No Cistanche iegūtais akteozīds uzlabo glikokortikoīdu izraisītu osteoporozi, aktivizējot PI3K/AKT/mTOR ceļu

Abstrakts

Mērķis

Glikokortikoīdus plaši izmanto klīniskajā praksē; tomēr tie var izraisīt blakusparādības, piemēramosteoporoze. Akteozīds(ACT) no Cistanche ir izmantots, lai apkarotu dažādas slimības. Pētījums tika veikts, lai novērtētu ACT efektivitāti glikokortikoīdu izraisītā ārstēšanāosteoporoze(GIOP) un tā potenciālais mehānisms.

Metodes
Deksametazons (Dex) tika injicēts intramuskulāri, lai izraisītuosteoporozežurku modelī, un ACT tika ievadīts mutiski. ACT tika papildināts in vivo Dex stimulētā veidāosteoblastisksMC3T3-E1 šūnas. RT-qPCR tika veikta, lai novērtētu mRNS līmenikaulu veidošanās(Runx2, CoL1A1) un kaulu rezorbciju (OPG un RANKL). Lai novērtētu OC un CTX līmeni serumā, tika izmantots komerciāls ELISA komplekts. Western blot tika veikts, lai novērtētu olbaltumvielu līmeni PI3K / AKT / mTOR signalizācijas ceļā. Lai novērtētu osteoblastu dzīvotspēju un apoptozi, tika veikts CCK-8 tests un plūsmas citometrija.

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu Cistanche Acteoside Dex stimulētu osteoblastu ārstēšanai

Rezultāti
ACT samazināja Dex izraisītu kaulu mikrostruktūras pasliktināšanos, palielināja OC līmeni serumā un samazināja CTX līmeni (P< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and veicināja apoptozi; tomēr šo efektu ievērojami vājināja ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

Secinājums
ACT noCistanchevar izraisīt osteoprotektīvu iedarbību, aktivizējot PI3K/AKT/mTOR signalizācijas ceļu, lai atvieglotu Dex izraisītu osteoporozi.

Atslēgvārdi:Akteozīds Cistancheglikokortikoīdu izraisītiosteoporoze

Ievads
Osteoporoze (OP) ir ģeneralizēta skeleta slimība, kurai raksturīga zema kaulu masa, kaulu audu mikrostruktūras iznīcināšana un kaulu homeostāzes nelīdzsvarotība [1]. OP izraisa vairāk nekā 8,9 miljonus lūzumu gadā, un osteoporotiski lūzumi notiek gandrīz ik pēc 3 sekundēm un izraisa mūža invaliditāti vai nāvi [2]. Glikokortikoīdus (GC) parasti lieto neinfekciozu iekaisuma slimību (piemēram, astmas un iekaisīgas zarnu slimības), kā arī autoimūnu stāvokļu ārstēšanai [3]. Tomēr ilgstoša GC lietošana rada noslieci uz vairāk nekā 30 procentiem OP gadījumu un vairāk nekā 10 procentiem osteonekrozes gadījumu [4]. GC tieši kavē osteoblastu proliferāciju un diferenciāciju [5], samazina nobriešanu un aktivitāti, kā arī izraisa osteoblastu apoptozi, kas savukārt izraisa glikokortikoīdu izraisītas osteoporozes (GIOP) attīstību [6]. Turklāt arvien vairāk pierādījumu liecina, ka osteoblastu disfunkcija ir galvenais kaulu zuduma cēlonis. Tāpēc šķiet, ka osteoblastu skaita un funkciju palielināšana ir galvenā stratēģija OP, īpaši GIOP, profilaksei.

Augu izcelsmes zāles, īpaši tās, kuru pamatā ir dabiskie savienojumi, jau tūkstošiem gadu tiek izmantotas dažādu slimību ārstēšanai [7]. Cistanche ir Ķīnas farmakopejā reģistrēts vērtīgs augs, kas aug Sjiņdzjanas Uiguru autonomā reģiona dienvidu apgabalā un ir pazīstams kā tuksneša žeņšeņs [8]. Ir pierādīts, ka Cistanche ir dažādi efekti, piemēram, imunitātes uzlabošana, nieru aizsardzība, pretnovecošanās, antioksidanta, pretiekaisuma un neiroprotektīva iedarbība [9].Akteozīds(ACT) ir feniletanola glikozīds Cistančā, kam ir bioloģiskas aktivitātes, piemēram, neironu apoptozes inhibīcija [10], aknu bojājumu mazināšana [11], pretiekaisuma iedarbība [12], antioksidācija [13]. , diabēta [14] un aptaukošanās [15] profilakse, kā arī locītavu skrimšļa deģenerācija [16]. Turklāt vairāki pētījumi ir ziņojuši par ACT farmakokinētiku un apstiprinājuši, ka terapeitiskais efekts pastāv pat tad, ja perorālā lietošana ir tikai 0,12 procenti. ACT tiek uzskatīts par priekšzālēm ar aktīviem metabolītiem in vivo [17].

Džans et al. parādīja ACT potenciālu aizsargājošu iedarbību uz olnīcu izņemšanas izraisītu kaulu zudumu žurkām [18]. ACT modulē IGF-1/PI3K/mTOR signālu ceļu, lai novērstu kaulu zudumu žurkām ar diabētu [19]. Ir ziņots, ka PI3K / AKT / mTOR ceļam ir būtiska regulējoša loma dažādās slimībās, tostarp GIOP [20]. Naringīns atvieglo GIOP, regulējot PI3K/AKT/mTOR signalizācijas ceļu [21]. Turklāt šis signalizācijas ceļš regulē osteoblastu diferenciāciju [22], kaulu veidošanos [23] un lūzumu dzīšanu [24]. Tomēr nav zināma ACT iespējamā loma GIOP un tas, vai to regulē PI3K / AKT / mTOR signalizācijas ceļa modulācija.

Šī pētījuma mērķis bija izprast ACT aizsargājošo iedarbību GIOP žurku modelī un osteoblastos in vitro un noskaidrot pamatā esošos molekulāros mehānismus.

materiāli un metodes
Eksperimentālie dzīvnieki
Četrdesmit 8-nedēļas veci Sprague-Dawley (SD) žurku tēviņi, kas sver 280–340 g, tika iegūti no Šanhajas laboratorijas dzīvnieku centra (CAS, Šanhaja, Ķīna). Eksperimentālo dzīvnieku aprūpes procedūras tika veiktas saskaņā ar protokolu, ko apstiprinājusi Qiqihar Medicīnas universitātes Dzīvnieku ētikas komitejas trešā saistītā slimnīca. Un pētījums tika veikts saskaņā ar ARRIVE vadlīnijām. Dzīvnieki tika izmitināti dzīvnieku centros, kuros nebija patogēnu, 24 ± 2 grādu, 12 stundu gaismas un tumsas ciklu, 50 ± 5 procentu mitruma un ar brīvu piekļuvi pārtikai un ūdenim.

GIOP modeļa konstrukcija
Pēc 7 dienu adaptīvās barošanas žurkas tika nejauši sadalītas kontroles un modeļu grupās, izmantojot nejaušo skaitļu tabulas metodi, deksametazons (Dex, Sigma-Aldrich St. Louis, MO, ASV) tika injicēts 5 mg/kg divas reizes nedēļā 6 nedēļas. intramuskulāri, lai izraisītu OP žurkām modeļu grupā [25]. Kontrolgrupas žurkām (n = 10) tika injicēts vienāds daudzums fizioloģiskā šķīduma. Abās grupās žurkām pēc 6 nedēļām netika novērotas būtiskas ķermeņa svara izmaiņas. Pēc tam modeļa grupas žurkas tika iedalītas modeļu grupā, ACT zemas devas grupā (modelis plus ACT-L) un ACT lielas devas grupā (modelis plus ACT-H). ACT (HPLC 98 procenti) tika iegūts no Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, Ķīna) un apstrādāts ar ūdens šķīdinātāja suspensiju. Žurkām zemas un lielas devas grupās (8 žurkas katrā grupā) perorāli ievadīja ACT devu 50 mg/kg/d un 100 mg/kg/d. turpinājās 8 nedēļas. Tostarp izlases lielums tika aprēķināts, pamatojoties uz iepriekšējo pētījumu [26]. Ņemot vērā abpusējo nozīmīguma līmeni 0,05 [95 procentu ticamības intervāls (= 0.05)], 80 procentu jaudu un efekta lielumu 0,5, jaudas analīzē tika aprēķināts nepieciešamais izlases lielums 6 dzīvnieki katrā grupā, pieņemot, ka attiecīgais 30 procentu osteoporozes efekta līmenis. Turklāt ar 20 procentu atbirumu 8 dzīvnieki katrā grupā (kopā 32 žurkas) tika uzskatīti par ideāliem.

Žurku seruma paraugi
Pēc 8 nedēļām žurkas tika anestēzētas ar 10% hlorhidrātu (400 mg / kg, intraperitoneāli, Solarbio, Pekina, Ķīna), asinis tika savāktas no vēdera aortas, sarecētas istabas temperatūrā un centrifugētas ar ātrumu 3500 apgr./min 10 minūtes. Serums tika uzglabāts 1, 5 ml centrifūgas mēģenēs līdz turpmākai lietošanai.

Kaulu minerālā blīvuma novērtējums
Kaulu minerālo blīvumu (KMB) izmantoja DAX mazu dzīvnieku kaulu densitometrs (Ranzhe Instrument Equipment Co., Šanhaja, Ķīna). Īsumā, žurkas tika novietotas guļus stāvoklī, un pakaļējās ekstremitātes tika novietotas uz āru. Žurku labais augšstilbs tika skenēts saskaņā ar ražotāja norādījumiem, un tika reģistrētas KMB vērtības [27].

Kaulu morfoloģijas analīze
Eksperimenta beigās žurkas tika eitanāzētas, intraperitoneāli ievadot hlorālhidrāta pārpalikumu, un augšstilba kauli tika fiksēti 70% etanolā. Pēc tam tika veikta skenēšana ar VivaCT 40μCT sistēmu, kā aprakstīts iepriekšējā pētījumā, un tika noteikts kaulu tilpums/kopējais tilpums (BV/TV), kaula trabekulārais skaits (Tb.N), kaula trabekulārais biezums (Tb.Tn) un kaulu trabekulārā atdalīšana. (Tb.Sp) tika novērtēti [28]. Eitanāzijas gadījumā SD žurkas tika anestēzijas pēc kaulu morfoloģijas analīzes, intraperitoneāli ievadot 10% hlorālhidrāta (350 mg / kg).

Ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests (ELISA)
Osteokalcīna (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) un C-termināla telopeptīda (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) līmeņa noteikšanai žurku serumā tika izmantoti komerciāli ELISA komplekti. Īsumā, reaģenti tika noņemti 18-25 pakāpē, lai līdzsvarotu un sagatavotu šķīdumu mazgāšanai un standarta darbam. Enzīmu plāksnes Plāksnes tika izveidotas ar standarta, tukšo un paraugu iedobēm. Iedobēm tika pievienots apmēram 100 μL parauga šķīdinātāja šķīduma, inkubēts 90 minūtes 37 grādu temperatūrā un aizstāts ar biotinilētu antivielu 60 minūtes 37 grādu temperatūrā. Pēc mazgāšanas pievienoja fermentu saistošo darba šķīdumu un inkubēja 30 minūtes. Pievienoja substrāta šķīdumu (90 μL) un inkubēja 15 minūtes, aizsargājot no gaismas. Kad standarta iedobēs parādījās zils gradients, tika pievienots 50 μL beigu šķīduma un tika analizētas OD450 izmaiņas.

Reversās transkripcijas kvantitatīvā reāllaika PCR (RT-qPCR)
Žurku serumam un ar ACT apstrādātajām MC3T3-E1 šūnām tika pievienots TRlzol LS reaģents, un kopējā RNS tika ekstrahēta, inkubējot istabas temperatūrā, kam sekoja hloroforma pievienošana. RNS koncentrācija un tīrība tika apstiprināta, izmērot A260/280 absorbciju Nanodrop ND-1000 spektrofotometrā. SuperScript II reversās transkriptāzes komplekts tika izmantots RNS reversajai transkripcijai uz cDNS. Pēc tam kDNS tika izmantots kā veidne, tika pievienots primer, un SYBR-Green PCR maisījuma komplekts tika sajaukts un papildināts ar ddH2O līdz 20 μL, un PCR amplifikācijas reakcija tika veikta, izmantojot Applied biosystems AMI7500 Fast Real-time PCR. sistēma (ABI, CA, ASV). GAPDH tika izmantots kā iekšēja atsauce normalizēšanai, un relatīvie ekspresijas līmeņi tika aprēķināti, izmantojot 2-ΔΔCt metodi, un veikti trīs eksemplāros. Ar Runtu saistītā 2. transkripcijas faktora (Runx2), I 1. tipa kolagēna (CoL1A1), kodolfaktora-κB liganda (RANKL), osteriksa un osteoprotegerīna (OPG) receptoru aktivatora praimeru secība ir parādīta 1. tabulā.

Western blot analīze
Šūnām tika pievienots RIPA lizāts, kas satur 1 procentu proteāzes inhibitoru, un kopējais proteīns no katras grupas tika savākts pēc šūnu līzes, kratot 5 minūtes 4 grādos. Lai kvantitatīvi noteiktu proteīnu koncentrāciju katrā grupā, tika izmantots BCA testa komplekts. Pēc tam proteīna paraugus sajauca ar 10% nātrija dodecilsulfāta (SDS) buferšķīdumu vienādā tilpumā un vārīja ūdens vannā 95 grādu temperatūrā 5 minūtes proteīna denaturēšanai. Tika sagatavots 12% SDS-poliakrilamīda vertikālais gēls, un pēc gēla sacietēšanas tika ņemti 30 ug proteīna 120 mA 90 minūšu gēla elektroforēzes atdalīšanai. Pēc tam proteīns tika pārnests uz PVDF membrānu pie 90 V 120 minūtes. Pēc aizzīmogošanas ar 5% liellopu seruma albumīna PVDF membrāna tika sagriezta, pamatojoties uz marķiera un mērķa proteīna joslas molekulmasu, un inkubēta ar atbilstošo primāro antivielu nakti 4 grādu temperatūrā. Trušu poliklonālās antivielas pret p-AKT, p-mTOR un p-PI3K tika atšķaidītas ar attiecību 1:1000 (Proteintech, Uhaņa, Ķīna). TBST tika mazgāts 30 minūtes un inkubēts ar atbilstošo mārrutku peroksidāzes iezīmēto sekundāro antivielu istabas temperatūrā 1 stundu. Blots tika vizualizēts, izmantojot uzlabotus hemiluminiscences reaģentus. Olbaltumvielu joslu blīvums tika kvantificēts, izmantojot attēlu J. GAPDH tika izmantots kā kontrole, lai aprēķinātu relatīvo olbaltumvielu līmeni.

Šūnu kultūra un grupēšana
Peļu pre-osteoblasti MC3T3-E1 tika iegādāti no Ķīnas audu kultūras kolekcijām (CTCC, Ķīna) un kultivēti -MEM, kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma un 100 V/ml penicilīna un 100 mg/ml streptomicīna mitrināts inkubators 37 grādu temperatūrā un 5 procenti CO2. Kaulu diferenciācijas kultūrai tika izveidota osteogēna indukcijas barotne, sajaucot 10 mM- -glicerofosfātu un 50 mg/ml askorbīnskābes (Sigma-Aldrich) ar -MEM un pievienoja MC3T3-E1 šūnām, lai ierosinātu. to diferenciācija. Barotne tika mainīta pēc 3 dienām. Sārmainās fosfatāzes (ALP) dzīvotspējai tika izmantotas kultūras 14 dienas. Turklāt šūnas tika iepriekš apstrādātas ar PI3K inhibitoru LY294002 (10 μM) 30 minūtes, kam sekoja apstrāde ar Dex un ACT.

Šūnu dzīvotspējas tests
Šūnu skaitīšanas komplekta-8 (CCK-8) tests tika veikts, lai novērtētu ar ACT apstrādāto osteoblastu dzīvotspēju. MC3T3-E1 šūnas tika inokulētas 96 iedobju plāksnēs ar ātrumu 5 × 103 šūnas/iedobē. Pamatojoties uz iepriekšējiem pētījumiem [29], tika ņemts vērā 1 μM Dex daudzums, un tas tika inkubēts ar ACT gradienta koncentrācijām (10–8, 10–7, 10–6 un 10–5 M). Kultivēšanas barotne 96-iedobju plāksnēs tika nomainīta pēc maisīšanas barotnes un CCK-8 reaģenta pievienošanas attiecībā 10:1. Pēc turpinātas inkubācijas 1 stundu 37 grādu temperatūrā tika novērtētas OD450 izmaiņas.

Osteoblastu apoptozes skaita noteikšana
MC3T3-E1 šūnas, kas tika pakļautas dažādai apstrādei, tika sagremotas, izmantojot tripsīnu, kas nesatur EDTA, un savāktas, centrifugējot. Pēc mazgāšanas ar 1 × saistīšanas buferšķīdumu pievienoja 5 μL Annexin V-FITC un inkubēja istabas temperatūrā 5 minūtes, papildināja ar 5 μL PI un izlaida caur 200- sieta neilona tīklu. Paraugi tika analizēti, izmantojot FACScan plūsmas citometrijas sistēmu.

ALP aktivitātes tests
MC3T3-E1 šūnas tika inokulētas 24-iedobju plāksnēs, un pēc apmetuma tika pievienotas ACT un Dex. Šūnu kultūras barotne kultivēšanai tika aizstāta ar osteogēnu diferenciācijas barotni. Pēc šūnu līzes izmantošanas ar šūnu līzes šķīdumu (P0012J, Beyotime Biotechnology), supernatants tika savākts, centrifugējot, un tika uzzīmēta standarta līkne. Lai novērtētu ALP aktivitāti, tika izmantots ALP komplekts (P0132S, Beyotime Biotechnology), un tika aprēķināts OD450.

Statistiskā analīze
Pēc trīs neatkarīgu eksperimentu veikšanas trīs eksemplāros, dati tika analizēti, izmantojot GraphPad Prism 6.0 programmatūru un izteikti kā vidējā ± standarta novirze. ANOVA tika izmantota, lai salīdzinātu statistiskās atšķirības starp vairākām grupām. P vērtība < 0,05 tika uzskatīta par statistiski atšķirīgu.