Jauns S-sulfhidrēts cilvēka seruma albumīna preparāts nomāc melanīna sintēzi

Kontaktpersona:jaslyn.ji@wecistanche.com

Cilvēka seruma albumīns (HSA) ir visizplatītākais proteīns serumā, un to plaši izmanto kā zāļu nesēju tā bioloģiskās saderības un ilgstošas ​​plazmas aiztures īpašību dēļ [14,15]. HSA kopumā satur 35 Cys atlikumus, un viens no tiem, Cys34, ir brīvas tiola grupas formā [16]. Cys34 dažkārt ir mērķis zāļu saistīšanās vietai tās reaktīvās tiolu grupas dēļ [17,18]. Piemēram, slāpekļa oksīda (NO) klātbūtnē Cys34 tiola grupa ir S-nitrozēta. Mēs iepriekš parādījām, ka S-nitrozētais HSA (SNO-HSA) ļauj ilgu laiku saglabāt NO serumā [19]. SNO-HSA ir dažādas bioloģiskas funkcijas, tostarp aknu aizsargājoša iedarbība pret išēmiju/reperfūziju [20] un audzēju nomācoša iedarbība [21].

Līdz ar to mēs izvirzījām hipotēzi, ka HSA var izmantot kā RSS nesēju (piemēram, SNO-HSA), izmantojot Cys34-SH S-sulfhidrāciju. DATS un DMTS kā polisēra avots ir ierobežoti to lipofilitātes un nepastāvības dēļ. Tādējādi šajā pētījumā tika izmantots komerciāli pieejams Na2Sn (Na2S, Na2S2, Na2S3 un Na2S4). Ogasawara et al. iepriekš sagatavots ar sēru saistīts seruma albumīns, kas reaģēja ar nātrija sulfīdu (NaHS), vienkārši sajaucot reaģentus [22]. Sērs no NaHS tika pievienots Cys34, un iegūtais preparāts aizsargāja lipīdu peroksīda izraisītus aknu bojājumus. Mēs izmantojām šo metodi, lai sagatavotu RSS pievienoto HSA, izmantojot Na2Sn RSS piegādei.

Šajā darbā mēs ziņojām par Na Sn apstrādāta HSA sagatavošanu un tās izmantošanu kā jaunu RSS piegādes sistēmu. Pievienotais sērs tika analizēts ar sulfāna sēra zondi [23] un sulfīda izvadīšanu no polisulfīda [24]. Lai novērtētu ar Na2Sn apstrādātā HSA ietekmi uz ādas balināšanu, ar B16 melanomas šūnu līniju tika pētīta ar Na2Sn apstrādātā HSA ietekme uz melanīna sintēzi.

2. Materiāls un metodes

2.1. Materiāli

Cilvēka seruma albumīns (HSA) tika iegādāts no KAKETSUKEN (Kumamoto, Japāna), un visi HSA paraugi tika attaukoti, apstrādājot ar oglēm. Nātrija sulfīds un nātrija tetrasulfīds tika iegādāti no DOJINDO laboratorijas (Kumamoto, Japāna). Sulfāna sēra zonde 4 (SSP4) tika sagatavota, kā aprakstīts iepriekš [23]. L-DOPA, glutationu (DTNB), askorbīnskābi un nātrija satīra Griesa reaģentu (sulfanilamīds, naftilēndiamīns-HCl) iegādājās no Nakarai Chemicals (Kioto, Japāna). Sephadex G-25 atsāļošanas kolonna (φ 1,6 × 2,5 cm) tika iegādāta no GE Healthcare (Kioto, Japāna). Dulbecco modificētā Eagle barotne (DMEM) un 2,2-difenil-1-pikrilhidrazils (DPPH) tika iegūti no Wako Pure Chemical (Osaka, Japāna). Sēņu tirozināze tika iegādāta no Sigma-Aldrich. Visas pārējās ķīmiskās vielas bija vislabākās komerciāli pieejamās kvalitātes, un visi šķīdumi tika pagatavoti dejonizētā un destilētā ūdenī.

cistanche ekstrakts

2.2. BCA proteīna tests

Olbaltumvielu koncentrācijas tika mērītas, izmantojot BCA proteīna testu. 10 μL paraugu un liellopu seruma albumīna (BSA) standartu alikvotas tika inkubētas 100 μL reakcijas buferšķīdumā 25 grādu temperatūrā 30 minūtes. Pēc reakcijas tika izmantots mikroplašu lasītājs, lai izmērītu 540 nm absorbciju. BSA tika izmantots, lai izveidotu standarta līkni.

2.3. Na2Sn apstrādātas HSA sintēze

HSA (300 μM) inkubēja ar 1 mM nātrija polisulfīdu (Na2Sn) PBS (pH 7,4) 1 stundu 37 grādu temperatūrā. Pēc reakcijas nātrija polisulfīdu pārpalikums tika noņemts ar gēla filtrēšanu ar Sephadex G{8}} kolonnu.

2.4. Sēra saistīšanās ātruma noteikšana ar sulfīda eliminācijas metodi no polisulfīda (EMSP)

EMSP tika sagatavots, kā aprakstīts iepriekš (3 × EMSP, pievienojot 792 mg L-askorbīnskābes 5 ml 3 N NaOH) [24]. Paraugus (7,5 μM, 133 μL) inkubēja ar 66,7 μL 3 × EMSP 3 stundas 37 grādu temperatūrā. Pēc tam reakcijas šķīdumam pievienoja 1% cinka acetāta šķīdumu (600 μL), kam sekoja nekavējoties maisīšana. Paraugus centrifugēja ar ātrumu 8,000 × g 5 minūtes un divreiz mazgā ar fosfātu buferšķīdumu (PBS). Pēc supernatantu noņemšanas nogulsnēm pievienoja dejonizētu un destilētu ūdeni (200 μL). Pēc 1% cinka acetāta (300 μL), 50 μL 20 mM N,N-dimetil-p-fenilēndiamīna un 20 mM FeCl3 pievienošanas 7,2 N HCl šķīdumu inkubēja 30 minūtes 25 grādu temperatūrā. Paraugus centrifugēja ar ātrumu 8000 × g 1 minūti un pārnesa 96-iedobju plāksnēs un noteica OD pie 665 nm. Standarta līknes izveidošanai tika izmantots Na2S.

2.5. Sulfāna sēra noteikšana ar SSP4

Katrs paraugs (20 μM) tika inkubēts ar 5 μM SSP4 1 mM cetiltrimetilamonija bromīdā/PBS (pH 7,4) 10 minūtes 25 grādu temperatūrā. Pēc inkubācijas fluorescenci mēra ar spektrofotometru (JASCO Corporation) ar ierosmi pie 457 nm, emisiju pie 490–535 nm.

2.6. DPPH radikālie testi

DPPH (250 μM) etanolā tika sajaukts ar tādu pašu daudzumu MES buferšķīduma (50 mM, pH 7,4). Šim DPPH šķīdumam tika pievienots ar Na2Sn apstrādāts HSA (40 μM), kas pēc tam tika inkubēts 30 minūtes 25 grādos un DPPH radikāļu absorbcija tika mērīta pie 540 nm. Izņemtās radikālas likmes tika konvertētas, izmantojot šādu formulu;

Attīrītais radikālis ( procenti )=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. NO un SNO analīze

Ar Na2Sn apstrādātu HSA (50 μM) inkubēja ar NO donoru NOC7 (200 μM) 30 minūtes 25 grādu temperatūrā. Pēc reakcijas NO un SNO koncentrācija tika mērīta ar Griesa testu ar nelielām modifikācijām [25]. Griesa reaģenta šķīdumu pagatavoja, sajaucot 0,1% N-1- naftiletilēndiamīda dihidrohlorīda un 1% sulfanilamīda 2% fosforskābē. Reakcijas buferšķīdums sastāvēja no 0,1 M NaCl, 0,5 mM DTPA un 10 mM AcONa・AcOH (pH 5,5). Paraugi (20 μM) tika reaģēti ar Griesa reaģenta šķīdumu (60 μL) reakcijas buferšķīdumā (110 μL) ar 3 mM HgCl2 10 mM Na acetātā (pH 5,5). Pēc 15 minūšu inkubācijas 540 nm absorbcija tika mērīta ar mikroplašu lasītāju. Atlikusī NO/SNO attiecība (procenti) tika aprēķināta un salīdzināta ar PBS vērtībām paraugiem.

2.8. Šūnu kultūra

B16 melanomas šūnas nodrošināja Japānas vēža izpētes resursu banka (JCRB, Tokija, Japāna), un tās kultivēja DMEM, kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma un antibiotiku šķīdumu. Šūnas inkubatorā audzēja, uzturot 37 grādu temperatūru mitrinātā gaisā, kas satur 5 procentus CO2 (pasāžas numurs 10–20).

2.9. Melanīna ražošana

B16 melanomas šūnas tika iesētas 24 iedobju plāksnēs koncentrācijā 2,5 × 10 4 šūnas/iedobē un kultivētas zem 5% CO2 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Paraugus apstrādāja ar 0,4 mM tirozīnu un 10 mM NH4Cl DMEM, kas satur 10 procentus FBS, un pēc tam inkubēja 5 procentu CO2 atmosfērā 37 grādu temperatūrā 72 stundas. Pēc inkubācijas šūnas divas reizes nomazgāja ar PBS un izšķīdināja 1 N NaOH (200 μL). Pēc 2 stundu inkubācijas 60 grādu temperatūrā absorbcija (405 nm) tika mērīta ar mikroplākšņu lasītāju.

Cistanche kavē melanīna ražošanu.

2.10. UV starojums

Paraugu apstarošanai 5 cm attālumā no iedobes plāksnes tika izmantota rokas UV lampa. Šī UV lampa nodrošina UV intensitāti attiecīgi 614 vai 743 μW/cm2 ar 254 nm vai 365 nm starojumu no 5 cm attāluma.

2.11. Na2S4-apstrādāta HSA attīrīšanas aktivitāte pret intracelulāro ROS, NO, RSS

ROS un NO B16 melanomas šūnās tika mērīts ar katru no fluorescences zondēm, attiecīgi CM-H2DCF-DA un DAF-FM-DA. B16 melanomas šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar koncentrāciju 1 × 104 šūnas/iedobē un kultivētas 37 grādu temperatūrā 5% CO2 24 stundas. Pēc kultivēšanas barotne tika noņemta un aizstāta ar CM-H2DCF-DA (5 μM) vai DAF-FM-DA (10 μM) PBS. Zondes uzņēma šūnas, inkubējot tās 37 grādu temperatūrā 30 minūtes. Pēc reakcijas supernatanti tika noņemti, paraugi tika atšķaidīti PBS un nekavējoties tika izmērīta fluorescence. Šūnas 15 minūtes izstaroja ar UV lampu. Pēc apstarošanas fluorescences intensitāte (piem. 485 nm, Em. 535 nm) tika mērīta ar fluorescences mikroplašu lasītāju.

2.12. Sēņu tirozināzes aktivitāte un melanīna agregācija

Tirozināzes un L-DOPA šķīdumi tika pagatavoti PBS (pH 7, 4) tieši pirms testa. Tirozināze, kas izolēta no sēnēm, tika izmantota, lai pārbaudītu ar Na2Sn apstrādāta HSA inhibējošo aktivitāti. 20 μl sēņu tirozināzes (537 U/mL) un 100 μL ar Na2Sn apstrādāta HSA (40 μM) 96 iedobju plāksnēs tika labi sajaukti ar PBS (60 μL) un tika pievienoti 20 μL L-DOPA (5 mM). pēc tam pievienoja. Pēc 30 minūšu inkubācijas tika analizēts sintezētā melanīna līmenis, mērot OD 490 nm. Lai noteiktu melanīna agregāciju, maisījumu centrifugēja ar ātrumu 20, 000 g, 15 minūtes 3 stundas. Baltā bultiņa parāda apkopoto materiālu. Neagregētais melanīns supernatantā tika mērīts pie OD 490 nm.

2.13. Drošības testi

Šajā pētījumā izmantotais lokālais krēms tika pagatavots, sajaucot ūdeni (30 ml), jojobas eļļu (15 ml) un 5 g emulgējošā vaska 60 grādu temperatūrā. Pēc atdzesēšanas ar Na2S4-apstrādāto HSA (20 μM) un iegūto suspensiju labi samaisa. Ādas kairinājuma tests tika veikts saskaņā ar ESAO testēšanas vadlīnijām 439, izmantojot LabCyte Epi-Model (3D kultivēts cilvēka ādas modelis).

2.14. Statistiskā analīze

Savākto datu statistiskais nozīmīgums tika novērtēts ar ANOVA analīzi, kam sekoja Ņūmena-Kīlsa metode vairāk nekā 2 vidus. Atšķirības starp grupām tika novērtētas ar Stjudenta t-testu. P < 0,05="" tika="" uzskatīts="" par="" statistiski="">

3. Rezultāti

3.1. S-sulfidētā HSA sagatavošana

Ar Na2Sn apstrādāts HSA tika sagatavots no HSA, kas bija inkubēts ar Na2Sn un pēc reakcijas pakļauts gēla filtrēšanai. Lai novērtētu sulfāna sēra daudzumu paraugā, tika izmantota EMSP, jauna kvantitatīvā metode, kuru mēs iepriekš izstrādājām [24]. Tādējādi ar Na2S4- apstrādāts HSA tika sagatavots no HSA un Na2Sn, ļaujot reaģentiem reaģēt 1 stundu 37 grādu temperatūrā. Dažādiem nātrija polisulfīdu daudzumiem tika atļauts reaģēt ar HSA. Pēc tam HSA paraugus inkubēja ar EMSP šķīdumu, kas tika sagatavots lietošanas laikā, 3 stundas 37 grādu temperatūrā. Pamatojoties uz EMSP analīzēm, S-sulfidrācijas līmenis palielinājās neatkarīgi no sēra daudzuma (1.A att.). No otras puses, kā parādīts 1.B attēlā, apstrāde ar Na2S3- vai Na2S4- uzlaboja SSP4 (fluorescences zonde sulfāna sēram) fluorescences intensitāti salīdzinājumā ar Na2S- vai Na2S{{24. }}apstrādes, kas liecina, ka SSP4, iespējams, nelineāri reaģēja ar proteīna polisulfīdu (1.B att.).

3.2. Ar Na2S apstrādāta HSA antioksidanta un NO nomācošā iedarbība

Mēs postulējām, ka ar Na Sn apstrādātais HSA nomāc melanīna ražošanu tās antioksidanta aktivitātes dēļ. Tādējādi tika veikts DPPH radikāļu tests [26, 27], lai analizētu antioksidantu aktivitāti in vitro. Tā rezultātā ar Na2Sn apstrādātajam HSA bija ievērojami augstāka pievienotā sēra koncentrācija (2. att. A). Lai noskaidrotu NO ietekmi, NOC7 (NO donors) tika inkubēts kopā ar Na2S4-apstrādātu HSA 25 grādu temperatūrā. Pēc 30 minūšu inkubācijas perioda atlikušā NO koncentrācija tika kvantitatīvi noteikta ar Griess testu. Kā redzams 2. B attēla aizvērtajos stieņos, ar Na2S4-apstrādāto HSA tika iegūts ievērojami vairāk NO, salīdzinot ar kontroli un HSA (2. B attēls). Ir zināms, ka elementārais dzīvsudrabs (Hg) samazina SNO un izdala NO2-. Kad Hg tika pievienots Na2S4-apstrādāta HSA šķīdumam, izdalījās NO2-, kas liecina, ka ar Na2S4- apstrādātais HSA tika noņemts ar S-nitrozēšanu.

3.3. Melanīns nomāc ar Na2Sn apstrādāta HSA iedarbību

B16 peļu melanomas šūnas tika kultivētas, un melanīna sintēze tika veicināta, barotnei pievienojot tirozīnu. Kā parādīts 3. attēlā, ar Na2Sn apstrādātais HSA inhibēja melanīna sintēzi, un inhibīcija bija atkarīga no sēra satura. B16 melanomas šūnu šūnu attēli pēc ar Na2Sn apstrādāta HSA lietošanas arī parādīja, ka ar Na2Sn apstrādātais HSA samazināja melanīna ražošanas attiecībupozitīvas šūnas (3. att.).

3.4. Na2S4-apstrādāta HSA antioksidanta iedarbība ar UV starojumu

Lai pārbaudītu, vai ar Na2Sn apstrādātais HSA nomāc UV izraisītu ROS vai NO veidošanos, tika veikts oksidatīvā stresa tests, izmantojot B16 melanomas šūnas kā modeļus. ROS veidošanās ar Na2S4-apstrādātu HSA B16 melanomas šūnās, apstarojot ar 2 dažādām UV ierīcēm 15 minūtes, tika mērīta ar CMH2-DCF-DA. Rezultāti liecina, ka ar Na2S4-apstrādātais HSA izraisīja ievērojamu CMH2-DCF-DA fluorescences samazināšanos uz PBS un HSA, apstarojot pie 254 nm un 365 nm (4AB attēls). Un otrādi, ar Na2S 4-apstrādātais HSA arī nomāca NO veidošanos B16 melanomas šūnās, apstarojot ar 254 nm UV (4. att. CD). Šie rezultāti liecina, ka ar Na2Sn apstrādātais HSA nomāc melanīna sintēzi, inhibējot ROS un NO, ko rada UV starojums.

3.5. Tieša tirozināzes un melanīna agregācijas nomākšana ar Na2Sn apstrādātu HSA

Ir zināms, ka daži komerciāli anti-melanīna līdzekļi tieši inhibē tirozināzes aktivitāti. Tādējādi mēs pārbaudījām, vai ar Na Sn apstrādātais HSA mainīja tirozināzes aktivitāti. Rezultāti liecināja, ka ar Na2Sn apstrādātais HSA inhibēja sēņu tirozināzi lielākā mērā nekā neapstrādāts HSA (5.A att.). Pēc ģenerēšanas melanīns viegli agregējas un izraisa medulla veidošanos [28]. Tāpēc mēs pēc tam pievērsāmies jautājumam par to, vai ar Na Sn apstrādātais HSA kavē melanīna agregāciju. Līdz ar to, tirozināzi un L-DOPA inkubējot kopā 3 stundas, melanīna pigmenti agregējās, bet ar Na2Sn apstrādātais HSA novērsa agregāciju (5.B att.). No vienas puses, tika konstatēts, ka HSA arī inhibē agregāciju, norādot, ka pati HSA var novērst L-DOPA saistīšanos ar tirozināzi.

3.6. Ar Na2Sn apstrādāta HSA drošības pārbaude, izmantojot 3D kultivētu cilvēka ādu

Ādas kairinājuma testi ar Na2S4-apstrādātu HSA tika veikti, izmantojot 3D kultivētas cilvēka ādas šūnas saskaņā ar ESAO vadlīnijām. Rezultātā izdzīvojušo šūnu skaits nesamazinās ar Na2S4-apstrādātu HSA ar lokālu krēmu vai bez tā (6.A attēls). LDH citotoksicitātes noteikšanas komplekta izmantošana arī atklāja, ka ādas šūnas nav bojātas ar Na2S4-apstrādāto HSA (6.B attēls). Šie dati norādīja, ka ar Na2Sn apstrādāts HSA ir ļoti drošs lietošanai pret cilvēka ādu šajā pētījumā pārbaudītajās koncentrācijās.

4. Diskusija

Melanīns tiek sintezēts, oksidējot tirozīnu. Tirozīns tiek oksidēts par L-DOPA un pēc tam par dopahinonu, iedarbojoties tirozināzei. Dopahinons spontāni oksidējas par melanīnu. Melanīns izraisa melno pigmentu un vasaras raibumu veidošanos, bet arī aizsargā ādu no UV starojuma bojājumiem. Cilvēka ādā melanocīti rada ROS un NO, ja tos stimulē UV starojums [2, 29, 30]. ROS veicina melanīna sintēzi, aktivizējot tirozināzi ar ATP sintāzes, fenilalanīna hidroksilāzes un MAPK fosforilēšanas palīdzību [31, 32]. NO aktivizē tirozināzi, palielinot cGMP līmeni šūnās [6]. Tāpēc ROS un NO uztvērēji tiek uzskatīti par anti-melanoģenēzes līdzekļiem. Šeit mēs pētījām ar Na2Sn apstrādātā HSA anti-melanīna sintēzes efektu. Ar Na2Sn apstrādātais HSA spēcīgi nomāca UV starojuma radīto ROS un NO līmeni šūnās (4. att.). Turklāt ar Na2Sn apstrādātajam HSA bija tieša ietekme uz tirozināzes darbības (5.A att.) un melanīna agregācijas inhibīciju (5.B att.). Mēs nevarējām precizēt mehānismu, kā sulfāna sērs tika pārnests no Na2Sn apstrādātā HSA uz šūnu. Tāpēc ar Na Sn apstrādātās HSA funkcijas tiešās ietekmes raksturs joprojām nav skaidrs. Yamashita et al. pierādīja, ka dopahinons saistās ar tiola proteīniem caur cisteīna atlikumiem [33]. Kopumā melanīna agregācijas kavēšana ar HSA un ar Na2Sn apstrādātu HSA var ietvert arī disulfīda saišu veidošanos ar dopahinonu vai melanīnu. No otras puses, tirozināzes inhibīcija bija atkarīga no pievienotā sēra satura (5.A attēls). Ir zināms, ka GSH saistās ar tirozināzi un samazina tās aktivitāti [34]. Tā kā S-sulfhidrētam cisteīnam ir spēcīgāka reaktivitāte nekā parastajam cisteīnam [11], glutationa persulfīds (GSSH) var kavēt tirozināzes darbību vairāk nekā GSH. Nākotnē ir nepieciešami turpmāki pētījumi par to, vai ar Na2Sn apstrādātais HSA palielina intracelulāro GSSH.

ROS rodas UV starojuma vai ārējā stresa izraisītas novecošanās pazīmes ne tikai melanīna sintēzes veidā, bet arī grumbu parādīšanos un ādas nokarāšanos, ko izraisa DNS bojājumi un savstarpēji saistīta kolagēna veidošanās. Ir arī zināms, ka ROS ir pastiprinošs faktors dažāda veida iekaisumus, piemēram, pūtītes un psoriāzi. Šo problēmu risināšanai ir izstrādāti dažādi ādas balināšanas līdzekļi, piemēram, traneksamskābe [35] un arbutīns [36]. Tomēr šie savienojumi tikai kavē melanīna sintēzi un neietekmē oksidatīvo stresu. Tādējādi ROS izraisītas toksicitātes risks saglabājās. Ar Na2Sn apstrādāta HSA izmantošanas priekšrocība ir tā, ka tā efektīvi attīra ROS (2. un 4. attēls).

Sērūdeņradis ir pētīts kā trešā būtiskā molekula pēc slāpekļa oksīda un oglekļa monoksīda. Ir pierādīts, ka sērūdeņraža terapeitiskā iedarbība ir piemērojama išēmijas/reperfūzijas [37], aterosklerozes [38], sepses [39] un augsta tauku satura diētas izraisītas toksicitātes [40] ārstēšanai. Turklāt hidropersulfīdam ir augstāka aktivitāte nekā sērūdeņradim. Piemēram, Na2S4 efektīvi detoksificē metildzīvsudrabu un kavē neiroblastomas šūnu diferenciāciju, savukārt Na2S to nedara [12,41]. Līdz ar to ir iespējama ne tikai ādas balināšanas iedarbība, bet arī citi pozitīvi ar Na2Sn apstrādāti HSA efekti.

Noslēgumā mēs ziņojām par jaunas RSS piegādes sistēmas izstrādi, izmantojot seruma albumīnu kā stabilu nesēju. Reaktīvajam sēram, ja to apvieno ar HSA, bija spēcīgāka antioksidanta iedarbība nekā HSA, un tas kavēja melanīna sintēzi melanomas šūnās. Anti-melanoģenēzes mehānisms ietver ne tikai ROS un NO attīrīšanu, bet arī tirozināzes aktivitātes un melanīna agregācijas nomākšanu. Tādējādi ar Na2Sn apstrādātajam HSA ir ievērojams potenciāls izmantot kā drošu ādas balināšanas līdzekli.

Šis ir mūsu produkts.

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, noklikšķiniet uz attēla.