Īsās ķēdes taukskābju acetāts, kas tiek piegādāts elpceļos, uzlabo pretvīrusu imunitāti rinovīrusa infekcijas laikā

Fons: 

Ir atzīts, ka mikrobiotai ir liela nozīme imunitātes regulēšanā, atbrīvojot imūnmodulējošus metabolītus, piemēram, īsās ķēdes taukskābes (SCFA). Rinovīrusi (RV) izraisa augšējo elpceļu slimības un izraisa astmas un hroniskas obstruktīvas plaušu slimības paasinājumus, izmantojot slikti saprotamus mehānismus. Vietējā mijiedarbība starp SCFA un pretvīrusu imūnreakcijām elpošanas traktā iepriekš nav pētīta.

Īsās ķēdes taukskābes (SCFA) ir organiskās skābes, kas rodas, fermentējot celulozi un citas uztura šķiedras, ko veic labvēlīgas baktērijas zarnās. Pētījumi ir parādījuši, ka SCFA ir nozīmīga ietekme uz cilvēka imūnsistēmu.

Pirmkārt, SCFA var veicināt zarnu gļotādas barjeras integritāti un uzlabot zarnu barjeras funkciju. Zarnu barjera ir pirmā aizsardzības līnija zarnu vides aizsardzībai. Ja zarnu barjera ir bojāta, kaitīgas vielas var iekļūt asinsrites sistēmā caur zarnu sieniņām, izraisot iekaisumu un patoloģisku imūnsistēmu. Pētījumos atklāts, ka SCFA var uzlabot zarnu barjeras integritāti un samazināt zarnu iekaisuma risku, veicinot gļotādas šūnu diferenciāciju un proliferāciju, palielinot gļotādas biezumu un gļotu veidošanos.

Otrkārt, SCFA ir imūno šūnu regulēšanas funkcija. Pētījumi ir parādījuši, ka SCFA var veicināt imūno šūnu diferenciāciju un proliferāciju un regulēt imūno šūnu darbību. SCFA var arī samazināt iekaisuma citokīnu veidošanos un kavēt imūno šūnu aktivitāti, tādējādi aizsargājot cilvēka imūnsistēmu. Citi pētījumi arī atklāja, ka SCFA var regulēt T šūnu darbību, palielināt autoimūno funkciju un spēlēt noteiktu lomu autoimūno slimību profilaksē un ārstēšanā.

Īsi sakot, īsās ķēdes taukskābes spēlē svarīgu lomu cilvēka imūnsistēmas normālā darbībā. Mums jāpievērš uzmanība saprātīgai uztura struktūras kombinācijai, kas bagāta ar šķiedrvielām, lai palielinātu labvēlīgo baktēriju skaitu un daudzveidību zarnās, tādējādi veicinot SCFA veidošanos un saglabājot cilvēka imūnsistēmas stabilitāti un veselību. No šī viedokļa mums ir jāuzlabo imunitāte. Cistanche var ievērojami uzlabot imunitāti, jo Cistanche ir bagāts ar dažādām antioksidantu vielām, piemēram, C vitamīnu, C vitamīnu, karotinoīdiem u.c. Šīs sastāvdaļas var attīrīt brīvos radikāļus un samazināt oksidatīvo stresu. Stimulēt un uzlabot imūnsistēmas pretestību.

Click cistanche tubulosa priekšrocības

Mērķis:

Mēs centāmies izpētīt, vai manipulācijas ar plaušu metabolītu, ievadot SCFA plaušās, var modulēt pretvīrusu imunitāti pret RV infekciju.

Metodes:

Mēs pētījām SCFA acetāta, butirāta un propionāta intranazālās ievadīšanas ietekmi uz pretvīrusu parakstu un acetāta bazālo ekspresiju RV infekcijas peles modelī un RV inficētās plaušu epitēlija šūnu līnijās. Mēs papildus novērtējām acetāta, butirāta un propionāta ietekmi uz RV infekciju diferencētās cilvēka primārajās bronhu epitēlija šūnās.

Rezultāti:

Intranazālā acetāta ievadīšana izraisīja IFN-b bazālo regulēšanu, kas nav novērota ar citiem SCFA. Butirāta izraisīta RIG-I ekspresija. Peļu ārstēšana ar intranazālu acetātu palielināja interferona stimulēto gēnu un IFN-l ekspresiju RV infekcijas laikā un samazināja plaušu vīrusu slodzi 8 stundas pēc inficēšanās. Acetāts uzlaboja vīrusa izraisītās proinflammatoriskās reakcijas ar novājinātu plaušu mucīna un IL-6 ekspresiju, kas novērota 4. un 6. dienā pēc inficēšanās. Šī acetāta interferonu pastiprinošā iedarbība tika apstiprināta cilvēka bronhu un alveolu epitēlija šūnu līnijās. Diferencētās primārās bronhu epitēlija šūnās ārstēšana ar butirātu labāk modulēja IFN-b un IFN-l gēnu ekspresiju RV infekcijas laikā.

Secinājumi:

SCFA palielina pretvīrusu imunitāti un samazina vīrusu slodzi un proinflammatoriskās reakcijas RV infekcijas laikā. (J Allergy Clin Immunol 2023;151:447-57.)

Uz gļotādas virsmām (mikrobiota) sastopamajām baktēriju kopienas ir galvenā loma imūnsistēmas homeostāzē un nosaka reakciju uz iekaisuma un infekcijas apstākļiem, tostarp astmu, kolītu un baktēriju un vīrusu infekcijām.{0}} Baktēriju metabolīti, piemēram, īsās ķēdes taukskābes (SCFA), galvenokārt acetāts, butirāts un propionāts, tagad ir labi atpazīstama saikne starp zarnu mikrobiotu un saimniekšūnām.6,7 Šīs molekulas rodas zarnu mikrobiotas sastāvdaļu metabolisma ceļā uztura šķiedrām. SCFA ir gan lokāla, gan sistēmiska iedarbība. Tie modulē imūno šūnu aktivāciju un darbību, izmantojot mehānismus, tostarp ar G-proteīnu saistītu receptoru aktivizēšanu (ti, Gpr41, Gpr43 vai Gpr109a) un histona dezacetilāzes inhibīciju, un ir pierādīts, ka tie veicina gļotādas homeostāzi un perorālo toleranci. Pavisam nesen tika aprakstīta mikrobiotas esamība apakšējos elpceļos, un jauni pierādījumi liecina, ka elpceļu komensāļi ir arī metaboliski aktīvi organismi, kas spēj ražot metabolītus ar imūnmodulējošu spēju, piemēram, SCFA.8 Tādējādi SCFA vai nu izdalās lokāli plaušu mikrobiota, vai arī kas iegūti no zarnu mikrobiotas, var spēlēt nozīmīgu lomu imunitātes regulēšanā. Tomēr SCFA pretvīrusu iedarbība pret rinovīrusiem (RV) nav zināma.

RV ir atbildīgas par milzīgu infekcijas slimību slogu visā pasaulē, izraisot vieglas pašlimitējošas saaukstēšanās slimības veseliem indivīdiem un izraisot paasinājumus personām ar hroniskām plaušu slimībām, piemēram, astmu vai hronisku obstruktīvu plaušu slimību (HOPS). Šīs slimības rada ievērojamas ekonomiskas izmaksas veselības aprūpes infrastruktūrām visā pasaulē. Pašlaik nav efektīvas RV infekciju terapijas vai licencētu vakcīnu, jo lielais serotipu/celmu daudzveidība ir radījusi nozīmīgus izaicinājumus pētniecībai.9 Tāpēc steidzami ir jāizstrādā jaunas profilaktiskas un terapeitiskas pieejas RV infekcijām. Ar zarnu mikrobiomu var terapeitiski manipulēt, lai piedāvātu klīnisku ieguvumu zarnu infekcijas slimībām (piemēram, Clostridium difficile). Joprojām nav izpētīta iespēja ievadīt elpceļu kommensālus vai saistītos metabolītus, lai līdzīgi palielinātu plaušu pretmikrobu imunitāti.10

Mēs jau iepriekš esam pierādījuši, ka augstas šķiedrvielu diētas vai SCFA acetāta, butirāta un propionāta ievadīšana aizsargāja peles no respiratorā sincitiālā vīrusa (RSV) infekcijas.5 Acetāta perorāla ievadīšana izraisīja IFN-b veidošanos un palielināja interferona stimulēto gēnu ekspresiju ( ISG) plaušās RSV infekcijas laikā. Turklāt mēs noskaidrojām, ka acetāts, kas ievadīts tieši elpceļos, aizsargā pret RSV infekciju, palielinot ISG ekspresiju plaušās.11 Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka tiešai acetāta ievadīšanai elpceļos, lai palielinātu vietējo mikrobu metabolītu koncentrāciju, būtu līdzīga aizsardzība. ietekme uz RV infekciju. Šeit mēs parādām, ka acetāta ievadīšana in vivo pelēm palielina pretvīrusu I un III tipa interferonus (IFN), samazina RV replikāciju un vājina vīrusu izraisītu imūnpatoloģiju. Apsverot specifisku šūnu tipu in vitro pretvīrusu reakciju uz plašāku SCFA klāstu, mēs atklājam, ka šie savienojumi neietekmē alveolāro makrofāgu IFN atbildes reakciju un tiem ir atšķirīga ietekme uz epitēliju, ar izteiktāku pretvīrusu pastiprinošo efektu, kas novērots ar butirātu. ar citiem SCFA, kas liecina, ka in vivo iedarbība var būt saistīta ar sarežģītāku šūnu un šūnu mijiedarbību. Šie dati liecina, ka manipulācijas ar plaušu mikrobu metabolītu vidi varētu būt jauna pieeja elpceļu vīrusu infekciju profilaksei vai ārstēšanai.

METODES

Ētikas paziņojums

Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Animals Act 1986 un Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) vadlīnijām, ievērojot Apvienotās Karalistes Iekšlietu ministrijas vadlīnijās apstiprināto protokolu (AK projekta licence PPL Nr. P07D80C24).

RV izplatīšanās un kvantitatīva noteikšana

Peles un cilvēka šūnu līniju pētījumiem neliela grupa RV serotips-A1 (RV-A1) tika audzēts Ohaio HeLa šūnās (Eiropas šūnu kultūru kolekcija). Inficētās šūnas tika savāktas pēc 24 stundām, vīruss tika koncentrēts un attīrīts, un tika veikts TCID50 (50 procentu audu kultūras infekciozās devas) tests, lai novērtētu vīrusa titru, kā aprakstīts iepriekš.12 Cilvēka primāro bronhu epitēlija šūnu (BEC) pētījumiem. RV-A1 tika pavairots RD-ICAM{11}} šūnā no iekšēja krājuma, kas izolēts no klīniskiem paraugiem un sekvenēts, lai apstiprinātu identitāti. RV-A1 tika titrēts, inficējot RD-ICAM-1 šūnu ar sērijveidā atšķaidītu RV-A1, kam sekoja citopātiskās iedarbības novērojumi un TCID50 tests, lai novērtētu vīrusa titru.

Peļu pētījums

Sešas nedēļas vecas BALB/c peļu mātītes tika iegādātas no Harlan Laboratories (Derbija, Apvienotā Karaliste) un turētas īpašos bez patogēniem apstākļos Londonas Imperiālajā koledžā (Apvienotā Karaliste). Peles tika iepriekš intranazāli apstrādātas ar 50 ml nātrija acetāta, butirāta vai propionāta (Sigma-Aldrich, Sentluisa, Mo) vieglā izofluorāna anestēzijā. Dažos eksperimentos peles pēc 24 stundām intranazāli tika inficētas ar 50 ml RV (5 3 106 TCID50). Acetāta terapijas deva bija 20 mM saskaņā ar mūsu iepriekšējo pētījumu, izmantojot to pašu pieeju.11 Ārstēšana ar acetātu tika ievadīta intranazāli ik pēc 24 stundām pēc inficēšanās.

Kvantitatīvā reāllaika PCR

Kopējā RNS no plaušām (100 mg plaušu audu) un šūnu lizāta tika ekstrahēta, izmantojot RNeasy Mini komplektu (Qiagen, Hilden, Vācija) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. cDNS tika sintezēts, izmantojot izlases veida heksamēru primerus (OmniscriptRT komplekts, Qiagen). Pirmās virknes cDNS tika izmantota, lai kvantitatīvi noteiktu IFN-b, IFN-l, Viperin, MuC5AC (pele un cilvēks), OAS1, RIG-I (Ddx58), MAVS, MDA-5 (pele) un RV kopijas, izmantojot TaqMan testi ar praimeriem un zondēm, kā ziņots iepriekš.13 Absolūtai kvantitatīvai noteikšanai katrs gēns tika normalizēts līdz 18s rRNS līmenim, un precīzas interesējošā gēna kopijas tika aprēķinātas, izmantojot standarta līkni, kas ģenerēta, pastiprinot plazmīdas DNS. Alternatīvi, lai aprēķinātu gēnu ekspresiju, tika izmantots 2-DDCt (reizes maiņa). PCR apstākļi atbilst TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) protokoliem. Gēnu ekspresijas tests tika veikts, izmantojot StepOne (Applied Biosystems, Waltham, Mass).

Bronhoalveolārais skalošanas šķidrums

Peles tika eitanizētas, intraperitoneāli ievadot pentobarbitona šķīdumu, un trahejas tika kanulētas. Plaušas 3 reizes mazgāja ar sterilu PBS. Bronhoalveolārā skalošanas (BAL) šķidrums tika centrifugēts, supernatants tika savākts divpavedienu DNS mērīšanai, un granulas tika suspendētas, lai noteiktu kopējo šūnu skaitu un diferenciālo skaitu. Šūnu diferenciālai skaitīšanai citospīna priekšmetstikliņus iekrāsoja ar MayGrunwald-Giemsa, un pieredzējis pētnieks skaitīšanas procedūru veica aklā veidā.

Divpavedienu DNS mērīšana

Divpavedienu DNS tika mērīts BAL šķidrumā, izmantojot Quant-iT PicoGreen divpavedienu DNS reaģentu (Invitrogen, Carlsbad, Calif) saskaņā ar ražotāja protokolu.

Histoloģiskā analīze

Pēc BAL plaušas caur sirdi tika perfūzētas ar PBS un uzpūstas ar 4 procentiem paraformaldehīda, un pēc tam kreisā plauša 24 stundas tika fiksēta 4 procentu paraformaldehīdā. Pēc tam gabali tika iestrādāti parafīna blokos un sagriezti 5- mm daļās, iekrāsoti ar hematoksilīnu un eozīnu. Iekaisuma infiltrāts tika mērīts mikrometros, un tika veikti 10 mērījumi, sākot no bronhu vai asinsvadu epitēlija gala līdz iekaisuma infiltrāta beigām, izmantojot programmatūru Olympus CellSens Standard (Olympus Corporation, Tokija, Japāna). Visa skaitīšana tika veikta akli pret eksperimentālajiem apstākļiem.

Plūsmas citometrija

Šūnas tika izolētas no plaušām ar perfūziju ar PBS un pēc tam sagremotas RPMI 1640 barotnē, kas papildināta ar 1 mg / ml kolagenāzes IV (Invitrogen-Gibco, Waltham, Mass). No plaušām un BAL izolētās šūnas 20 minūtes inkubēja ar Mouse Fc Block (#553141 BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Šūnas tika mazgātas un iekrāsotas ar virsmas antivielām anti-CD45 (1:200, #557235, klons 30-F11, BD Biosciences). Intracelulārai krāsošanai šūnas tika fiksētas ar citofiksu/citoplazmu (BD Biosciences) un ar anti-RIG-I (1:50, #35H2L48, ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass), un pēc inkubācijas šūnas tika marķētas ar sekundāro antivielu kazu anti-trušu IgG. H&L Cy{18}}konjugēts (1:1000, # ab97075, Abcam, Kembridža, Masa). Paraugi tika iegūti plūsmas citometrā BD FACS Canto-II (BD Biosciences). Dati tika analizēti FlowJo programmatūrā (versija 10, Tree Star, Inc, Ashland, Va).

In vitro pētījumi epitēlija šūnu līnijās

Cilvēka BEC (BEAS-2B) un cilvēka plaušu epitēlija šūnas (A549) tika iegādātas no ATCC (Manassas, Va) un kultivētas, kā aprakstīts iepriekš.13 Šūnas tika iesētas atsevišķi koncentrācijā 1.5 3 105 šūnas/ml 12-iedobju plāksnēs. Divdesmit četras stundas pēc iesēšanas šūnas vēl 24 stundas apstrādāja ar 400 mM nātrija acetāta (Sigma-Aldrich). Pēc tam šūnas tika inficētas ar RV-A1 (Infekcijas daudzveidība [MOI] 2) 1 stundu, pēc tam vīruss tika noņemts, šūnas tika mazgātas un pievienota jauna barotne, kas papildināta ar 5 procentiem FBS. Turpmāka apstrāde ar acetātu (400 mM) tika pievienota tūlīt pēc inficēšanās un ik pēc 24 stundām līdz šūnu novākšanai.

Primāro BEC un ētikas apstiprinājumu vākšana

BEC no veselīga nesmēķētāja tika savākti no bronhu suku bronhoskopijas laikā ar rakstisku informētu piekrišanu. Visus eksperimentus veica Hantera Jaunanglijas apgabala veselības dienesta ētikas komiteja (05/08/10/3.09) un Ņūkāslas Universitātes Drošības komitejas (H-163-1205) apstiprinājumi.

BEC un gaisa un šķidruma saskarnes kultūru nosacīta pārprogrammēšana

BEC tika nosacīti pārprogrammēti ar rho-saistītu proteīnkināzes inhibitoru (galīgā koncentrācija 10mM) un kombinācijā ar apstarotiem NIH-3T3 fibroblastiem vienslāņu kultūrās, kā aprakstīts iepriekš.14,15 Nosacīti pārprogrammētā barotne sastāvēja no: Dulbecco modificētā Eagle barotne (augsts glikozes līmenis 1 L-glutamīns)/Ham's F12 attiecība 1:2, kas papildināta ar 5% FCS, hidrokortizonu (400 ng/ml), insulīnu (5mg/ml), rekombinanto cilvēka epitēlija augšanas faktoru (10 ng). /mL), holēras toksīns (8,4 ng/ml), adenīns (23,9 mg/ml) un 0,2 procenti penicilīna-streptomicīna.16 Paplašinātie nosacīti pārprogrammētie BEC tika atradināti no rho saistītā proteīnkināzes inhibitora un iesēti uz {{24} }akas poliestera transwell membrānas un diferencētas gaisa un šķidruma saskarnē (ALI) 25 dienas, kā aprakstīts iepriekš.17 Eksperimenti tika veikti ar n 5 4 biotehniskiem atkārtojumiem. Standarta Alcian zilā, pH 2,5 un periodiskā skābes-Šifa krāsošana tika veikta 5- mm biezām ALI sekcijām, lai vizualizētu pseidostratificētu epitēliju (skatiet E1 attēlu šī raksta tiešsaistes krātuvē vietnē www.jacionline.org).

SCFA ārstēšana BEC kultūrā

Pirms inficēšanās ALI kultūras pamatā apstrādāja ar 100, 400 vai 1600 mM acetāta, butirāta. vai propionējiet 24 stundas 600 ml ALI gala barotnē, kas sastāv no bronhu epitēlija bāzes barotnes un Dulbecco modificētās Eagle barotnes (attiecība 50:50), kas satur hidrokortizonu (0,1 procents) , liellopu insulīns (0,1 procents), epinefrīns (0,1 procents), transferīns (0,1 procents), liellopu hipofīzes ekstrakts (0,4 procenti) un etanolamīns (80 mM), MgCl2 (0,3 mM), MgSO4 (0,4 mM), BSA (0,5 mg). /mL), amfotericīns B (250 mg/ml), all-trans-retīnskābe (30 ng/ml), penicilīns/streptomicīns (2 procenti) un rekombinantais cilvēka epitēlija augšanas faktors (0,5 ng/ml). Infekcijas dienā bazālā barotne tika aizstāta ar jaunu ALI galīgo barotni un SCFA ārstēšanu, kas tika atstāta līdz beigu punkta analīzei.

RV infekcija un paraugu ņemšana

ALI-BEC kultūras tika inficētas apikāli ar RV-A1. Sākotnēji RV-A1 izejvielu atšķaidīja, lai iegūtu MOI 0,1, un pievienoja kultūru apikālajai virsmai 2 stundas 50 ml bronhiālā epitēlija bāzes barotnē ar piedevām, 1% insulīna- transferīns-selēns un 0,5 procenti linolskābes. Pēc tam atlikušajā eksperimenta laikā infekcijas barotne tika aizstāta ar 500 ml svaigas bronhu epitēlija bāzes barotnes (ar piedevām). Apikālās mazgāšanas (100 ml PBS) un bāzes barotnes paraugi tika savākti 8- un 48-stundu pēc inficēšanās un uzglabāti 2808 C temperatūrā. Šūnas tika uzglabātas 350 ml RLT buferšķīdumā (Qiagen), kas satur 1 procentu 2-merkaptoetanola 2808 °C temperatūrā, lai veiktu gēnu ekspresijas analīzi ar RT kvantitatīvo PCR (attēls E2, C).

Atbilstoši pastiprinātajai pretvīrusu imūnsistēmas iedarbībai acetātam bija tendence samazināt vīrusa RNS kopiju skaitu (E2, D attēls) un dzīvu vīrusu slodzi (E2, E attēls) 48 stundas pēc inficēšanās. BEAS2B šūnās, BEC līnijā, mēs novērojām, ka apstrāde ar acetātu palielināja IFNB1 mRNS ekspresiju 8 stundas pēc inficēšanās un IFNL2 mRNS ekspresiju 4 un 8 stundas pēc inficēšanās (E2, F attēls). Nebija būtiskas ietekmes uz Viperin ekspresiju (E2, F attēls). Atšķirībā no ietekmes uz vīrusu slodzi, kas novērota A459 šūnās, acetāts neietekmēja vīrusa RNS vai TCID50 kvantitatīvo noteikšanu BEAS2B šūnās (E2, G un H attēls).

SCFA ārstēšanas ietekme uz pretvīrusu reakcijām ALI-BEC inficētās kultūrās

Novērojot acetāta pastiprinošo iedarbību plaušu epitēlija šūnu līnijās, mēs pēc tam centāmies novērtēt ietekmi primāro epitēlija šūnu modelī, kas diferencētas ALI (eksperimentālā sistēma, kas precīzāk apkopo in vivo šūnas). Šūnu diferenciāciju un morfoloģiju apstiprināja kausu šūnu veidošanās (periodiskā skābes-Šifa krāsošana) (E1 attēls).

Acetāts ievērojami palielināja IFNB1 un IFNl2/3 (IL28) ar RV inficētām BEC, salīdzinot ar neinficētām šūnām (3., B un D attēls), taču nebija atšķirības salīdzinājumā ar neapstrādātām RV inficētām šūnām. Acetātam bija tendence samazināt vīrusa RNS vai nu 8 stundās, vai 48 stundās pēc inficēšanās ar RV-A1 (3. attēls, A un B). Ņemot vērā to, ka acetātam bija mazāk izteikta pastiprinošā ietekme uz I tipa IFN reakciju RV indukciju primārajās diferencētās epitēlija šūnās, mēs paplašinājām izmeklēšanu, lai noteiktu, vai butirātam vai propionātam ir pamanāma ietekme. Butirāts un propionāts arī palielināja IFNb, IFNl2/3 (IL28) un IFNl1 (IL29) gēnu ekspresijas mRNS ekspresiju, salīdzinot ar neinficētām šūnām (3. attēls, F, G, H un L). Ārstēšana ar butirātu palielināja IFNB1, IL28 un IL29 ekspresiju 48 stundas pēc inficēšanās ar RV, salīdzinot ar neapstrādātām ar RV inficētām šūnām, lai gan šī iedarbība nebija pietiekama, lai ietekmētu vīrusu slodzi (3. attēls, I, J, K, un L). Mēs neatradām nomācošu ietekmi uz RV izraisītu MUC5AC ekspresiju jebkurā SCFA ārstēšanas devā (skatiet E3 attēlu, AC, šī raksta tiešsaistes krātuvē vietnē www.jacionline.org). Kopumā šie dati liecina, ka atšķirībā no datiem par pelēm un cilvēka šūnu līnijām, SCFA ir ierobežotāka ietekme uz pretvīrusu imunitāti diferencētās primārās epitēlija šūnās.

SCFA neietekmē I tipa IFN atbildes reakcijas alveolārajos makrofāgos

Lai noskaidrotu, vai acetāta un/vai citu SCFA pretvīrusu iedarbība bija saistīta ar alveolāro makrofāgu modulāciju (galvenā šūna ar agrīnu reakciju vīrusu infekciju laikā un galvenais I tipa IFN avots), mēs novērtējām SCFA ievadīšanas ietekmi uz ex vivo. pretvīrusu reakcijas makrofāgos, kas stimulēti ar RVA1. Mēs noskaidrojām, ka SCFA ievadīšanai nebija būtiskas ietekmes uz RV izraisītu Ifnb1, Viperin vai OAS1 indukciju, norādot, ka SCFA imūnstimulējošā iedarbība nenotiek, iedarbojoties uz alveolārajiem makrofāgiem (skat. E4 attēlu, AC, šī raksta tiešsaistē. Repozitorijs vietnē www.jacionline.org).

Ar elpceļiem ievadīti SCFA pastiprināti IFN-b un vīrusu jutīgie receptori pirms RV infekcijas

Lai iegūtu papildu mehānisku ieskatu pretvīrusu ceļiem, kas saistīti ar I tipa IFN uzlabošanu ar SCFA, mēs pēc tam pētījām šo savienojumu ietekmi uz pretvīrusu ceļu uztverošajiem gēniem. Mēs atkal intranazāli ievadījām 3 SCFA (acetātu, butirātu un propionātu) 20 mM koncentrācijās 24 stundas (4. attēls, A). Mēs nekonstatējām neviena SCFA ietekmi uz citozola vīrusa RNS sensora MDA5 vai tā adaptera molekulas MAVS ekspresiju (4., B un C attēls). Un otrādi, butirāta ievadīšana (bet ne citi SCFA) pārregulēja RIGI mRNS ekspresiju (4. attēls, D). Tika konstatēts, ka butirāta pastiprinošā ietekme uz RIG-I ekspresiju ir īpaši saistīta ar plaušu epitēlija/stromas šūnām (CD452), bet hematopoētiskajās imūnās šūnās (CD451) netika novērota ietekme (4. attēls, EI). Kopumā šie dati liecināja, ka dažādi SCFA var darboties, izmantojot specifiskus pretvīrusu jutīguma ceļus, lai regulētu iedzimto imunitāti.

DISKUSIJA

Šis pētījums sniedz jaunu ieskatu par iespējamo ieguvumu no mikrobu metabolītu ievadīšanas tieši elpceļos, lai palielinātu plaušu iedzimto imunitāti. Diētiskās šķiedras un zarnu mikrobiotas iegūtie SCFA jau sen ir saistīti ar labvēlīgu ietekmi uz plaušu veselību. Randomizēts, placebo kontrolēts pētījums parādīja, ka prebiotiku (šķiedru) lietošana priekšlaicīgi dzimušiem zīdaiņiem novērsa RV infekcijas pirmajā dzīves gadā.20 Diētiskās šķiedras ir nesagremojami polisaharīdi, kurus mikrobu fermentācijas ceļā var noārdīt līdz SCFA. Pētījumi arī atklāja, ka SCFA var modulēt veselīgu zarnu mikrobiotu.21 Mūsu pētījums uzsver, ka SCFA ievadīšana elpceļos var arī tieši lokāli labvēlīgi ietekmēt saimniekorganisma reakciju. Mēs esam identificējuši atšķirīgu mehānismu no uztura izraisītas ietekmes uz mikrobiotu, kas ietver iedzimtas pretvīrusu imunitātes tiešu plaušu stimulāciju ar SCFA.

Mūsu dati liecina, ka SCFA acetāta ievadīšana palielina pretvīrusu imūnmediatoru bazālo ekspresiju līdzsvara stāvoklī. Tas konceptuāli atbilst acetāta lomai plaušu sagatavošanā, lai nodrošinātu spēcīgāku agrīnu IFN izdalīšanos. To apstiprināja mūsu atklājumi, ka acetāta ievadīšana arī veicināja IFN un ISG indukciju, reaģējot uz RV infekciju pelēm. Tas bija saistīts ar samazinātu vīrusu slodzi un vēlāku proinflammatorisko reakciju un gļotu veidošanās nomākšanu. Visas šīs sekas tiek uzskatītas par labvēlīgām akūtas vīrusu infekcijas kontekstā. Mūsu dati atbilst literatūras kopumam, kas parāda, ka acetāts ir iesaistīts plaša spektra ieguvumu sniegšanā veselībai, piemēram, sirdsdarbības uzlabošanā, sarkano asinsķermenīšu veidošanās uzlabošanā un imūnās atmiņas veidošanā.22 Turklāt acetāts ir saistīts ar dažādu veidu modulēšanu. imūnās atbildes funkcijas23-25 un elpceļu slimību kontrole.

Mēs arī pētījām acetāta ievadīšanas ietekmi uz epitēlija RV infekciju, jo tā ir primārā vīrusa replikācijas vieta. Mēs atklājām līdzīgu acetāta pretvīrusu pastiprinošo efektu cilvēka plaušu šūnu līnijās, ar spēcīgāku iedarbību A549 šūnās nekā BEAS-2B šūnās (kuras, kā zināms, ekspresē augstāku IFN un ISG bazālo līmeni).27 ,28 Tas varētu daļēji izskaidrot, kāpēc apstrādei ar acetātu bija mazāka ietekme uz BEAS-2B šūnām. Turpretī mēs novērojām, ka cilvēka primāri diferencētajos BEC (ALI-BEC) nebija skaidras acetāta ietekmes uz I tipa IFN reakciju uz RV. Turklāt mēs novērtējām arī acetāta un citu SCFA spēju modulēt I tipa IFN atbildes alveolāros makrofāgos, kas kultivēti ex vivo, un līdzīgi nekonstatējām nekādu efektu. Šī neatbilstība starp in vivo un in vitro atklājumiem var liecināt, ka vairāki šūnu tipi un šūnu-šūnu komunikācija var būt atbildīgi par skaidru fenotipu, kas novērots in vivo, ar mazāk spēcīgu efektu, kas novērots, ja izolētas šūnas tiek apstrādātas ar SCFA.

Lai gan mūsu pētījuma galvenais mērķis bija novērtēt SCFA ietekmi uz iedzimtu pretvīrusu imunitāti, ir iespējams, ka varētu rasties pakārtota ietekme uz adaptīvām imūnreakcijām, un turpmākie pētījumi var koncentrēties uz iespējamo ietekmi uz T- un B-limfocītu populācijām un ražošanu. neitralizējošām antivielām.

Jāņem vērā arī tas, ka mūsu izmantotais peles modelis ir tāds, kurā notiek salīdzinoši ierobežota (;{0}} stundu) vīrusa replikācija, lai gan visi izmērītie galapunkti ir atkarīgi no replikācijas.12,29 Turpmākie pētījumi, izmantojot pelei pielāgotus vīrusu celmus. kur vīrusu replikācija ir noturīgāka, var būt dziļāka un ilgstošāka ietekme. Turklāt mūsu eksperimenti tika veikti tikai ar peļu mātītēm, un turpmākiem pētījumiem jāapstiprina, vai līdzīga iedarbība rodas arī vīriešiem.

Lai gan acetātam bija ierobežota ietekme uz ALI-BEC, mēs novērojām, ka butirāta ievadīšana var palielināt I tipa IFN reakciju RV indukciju. Šie dati ir pretrunā ar Chemudupati et al pētījumu30, kas parādīja butirāta nomācošu ietekmi uz I tipa IFN reakcijām. Tomēr šajā pētījumā tika izmantotas daudz lielākas butirāta koncentrācijas, kā arī uzmanība tika pievērsta dažādiem elpceļu vīrusiem.

Gļotu veidošanās plaušās ir raksturīga RV infekcijai, kas izraisa paaugstinātu astmas un HOPS klīnisko smagumu un saasināšanos,31,32 īpaši pateicoties MUC5AC pastiprināšanai elpceļu iekaisumam.33 Mēs parādījām, ka ārstēšana ar acetātu samazināja plaušu Muc5AC ekspresiju 4. un 4. dienā. 6 pēc inficēšanās. Attiecīgi ir pierādīts, ka SCFA mazina gļotu veidošanos plaušās gripas infekcijas34 un alerģiska elpceļu iekaisuma laikā.34,35 Tomēr ALI-BEC šūnās acetāts nemodulēja Muc5AC gēna ekspresiju, lai gan jāatzīmē, ka vēlāki laika punkti nav pārbaudīts. Mūsu novērojums par samazinātu mucīna ekspresiju pelēm, kas ārstētas ar acetātu un inficētas ar vīrusu, atbilst mūsu iepriekšējiem atklājumiem, ka I tipa IFN negatīvi regulē galveno elpceļu mucīna Muc5ac ekspresiju vīrusa infekcijas laikā.14 Molekulārie mehānismi, ar kuriem tas notiek, nav skaidri. , lai gan iepriekšējie pierādījumi liecina, ka IL-13 mediētais 2. tipa iekaisums var būt nozīmīgs MUC5AC indukcijā.36,37 Turpmākajos pētījumos jācenšas visaptverošāk izprast, kā acetāts var ietekmēt elpceļu gļotu veidošanos.

Lai izpētītu molekulāros mehānismus, caur kuriem SCFA inducē IFN, mēs papildus izmērījām pretvīrusu ceļu uztverošo gēnu ekspresiju. Mēs novērojām, ka butirāts un mazākā mērā acetāts var izraisīt RIG-I ekspresiju plaušu epitēlija šūnās no naivām pelēm. Mūsu dati liecina, ka šie SCFA palielina vīrusu uztveršanas reakciju, sagatavojot plaušas pastiprinātai iedzimtai reakcijai uz vīrusu infekciju.

Elpceļu epitēlija šūnās gan astmas, gan HOPS gadījumā ir novērota I tipa IFN ražošanas pavājināšanās ex vivo I tipa IFN veidošanās gadījumā. Mehānismi, kas izraisa šos defektus, nav zināmi. Ir nepieciešams turpmāks darbs, izmantojot dzīvnieku modeļus vai slimu šūnu kultūras sistēmas, lai noteiktu, vai astmas un HOPS gadījumā novērotā mikrobu disbioze izraisa relatīvu acetāta vai citu SCFA deficītu, ko varētu koriģēt, ievadot, lai atjaunotu pavājinātu pretvīrusu imunitāti.

Rezumējot, SCFA lietošana kā ārstēšana pret RV infekciju ir saistīta ar I un III tipa IFN ražošanas palielināšanos, kas ir plaušu pretvīrusu imūnās atbildes centrālās sastāvdaļas. Šis pētījums uzsver, ka mikrobu metabolītu, piemēram, SCFA, ievadīšana elpceļos var labvēlīgi ietekmēt pretvīrusu imunitāti un potenciāli uzlabot elpceļu vīrusu slimību smagumu.

ATSAUCES

1. Trompette A, Gollwitzer ES, Yadava K, Sichelstiel AK, Sprenger N, Ngom-Bru C u.c. Diētisko šķiedru zarnu mikrobiotas metabolisms ietekmē alerģiskas elpceļu slimības un hematopoēzi. Nat Med 2014;20:159-66.

2. Thorburn AN, McKenzie CI, Shen S, Stanley D, Macia L, Mason LJ u.c. Pierādījumi, ka astma ir attīstības izcelsmes slimība, ko ietekmē mātes uzturs un baktēriju metabolīti. Nat Commun 2015; 6:7320.

3. Rivera-Chavez F, Zhang LF, Faber F, Lopez CA, Byndloss MX, Olsan EE u.c. Butirātu ražojošo klostrīdiju izsīkšana no zarnu mikrobiotas veicina salmonellas aerobo luminālo izplešanos. Šūnu saimnieka mikrobs 2016;19:443-54.

4. Fachi JL, Secca C, Rodrigues PB, Mato FCP, Di Luccia B, Felipe JS u.c. Acetāts koordinē neitrofilu un ILC3 reakcijas pret C. difficile caur FFAR2. J Exp Med 2020;217:jem.20190489.

5. Antunes KH, Fachi JL, de Paula R, da Silva EF, Pral LP, Dos Santos AA u.c. No mikrobiotas iegūtais acetāts aizsargā pret elpceļu sincitiālā vīrusa infekciju, izmantojot GPR43-1. tipa interferona reakciju. Nat Commun 2019;10:3273.

6. Correa-Oliveira R, Fachi JL, Vieira A, Sato FT, Vinolo MA. Imūnās šūnu funkcijas regulēšana ar īsās ķēdes taukskābēm. Clin Transl Immunol 2016;5:e73.

7. Koh A, De Vadder F, Kovatcheva-Datchary P, Backhed F. No uztura šķiedrām līdz saimnieka fizioloģijai: īsas ķēdes taukskābes kā galvenie baktēriju metabolīti. Šūna 2016;165: 1332-45.

8. Sulaiman I, Wu BG, Li Y, Tsay JC, Sauthoff M, Scott AS u.c. Funkcionāla apakšējo elpceļu mikrobioma genoma profilēšana, lai fiksētu aktīvo mikrobu metabolismu. Eur Respir J 2021;58:2003434.

9. Glanville N, Johnston SL. Problēmas, izstrādājot starpserotipu rinovīrusu vakcīnu. Curr Opin Virol 2015;11:83-8.

10. Spacova I, De Boeck I, Bron PA, Delputte P, Lebeer S. Aktuāla mikrobu terapija pret elpceļu vīrusu infekcijām. Trends Mol Med 2021;27:538-53.

11. Antunes KH, Stein RT, Franceschina C, da Silva EF, de Freitas DN, Silveira J u.c. Īsās ķēdes taukskābju acetāts izraisa pretvīrusu reakciju, ko mediē RIG-I šūnās no zīdaiņiem ar elpceļu sincitiālā vīrusa bronhiolītu. EBioMedicine 2022;77: 103891.

12. Bartlett NW, Walton RP, Edwards MR, Aniscenko J, Caramori G, Zhu J u.c. Peļu modeļi rinovīrusa izraisītai slimībai un alerģiska elpceļu iekaisuma paasinājumam. Nat Med 2008;14:199-204.

13. Singanayagam A, Glanville N, Girkin JL, Ching YM, Marcellini A, Porter JD u.c. Kortikosteroīdu pretvīrusu imunitātes nomākšana palielina baktēriju slodzi un gļotu veidošanos HOPS saasināšanās gadījumā. Nat Commun 2018; 9:2229.

14. Gentzsch M, Boyles SE, Cheluvaraju C, Chaudhry IG, Quinney NL, Cho C u.c. Nosacīti pārprogrammētu cistiskās fibrozes bronhu epitēlija šūnu farmakoloģiskā glābšana. Am J Respir Cell Mol Biol 2017;56:568-74.

15. Liu X, Ory V, Chapman S, Yuan H, Albanese C, Kallakury B u.c. ROCK inhibitors un barojošās šūnas izraisa epitēlija šūnu nosacītu pārprogrammēšanu. Am J Pathol 2012;180:599-607.

For more information:1950477648nn@gmail.com