipore), saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2,9|Kvantitatīvā reāllaika PCR (qRT-PCR)

Kopējā RNS ekstrakcija un cDNS sintēze tika veikta saskaņā ar ražotāja norādījumiem attiecīgi par RNAiso Plus (9109, Takara) un PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). Reāllaika PCR tika veikta, izmantojot THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) CFX Connect reāllaika PCR noteikšanas sistēmā (Bio-Rad). Transkripta līmeņi tika normalizēti līdz aktīna mRNS ekspresijas līmenim. qRT-PCR tika veikts trīs eksemplāros, izmantojot gēnu specifiskus primerus. HIF-1 tika pastiprināts, izmantojot priekšējo, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ un reverso 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′ praimerus. -aktīns tika pastiprināts, izmantojot priekšējo, 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ un reverso 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′ praimerus.

2.10|Transfekcija ar siRNS

Lai izpētītu RNSi izraisīto HIF-1 notriekšanu HK-2 šūnās, sešu iedobju plāksnēs tika sagatavotas 50 × 104 HK-2 šūnas katrā iedobē. Kopā ar Lipofectamine RNAiMAX tika izmantoti divu veidu RNSi — HIF-1 siRNS (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] un siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]). Transfekcijas reaģents (Thermo Fisher Scientific). Kā negatīva kontrole tika izmantota Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Tika sajaukti 1,5 µl katras siRNS un 5 µl RNAiMAX. siRNS transfektētās šūnas tika inkubētas normoksiskos vai hipoksiskos (1 procents O2) apstākļos 48 stundas, un RNS tika ekstrahēts. HIF-1 notriekšanas efektivitāte tika pārbaudīta, izmantojot qRT-PCR.

2,11|PH gradienta efektu tiešraides attēlveidošana

Mēs vizualizējām dzīvo šūnu intracelulāro pH gradientu zem pārklājuma. Pirms pārklājuma modeļa ieviešanas šūnas tika apstrādātas ar pHrodo Green AM intracelulāro pH indikatoru (p35373, ThermoFisher Scientific) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Lai novērotu fluorescences intensitātes gradienta laika pāreju zem pārklājuma, tika izmantots apgriezts fluorescences mikroskops BZ-X710 (Keyence Corporation) ar GFP filtru.

2,12|HIF gredzena kvantitatīvā analīze

2.12.1|HIF gredzena vieta

Mēs izmērījām HIF gredzenu un pimonidazola pozitīvo zonu attālumu no pārklājuma malām, izmantojot ImageJ, šādi. Tika noteikti HIF gredzena un pimonidazola pozitīvā apļa ārējo un iekšējo apļu laukumi un aprēķināts katra apļa rādiuss. Katra vērtība tika atņemta no 7,5 mm, kas ir 15 mm pārklājuma rādiuss, lai aprēķinātu tā attālumu no pārklājuma malas. Tika veikti trīs neatkarīgi HIF ICC eksperimenti katrā stāvoklī.

2.12.2|HIF gredzena definīcija

Mēs izmantojām fluorescējošus attēlus, kas iegūti no pārklājuma modeļa, kas inkubēts normoksijā un neitrālā pH. Mēs definējām HIF gredzena vietu un tā ārpusi un iekšpusi kā 2,5–3.0 skala (0,22–0,45 mm), 0,5 Attiecīgi –1.{11}} mērogā (1,12–1,35 mm) un 5.0–5,5 mērogā (2,24–2,47 mm) no pārklājuma malas, izmantojot attēluJ. Mēs izmērījām piecas HIF-1 signālu vietnes katrā paraugā un aprēķinājām vidējo. Tika veikti trīs neatkarīgi HIF ICC eksperimenti.

cistanche ekstrakta pulveris

2,13|Skābekļa spiediena mērīšana ar PLIM attēlu

2.13.1|Kalibrēšanas līnijas uzbūve skābekļa spiediena mērīšanai

Tika izveidota HK{0}} šūnu kalibrēšanas līkne, pamatojoties uz metodi, kas aprakstīta mūsu iepriekšējā ziņojumā (Yoshihara et al., 2015). HK-2 šūnas, kas ielādētas ar 500 nM BTPDM1 30 minūtes, tika kultivētas ar maināmu skābekļa koncentrāciju vairāku gāzu inkubatorā, kas aprīkots ar apgrieztu fluorescējošu mikroskopu, kas bija savienots ar mūža mērīšanas sistēmu. Kalibrēšanas līnija, pamatojoties uz Sterna-Volmera analīzēm, tika izveidota, izmantojot HK-2 šūnu fosforescences kalpošanas laiku (PL) vairākos dažādos skābekļa spriegumos, izmantojot

1. vienādojums

kur τp apzīmē PL pO2, τ0 apzīmē PL deoksigenācijā, kq apzīmē dzēšanas ātruma konstanti un pO2 apzīmē skābekļa daļējo spiedienu. Izmantojot šo kalibrēšanas līniju, skābekļa spiedienu varēja aprēķināt no PL.

2.13.2|PLIM pārklājuma modeļa attēls

Tika sagatavotas HK-2 šūnas, kas 30 minūtes bija ielādētas ar 500 nM BTPDM1. Tika uzbūvēts un kultivēts pārklājuma modelis O2 koncentrācijas maināmā vairāku gāzu inkubatorā, kas aprīkots ar apgrieztu fluorescējošu mikroskopu, kas savienots ar mūža mērīšanas sistēmu.

Fosforescences mūža attēlveidošanas mikroskopijas (PLIM) attēli tika ierakstīti, izmantojot apgrieztu fluorescences mikroskopu, kas aprīkots ar konfokālās skenēšanas sistēmu (Hirakawa et al., 2018). PLIM attēli tika iegūti pēc 30 minūšu inkubācijas 21% O2 vai 4% O2. Katram paraugam tika uzņemti četri PLIM attēli no augšējā, apakšējā, kreisā un labā apgabala netālu no pārklājuma malas, lai noteiktu vidējo PL, ņemot vērā PL izmaiņas segstikliņā.

2.13.3|HIF gredzena identifikācija PLIM attēlā

Pimonidazols bija pozitīvs zem 10 mmHg skābekļa spiediena. Saskaņā ar kalibrēšanas līniju PL ekvivalents 10 mmHg skābekļa spiedienam bija 4034,6 ns, tāpēc PLIM attēlā varēja identificēt pimonidazola apļa ārējo līniju. Pēc tam ārējo un iekšējo HIF gredzenu vietas PLIM attēlā varēja atrast, izmantojot attāluma kvantitatīvo analīzi. Mēs izmērījām vidējo PL diapazonu, kas ir līdzvērtīgs HIF gredzenam 21% O2 un 4% O2.

2.13.4|HIF gredzena skābekļa spiediena mērīšana

Mēs aprēķinājām HIF gredzena skābekļa spiediena diapazonu no PL, izmantojot kalibrēšanas līniju. PLIM attēli tika analizēti, izmantojot SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2,14|Statistiskā analīze

Lai salīdzinātu eksperimentālās un kontroles grupas, tika izmantots Daneta tests, un tika uzskatīts, ka vērtības <,05 norāda="" uz="" statistiski="" nozīmīgām="" atšķirībām.="" trīs="" vai="" vairāk="" grupu="" salīdzināšanai="" tika="" izmantoti="" studenta="" t="" testi,="" un="" tika="" piemērota="" bonferroni="" koriģētā="" p="" vērtība.="" visas="" statistiskās="" analīzes="" tika="" veiktas,="" izmantojot="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" tika="" pieņemts,="" ka="" vērtības="" ir="" iegūtas="" no="" normāli="" sadalītas="" populācijas,="" un="" tās="" ir="" parādītas="" kā="" vidējā="" ±="" standarta="" novirze="">

kas ir cistanche

3|REZULTĀTI

3.1|Skābekļa gradienta veidošanās hipoperfūzijas modelī

Mēs apstiprinājām skābekļa gradienta esamību hipoperfūzijas modelī, ko izraisīja pārklājuma izvietošana, tieši novērtējot skābekļa spriegumu, izmantojot fosforescenci. Fosforescences intensitātes mērījumi var paredzēt aptuvenu skābekļa spiediena tendenci (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Mēs novērojām ar BTPDM1 apstrādāto HK-2 šūnu pārklājuma modeļa fosforescences intensitāti. Fosforescences intensitātes attēli liecināja par hipoksiju lielākajā daļā pārklājuma zonas, bet nebija hipoksijas pie malas, kas liecina par skābekļa gradienta esamību ap pārklājuma malu HK-2 šūnās, kas pārklātas ar pārklājumu. segstikliņu (1.a attēls). Tā kā fosforescences intensitāte ir atkarīga no zondes koncentrācijas un ierosmes laika, fosforescences kalpošanas laika (PL) mērījums ir noderīgs skābekļa spiediena kvantitatīvai analīzei (Yoshihara et al., 2015). Tādējādi, lai kvantitatīvi mērītu kultivēto šūnu skābekļa spriegumu ap pārklājuma malu, mēs ieguvām PLIM attēlus no HK-2 šūnām, kas 30 minūtes bija pārklātas ar pārklājumu (1.b attēls). PL pagarinājās, palielinoties attālumam no pārklājuma malas. Mēs apstiprinājām, ka skābekļa spriegums, kas aprēķināts, izmantojot kalibrēšanas līniju (S3 attēls), samazinājās, palielinoties attālumam no pārklājuma malas, nodrošinot pierādījumus par skābekļa gradienta esamību ap pārklājuma malu (1.c attēls). Fosforescences intensitātes laika profila pārbaude liecināja, ka skābekļa gradients sāka veidoties 10 minūtes pēc pārklājuma uzlikšanas

(1.d attēls).

3.2|Unikāls HIF-1 sadalījums hipoperfūzijas modelī "HIF gredzens"

Mēs pārbaudījām HIF-1 sadalījumu hipoperfūzijas modelī ar skābekļa gradientu. HIF-1 ICC HK-2 šūnās uzrādīja virtuļa formas uzlabojumu pimonidazola pozitīvā apgabala malā, ko mēs nosaucām par "HIF gredzenu" (2.a attēls). HIF-1 signāla intensitāte HIF gredzenā bija ievērojami augstāka nekā tā iekšējā vai ārējā zonā (2.b attēls). Šī parādība tika apstiprināta, izmantojot ICC ar citu HIF-1 antivielu (S4a attēls) vai citām cauruļveida šūnu līnijām (S4b, c attēls). Mēs veicām arī HIF{11}} ICC analīzi cita veida kultivētās šūnās, piemēram, HeLa dzemdes kakla vēža šūnās. Lai gan šo šūnu vājā adhēzija ar segstikliņu apgrūtināja detalizētu HIF-1 sadalījuma novērtēšanu, mēs novērojām virtuļa formas HIF-1 uzlabošanos HeLa šūnās (S4d attēls).

HIF gredzens un pimonidazola pozitīvais apgabals sāka veidoties vairākas stundas pēc pārklājuma uzlikšanas, un HIF gredzens parādījās statisks pēc 3 stundām (2.c attēls). HIF-1 notriekšanas rezultātā pazuda signāls HIF-1, ieskaitot HIF gredzenu (2.d attēls, S4e attēls), norādot, ka HIF gredzens bija atkarīgs no HIF-1.

Lai izpētītu iespēju, ka HIF gredzena veidošanās ir atkarīga no skābekļa, mēs pētījām HIF-1 sadalījumu segslāņu modelī, inkubējot ar dažādu skābekļa spriegumu. Trauku ievietojām hipoksiskās kamerās ar dažādu skābekļa spriegumu uzreiz pēc segstikliņa modeļa izgatavošanas. Hipoksiskās inkubācijas laikā mēs novērojām, ka gan HIF gredzens, gan pimonidazola pozitīvais apgabals izplešas uz āru (3.a attēls). Mēs izmērījām katra HIF gredzena un pimonidazola pozitīvā apgabala attālumu no pārklājuma malas normoksijas, 4% O2 un 1% O2 inkubācijas apstākļos. Gan HIF gredzens, gan pimonidazola pozitīvais apgabals paplašinājās uz āru, samazinoties apkārtējai skābekļa spriedzei (3.b attēls). Šie rezultāti norādīja, ka HIF gredzens bija atkarīgs no HIF{10}} un skābekļa spriedzes.

Lai apstiprinātu, ka virtuļa formas uzkrāšanās ir specifiska HIF parādība, pārklājuma modelī veicām ICC ar mājturības gēniem. GAPDH un aktīna signāli tika uzturēti visā pārklājuma apgabalā un bija salīdzināmi starp HIF gredzena reģionu un citiem reģioniem (S5a, b attēls).

3,3|HIF gredzena skābekļa spiediena diapazona mērīšana

Mēs apstiprinājām HIF-1 uzkrāšanās gredzenveida pastiprināšanos kultivētās šūnās, kas pārklātas ar pārklājumu. Šī parādība ir atkarīga no skābekļa spriedzes. Lai noteiktu iesaistītā skābekļa spriedzes diapazonu, mēs analizējām HIF gredzena skābekļa spiedienu, izmantojot fosforescences kalpošanas laika metodi. Mēs ieguvām segstikliņa modeļa PLIM attēlus pēc 30 min inkubācijas 21% O2 vai 4% O2 (4.a attēls). HIF gredzens izveidojās uz pimonidazola apļa malas HIF ICC (3.b attēls). Mēs identificējām vietu PLIM attēlā, kas bija līdzvērtīga pimonidazola pozitīvajam apgabalam HIF ICC, un pēc tam identificējām vietu, kas atbilst HIF gredzenam (4.b attēls), izmantojot attāluma datu kvantitatīvo analīzi no HIF gredzena un pimonidazola pozitīvā zona (3.b attēls). Mēs arī izmērījām HIF gredzena PL diapazonu un pēc tam izmantojām kalibrēšanas līniju (S3 attēls), lai aprēķinātu HIF gredzena skābekļa spiedienu 21 procentā O2 (4,20 [3,46–4,97] ~ 35,9 [28,5–44,9] mmHg). , un 4 procenti O2 (2,19 [0,21–4,32] ~ 20,4 [17,1–24,1] mmHg) (4.c attēls).

3,4|HIF-1 uzkrāšanās viendabīgā skābekļa spriegumā

Lai gan vājus HIF-1 signālus ārpus HIF gredzena segstikliņa modelī var saistīt ar nepietiekamu hipoksiju, tiem, kas atrodas gredzenā, kur HIF-1 vajadzēja spēcīgāk aktivizēties ar zemāku skābekļa spriegumu. var kontrolēt no skābekļa neatkarīga parādība. Lai pārbaudītu parādības, kas izraisa HIF-1 maksimālās uzkrāšanās trūkumu anoksiskajā zonā, kas notiek tikai hipoperfūzijas modelī, mēs pārbaudījām, vai pastāv apgriezta sakarība starp skābekļa spriegumu un HIF-1 uzkrāšanos inkubācijas laikā. ar viendabīgu skābekļa spriegumu. Šūnu lizātu Western blot analīze dažādos homogēnos skābekļa spriegumos parādīja HIF-1 uzkrāšanās palielināšanos bezskābekļa inkubācijas laikā (5.a attēls). HRE-luciferāzes reportiera tests arī norādīja, ka HIF-1 uzkrāšanās palielinājās ar zemāku skābekļa spriedzi homogēnas skābekļa spriedzes apstākļos (5.b attēls). Šie rezultāti liecināja, ka HIF-1 uzkrāšanās bija atkarīga no skābekļa sprieguma, un maksimālā uzkrāšanās tika novērota bezskābekļa diapazonā. HIF-1 īpašībām ir jāatšķiras atkarībā no hipoperfūzijas modeļa un modeļa ar homogēnu skābekļa spriegumu. Mēs domājām, ka unikālo HIF-1 uzkrāšanās fenomenu šajā hipoperfūzijas modelī var noteikt cits faktors, nevis skābekļa spriegums.

3,5|HIF gredzena veidošanās nebija atkarīga no doktora grāda

Mēs pārbaudījām, vai HIF{0}} degradācija, iespējamais HIF gredzena veidošanās mehānisms, tika pārregulēta HIF gredzena iekšpusē. Šī ideja šķita nederīga, jo doktorantūras hidroksilēšanai, kas ir HIF degradācijas ātrumu ierobežojošs process, kā substrāts ir nepieciešams skābeklis. Kobalta hlorīds tiek plaši izmantots kā ķīmisks HIF stabilizators. Mēs izveidojām ar kobalta hlorīdu apstrādātu HK-2 šūnu pārklājuma modeli un veicām HIF ICC analīzi. HIF-1 signāls nepalielinājās HIF gredzena iekšpusē, kas kļuva neskaidrs, jo palielinājās HIF-1 signāls ārpus gredzena (6.c attēls). HK-2 šūnu ICC ar PHD2 notriekšanu, kas, domājams, ir primārā HIF prolilhidroksilāze šūnu kultūras eksperimentos (Strowitzki et al., 2019), radīja līdzīgus rezultātus (S6. attēls). Šie rezultāti norādīja, ka HIF degradācijas PHD-VHL ass nebija saistīta ar HIF gredzena veidošanos.

3,6|pH ietekme uz HIF-1 uzkrāšanos

Iepriekšējā ziņojumā tika aprakstīts sirds miocītu pārklājuma modeļa izmantošana, kam bija pH samazināšanās pārklājuma stiklā (Pitts & Toombs, 2004). Mēs pētījām pH zem pārklājuma un tā ietekmi uz HIF gredzena veidošanos. Mēs apstrādājām HK-2 šūnas ar intracelulāro pH indikatoru, kura fluorescences intensitāte ļauj novērtēt pH līmeni šūnās. Dzīvā attēlveidošana parādīja, ka pH samazinājās lielākajā daļā iekšpuses, bet ne tuvu pārklājuma malai, kas liecina par pH gradienta esamību ap pārklājuma modeļa malu (6.a attēls). Kvantitatīvā korelācijas analīze starp fluorescences intensitāti un attālumu no pārklājuma malas parādīja, ka pirmais bija paaugstināts, attālumam palielinoties, un novērojums, kas apstiprināja pH un skābekļa gradientu esamību ap pārklājuma malu (6.b attēls). Šūnu lizātu Western blot analīze homogēnās skābekļa koncentrācijās atklāja, ka inkubācija ar pH 5,0 barotni nomāc HIF-1 uzkrāšanos hipoksijas apstākļos (S7a–d attēls). Mēs arī apstiprinājām, ka HIF-1 uzkrāšanās hipoksijas apstākļos dažādos pH apstākļos samazinājās zem pH 6,0 (S8a–c attēls).

Vienā ziņojumā tika uzsvērta viegli skābu apstākļu nozīme, ja pH ir aptuveni 6.0. Saskaņā ar šo pētījumu, reoksigenācija pēc hipoksijas paskābināja barotni, kas izraisīja VHL nukleolāro sekvestrāciju. Savukārt HIF degradācija tika novērsta C2C12 miocaurulēs, PC12 neironos un 786-0 nieru vēža šūnās (Mekhail et al., 2004). Mūsu pētījumā nebija nekādu izmaiņu VHL sadalījumā cauruļveida šūnās starp reģioniem ar HIF-1 uzkrāšanos un tiem, kuros tā bija nomākta, izmantojot segstikliņu modeli ar pH vērtībām no 5.0 līdz 7,4. (S9a–c attēls). Cauruļveida šūnas ir pakļautas plašam pH apstākļu diapazonam (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), tāpēc mēs pētījām HIF gredzena izmaiņas vidē ar dažādu pH līmeni. vērtības no 5,0 līdz 8,5. HIF gredzens tika skaidri novērots barotnēs ar pH 8,5 un 7,4 (6.c attēls). HIF gredzens pastāvēja arī pie pH 6, 5, bet bija neskaidrs (6.c attēls). HIF-1 signāls tika novājināts visā pārklājuma daļā pie pH 5,0. (6.c attēls). Mēs veicām turpmāku kvantitatīvu analīzi par pozicionālo attiecību starp HIF gredzenu un pimonidazola pozitīvā apgabala malu (7.a attēls) un atklājām, ka gredzena stāvoklis mainījās atkarībā no pH. Iekšējam aplim bija tendence paplašināties uz āru pie pH 6,5, salīdzinot ar pH 7,4, savukārt ārējais aplis ievērojami saruka uz iekšu pie pH 8,5, pamatojoties uz pimonidazola pozitīvās zonas malu (7.b, c attēls). Mēs arī apstiprinājām, ka mājturības gēnu aktivitātes tika uzturētas pārklājuma modelī skābā inkubācijā (S10. attēls). Tāpēc šķiet, ka pH ir svarīga loma HIF gredzena veidošanās mehānismā.

4|DISKUSIJA

Šajā pētījumā mēs noteicām unikālu HIF-1 sadalījumu nieru kanāliņu šūnās, izmantojot hipoperfūzijas modeli, ko izraisīja pārklājuma slāņu novietošana. Mēs noskaidrojām, ka HIF gredzena veidošanos un uzturēšanu regulēja skābekļa spiediens un pH, kas abi pastāvēja gradientā segstikla modeļa pārklājuma malā. Pamatojoties uz šiem rezultātiem, mēs piedāvājam iespējamu HIF gredzena veidošanās mehānismu, kas ietver HIF-1 uzkrāšanos, samazinot skābekļa spriegumu, un uzkrāšanos tiek nomākta zemā pH dēļ noteiktā attālumā no pārklājuma malas (8. attēls). ).

Hipoperfūziju izraisa mikrovaskulāras sistēmas retums HNS (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). Iepriekšējā darbā mēs izmantojām in vivo attēlveidošanu, lai parādītu skābekļa gradienta klātbūtni normālu peles nieru nieru kanāliņu šūnās (Hirakawa et al., 2018). Paredzams, ka CKD cauruļveida šūnās skābekļa spriedze būs neviendabīga. Tomēr joprojām nav skaidrs, vai hipoperfūzijas esamība ar skābekļa gradientu ietekmē aizsardzības sistēmu pret hipoksiju, HIF. Šajā pētījumā mēs pētījām HIF sadalījumu kultivētajās proksimālajās kanāliņu šūnās saskaņā ar hipoperfūzijas modeli un atklājām, ka skābekļa gradients kultivētajās nieru kanāliņu šūnās tika veiksmīgi modelēts, izmantojot apaļu stikla pārklājumu. Pierādījumi no eksperimentiem, kuros izmantoja viendabīgu skābekļa spriegumu, liecināja, ka uzkrājas HIF-1, kura hidroksilēšana un sekojošā sadalīšanās galvenokārt ir atkarīga no skābekļa. Tas ir, HIF-1 daudzums palielinās, samazinoties skābekļa spriedzei. Tomēr mūsu pārklājuma modelī HIF-1 tika nomākts bezskābekļa zonā, un tam bija visaugstākā uzkrāšanās noteiktā attālumā no pārklājuma malas. Šī virtuļa formas HIF uzkrāšanās nekad agrāk nav bijusi parādīta. Mēs parādījām, ka HIF gredzena veidošanos var novērot neatkarīgi no inkubācijas atmosfēras skābekļa spriedzes, bet tā atrašanās vieta bija atkarīga no skābekļa spriedzes. Skābekļa spriedzes diapazons uz HIF gredzena tika mērīts aptuveni 4–20 mmHg, izmantojot PLIM ar BTPDM1. Lielākā daļa iepriekšējo pētījumu, kas bija vērsti uz kultivētām šūnām atmosfērā ar viendabīgu skābekļa spriegumu, atklāja, ka HIF-1 proteīna daudzums palielinājās hipoksiskā vai anoksiskā diapazonā (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Tādējādi mūsu modelī HIF gredzena veidošanos noteikti ir ietekmējis kāds cits faktors, nevis skābekļa spriegums; tas bija neatkarīgs no doktora grāda, kas ir HIF degradācijas ātrumu ierobežojošs process. Izrāviens HIF gredzena veidošanās mehānisma noskaidrošanā bija mūsu atklājums par pH gradienta, kā arī skābekļa gradienta lomu vāku-lūpu modelī, kas ierobežoja barotnes ieplūšanu līdzīgi kā in vivo hipoperfūzijai. modelis. Šajā hipoperfūzijas modelī intracelulārais pH samazinājās, palielinoties attālumam no pārklājuma malas, un ap pārklājuma malu tika novērots pH gradients. Mēs parādījām, ka HIF-1 uzkrāšanās tika nomākta pie zema pH, aptuveni pH 5,0, salīdzinot ar inkubāciju aptuveni neitrālā pH temperatūrā homogēnas skābekļa spriedzes apstākļos. HIF gredzena ārējā mala paplašinājās uz āru pie pH 6, 5, un HIF gredzena iekšējā mala saruka uz iekšu pie pH 8, 5, pamatojoties uz pimonidazola pozitīvās zonas malu. Skābos apstākļos HIF gredzens tika aizsegts, un HIF-1 signāls pazuda pie pH 5,0. Tādējādi mēs noskaidrojām pH nozīmi HIF gredzena veidošanā pārklājuma modelī. Mēs parādījām iespēju, ka HIF gredzens tika izveidots, nomācot HIF-1 uzkrāšanos zemā pH dēļ gredzena iekšpusē.

Vairākos iepriekšējos pētījumos, izmantojot pārklājuma metodi, ir izmantotas vēža šūnas. Saskaņā ar vienu ziņojumu, kurā izmantota cilvēka hepatomas šūnu līnija Hep3B, kas pauž no skābekļa atkarīgo zaļā fluorescējošā proteīna (AcGFP1) sarkano nobīdi, ar taisnstūrveida segstikliņu pārklātu šūnu dzīvā attēlveidošana parādīja sarkano nobīdi, palielinoties attālumam no pārklājuma malas (Takahashi & Sato, 2010). Hepatomas šūnu emisijas spektrs mainījās no zaļās fluorescējošā proteīna (GFP) fluorescences uz sarkano viļņa garumu, samazinoties skābekļa spriedzei. Citā pētījumā skābekļa spriegums SCC-7 šūnām ar apaļu 15-mm pārklājumu tika mērīts, izmantojot fosforescences kalpošanas laika metodi. Skābekļa spriegums bija 6,9 mmHg un 166 mmHg, kas aprēķināts no PL, kas bija 3,89 µs un 893 µs, attiecīgi 0–2 mm iekšpusē un 0–1 mm ārpus pārklājuma malas (Yoshihara et al., 2015). Pārklājuma metode ir izmantota arī ar sirds miocītiem - sistēmu, kas ir piesaistījusi uzmanību kā daudzsološs in vivo išēmijas-reperfūzijas modelis. Kellija et al parādīja, ka miocītos, kas pārklāti ar vāku, laika gaitā tika veiktas ievērojamas morfoloģiskas izmaiņas, ko papildināja mitohondriju membrānas potenciāla un plazmas membrānas dinamikas izmaiņas, kas galu galā izraisīja miocītu nāvi. Viņi arī pierādīja, ka ar segstikliņu pārklāto miocītu intracelulārais pH strauji pazeminās līdz aptuveni pH 4 segstikliņa centrā (Pitts & Toombs, 2004). Pārklājuma modelis, kas kavē skābekļa vai barības vielu difūziju kultivētās šūnās zem pārklājuma, var atdarināt in vivo išēmisku, normālu un marginālu zonu modeli attiecīgi segstikla centrā, ārpusē un malā. Vairākos pētījumos šis modelis ir izmantots kā miocītu išēmijas-reperfūzijas modelis in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Cik mums ir zināms, mūsu pētījums ir pirmais, kas izmanto pārklājuma metodi cauruļveida šūnām. Mūsu sistēmā attālums no pārklājuma malas līdz apgabalam, kas atbilst 10 mmHg skābekļa spriegumam, kur pimonidazolam vajadzētu kļūt pozitīvam, bija 1,22 mm, un skābekļa spriegums samazinājās līdz nullei 2 mm attālumā no pārklājuma malas. . Šis rezultāts var būt saderīgs ar iepriekšējiem ziņojumiem, izmantojot aptuveni 15 mm pārklājumu, kas parāda skābekļa gradienta esamību vismaz 2 mm attālumā no malas (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Mēs pārbaudījām šūnu apoptozes ātrumu zem vāka (attēls S11) un atklājām, ka GAPDH un aktīns tika saglabāti pat HIF gredzena iekšpusē, norādot, ka HIF gredzenu neizraisīja tikai šūnu apoptoze vai nāve HIF gredzena iekšpusē.

Vairāki pētījumi ir izmērījuši skābekļa spriedzi nierēs, izmantojot dažādas metodes. Daži normālu nieru skābekļa sprieguma mērījumu piemēri bija šādi: 50 mmHg un 30 mmHg garozā un smadzenēs, izmantojot mikroelektrodus; un 49 mmHg un 41 mmHg garozas cauruļveida šūnu S1 un S2 segmentos, izmantojot PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Slimu nieru skābekļa spriedze būtu zemāka. Saskaņā ar iepriekšējo ziņojumu, izmantojot skābekļa mikroelektrodus, diabēta žurkām bija zemāks nieru parenhīmas skābekļa spriegums: attiecīgi 36 mmHg un 11 mmHg garozā un smadzenēs (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Tā kā skābekļa mikroelektrodi mēra vidējo parenhīmas skābekļa spriegumu, slimām nierēm ir sagaidāms plašāks diapazons. Intracelulārā skābekļa spriedze samazinājās līdz nullei mmHg išēmiskas nieres modelī, kuras sānu nieru artērija un vēna bija saspiestas (Hirakawa et al., 2015). Ņemot vērā šos atklājumus, skābekļa sprieguma diapazons uz HIF gredzena, aptuveni 4–20 mmHg, šķita ticams in vivo.

Mēs arī atklājām, ka pH ietekmēja HIF gredzena veidošanos, kā arī skābekļa spriedzi. Tā kā cauruļveida epitēlija šūnas nierēs ir nepārtraukti pakļautas urīna šķidrumam, cauruļveida šūnu pH ir jāietekmē urīna pH. Ņemot vērā plašo pH diapazonu urīnā, mēs nolēmām izpētīt šūnas, kas inkubētas pH diapazonā 5.{1}}–8,5. Ir veikti pētījumi par pH diapazonu normālās nierēs. Vienā pētījumā tika atklāts, ka garozas pH bija 7,39 ± 0.{{10}}8, bet medullas pH bija 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, mērot, izmantojot mikroelektrodus (Burke et al., 1999). Citā pētījumā, izmantojot uz MRI balstītu pH attēlveidošanu, tika uzrādītas pH vērtības attiecīgi 7,3 ± 0,13 un 7.0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). Tika ziņots, ka HNS ar acidozi peles modelī nieru pH pazeminājās no 6,5 līdz 6,32 un līdz pat 5,83 smagā gadījumā (Pavuluri et al., 2019). Šie novērojumi ir pierādījuši pH kritumu un CKD izmaiņas. Tomēr pH ietekme uz HIF-1, ko izraisa hroniska hipoksija HNS, nav pietiekami labi izpētīta. Šajā pētījumā HIF gredzena nobīde tika novērota starp pH 6, 5 un pH 7, 4, pH diapazonu, kas ir ticams CKD. Šis rezultāts apstiprināja hipotēzi, ka neliela pH pazemināšanās ietekmē HIF-1 uzkrāšanos HNS. Pamatojoties uz pierādījumiem par pH pazemināšanos zem 6,0 smagos HNS gadījumos, ir jānovērtē arī HIF-1 fizioloģiskais stāvoklis pie zemāka pH. Lai gan ir saņemti ziņojumi, ka skāba vide pat normoksijas gadījumā stabilizē HIF-1, vairumā šo ziņojumu tika pētīti apstākļi ar vieglu skābumu, kas pārsniedz pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004). . Šajā darbā mēs parādījām HIF-1 uzkrāšanās nomākšanu cauruļveida šūnās pie pH 5,0 un HIF-1 signālu vājināšanos segstikliņu modelī, kas inkubēts pie pH 5,0. Tāpēc nieru pH pazemināšanās HNS in vivo var būt saistīta ar nepietiekamu HIF aktivāciju, kā arī ar urēmiskajiem toksīniem hipoksiskajā nierē, pastiprinot HNS progresēšanu (Tanaka et al., 2013).

Mūsu pētījumam ir vairāki ierobežojumi. Pirmkārt, hipoperfūzijas jomā barotnē papildus skābekļa deficītam un pazeminātam pH jābūt barības vielu deficītam. Tomēr ir grūti noteikt pH, skābekļa spriedzes un citu hipoperfūzijas izraisītu faktoru ietekmi. Organismā orgānos un šūnās rodas išēmija, patoloģiska asins hipoperfūzija, ko izraisa zems skābekļa un barības vielu trūkums. Ir svarīgi saprast atšķirības starp hipoksijas noteikšanu un išēmijas noteikšanu. Neskatoties uz grūtībām noskaidrot katra faktora bioloģisko efektu, mūsu hipoperfūzijas modelis ir fizioloģiski ticams, imitējot patoloģisko stāvokli in vivo . Otrkārt, pārklājuma modeļa izveidošanai ir vajadzīgas prasmes un prakse, jo lielākā daļa šūnu dažkārt atdalījās pārklājuma noņemšanas laikā, it īpaši, izmantojot tradicionālo metodi (S2a attēls). Šī problēma bija atkarīga no izmantotās šūnu līnijas. Piemēram, mums bija grūti uzklāt segstikliņa modeli HEK 293 šūnām, jo ​​to saķere ar segstikliņu bija salīdzinoši vāja. Treškārt, bija vēlams samazināt kultivēto šūnu bojājumus zem pārklājuma. Bojāto šūnu skaits palielinājās, palielinoties periodam, kurā tās tika pārklātas, kā liecina apoptozes analīze. Mēs noteicām, ka 3 stundas bija piemērotas, lai novērtētu HIF gredzenu, kad tas šķita statisks, un aptuveni 10 procenti šūnu kļuva apoptotiski (attēls S11). Ceturtais ierobežojums bija grūtības vienādi piestiprināt kultivētās šūnas pie pārklājuma katrā paraugā (S2b, c attēls). Pētījumu varēja ietekmēt arī atšķirība starp tradicionālo un alternatīvo pārklājuma modeļa izgatavošanas metodi. Mēs izmērījām skābekļa spriedzes diapazonu, kas līdzvērtīgs HIF gredzenam, izmantojot fosforescences mūža metodi, kurā mēs izveidojām pārklājuma modeli, izmantojot tradicionālo metodi. Tā kā HIF gredzens imūncitoķīmijas laikā tika vizualizēts, izmantojot alternatīvu metodi, patiesais skābekļa spriegums var būt atšķirīgs. Mēs samazinājām šīs kļūdas, izmantojot pierādījumus, ka pimonidazols bija pozitīvs, ja skābekļa spriegums bija 10 mmHg vai mazāks. Piektais ierobežojums ir tāds, ka intracelulārais pH ne vienmēr ir tāds pats kā barotnes pH. Vairāki iepriekšējie ziņojumi ir parādījuši, ka intracelulārais pH zināmā mērā atbilst barotnes pH kultivētās šūnās (Michl et al., 2019), mēs varētu novērtēt tikai intracelulārā pH tendenci, mainot barotnes pH. In vivo attiecības starp intracelulāro un ārpusšūnu reģionu, piemēram, urīna vai ķermeņa šķidruma, pH ir sarežģītākas nekā kultivētās šūnās. Tādējādi nākotnē būs nepieciešami turpmāki pētījumi par to, kā pH maiņa regulē HIF-1 proteīna uzkrāšanos in vivo.

Cistanche ieguvums: uzlabot nieresfunkciju

Vēl viens ierobežojums ir tāds, ka pH vajadzētu ietekmēt hipoksijas marķieri, pimonidazolu. Mēs salīdzinājām pimonidazola pozitīvā apgabala malas attālumu no pārklājuma centra dažādos pH apstākļos mūsu pārklājuma modelī. Pimonidazola pozitīvā apgabala mala bija salīdzināma starp pH 6, 5, 7, 4 un 8, 5 (S12a, b attēls). Iepriekšējais pētījums arī parādīja pimonidazola saistīšanās saglabāšanos dažādās pH vērtībās (Kleiter et al., 2006). Pamatojoties uz šiem pierādījumiem, mēs secinājām, ka pimonidazols ir piemērots hipoksijas marķieris mūsu pārklājuma eksperimentiem. Pēdējais ierobežojums ir tāds, ka, ņemot vērā HIF gredzena skābekļa sprieguma diapazonu no aptuveni 4 mmHg līdz 20 mmHg (0,52 procenti O2 līdz 2,6 procenti O2), Pt(II)- un Pd(II)-porfirīni, kurus plaši izmanto kā bioloģiskus. skābekļa zondēm ir priekšrocības ļoti zemas skābekļa koncentrācijas mērīšanai, jo tām ir ievērojami ilgāks fosforescences kalpošanas laiks, salīdzinot ar tiem, kas izmanto Ir (III) kompleksus (Yoshihara et al., 2017). Tomēr kopumā kvantitatīviem skābekļa mērījumiem, kuru pamatā ir fosforescence, kas aprēķināts, izmantojot Sterna-Volmera vienādojumu, ir labāka veiktspēja zemos O2 diapazonos (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Vairāki iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka uz Ir (III) kompleksu balstīta skābekļa spriedzes mērīšana ir līdz aptuveni 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Tāpēc mēs uzskatām, ka HIF gredzena skābekļa sprieguma diapazonam jābūt precīzam rezultātam.

5|SECINĀJUMI

Rezumējot, mēs noskaidrojām, ka izpratne par skābekļa un pH lomu ir būtiska, lai izprastu HIF-1 fizioloģisko stāvokli HNS, un to var iegūt, pētot cauruļveida šūnas ar hipoperfūziju. Nosedzošais stiklu modelis ar tā ierobežojumiem attiecībā uz barotnes pieplūdumu bija labs hipoperfūzijas modelis in vivo, jo īpaši HNS kanāliņos, jo peritubulāro kapilāru retināšana ir galvenā HNS pazīme (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Šis hipoperfūzijas modelis var arī atdarināt skābekļa un pH gradientus in vivo, piemēram, audzējus un išēmiskus bojājumus. Modelis nodrošina daudzsološu pieeju šo bioloģisko mehānismu noskaidrošanai.

INTEREŠU KONFLIKTS

Visiem autoriem nav jādeklarē interešu konflikti.

AUTORU IEGULDĪJUMI

Visi autori piedalījās kopējās koncepcijas veidošanā. TH veica vispārējos eksperimentus. TH un YH analizēja rezultātus un izveidoja skaitļus. TH uzrakstīja oriģinālo manuskriptu. KM, TY un ST veica eksperimentu, izmantojot fosforescences mūža metodi, un rediģēja manuskripta daļu. YH, TT un MN rediģēja kopējo manuskriptu. Visi autori ir izlasījuši un apstiprinājuši galīgo manuskriptu.

ATSAUCES

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir (iii) dzīvu šūnu un acu dibena attēlveidošana uz kompleksu bāzes ar ICCD kameru. Photochemical and Photobiological Sciences, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustats, pārveides un uzturošā terapija anēmijas ārstēšanai hemodialīzes pacientiem: randomizēts, placebo kontrolēts 2.b fāzes pētījums, kam seko ilgtermiņa pētījums. Nephron, 143(2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE un Harris, AL (2002). Žurkas VL30 elementa regulēšana cilvēka krūts vēža šūnās hipoksijas un anoksijas gadījumā: HIF loma-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016). Arilogļūdeņraža receptoru aktivizēšana veicina no hipoksijas izraisītu faktoru atkarīgu eritropoetīna ekspresijas nomākšanu ar indoksilsulfātu. Amerikas fizioloģijas žurnāls. Šūnu fizioloģija, 310(2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D. un Shapiro, JI (1999). Faktori, kas uztur pH gradientu nierēs: asinsvadu arhitektūras loma. Kidney International, 56(5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ un Macip, S. (2014). HIF-1alfa transkripcijas faktora loma palielinātā šūnu dalīšanā pie fizioloģiskas skābekļa spriedzes. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019) ).

Roxadustat anēmijas ārstēšanai pacientiem ar nieru slimību, kas nesaņem dialīzi. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., Viņš, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). 2. fāzes pētījumi par perorālo hipoksijas inducējamā faktora prolilhidroksilāzes inhibitoru FG-4592 anēmijas ārstēšanai Ķīnā. Nefroloģija, dialīze, transplantācija, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoksilsulfāts, reprezentatīvs urēmiskais toksīns, nomāc eritropoetīna veidošanos atkarībā no HIF. Laboratory Investigation, 91(11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H. un Moon, IS (2015). Glikozes-insulīna-kālija šķīdums aizsargā jaundzimušo žurku kambaru miocītus in vitro pārklājuma išēmijas/reperfūzijas modelī. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D. un Macdougall, IC (2017). Jaunas iespējas hroniskas nieru slimības anēmijai. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. skūpsts.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al (2010). Nieru aizsardzība hroniskas nieru slimības gadījumā: hipoksijas izraisīta faktora aktivācija pret angiotenzīna II blokādi. Amerikas fizioloģijas žurnāls. Nieru fizioloģija, 299(6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Acidoze darbojas caur HSP90 neatkarīgi no doktorantūras/VHL, lai veicinātu HIF funkciju un cilmes šūnu uzturēšanu gliomas gadījumā. Cancer Research, 76(19), 5845–5856. VAR-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Akūta un hroniska nieru mazspēja žurkām: funkcionālā kompensācija un hipoksijas tolerance. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013). Kāpēc cukura diabēts ir kontrastvielas izraisītas nefropātijas riska faktors? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018). Nieru garozas intravitālās fosforescences mūža attēlveidošana precīzi mēra nieru hipoksiju. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T. un Nangaku, M. (2017). Nieru hipoksija HNS; Patofizioloģija un noteikšanas metodes. Robežas fizioloģijā, 8, 99.