Jauns, ataksiskas peles ataksijas telangiektāzijas modelis, ko izraisījusi klīniski nozīmīga muļķīga mutācija (2. daļa)

Lai uzzinātu vairāk informācijas, lūdzu sazinietiesdavid.wan@wecistanche.com

3.{1}} Diskusija

Palielinot genotoksisko stresu, pievienojot sekundāru trāpījumu DDR ceļam, mēs izveidojām jaunu peles modeli, kas parāda visplašāko AT simptomu kopumu no jebkura modeļa līdz šim. Tas ietver smagu un progresējošu ataksiju, kas saistīta ar smadzenīšu atrofiju un PN īpašību traucējumiem, kā arī augstu vēža sastopamību un imūno šūnu attīstības defektiem. Kopā šīs blakusslimības ietver trīs galvenos priekšlaicīgas nāves cēloņusAT — katrs sniedz ieguldījumulīdz aptuveni trešdaļai nāves gadījumu. No tiem ataksijas darbnespējas mazinošā ietekme ir visizplatītākā, un pacienti un aprūpētāji ziņo, ka tai ir vislielākā ietekme uz viņu dzīves kvalitāti. Šī iemesla dēļ ataksijas un smadzenīšu atrofijas klātbūtnei šajā jaunajā peles modelī ir liela nozīme, jo tas pirmo reizi nodrošina resursu, lai ne tikai izskaidrotu neiroloģiskās disfunkcijas mehānismus, bet arī ļoti nepieciešams in vivo modelis, lai. pārbaudīt ļoti nepieciešamos AT terapijas līdzekļus, piemēram, nolasāmos savienojumus, kurus mēs šeit aprakstām. Mēs atklājām vairākas līdzības starp kopējo ataksijas progresēšanu Atm3535; Aptx pelēm unAT pacienti. Klīniskajā AT motorikas deficīts ir novērojams aptuveni 2 gadu vecumā, kad vecāki un ārsti konstatē pazeminātu spēju pāriet no mazuļa uz gludiem, refleksīvi koordinētiem vārtiem — diemžēl maz ir zināms par motoriskiem defektiem agrākos slimību dēļ. zema izplatība un pašreizējais agrīnas diagnostikas testu trūkums (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Pacienti parasti iemācās staigāt bez palīdzības, un neiroloģiskie simptomi parasti saglabājas stabili pirmajos 4 līdz 5 dzīves gados (Rothblum-Oviatt et al. 2016). Mēs konstatējām līdzīgu motora deficīta agrīnu progresēšanu Atm735 × R3x; Aptx^' pelēm, kas atklāja agrīnu vieglu motora deficītu pie P8 (iztaisnošanas refleksa deficīts), kam seko relatīvas stabilitātes periods pirms progresējošas un smagas ataksijas, kas attīstās pēc p210, kas ietvēra izmaiņas gājienā, pārsteiguma refleksu, trīci un kustību. aktivitāte. No šiem atklājumiem rodas vairāki svarīgi jautājumi, tostarp tas, vai ATM un/vai APTX ir neiroloģiskās attīstības loma

smadzenītes. Turpmākie pētījumi, kas vērsti uz traucējumu agrīno fāzi, būs ļoti svarīgi, lai saprastu, vai smadzenītes attīstās normāli pirms disfunkcijas vai arī attīstības defekti ir sākotnējais iemesls. Līdzīgi kā AT pacientiem, mēs arī atklājām, ka vēlīnās ataksijas smagums bija mainīgs, dažām pelēm pārvietojoties ar neveikliem, augstiem aizmugures vārtiem (3. video), bet citas gandrīz pilnībā pārvietojās, izliekot aizmugurējo stumbru ( 1. E attēls un 4. video) (Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958). Kopumā mēs atklājām, ka Atm?35 × R35 ×; Aptx pelēm attīstījās vizuāli dziļš un izmērāms progresīvs kustību koordinācijas zudums, kas līdzīgs AT pacientiem novērotajam, ko izglāba vismaz viena Atm vai Aptx get he kopija. Motoriskās koordinācijas zudums AT gadījumā ir saistīts ar smadzenīšu deģenerāciju, ko izraisa tās relatīvi selektīva neiropatoloģija visā smadzenēs un tās cēloņsakarība vairākās dažādās ataksijas formās (Hoche et al.2012). AtbilstošiAT pacientamneiroattēlveidošanas pētījumos (Wallis et al. 2007; Sahama et al. 2015; Sahama et al. 2014; Dineen et al. 2020; Tavani et al. 2003; Quarantelli et al. 2013), mēs atklājam, ka smadzenītes izmērs ir Atm735 × R3 × ; Aptx peles sākotnēji ir normālas, bet pakāpeniski atrofējas vienlaikus ar neiroloģiskās funkcijas izmaiņām. Lai gan smadzenīšu audu zudums tiek uzskatīts par galveno ataksijas cēloni cilvēkiem, no klīniskajiem datiem nav skaidrs, vai ataksijas smaguma pakāpe ir labs pēcnāves smadzeņu deģenerācijas pakāpes prognozētājs (Aguilar et al. 1968b: Crawford et al, 2006). : Dineen et al.2020). Atm?35×R35×; Aptx^ pelēm mēs atklājam skaidru atrofiju, kas saistīta ar Purkinje neironu dendrīta slāņa retināšanu, kas notiek pirms vēlīnā, smaga uzvedības deficīta. Mūsu histoloģiskie novērojumi Atm?35xR35×; Aptx'peles liecina, ka izmaiņas pašā smadzenīšu funkcijā, nevis pamatīgs smadzeņu šūnu zudums, ir pietiekamas, lai izraisītu ataksisko fenotipu, kas atbilst uzvedības defektu novērojumiem pirms nozīmīga PN zuduma vairākos SCA (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al., 2000; Clark et al., 1997; Jayabal et al., 2016). Iemesls, kāpēc ATM un APTX deficīts ir nepieciešams, lai radītu ataksiju pelēm, kad viena vai otra zaudēšana ir pietiekama, lai izraisītu ataksiju cilvēkiem, joprojām nav skaidrs. Viena iespēja ir tāda, ka grauzēju smadzenes var elastīgāk izmantot kompensācijas ceļus vai liekos proteīnus, vienlaikus reaģējot uz 10-20k DNS bojājumiem, kas katru dienu ietekmē šūnas (Lindahl un Barnes 2000). Pastāv vairāki DNS remonta veidi, lai varētu risināt šo izaicinājumu, tostarp bāzes izgriešanas remonts (BER), nukleotīdu izgriešanas remonts (NER),

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par Cistanche

kā arī homologu un nehomologu galu savienošanu (HEJ un NHEJ, attiecīgi), kuros ir iesaistīti ATM un APTX (Chou et al. 2015; Caglayan et al. 2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee un Walker 2017). Alternatīvi, tas var būt Gadījumā, ja tikai ATM vai APTX deficīts pietiekami neietekmē šūnu veselību peles salīdzinoši īsā dzīves laikā, un tādējādi ir nepieciešams likvidēt abus proteīnus, lai panāktu pietiekamu DNS bojājumu uzkrāšanos, kas izpaužas šajā laika periodā. Šo iespēju pastiprina fakts, ka ATM un APTX ir atšķirīgas bioķīmiskās īpašības un funkcionālās lomas DNS bojājumu reakcijā, un tāpēc tiek prognozēts, ka abu deficīts izraisīs plašāku ietekmi uz genoma stabilitāti (ti, palielinātu genotoksisko stresu). Mūsu atklājums, ka ir nepieciešami divi genoma stabilitātes ceļa proteīni, lai izraisītu neiroloģiskus defektus pelēm, liecina, ka smadzeņu defektus izraisa ATM Oriole zudums DNS labošanā, nevis iespējamās funkcijas oksidatīvā stresa signalizācijā, mitofagijā vai mitohondriju funkcijās ( Šilo 2020). Tomēr alternatīvas nevar pilnībā izslēgt, jo APTX, tāpat kā ATM, ir novērots smadzeņu šūnu mitohondrijās, kur tiek uzskatīts, ka tas atbalsta mitohondriju DNS apstrādi (Meagher un Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011). Šis jaunais peles modelis nodrošina jaunu rīku, lai izpētītu šīs iespējas un mehāniski noteiktu, kā ATM un APTX zudums galu galā izraisa smadzenīšu disfunkciju. Biofizikālās perturbācijas, kas novērotas PN, kas reģistrētas no AtmR35XR35X; Aptx peles ir līdzīgi atrodamas vairākos citos ataksijas peles modeļos. Tas ietver izmaiņas, ko novērojām PN ievades pretestībā, membrānas kapacitātē un AP slieksnī un platumā, kas ir aprakstītas arī SCA peles modeļos, piemēram, 1, 3 un 7 (Stoyas et al.2020; Shakkottai et al. 2011; Dell). Orco et al.2015). Turklāt progresīvais PN darbības potenciāla šaušanas biežuma samazinājums, par kuru mēs ziņojam, pozitīvi korelē ar ataksijas attīstību AtrnR35XR35X; Aptx'peles ir ziņots daudzos ataksisko peles modeļos, tostarp SCA 1, 2, 3, 5, 6 un 13, kā arī dažās epizodiskās formās (skatiet pārskatu (Cook, Fields un Watt 2021)). Ņemot vērā ievērojamo PN traucējumu pārklāšanos, kas novērota daudzās dažādās ataksijās, ko izraisa atšķirīgi šūnu defekti, PN AP šaušanas frekvenču atjaunošana tika uzskatīta par plašu terapeitisku pieeju. Tomēr joprojām nav skaidrs, vai samazināta PN izšaušana ir ataksijas cēlonis. Turklāt eksperimentālie pierādījumi liecina, ka izmaiņas PN aktivitātē faktiski var būt vispārēja reakcija uz homeostāzes saglabāšanu pastāvīgu ar slimību saistītu PN fizioloģijas traucējumu laikā (Dell'Orco et al. 2015). Tādējādi ir nepieciešami nepārtraukti centieni visās smadzenīšu ataksijās, lai saistītu slimības izraisītos ģenētiskos, molekulāros un šūnu traucējumus ar specifiskām izmaiņām smadzenīšu nervu signalizācijā, kas galu galā rada ataksiju. Šajos centienos ļoti svarīgi būs noteikt, vai slimību izraisošie smadzenīšu defekti parasti vai atšķirīgi izraisa ataksiju, zaudējot smadzenīšu funkciju (piemēram, koordinācijas signālu zudumu kustības laikā) vai no dominējošas negatīvas ietekmes (piemēram, traucējot pakārtots neironu). shēmas ar neparastiem neironu izvades modeļiem). Galu galā, lai gan kopējai terapeitiskajai stratēģijai smadzenīšu ataksijas novēršanai būtu vislielākā ietekme, mērķtiecīga pieeja, kas risina atšķirīgos šūnu disfunkcijas ģenētiskos un molekulāros cēloņus, galu galā var būt nepieciešama, lai veiksmīgi izstrādātu efektīvu terapeitisko līdzekli. Mehāniskā saikne starp DNS deficītu stabilitātes proteīni, piemēram, ATM un APTX, un PN disfunkcija nebūt nav skaidra. Mūsu rezultāti liecina, ka ATM un APTX zuduma ietekme uz PN ir raksturīga, jo mēs neatrodam izmaiņas granulu šūnu presinaptiskajās īpašībās vai pierādījumus par to šūnu zudumu (nav izmaiņas GCL biezumā). Turklāt, lai gan mēs novērojām atšķirības īstermiņa plastiskumā zemākas olivāru ievades ATM un APTX deficīta PN un savvaļas tipa gadījumā, šie rezultāti, iespējams, norāda uz Ca2* homeostāzes traucējumiem, iespējams, samazinoties inozitola 1,4,5- trifosfāta receptoru 1 (ltpr1) ekspresija, līdzīga tai, kas novērota SCAs 1, 2 un 3 peļu modeļos, kā arī pelēm ar ATM deficītu (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al. al.2011). Lai gan tas ir daudzsološs ceļš turpmākai pārbaudei un salīdzināšanai, pat SCA vēl nav skaidrs, vai Ca²* homeostāzes izmaiņas ir cēloniskais faktors vai tikai vēl viens simptoms vai pat kompensējoša reakcija uz slimiem vai traucētiem PN (Dell). Orco et al.2015). Imūnsistēmā ATM ir iesaistīts DNS pārtraukumu labošanā, kas dabiski rodas antigēnu receptoru gēnu gēnu pārkārtošanās laikā B un T šūnu prekursoros, kas ir būtiska šo šūnu antigēnu receptoru (LG un TCR) daudzveidībai. to atrastT-šūnaproporcijas asinīs ir ievērojami samazinātas, kas atbilst iepriekšējiem pētījumiem ar cilvēkiem un AT nokautām pelēm (Schubert, Reichenbach un Zielen 2002; Hathcock et al. 2013; Chao, Yang un Xu 2000; Barlow et al. 1996). Šī T-šūnu samazināšanās perifērijā, iespējams, korelē ar šūnu un humorālās imunitātes defektu. Svarīgi, ka mēs atklājām, ka ar vienas ATM gēna kopijas ekspresiju pietiek, lai atjaunotu CD4 plus deficītu asinīs, norādot, ka terapijai, kas spēj atjaunot daļēju ATM ekspresiju, būtu terapeitiska efektivitāte. Lai gan šajā rakstā mēs neesam novērtējuši B-šūnu attīstību, iespējams, ka līdzīgi secinājumi attiektos uz šo procesu, ņemot vērā to mehāniskās līdzības (Marshall et al. 2018). Kā gaidīts, T-šūnu samazināšanās perifērajās asinīs ir saistīta ar nepilnīgu timocītu attīstību. Aizkrūts dziedzerī mēs atklājām divus galvenos defektus. Viens, ko galvenokārt izraisa APTX deficīts, izpaužas kā DN3 pārejas uz DN4 defekts, kas sakrīt ar TCR lokusa agrīnu pārkārtošanos. Otrs defekts, ko galvenokārt izraisa ATM deficīts, korelē ar divkārši pozitīvu CD4 * CD8 progresēšanas samazināšanos uz vienu pozitīvām šūnām, galvenokārt CD4' timocītiem. Lai gan APTX atradums bija pārsteidzošs, jo tā deficīts (AOA 1) nav saistīts ar imūndeficītu, ir zināms, ka APTX mijiedarbojas ar TCR gēnu pārkārtošanās proteīniem, tostarp XRCC4 (Clements et al. 2004). Turpmākie pētījumi, kuru mērķis ir noteikt APTX lomu gala savienošanas mehānismos TCR gēnu pārkārtošanās laikā, būs

ir svarīgi, un iespēja, ka alternatīvi gala savienošanas mehānismi, piemēram, mikrohomoloģiju izmantošana, izraisa imūndeficīta trūkumu, ja tā nav, ir nepieciešama turpmāka izpēte (Bogue et al. 1997). Atm35×/R35× izdzīvošanas spēja; Aptx'peles ir ievērojami garākas nekā iepriekšējie AT peles modeļi. Salīdzinājumam, pirmaisAT KOpeles modelis, par kuru ziņo Bārlovs et al. nomira no timomas parasti 2-4 mēnešu laikā pēc dzimšanas (Barlow et al. 1996). Samazināta vēža izdzīvotība šajā un daudzos citos AT peles modeļos, kas izslēdzas, visticamāk, ir ģenētiska, jo ir pierādīts, ka fona celmam, kas satur mutāciju, ir būtiska ietekme uz vēža izplatību un izdzīvošanu ar A/J un C57BL/6.

foni, kuriem ir ievērojami palielināta izdzīvošana salīdzinājumā ar BALBC un 129S celmiem (Genik et al. 2014). Iespējams, ka pamatā ir fakts, ka mūsu peles ar ATM deficītu tika izveidotas uz C57BL/6 fona; ka Aptx*t pelēm neattīstās ataksija, tas ir to salīdzinoši ilgs mūžs. Ņemot vērā, ka Atm35xR35×; maz ticams, ka agrīna nāve AT KO pelēm neļauj novērot ataksisku fenotipu, kas citādi attīstītos šajās pelēs. Tomēr nav zināms, vai C57BL/6 fons nodrošina noturību pret ataksijas attīstību, kā tas ir vēža gadījumā. Ģenētisko vai, iespējams, epiģenētisko faktoru noteikšana, kas ietekmē slimības smagumu, varētu nodrošināt turpmākās terapeitiskās attīstības iespējas. Ņemot vērā ATM un APTX nulles mutācijas globālo raksturu mūsu peles modelī, mēs nevaram pilnībā izslēgt, ka ārpussmadzenīšu defekti var veicināt arī smagu ataksisko fenotipu un tādējādi turpmāko izmeklēšanu ārpus smadzenītēm priekšsmadzenēs, smadzeņu stumbrā, muguras smadzenēs. , un būs jāvada pat muskuļi. Smadzenēs, lai gan mēs atklājām dažas anatomiskas atšķirības PN šaušanas īpašībās dažādos smadzenīšu reģionos, mēs nekonstatējām reģionālas atšķirības ML platumā vai PN blīvumā. Tomēr ir problēmas, izmantojot reģionālo anatomiju kā grupēšanas faktoru smadzenītēs, jo audu fiziskās krokas ne vienmēr korelē ar aprakstītajām funkcionālās, molekulārās ekspresijas vai fizioloģisko īpašību domēnu robežām (Apps un Hawkes 2009). Tsutsumi et al. 2015; Gao, van Beugen un De Zeeuw 2012; Zhou et al. 2014). Eksperimenti, kas vērsti uz smadzeņu defektu izplatības pārbaudi šajās jomās, būs svarīgi turpmākajos pētījumos un salīdzinājumā ar anekdotiskiem ziņojumiem par anatomiskām atšķirībām AT pacientiem (Verhagen et al.2012; De Leon, Grover un Huff 1976; Amromin, Boder, un Teplitz 1979; Monaco et al. 1988; Terplan un Krauss 1969; Strich 1966; Solitare 1968; Solitare un Lopez 1967; Aguilar et al. 1968a; Paula-Barbosa et al. 1983). Kamēr mēs atklājam divus iespējamos ataksijas progresēšanas posmus Atm735wR35x; Aptx pelēm smagas ataksijas vēlākā stadija pelēm attīstās pieaugušā vecumā, salīdzinot ar bērnības sākumu cilvēkiem. Tas var ierobežot tā izmantošanu dažos neiroloģiskās attīstības pētījumos. Arī turpmāko eksperimentu interpretācijā rūpīgi jāņem vērā fakts, ka šis jaunais modelis vienlaikus izsaka nulles mutācijas divos genoma stabilitātes gēnos, kas nav konstatēta cilvēkiem ar AT vai AOA1. Visbeidzot, precīzi noteikt, kur, kad un kā ATM deficīts izraisa smadzenīšu patoloģiju un ataksiju, ir bijis izaicinājums, jo iepriekšējām ATM deficīta pelēm parasti trūkst raksturīgo pazīmju, kas nepieciešamas, lai saistītu šūnu un molekulāro deficītu ar ataksisko fenotipu. Ir noteikti vairāki daudzsološi izmeklēšanas ceļi, tostarp tie, kas vērsti uz neironu līmeni, kur ATM ir saistīts ar oksidatīvā stresa signalizāciju (Chen et al. 2003) un sinaptisko funkciju (Li et al. 2009; Vail et al. 2016), kā kā arī glia funkcija, kur jaunākie pierādījumi liecina, ka glia patoloģija var būt galvenais faktors smadzenīšu patoloģijā (Kaminsky et al. 2016; Campbell et al. 2016; Petersen, Rimkus un Wassarman 2012; Weyemi et al. 2015). Šis jaunais dzīvnieku modelis nodrošina jaunu rīku, lai pārbaudītu mehāniskās hipotēzes par to, kā ATM deficīts izraisa smadzenīšu patoloģiju un ataksiju. Turklāt šis modelis var būt vissvarīgākais, lai pārbaudītu iepriekš piedāvātos terapeitiskos kandidātus (Browne et al. 2004; Chen et al. 2003) un mūsu pašu SMRT savienojumus (Du et al. 2013). Nevar pārvērtēt nopietnos ierobežojumus, kas saistīti ar to, ka nav piemērota preklīniskā modeļa terapeitiskai pārbaudei, jo īpaši attiecībā uz retiem traucējumiem, piemēram, AT un AOA1.

4.0 Materiāli un metodes

4.1. Ētikas paziņojums

Šis pētījums tika veikts stingri saskaņā ar ieteikumiem Nacionālo veselības institūtu laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatā. Visi dzīvnieki tika apstrādāti saskaņā ar apstiprinātajiem Institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas (IACUC) protokoliem Lundkvista institūtā (31374-03,31773-02) un UCLA (ARC-2007-082, ARC{{3}). }). Protokolu apstiprināja Lundkvista institūta Eksperimentu ar dzīvniekiem ētikas komiteja (pārliecības numurs: D16-00213). Tika pieliktas visas pūles, lai mazinātu sāpes un ciešanas, vajadzības gadījumā sniedzot atbalstu un izvēloties ētiskus parametrus.

4.2 Peles

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>T mutācija konstatēta lielā Ziemeļāfrikas populācijāATpacientiem using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), kas atkārto cilvēka AT PTC). Pēc tam genoma alēles tika klonētas pārveidotā NorCOMM zīdītāju mērķauditorijas vektora versijā, izmantojot 3-way Gateway Reaction (Bradley et al. 2012). Iegūtie mērķvektori tika elektroporēti C2 ES šūnās (C57BI/6N, iegūti A. Nagy laboratorijā, Toronto, Kanādā), un veiksmīgi mērķtiecīgi kloni tika identificēti, atlasot ar G418 (Gertsenstein et al.2010). Mutācijas mērķēšanas kasetes integrācija Atm gēna lokusā tika apstiprināta ar Southern blot un PCR produktu sekvencēšanu, lai apstiprinātu Atm PTC mutācijas klātbūtni, bezkļūdu mērķēšanu uz Atm lokusu un bezkļūdām funkcionālos komponentus.

vektors (dati nav parādīti). Pozitīvie ES kloni tika izmantoti blastocistu injekcijai, lai iegūtu transgēnās līnijas. Transgēnā alēle saturēja cilvēka beta-aktīna promotoru-deltaTK1-Neo cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(Fig.1A). Abu Atm līniju genotipēšana tika veikta, izmantojot šādus primerus Tm 62 grādu pakāpē: Atm gēna priekšējais (F) primer:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; un Atm gēnu reversais(R)primer: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', radot savvaļas tipa alēles produktu ar 151 bp vai mērķa alēles produktu ar 241 bp (1.A, 1.B att.). Atmn35~ un Atm035×v bija pirms kriokonservēšanas un sekojošas atkārtotas iegūšanas, izmantojot C57BI/6J surogātmātes, 9 paaudzēs krustoja ar C57Bl/6J pelēm (99,2% izogēnas). Atm735× un Atm?35x un Atm 35×/Q35× bija audzētāji, kas iegūti no F1 brāļiem Atm35 un Atm835X plus pelēm. AtmR35 × k35 ×: abi tika atzīti par auglīgiem. Aptx knockout (Aptx) peles tika izveidotas un piegādātas Dr. Mathews kā embriji no Dr. McKinnon (Ahel et al.2006), un pēc tam tika atkārtoti iegūtas, izmantojot C57Bl/6J surogātmātes. Aptx peles ir uz C57Bl/6 un 129 jaukta fona. Atm35k35; No Atm35X tika izveidotas dažādu savvaļas tipa, heterozigotu un homozigotu kombināciju Aptx peles; Aptxt audzētāji tika radīti, krustojot Atm?35 × R35 un Aptx^ peles. Viena dubultmutantu un atbilstošo kontroles peļu grupa tika izmantota garengriezuma uzvedības pētījumā gaitas analīzei un SHERPA testēšanai (2., 3. att.). Elektrofizioloģiskajos, imūnhistoloģiskajos un vertikālā pola testa eksperimentos tika izmantotas vairākas papildu vecuma grupās atbilstošās dubultmutācijas un kontroles peles (4., 7. att.). Imunoloģiskie un proteīna ekspresijas eksperimenti tika veikti, izmantojot pelēm, kas audzētas no sākotnējām AtmR35× un Atm35× atvasinātajām pelēm (5., 6. un 8. att.). Genotipēšana tika veikta no P8-11 peļu ausu audu paraugiem. Katra dzīvnieka genotipa noteikšanai tika izmantotas reāllaika PCR metodes, ko veica Transnetyx Inc.. Dzīvnieki tika identificēti, izmantojot pirkstu tetovējumus, kas tika veikti vienlaikus ar auss biopsiju. Unikālie Atm35 × un Atm35 × praimeri tika kvantificēti un izmantoti, lai identificētu savvaļas tipa, heterozigotas un homozigotas peles (uzskaitītas iepriekš). Aptx'un Aptx*" praimeri tika izmantoti, lai novērtētu to genotipus.

4.3. Dzīvnieku veselība

Dzīvnieki tika nosvērti, izmantojot digitālos svarus P8, 45, 120 210 400. Dzīvnieka nāve tika reģistrēta kā diena, kad dzīvnieki tika atrasti miruši, vai eitanāzijas diena, kad dzīvnieki sasniedza humānu galarezultātu (dzīvnieks nespēj atgūties 60. gados, ievērojams matu matējums, kas liecina par sevis kopšanas trūkumu vai pārmērīgu diskomfortu, kā atzīmēja veterinārārsts personāls). Dzīvnieku līķi tūlīt pēc nāves tika sasaldēti, un pēcnāves sekcijas tika veiktas partijās. Iespējamais nāves cēlonis tika noteikts mūsu iespēju robežās sadarbībā ar personāla veterinārārsti (Dr. Catalina Guerra), vizuāli pārbaudot iekšējos orgānus. Dažas peles vivārija darbinieki kanibalizēja vai nejauši iznīcināja

tāpēc tika apzīmētas kā "pazudis".Peles, kurām nebija redzama vizuāla nāves iemesla, tika apzīmētas ar "nenoteiktu".Peles, kurām tika atrastas krūšu masas tuvu vietai, kur jaunām pelēm parasti būtu aizkrūts dziedzeris, tika uzskaitītas kā "aizkrūts dziedzera vēzis". iespējamie nāves cēloņi (piemēram, palielinātas aknas, urīnceļu aizsprostojums) tika apzīmēti kā "citi".

4.4. Uzvedība

Pirms jebkura uzvedības testa veikšanas peles tika aklimatizētas uz uzvedības komplektu ~ 20 minūtes. Peles tika pārbaudītas dažādos dienas laikos atbilstoši to ikdienas ciklam. Uzvedības testu komplekts tika veikts ar naivām dubultu mutantu pelēm ar norādītajiem genotipiem dažādos laika punktos atkarībā no uzvedības, bet tajā pašā peļu grupā. Testu komplekts ietvēra Catwalk Gait novērtējumu (P45, 120,210, 400) un SmithKline-Beecham Harwell Imperial-College un Royal-London-Hospital fenotipa novērtējuma (SHERPA) testu apakškopu (P30 un 400). Šos testus veica UCLA Behavioral Core. Divkāršās mutācijas un kontroles peles tika papildus pārbaudītas vertikālā pola testā. Visi uzvedības aparāti tika noslaucīti ar etanolu (70 procenti) starp katru testa subjektu.

Gaitas analīze

Mēs izmantojām Noldus Catwalk Gait analīzes sistēmu, kas paredzēta, lai pusautomātiski izmērītu un analizētu peļu gaitu parastās pārvietošanās laikā. Īsumā, peļu kustība pa stikla dibena koridoru ir video, kas ierakstīts no centrālās pozīcijas. Ķepu nospiedumi videoklipā ir izcelti gaismas apgaismojuma dēļ pāri stikla pastaigu platformai. Katrs video peles solis pēc tam tiek atklāts, izmantojot Catwalk XT (Noldus) pusautomātiskā veidā. Katras peles palaišana sastāv no 3 konsekventas pārvietošanās izmēģinājumiem pa uzraudzīto platformu. Tiek pieņemti tikai konsekventi izmēģinājumi, un pelēm var būt līdz 10 mēģinājumiem, lai pabeigtu 3 saderīgus izmēģinājumus abos virzienos visā koridorā. Atbilstoši izmēģinājumi tika definēti kā tādi, kuru pārvietošanās pa platformu nepārsniedz 5 s un ar ātruma svārstībām ne vairāk kā 60%. Kad peles tika novietotas uz platformas, tās parasti skraidīja uz priekšu un atpakaļ bez eksperimentētāja pamudināšanas.

Vertikālais pols

Peles novieto 80 cm garas skrūves augšpusē ar degunu uz leju un pakaļējās ķepas pēc iespējas tuvāk augšai. Peles tiek nekavējoties atbrīvotas, un laiks sākās tūlīt pēc ievietošanas.

Laiks tiek apturēts, kad pirmā priekšķepa pieskaras virsmai zem staba. Peles dabiskā vēlme ir nekavējoties kāpt lejā pa stabu, un tās tiek dotas līdz 60 sekundēm, lai šķērsotu stabu, pretējā gadījumā tās tiek palīdzētas nokāpt no staba. Nepabeigtam izmēģinājumam automātiski tiek piešķirts laiks 30 s, jo 95 procenti peļu, kas nenolaidās 30 s laikā, joprojām atradās uz staba pie 60. gadu atzīmes. SHIRPA uzvedības testus veica Kalifornijas Universitātes Losandželosas uzvedības kodols P30.

un P400. Visi parametri tiek vērtēti, lai nodrošinātu kvantitatīvu novērtējumu. kas ļauj salīdzināt rezultātus gan laika gaitā, gan starp dažādām laboratorijām. Katra pele tika secīgi pārbaudīta visās darbībās ~20-min laika posmā, pirms pāriet uz nākamo peli. Eksperimentētājs bija akls pret dzīvnieku genotipu. Ekrāns tika veikts, kā aprakstīts iepriekš (Rogers et al. 1997).

Uzvedības novērošana

Primārais ekrāns nodrošina uzvedības novērošanas profilu, un katra dzīvnieka novērtējums sākas, novērojot netraucētu uzvedību skatīšanās burkā (diametrs 10 cm) 5 minūtes. Papildus novērtētajai ķermeņa stāvokļa, spontānās aktivitātes, elpošanas ātruma un trīces uzvedībai novērotājs reģistrē visus dīvainas vai stereotipiskas uzvedības un krampju, piespiedu laizīšanas, pašiznīcinošu košanu un retropulsiju (staigāšanu atpakaļ) un telpiskas pazīmes. dezorientācija.

Arēnas uzvedība

Pēc tam peli tiek pārvietota uz arēnu (30 cm x 50 cm), lai pārbaudītu pārneses uzbudinājumu un novērotu normālu uzvedību. Arēna ir iezīmēta 10 x 10 cm² kvadrātu režģī, lai izmērītu kustību aktivitāti 30 s periodā. Kamēr pele ir aktīva arēnā, tiek reģistrēti pārsteiguma reakcijas rādītāji, gaita, iegurņa pacēlums un astes pacēlums.

Atturība guļus stāvoklī

Dzīvnieks ir savaldīts guļus stāvoklī, lai reģistrētu autonomo uzvedību. Šī novērtējuma laikā tika novērtēts saķeres spēks, ķermeņa tonuss, virsotnes reflekss, radzenes reflekss, pirksta saspiešana, stieples manevrs un sirdsdarbība.

Līdzsvars un orientācija

Visbeidzot, tika veikti vairāki vestibulārās sistēmas funkcijas mērījumi. Tika veiktas iztaisnošanas refleksa, kontakta iztaisnošanas refleksa un negatīvas ģeotakses pārbaudes. Šīs procedūras laikā tika reģistrēta vokalizācija, urinēšana un vispārējas bailes, aizkaitināmība vai agresija.

Lietots aprīkojums

1.Clear Plexiglas arēna (aptuveni iekšējie izmēri 55x33 x18 cm). Uz arēnas grīdas atrodas plexiglas loksne, kas marķēta ar 15 kvadrātiem (11 cm). Stingra horizontāla stieple (3 mm diametrā) ir nostiprināta pāri aizmugurējam labajā stūrī tā, lai dzīvnieki nevarētu pieskarties sāniem stieples manevra laikā. Visā kastes platumā ir nostiprināts režģis (40x 20 cm) ar 12 mm sietu (aptuveni), lai izmērītu astes balstiekārtu un saķeres izturību. 2. Kā skatīšanās burka tika izmantots caurspīdīgs plexiglas cilindrs (15 x ll cm). 3. Viena režģa grīda (40x 20 cm) ar 12 mm sietiem, uz kuriem atrodas skatīšanās burkas.4. Četri cilindriski nerūsējošā tērauda balsti (3 cm garums x 2,5 cm diametrs), lai paceltu režģus no sola. 5. Viena kvadrātveida (13 cm) nerūsējošā tērauda plāksne dzīvnieku pārvietošanai uz arēnu. 6. Grieziet garumu 3/0 Mersilk, kas turēts knaibles radzenes un smailes refleksu testiem 7. Plastmasas dībeļa stienis tika uzasināts līdz zīmuļa galam, lai pārbaudītu siekalošanos un košanu.8. Preparēšanas aprīkojuma knaibles, izliektas ar smalkiem galiem (125 mm knaibles, Philip Harris Scientific, kat. Nr. D46-174) pirksta saspiešanai. 9.Hronometrs.10. IHR Click lodziņš tiek izmantots, lai pārbaudītu satriecošās atbildes. Click Box ģenerē īsu 20 kHz signālu ar 90 dB SPL, turot 30 cm virs peles. Sazinieties ar prof. KP Steel, MRC Dzirdes izpētes institūtu, University Park, Notingemas NG7 2RD. 11.Lineāls.12.30 cm caurspīdīga plexiglas caurule ar iekšējo diametru 2,5 cm kontakta iztaisnošanas refleksam.4.5 Elektrofizioloģija Akūtas smadzenīšu šķēles sagatavošana No eksperimentālās un kontroles littermate peļu smadzenītēm tika sagatavotas jaukas parasagitālas šķēles 300 μm biezumā. izmantojot publicētās metodes (Hansen et al., 2013). Īsumā, smadzenītes tika ātri izņemtas un iegremdētas ledusaukstā ekstracelulārā šķīdumā ar sastāvu (mM): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 glikoze, 2,5 KCl, 2,5 CaCla, 1,3 MgCla un 1 NaHzPOa, pH 7,4, kad gāzēts ar 5 procentiem CO-/95 procentiem O2. Smadzenītes tika sadalītas parasagitāli, izmantojot vibratomu (Leica VT-100, Leica Biosystems, Nusloha, Vācija), un sākotnēji inkubēja 35 grādu temperatūrā -30 min., pēc tam līdzsvaroja un uzglabāja istabas temperatūrā līdz lietošanai. Ekstracelulārā elektrofizioloģija Ekstracelulāri un intracelulāri ieraksti tika iegūti no Purkinje neironiem (PN) šķēlēs, kas pastāvīgi tika perfūzētas ar ogļhidrātu burbuļotu ekstracelulāru šķīdumu un uzturētas vai nu 37 ° C (ārpusšūnu) vai 32 ° C (intracelulārā) ± 1 grāda (skatīt iepriekš). Šūnas tika vizualizētas ar DIC optiku un ūdens iegremdēšanas 40 × objektīvu (NA 0, 75), izmantojot Zeiss Examiner mikroskopu. Stikla pipetes ar ~3 MQ pretestību (modelis P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) tika piepildītas ar ārpusšūnu šķīdumu un novietotas netālu no PN aksonu pakalniem, lai izmērītu ar darbības potenciālu saistītos kapacitatīvās strāvas pārejas sprieguma skavas režīmā. ar pipetes potenciālu 0 mV. Pilnu šūnu plākstera skavām ierakstīšanai pipetes tika piepildītas ar intracelulāru šķīdumu (mM): 140 mēneši (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2, 0,2 CaClz, 10 HEPES, 14 fosfokreatīns (tris sāls), 1 EGTA, 4 Mg -ATP,0,4 Na-GTP.100 μM pikrotoksīns (Sigma) tika pievienots, lai bloķētu inhibējošās GABAegeric sinaptiskās ievades. Dati iegūti, izmantojot

MultiClamp 700B pastiprinātājs ar frekvenci 20 vai 100 kHz sprieguma vai strāvas skavas režīmā, Digidata 1440 ar pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) un filtrēts ar frekvenci 2–4 kHz. Sērijas pretestība parasti bija no 10 līdz 15 MQ. Sērijas pretestība tika kompensēta par 80 procentiem tikai īstermiņa plastiskuma eksperimentiem. Ekstracelulāriem ierakstiem no katra dzīvnieka tika reģistrēti kopumā 20 līdz 45 PN visos genotipos, dzimumos un vecuma grupās. Ieraksti tika izplatīti gan pa smadzeņu mediālo-sānu, gan rostrokaudālo asi. Tika pārbaudītas tikai šūnas ar "veselīgu" izskatu (zems šūnu robežu kontrasts) un regulāru, nepārtrauktu šaušanas ātrumu. Analīzes laikā tika konstatēts, ka dažās šūnās ir pārtraukumi, kas pārsniedz 2 sekundes, un šīs šūnas tika izslēgtas no analīzes, jo šāda veida izšaušana ir saistīta ar "neveselīgu". parādīšanās DIC mikroskopijā pirms ierakstīšanas, kā arī "neveselīgo" šūnu skaits nebija lielāks nekā citu genotipu skaits (7 procenti pret 4 līdz 11 procentiem no visām šūnām kontroles genotipos pie P400). Neironu aktivitātes telpiskais salīdzinājums tika iegūts, ierakstot no sērijveida sekcijām flokula, sānu (2"d vai 3'), starpposma (6" vai 7.) un mediālās (11" vai 12t) šķēlēs. jaunākās vecuma grupas (P45 un 110), lai aptuveni atbilstu ierakstu relatīvajam izvietojumam dažādās vecuma grupās. 0-3 tika veikti ieraksti no katras daivas katrā šķēlītē atkarībā no audu kvalitātes un veselības. Katrs ieraksts ilga {{29} Katrai vecuma grupai tika izmantotas 3 līdz 5 peles, un eksperimentētājs tika akls attiecībā uz genotipu, vecumu un dzimumu.

Intracelulārie ieraksti tika iegūti no PN mediālās smadzenītes IIl vai VIl daivā (ti, vermis); starp lobulām netika novērotas statistiskas īpašību atšķirības.

Analīzes

Spontāni darbības potenciāla interstimulu intervāli tika atklāti un analizēti, izmantojot standarta un pielāgotas rutīnas programmās ClampFit (Molecular Device), GoPro (Wavemetrics) un Excel (Microsoft). Konkrētāk, darbības potenciāls tika noteikts slieksni, un pieaugošā statistika (ti, biežums un intervāla garums) tika noteikta, izmantojot pielāgotas lgorProroutines (TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/). Vidējā starpsmailes intervāla (CV) un vidējā starpsmailes intervāla (CV2=2 ISIn plus 1-ISInl/(ISIn plus 1 plus ISIn)) variācijas koeficients tika aprēķināts programmā Excel, izmantojot pielāgoti makro. Standarta membrānas īpašības tika analizētas, izmantojot lgorPro. RM tika noteikts, vidēji aprēķinot 3 sprieguma izsekošanas reakcijas uz -5 mV soli impulsu no -80 mV aizturēšanas potenciāla un izmērot iegūto strāvas novirzi starp 900 un 1000 ms pēc sākuma. Membrānas laika konstante tika mērīta, uzstādot vienu eksponenciālu sākotnējai sabrukšanas fāzei no 90 procentiem līdz 10 procentiem no maksimuma. CM tika aprēķināts, dalot membrānas laika konstanti ar RM.sEPSC notikumiem, kas tika reģistrēti 1-minūtes laikā un tika atklāti un izmērīti, izmantojot Neuroexpress (v21.1.13). Paralēli un kāpšanas šķiedru aksoni tika stimulēti, izmantojot teta stikla elektrodus (WPI) un ar TTL kontrolētu stimulēšanas izolatoru (ISO-Flex, AMPI). Izsauktās EPSC amplitūdas un samazināšanās laika konstantes (1 eksp. paralēlām un 2 exp. kāpšanas šķiedrām) tika analizētas, izmantojot pielāgotas rutīnas programmā lgorPro. Darbības potenciāli tika pārbaudīti kā daļa no 1 s strāvas injekcijas komplekta starp -500 un 2250 pA (250 pA soļi) ar turēšanas strāvu, kas tika pielāgota, lai uzturētu ~ 70 mV potenciālu. Darbības potenciāla viļņu formas tika mērītas, izmantojot pielāgotu

rutīnas programmā lgorPro. Darbības potenciāla slieksnis tika definēts kā pirmais membrānas spriegums, kurā pirmais atvasinājums pārsniedza 30 mV/ms (Zhu et al.2006).

4.6. Smadzeņu atrofijas pārbaude

Smadzenīšu izmērs Tūlīt pēc smadzeņu izņemšanas no galvaskausa tika iegūts dorsāls, visa stiprinājuma attēls. Pēc tam attēli tika apstrādāti, izmantojot Fidži (NIH). Priekšējo smadzeņu un smadzenīšu izmēri tika novērtēti, iezīmējot to 2-dimensiju telpu un pēc tam aprēķinot laukumu. Mēs normalizējām iespējamās vispārējā smadzeņu lieluma atšķirības, dalot smadzenīšu rezultātus ar priekšējo smadzeņu izmēru, lai iegūtu relatīvu smadzenīšu un priekšējo smadzeņu attiecību. Eksperimentētāji bija akli pret dzīvnieka genotipu. Imūnhistoķīmija Attiecīgajos pētījuma galapunktos (P45, 120,210,4{{7{{104}}}}0) visu genotipu peļu tēviņi un mātītes Šajā pētījumā pārstāvētā tika anestēzēta ar izoflurānu un tika veikta transkardiāla perfūzija ar fosfātu buferšķīdumu, kam sekoja 4% (w/v) buferēta paraformaldehīda (PFA), un pēc tam tika sadalīta, lai ekstrahētu smadzenes. Visu smadzeņu attēli tika uzņemti uzreiz pēc smadzeņu izņemšanas no galvaskausa, un pēc tam smadzenes 24 stundas iegremdēja 4% PFA un pēc tam 72 stundas tika aizsargātas ar krioaizsardzību Tris buferšķīdumā (TBS) ar 0,05% azīda un 30% saharozes. stundas un uzglabāt 4 grādos līdz turpmākai lietošanai. Smadzenītes tika atdalītas no priekšējām smadzenēm un parasagitālās sekcijas, izmantojot bīdāmu mikrotomu (Microm HM 430, Thermo Scientific), kas iestatīts uz sekciju 40 μm biezumā. Smadzenīšu sekcijas tika savāktas pa sešām un uzglabātas TBS-AF (TBS ar 30% saharozes, 0,05% nātrija azīda un 30% etilēnglikola) 4 grādu vai -20 grādu temperatūrā līdz turpmākai lietošanai. Purkinje neironu, abu Atm* smadzenīšu sekciju imunofluorescējošai vizualizācijai; Aptx*t un Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 katram genotipam) trīs reizes mazgāja 5 minūtes TBS un pēc tam 30 minūtes bloķēja 15% normālā kazas serumā istabas temperatūrā, kam sekoja brīvi peldoša inkubācija truša vai peles antikalbindīna D. -28k (1:1000) 1 stundu istabas temperatūrā uz orbitālā kratītāja. Pēc tam sekcijas trīs reizes mazgāja 5 minūtes ar TBS, kam sekoja brīvi peldoša inkubācija kazu prettrušu vai peles Alexa Fluor 488 (1:1000) 1 stundu tumsā istabas temperatūrā uz orbitālā kratītāja. Pēc sekundārās antivielu inkubācijas sekcijas trīs reizes 5 minūtes mazgāja TBS, pēc tam uzmontēja un pārklāja ar Fluoromount-G ar DAPI. Dažām sekcijām anti-šķeltās Caspase-3(1:200) un anti-CD68(1:400) antivielas tika papildus pārbaudītas paralēli Calbindin, izmantojot Alexa Fluor 647 (1:500) sekundāro antivielu. Priekšmetstikliņi tika skenēti, izmantojot Stereo Investigator (MBF Bioscience, versija 2020) Zeiss mikroskopā, kas aprīkots ar ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2), izmantojot 2,5, 10, 20, 40 vai 63x objektīvu un attēlus. uzņemts ar Hamamatsu CMOS kameru (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus ). Lai aprēķinātu ar kalbindīnu reaģējošo šūnu skaitu katrā daiviņā iegūtajos attēlos, mēs izmantojām Stereo Investigator, lai nejauši uzzīmētu 2 līnijas, kuru garums ir no 300 līdz 500 μm. katru daivu un manuāli saskaitīja kopējo PN skaitu audu šķēles garumā 40 um biezumā ar 40x palielinājumu. Pēc tam tika noteikts divu paraugu 2D blīvums (PN skaits/(lineārais garums* 40 um biezums)). vidējais rādītājs turpmākam lobulu un dzīvnieku salīdzinājumam. Kalbindīna pozitīvais PN dendrīta platums tika mērīts iepriekš noteiktā vietā VI daivā no katra dzīvnieka 25 vai 40 um biezās audu daļās ar 20x palielinājumu. Primāro un sekundāro zaru dendrītiskie platumi tika mērīti viduslīnijā starp PN šūnu ķermeņiem un molekulārā slāņa malu. Katrā sekcijā tika izmērīti no 7 līdz 13 dendritiem, viena sekcija katram dzīvniekam. PN somatiskajiem mērījumiem tika izmantots Stereo Investigator, lai nejauši atlasītu PN, kas sadalīti visā mediālajā daļā ar 20x palielinājumu. Vidējais PN platums vienam dzīvniekam tika noteikts, aprēķinot vidējos rezultātus 3 sērijveida sekcijās (16 līdz 37 PN katrā sekcijā). PN platumi tika mērīti perpendikulāri PN slānim vai izejošajam dendrītam, ja tas bija šķībs par vairāk nekā dažiem grādiem. Molekulārā slāņa un granulu šūnu slāņa (attiecīgi vizualizēti ar Calbindin un DAPI traipiem) platumi tika novērtēti programmā Stereo Investigator, vidēji nosakot divus platuma mērījumus iepriekš noteiktās vietās katrai daivai, aptuveni pusceļā kopā ar katras daivas garumu ar 2,5x palielinājumu. CD68 pozitivitāte smadzenīšu sekcijās tika kvantitatīvi noteikta, izmērot kopējo CD68 laukumu procentuālo daudzumu plus pozitīvo krāsojumu visā mediālajā smadzeņu sekcijā. 10x sašūtu attēlu slieksnis tika ierobežots līdz negatīvajai kontrolei un kvantificēts, izmantojot ImageJ, viena sadaļa katram dzīvniekam. Lai kvantitatīvi noteiktu to Kalbindīna pozitīvo PN procentuālo daudzumu, kas bija pozitīvi attiecībā uz šķelto kaspāzi-3, mēs saskaitījām PN visā smadzenītē, izmantojot Stereo Investigator. Katram dzīvniekam tika pārbaudīti trīs, 20x palielinājuma šūti attēli, un rezultāti tika aprēķināti vidēji. Kaspāzes -3 pozitivitātes slieksnis tika noteikts kontroles sekcijās, kas iekrāsotas tikai ar sekundārajām antivielām. Lai veiktu nefluorescējošu histoloģisku analīzi, 25-mm biezas, brīvi peldošas audu daļas uz pozitīvi lādētiem priekšmetstikliņiem un nakti žāvē gaisā. Audus mazgā ar fosfātu buferšķīdumā (PBS) divas reizes 5 minūtes, pēc tam secīgi krāsoja ar 0,1% hematoksilīnu 95% etanolā apmēram 25 sekundes un 0,5% eozīnu 95% etanolā apmēram 3 sekundes un pēc tam mazgāja divreiz destilētā ūdenī. katrs traips. Pēc tam audus 1 minūti dehidrēja 95% etanola, 100% etanola un 100% ksilola mazgāšanas šķīdumā, pēc tam pārklāja ar Permount. Slaidi tika attēloti, izmantojot krāsu kameru (Q Imaging, MBF Biosciences) tajā pašā Zeiss mikroskopā un MBF iegūšanas programmatūru. Eksperimentētāji tika akli pret peles genotipu, kurā tika pārbaudītas sekcijas, un visiem histoloģiskajiem mērījumiem pārbaudes secība tika pārslēgta.

4.7. Plūsmas citometrijas mērījumi

Asins un aizkrūts dziedzera šūnu plūsmas citometrijas analīze tika veikta, krāsojot ar specifiskām anti-peļu antivielām ∶ CD4, CD8, CD3, CD44 un CD25. Īsi sakot, pilnas asins paraugi (50 μ) tika iekrāsoti, izmantojot fluorescējoši iezīmētas antivielas, pēc tam sarkanās asins šūnas tika lizētas, izmantojot BD lizēšanas šķīdumu, bet dzīvās baltās asins šūnas tika iekrāsotas, izmantojot dzīvotspējas krāsojumu. Timizi tika mehāniski atdalīti. 1 līdz 2 miljoni aizkrūts dziedzera šūnu tika līdzīgi iekrāsoti, izmantojot specifiskas antivielas pret CD4, CD8, CD44 un CD25. Imunoloģiski iekrāsotu balto asins šūnu vai aizkrūts dziedzera paraugu analīze tika veikta, izmantojot FACS ARIA l, un dati tika analizēti, izmantojot FlowJo programmatūru, kā ziņots iepriekš (Sanghez et al. 2017).

4.8 Western BIots

Olbaltumvielu ekstrakti (šūnas/audi) tika homogenizēti radioimūnprecipitācijas testa (RIPA) līzes buferšķīdumā (150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 [NP-40],0 0,5 procenti deoksiholāta,0,1 procenti SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) ar proteāzes inhibitoriem (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptīna, 5 ug/ml pepstatīna, 5 ug/ml himotripsīna, 10 ug/ml aprotinīna). Olbaltumvielu ekstrakti tika apstrādāti ar ultraskaņu un pēc tam granulēti, centrifugējot ar ātrumu 13, 000 apgr./min 15 minūtes 4 ° C temperatūrā. Lai noteiktu olbaltumvielu koncentrāciju, tika izmantots BCA proteīna tests. Paraugi, kas satur vienādus proteīna daudzumus no 50 līdz 100 ug katrā joslā, tika atdalīti, izmantojot 4 līdz 12 procentu gradienta TGX saliekamos gēlus BioRad, pēc tam pārnesot ar TransBlot Semi-Dry BioRad sistēmu, izmantojot nitrocelulozes pārneses iepakojumu. Pārnestie bloti tika iekrāsoti ar Ponceau S traipu, lai nodrošinātu vienādu olbaltumvielu daudzumu, pēc tam mazgāti un bloķēti ar 5% beztauku sausu pienu TBST 60 minūtes istabas temperatūrā. Primārās antivielas tika inkubētas, kratot nakti 4 grādu temperatūrā. Bloti tika pārbaudīti attiecībā uz šādām antivielām: ATM (D2E2) truša mAb šūnu signalizācija, atšķaidījumā 1:1000, -aktīns (D6A8) truša mAb šūnu signalizācija, GAPDH (D16H11) truša mAb šūnu signalizācija, kam seko atbilstošā zirgu mAb peroksidāze. HRP) sekundārā Anti-rabbit, Anti-pele 2 stundas istabas temperatūrā. Pēc vairākkārtējas mazgāšanas ar TBST proteīna ekspresija tika noteikta ar Radiance Plus hemiluminiscences substrātu, izmantojot Azure c400 un BioRad ChemiDoc attēlveidošanas sistēmas. ATM densitometriskā analīze tika veikta, izmantojot ImageJ. Eksperimenti tika veikti ar 2 tehniskiem un 2-3 bioloģiskiem atkārtojumiem, kā norādīts.

4.9. Statistiskais novērtējums

Katrai grupai izvēlēto dzīvnieku skaits tika noteikts, pamatojoties uz a priori jaudas analīzi, izmantojot GPower v3.1, pamatojoties uz lielumu 0,5, jaudu 0,8 un efektu lielumus, kas aprēķināti no provizoriskajiem datiem. vai iepriekšējām studijām. Mēs izmantojām gan parametru (1-, gan 2-ceļu ANOVA) normāli sadalītām un neparametriskām (Kruskal Wallace) statistikas metodēm intervālu datiem, lai pārbaudītu atšķirības starp grupām, kam sekoja vairāku pāru salīdzināšanas testi, kā norādīts teksts. Izņēmumi imūnsistēmas datiem 1. 6 un 7 tika izslēgti, izmantojot ROUT metodi (Q=2 procenti). Konkrētās analīzes, kas izmantotas katrai datu kopai, ir norādītas katras figūras leģendā. Visiem skaitļiem: ns nav nozīmīgas,*p Mazāks vai vienāds ar 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">