Algināta oligosaharīds atvieglo D-galaktozes izraisītu sirds novecošanos, regulējot miokarda mitohondriju darbību un integritāti pelēm

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstrakts

Novecošana ir būtisks riska faktors ar vecumu saistītu sirds un asinsvadu slimību attīstībai. Tāpēc ir rūpīgi jāizpēta novecošanās molekulārie mehānismi un jaunas pretnovecošanās iejaukšanās. Algināta oligosaharīdam (AOS) ir augsta farmakoloģiskā aktivitāte un labvēlīga iedarbība. Mūsu pētījums tika veikts, lai noskaidrotu, vai AOS var izmantot kā pretnovecošanās līdzekli, lai mazinātu sirds novecošanos. D-galaktozes (D-gal) izraisītas C57BL/6J novecojošas peles tika noteiktas, subkutānu injekciju ievadot D-gal (200 mg-kg'-d') 8 nedēļas. AOS (50 100 un 150 mg; kg'l.d') tika ievadītas intragastrāli pēdējās 4 nedēļas. Rezultātā AOS novērsa sirds disfunkciju D-gal izraisītām novecošanas pelēm, tostarp daļēji saglabātu izsviedes frakciju (EF procenti) un frakcionētu saīsināšanu (FS procenti).cistanche benefíciosAOS no devas atkarīgā veidā inhibēja D-gal izraisītu natriurētisko peptīdu A (ANP), smadzeņu natriurētiskā peptīda (BNP) un novecošanās marķieru p53 un p21 regulēšanu. Lai turpinātu izpētīt iespējamos mehānismus, kas veicina AOS aizsargājošo iedarbību pret novecošanos, tika analizēts ar vecumu saistīts mitohondriju kompromiss. Mūsu dati liecināja, ka AOS mazināja D-gal izraisītu sirds novecošanos, uzlabojot mitohondriju bioģenēzi, saglabājot mitohondriju integritāti un uzlabojot traucētu mitohondriju efektīvu noņemšanu. AOS arī samazināja ROS veidošanos un oksidatīvā stresa stāvokli, kas savukārt vēl vairāk kavē sirds mitohondriju iznīcināšanu. Šie rezultāti kopā parāda, ka AOS var būt efektīvs terapeitiskais līdzeklis sirds novecošanās mazināšanai.

ATSLĒGVĀRDI

alginātu oligosaharīds, sirds novecošanās, D-galaktoze, mitohondriji, oksidatīvais stress

1|IEVADS

Novecošanu var plaši definēt kā no laika atkarīgu šūnu bojājumu uzkrāšanos, kas izraisa progresējošu audu un orgānu funkcionālo samazināšanos.¹ Kopumā ar vecumu saistītas izmaiņas sirdī galvenokārt ietver kreisā kambara hipertrofiju, pastiprinātu miokarda fibrozi un sirds mazspēju.Cistanche ekstrakts pret radiācijuNovecošana ir būtisks riska faktors ar vecumu saistītu sirds un asinsvadu slimību attīstībai, kas ievērojami palielina sirds un asinsvadu slimību izplatību iedzīvotāju novecošanā.23 Tādējādi novecošanas izraisītas sirds mazspējas ārstēšanai ir steidzami nepieciešamas efektīvākas ārstēšanas stratēģijas. .

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Algināts ir dabisks no jūras aļģēm iegūts polisaharīds, kas iegūts no brūnajām aļģēm. Algināta oligosaharīdu (AOS) ražo, depolimerizējot alginātu, kam ir vairākas unikālas priekšrocības, piemēram, ūdenī šķīstošs, netoksisks, neimunogēns un bioloģiski noārdāms. AOS veic daudzsološas bioloģiskas aktivitātes. Šim oligosaharīdam piemīt neiroprotektīvas, hipolipidēmiskas, antioksidatīvas, "pretiekaisuma", antiagregācijas, pretaudzēju,10 antibakteriālas un imūnregulējošas īpašības, kā arī nomāc aptaukošanos¹ un uzlabotas glikācijas galaprodukta (AGE) aktivitātes. 4. Jo īpaši nav pētīts AOS spēja aizsargāt pret sirds novecošanos.

Mitohondriji ir dubultmembrānas organoīdi, un tie pilda vairākas funkcijas šūnu bioenerģētikā un vielmaiņā.14 Sirds ir orgāns ar augstu enerģijas pieprasījumu un augstu mitohondriju saturu. Sirds mitohondriji veido 90 procentus no ATP un tiem ir būtiska loma veselīgas sirds uzturēšanā.cistanche herbaMitohondriju disfunkcija, kas var paātrināt novecošanās procesu zīdītājiem, ir viens no svarīgākajiem novecošanas mehānismiem.15;16 Ar vecumu saistītai mitohondriju disfunkcijai ir dažādas pazīmes, tostarp mitohondriju integritātes zudums, samazināta mitohondriju bioģenēzes efektivitāte, slikta kvalitāte. kontrole ar autofagiju, samazināts mitohondriju membrānas potenciāls (MMP), izmaiņas mitohondriju dinamikā, palielināta reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanās un mutāciju uzkrāšanās mitohondriju DNS (mtDNS).17 Zemākas biogēnas un samazinātas klīrensa dēļ palielinātu bojājumu un samazinātas atjaunošanās kombinācija mitohondriālos galu galā var veicināt novecošanās procesu.18,17 Turklāt progresējoša mitohondriju disfunkcija izraisa palielinātu ROS veidošanos un oksidatīvo stresu, kas savukārt izraisa turpmāku mitohondriju pasliktināšanos un šūnu bojājumus un galu galā veicina līdz ar vecumu saistītai sirds disfunkcijai.20

Cistanche var novērst novecošanos

D-galaktozes (D-gal) izraisītas novecošanās dzīvnieku modeļi ir plaši izmantoti, lai pētītu novecošanās mehānismus un zāļu pretnovecošanās iedarbību.21 Liela daudzuma D-gal hroniska ievadīšana izraisa šūnu vielmaiņas traucējumus un šūnu bojājumus, kas paātrina novecošanās procesu un galu galā izraisīt strukturālas un funkcionālas izmaiņas sirds un asinsvadu sistēmā.22 Tāpēc pašreizējā pētījumā mēs izveidojām D-gal izraisītas peles novecošanās modeli, lai sistēmiski novērtētu AOS pretkardiozo novecošanās aktivitāti un turpinātu izmeklēšanu. iespējamo pamatā esošo mehānismu.

2|MATERIĀLI UN METODES

2.1|Zāles un reaģenti

D-galaktozi ieguva no Sigma-Aldrich. AOS tika iegādāts no Qingdao BZ Oligo Biotech Co., Ltd. Malondialdehīda (MDA) testa komplekts tika iegūts no Jiancheng Bioinženierijas institūta. Trušu poliklonālās antivielas pret BNP, PGC-1a, p67-phox un gp{4}}phox tika iegūtas no Abcam Inc. Trušu monoklonālās antivielas pret natriurētiskajiem peptīdiem A (ANP) un SIRT3 un peles monoklonālās antivielas pret p53 tika iegūtas no Abcam Inc. Trušu poliklonālās antivielas pret beklīnu-1 un p-mTOR tika iegādātas no Cell Signaling Technology. Trušu poliklonālās antivielas pret p21 un peles monoklonālās antivielas pret p47-phox tika iegūtas no Santa Cruz Biotechnology, Inc. Trušu poliklonālās antivielas pret mTOR tika iegādātas no Proteintech Group, Inc. Mitohondriju ekstrakcijas komplekts un JC{14} } mitohondriju membrānas potenciāla noteikšanas komplekts tika iegādāts no Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. TIANamp Genomic DNS komplekts tika iegūts no Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD.cistanche dzimumlocekļa augšanaPeles mtDNS zondes PCR komplekts tika iegādāts no Beijing Tiandz Gene Technology CO., Ltd. Tika iegādāts kazu anti-trušu IgG (H＋L) (konjugēts ar peroksidāzi/HRP) un kazas anti-peles IgG (H plus L) (konjugēts peroksidāze/HRP). no Elabscience Biotechnology Co., Ltd. Visas pārējās ķīmiskās vielas un reaģenti tika iegādāti no standarta komerciāliem piegādātājiem, ja vien nav norādīts citādi.

2.2|Dzīvnieki

Peļu tēviņi8-nedēļu vecas C57BL/6J (20±2 gbodyweight,n=40) tika iegūtas no Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co, LTD. Visas peles tika barotas ar parasto barību un tika izmitinātas 12-stundu gaišā/12-stundu tumšā ciklā īpašos bez patogēnu (SPF) apstākļos Cjindao Universitātes Medicīnas departamenta Laboratorijas dzīvnieku centrā. . Visas eksperimentālās procedūras ar dzīvniekiem atbilda “Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatai”, ko publicējis ASV Nacionālā veselības institūta un sabiedrības veselības dienesta politika par humānu aprūpi un laboratorijas dzīvnieku izmantošanu. Pētījuma protokolus apstiprināja Qingdao Universitātes Eksperimentu ar dzīvniekiem ētikas komiteja (apstiprinājuma numurs: QYFYWZLL25840).

2,3|D-gal izraisīts novecošanas modelis un zāļu ievadīšana

Peles tika nejauši sadalītas piecās grupās (n =8 katrā grupā): kontrole, D-gal, D-gal plus mazas devas AOS (D-gal plus AOS-50), D-gal plus vidējas devas AOS (D-gal plus AOS-100) un D-gal plus lielas devas AOS (D-gal plus AOS-150) grupas. C57BL/6J pelēm novecošana tika ierosināta, subkutānu injekciju ievadot D-gal (200 mg/kg, Sigma-Aldrich) 8 nedēļas.23,24 Kontroles pelēm tika ievadīta līdzvērtīga sterila ūdens subkutāna injekcija. Četras nedēļas pēc D-gal injekcijas, D-gal plus AOS-50, D-gal plus AOS-100 un D-gal plus AOS-150 grupas tika intragastrāli ievadītas kopā ar AOS ( attiecīgi 50, 100 un 150 mg-kg2-d'l) vēl 4 nedēļas. Kontroles grupas un D-gal grupas pelēm intragastrāli tika ievadīts līdzvērtīgs sāls šķīdums.

2,4|Ehokardiogrāfija

Ehokardiogrāfija tika veikta anestēzētām pelēm, izmantojot Vevo2100(VisualSonics) ar 30-MHz devēju eksperimenta beigās. Šādi parametri tika mērīti, kā aprakstīts iepriekš: kreisā kambara izsviedes frakcija (EF) un kreisā kambara frakcionētā saīsināšana (FS).25

2,5|Histoloģiskā analīze

Sirds paraugi tika fiksēti ar 4% paraformaldehīdu 24 stundas, pēc tam iestrādāti parafīnā un sagriezti 4-mm biezās daļās. H&E un Massona trihroma krāsošana tika izmantota, lai vizualizētu attiecīgi sirds arhitektūru un sirds fibrozi. Šķēles tika pārbaudītas ar apgrieztas gaismas mikroskopu (TE 200, Nikon). Atbilstošos datus analizēja un aprēķināja pētnieki, kuri bija akli pret ārstēšanas grupu piešķiršanu.

2,6|Transmisijas elektronu mikroskopija

Mitohondriju ultrastruktūra tika noteikta, izmantojot transmisijas elektronu mikroskopijas analīzi. Pēc iepriekšējā pētījuma 26 svaigi kreisā kambara audi tika sagriezti 1 mm³ blokos un fiksēti 2,5% glutaraldehīdā 2 stundas 4 grādu temperatūrā. Pēc 2 stundām istabas temperatūrā pēcfiksācijas 1% osmija tetroksīdā kreisā kambara audi tika dehidrēti un pēc tam iestrādāti sveķos. Sērijveida īpaši plānas sekcijas (30-40 nm) tika savāktas uz vara režģiem un visbeidzot iekrāsotas ar 0,5 procentiem uranilacetāta, kam sekoja 1 procenti svina citrāta. Krāsotu sekciju ultrastrukturālā analīze tika noteikta ar Tecnai G2 12 transmisijas elektronu mikroskopiju (FEI Co.).

2,7|Mitohondriju membrānas potenciāla (MMP) noteikšana

Mitohondriju membrānas potenciāls tika mērīts, izmantojot JC-1 imūnfluorescējošu krāsošanu un plūsmas citometriju. Svaigi sirds audi tika izmantoti, lai sagatavotu saldētas sekcijas vai ekstrahētu mitohondrijus. Saldētas sekcijas tika izmantotas JC-1 imunofluorescējošai krāsošanai saskaņā ar ražotāja protokolu.cistanche salsas priekšrocībasFluorescence tika noteikta pie ierosmes/emisijas 485/580 nm (sarkans) un ierosmes/emisijas 485/530 nm (zaļš), izmantojot fluorescences mikroskopu.

Turklāt mitohondriji tika izolēti no svaigiem sirds audiem, izmantojot mitohondriju ekstrakcijas komplektu saskaņā ar metodi, ko publicēja Peng et al?. Pēc tam ekstrahētie mitohondriji tika izmantoti, lai noteiktu MMP integritāti, mērot JC{ fluorescējošo intensitāti. {2}}. Īsumā, mitohondriji tika inkubēti ar JC-1 JC-1 testa buferšķīdumā 10 minūtes istabas temperatūrā. Karbonilcianīda m-hlorfenilhidrazons tika izmantots, lai izjauktu MMP un kalpoja kā pozitīva kontrole, ievērojot ražotāja norādījumus. Paraugi tika analizēti pie 488 un 575 nm ar plūsmas citometriju, izmantojot CellQuest programmatūru (Becton Dickinson).

2,8|mtDNS kopiju skaita mērīšana

Mitohondriju DNS kopiju skaits tika mērīts ar kvantitatīvu reālā laika PCR (qPCR). Īsāk sakot, sirds audi tika homogenizēti un izņemti proteīni un RNS, izmantojot proteināzi K un RNāziA. Kopējās DNS tika ekstrahētas ar TIANamp Genomic DNS komplektu un pēc tam kvantitatīvi noteiktas ar QuickDrop spektrofotometru no Molecular Devices (Holliston, MA). Peles mtDNA zondes PCR komplekts tika izmantots, lai pastiprinātu parauga mtDNS ar fluorescences PCR noteikšanas sistēmu (Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd.). mtDNS kopiju skaits tika aprēķināts no qPCR pozitīvās kontroles līknes saskaņā ar ražotāja protokolu.

2,9|ROS ražošanas noteikšana in situ

Kā aprakstīts iepriekš, DHE fluorescences krāsošana tika veikta, lai novērtētu ROS ražošanas līmeni in situ.2³ Īsumā, svaigi sirds audi tika iestrādāti AZT savienojumā un pēc tam nekavējoties sasaldēti, izmantojot kriostatu -20 pakāpē. Saldētie sirds audi tika sagriezti 6-mm biezos histoloģiskajos priekšmetstikliņos. Sirds šķēles tika mazgātas ar 1 x fosfātu buferšķīdumu (PBS) un pēc tam inkubētas ar DHE (5 umol / l) šķīdumu gaismas aizsargātā mitrinātā kamerā 37 grādu temperatūrā 30 minūtes. Pēc inkubācijas šķērseniskās sirds sekcijas tika izskalotas ar 1 × PBS. Visbeidzot, attēli tika iegūti ar fluorescences mikroskopu, un fluorescences intensitāte tika kvantificēta ar ImageJ programmatūru, izmantojot aklo testeri.

2.10|Lipīdu peroksidācijas mērīšana

Kā galvenie lipīdu peroksidācijas sekundārie oksidācijas produkti, malondialdehīda (MDA) koncentrācija serumā un sirds homogenātos tika mērīta saskaņā ar MDA testa komplekta (Jiancheng Bioinženierijas institūta) norādījumiem.

2,11|Western blot analīze

Sirds audi tika homogenizēti RIPA buferšķīdumā, kas satur fosfatāzes un proteāzes inhibitorus, un centrifugēti ar 12 00 apgr./min 4 grādiem 20 minūtes. Pēc tam supernatants tika savākts turpmākajiem eksperimentiem. Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta, izmantojot BCA proteīna testa komplektu. Vienāds daudzums olbaltumvielu tika ievietots 10 procentu SDS-PAGE gēlā un pārnests uz PVDF membrānām (Roche). Membrānas tika bloķētas ar blīvēšanas šķīdumu 1 stundu un inkubētas ar atbilstošām primārajām antivielām 4 grādu temperatūrā nakti. Pēc tam membrānas nomazgāja TBS-T un inkubēja ar atbilstošām sekundārajām antivielām. Pēc tam membrānas tika mazgātas TBS-T un vizualizētas, izmantojot ECL Western blot noteikšanas reaģentus (Bio-Rad). Olbaltumvielu ekspresija tika kvantitatīvi noteikta ar joslu densitometrijas analīzi, izmantojot ImageJ programmatūru. Mājas uzturēšanas proteīns GAPDH tika izmantots kā slodzes kontrole. Primāro un sekundāro antivielu atšķaidīšanas koeficienti tika parādīti šādi: ANP(1:1000),BNP(1:2000),p53(1:1000),p21 (1:1000),PGC-1 a (1:1000),SIRT3(1:1000),beclin-1(1:1000),p-mTOR(1:1000),mTOR (1:1000),p47-phox( 1:500),p67-phox(1:1000),gp91-phox(1:2000), GAPDH (1:2000), kazas anti-trušu IgG (H ＋ L)(peroksidāze /HRP konjugēts) (1:5000) un kazas pretpeļu lgG (H＋L) (konjugēts ar peroksidāzi/HRP) (1:5000).

2,12|Statistiskā analīze

Dati tika izteikti kā vidējais ± SEM. Statistiski nozīmīgi tika noteikti ar vienvirziena ANOVA, kam sekoja Studenta-Ņūmena Keula (SNK) post hoc tests.P<.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

3|REZULTĀTI

3.1|AOS ietekme uz sirds darbību un novecošanas marķieru izpausmi D-gal izraisītās novecošanas pelēm

Ehokardiogrāfija tika izmantota, lai analizētu peļu sirds darbību. D-gal izraisītām novecošanas pelēm bija ievērojams EF procentu un FS procentu samazinājums. Tomēr AOS būtiski novērsa sirds disfunkciju D-gal izraisītām novecojošām pelēm, tostarp daļēji saglabājušos EF procentus un FS procentus (1.A–C. attēls). Kā parādīts 1.D–G attēlā, sirdsdarbības ātrumā nebija statistiskas atšķirības starp katra grupa. D-galaktozes pelēm bija tendence palielināt LVEDD (kreisā kambara gala diastoliskais diametrs) un LVPWd (kreisā kambara aizmugurējās sienas biezums diastolā beigu beigās), taču nebija statistiski nozīmīgas atšķirības salīdzinājumā ar kontroles pelēm. Tomēr LVESD (kreisā kambara beigu sistoliskais diametrs) ievērojami palielinājās D-gal izraisītām novecojošām pelēm, un AOS samazināja LVESD atkarībā no devas. ANP un BNP ekspresija sirds audos tika noteikta ar Western blot, lai vēl vairāk pārbaudītu peļu sirds darbību katrā grupā. Kā parādīts 1H-I attēlā, ANP un BNP līmeņi bija ievērojami paaugstināti D-gal izraisītām novecojošām pelēm, un AOS ievērojami samazināja ANP un BNP līmeni atkarībā no devas. Šie dati liecināja, ka AOS novērsa sirds disfunkciju D-gal izraisītām novecošanas pelēm. Turklāt mēs atklājām novecošanās marķieru p53 un p21 olbaltumvielu ekspresiju. Kā gaidīts, p53 un p21 proteīna ekspresija ievērojami palielinājās D-gal izraisītu novecojošu peļu sirds audos, un AOS ievērojami samazināja p53 un p21 ekspresiju atkarībā no devas (1J-K attēls).

3.2|AOS ietekme uz sirds histopatoloģiskajām izmaiņām D-gal izraisītās novecošanās pelēm

Lai izpētītu peļu miokarda arhitektūras izmaiņas, sirds audu priekšmetstikliņi tika iekrāsoti ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E). Kā parādīts 2.A attēlā, salīdzinot ar kontroles pelēm, D-gal izraisītām novecojošām pelēm bija patoloģiska miokarda arhitektūra, ko galvenokārt raksturo nesakārtots kardiomiocītu izvietojums un palielināta starpšūnu telpa starp šūnām. AOS ievadīšana ievērojami samazināja nesakārtoto izvietojumu un vietu starp kardiomiocītiem. H&E krāsošana arī parādīja, ka kreisā kambara kardiomiocītu laukums tika ievērojami palielināts D-gal izraisītām novecojošām pelēm, un ārstēšana ar AOS ievērojami samazināja kardiomiocītu laukumu atkarībā no devas (attēls 2B, D).

Lai noskaidrotu sirds fibrozes pakāpi, tika veikta Masona sirds šķērsgriezumu trīshroma krāsošana. Kā parādīts 2C, E attēlā, kolagēna uzkrāšanās miokarda intersticiālajos un perivaskulārajos reģionos tika ievērojami palielināta D-gal izraisītām novecošanas pelēm. Tomēr, salīdzinot ar D-gal grupu, AOS ārstēšana ievērojami samazināja kolagēna laukuma procentuālo daudzumu atkarībā no devas (attēls 2C, E). Šie dati liecināja, ka AOS novērsa D-gal izraisītas morfoloģiskās izmaiņas un sirds fibrozi C57BL / 6J pelēm.

3,3|AOS ietekme uz D-gal izraisītu novecojošu peļu sirds mitohondriju ultrastruktūru

Pēc tam mēs izmantojām transmisijas elektronu mikroskopiju, lai noteiktu sirds mitohondriju ultrastruktūras izmaiņas. Kā parādīts 3. attēlā, kontroles peļu kardiomiocītu mitohondriji bija strukturāli normāli, un tiem bija skaidri saskatāmas kristas un elektronu caurspīdīga matrica. Tomēr daži D-gal peļu kardiomiocītu mitohondriji tika palielināti, pietūkums un daļējs cristae zudums, un AOS ārstēšana novērsa sirds mitohondriju ultras struktūras iznīcināšanu D-gal izraisītām novecošanas pelēm.

3,4|AOS ietekme uz D-gal izraisītu novecojošu peļu sirds MMP

Kā svarīgs mitohondriju funkcionālā stāvokļa noteicējs MMP tika mērīts, izmantojot JC-1 fluorescences krāsošanu un plūsmas citometriju. Parasti, ja mitohondriju membrānas potenciāls ir augsts, JC-1 agregējas mitohondrijās un izstaro sarkanu fluorescenci, savukārt JC-1 pastāv kā monomērs citozolā un izstaro zaļo fluorescenci, ja mitohondrijās ir zems membrānas potenciāls.29 Tātad. sarkanās fluorescences attiecība pret zaļo fluorescenci varētu atspoguļot MMP intensitāti. Kā parādīts 4A-B attēlā, JC-1 fluorescences krāsošanas rezultāts liecināja, ka sirds MMP līmenis D-gal izraisītām novecošanās pelēm bija ievērojami zemāks nekā kontroles pelēm, un AOS ievadīšana bija aizsargāta pret D- galaktozes izraisītā MMP samazināšanās. In

3,5|AOS ietekme uz mitohondriju bioģenēzi un autofagijas proteīna ekspresiju D-gal izraisītu novecojošu peļu sirdīs

Mēs izmantojām Western blot, lai noteiktu proteīna ekspresiju mitohondriju bioģenēzes marķiera PGC-1a. Kā gaidīts, ievērojama PGC-1o proteīna ekspresijas samazināšanās tika novērota D-gal izraisītas novecošanas peļu sirds audos, un AOS ievērojami palielināja PGC-1a ekspresiju no devas atkarīgā gadījumā. veidā (5A-B attēls). Pētījumi liecina, ka SIRT3 ir svarīga loma mitohondriju bioenerģētikas uzturēšanā. Tāpēc mēs tālāk atklājām SIRT3 ekspresiju sirds audos. Mūsu rezultāts parādīja, ka ievērojama SIRT3 proteīna ekspresijas samazināšanās D-gal izraisītās novecošanās pelēm un AOS ievērojami palielināja SIRT3 proteīna ekspresiju atkarībā no devas (attēls 5C-D). Turklāt mtDNS zondes PCR rezultāts parādīja, ka mtDNS kopiju skaits bija ievērojami samazināts D-gal izraisītām novecojošām pelēm, un AOS ievērojami palielināja mtDNS kopiju skaitu atkarībā no devas (attēls 5E). Šie dati norādīja, ka AOS regulēja mitohondriju bioģenēzi D-gal izraisītām novecošanas pelēm.

Pēc tam mēs izmantojām Western blot, lai noteiktu kritisko autofagijas regulatoru ekspresiju un fosforilāciju sirds audos. Kā parādīts 5F-I attēlā, D-gal izraisītu novecojošu peļu sirds audos tika novērota ievērojama beklin-1 proteīna ekspresijas samazināšanās un ievērojams mTOR fosforilācijas pieaugums. Kā gaidīts, AOS ievērojami palielināja beklin{5}} ekspresiju un samazināja mTOR fosforilāciju atkarībā no devas.

3,6|AOS ietekme uz ROS veidošanos un oksidatīvo stresu D-gal izraisītu novecojošu peļu sirdīs

Mēs noteicām ROS veidošanos sirdīs, izmantojot DHE fluorescences krāsošanu. Kā parādīts 6A-B attēlā, mēs noskaidrojām, ka kreisā kambara kardiomiocītu DHE fluorescences intensitāte tika ievērojami uzlabota D-gal izraisītām novecošanas pelēm, un AOS ievērojami samazināja kreisā kambara kardiomiocītu DHE fluorescences intensitāti.

Lai izpētītu AOS ietekmi uz oksidatīvā stresa stāvokli D-gal izraisītu novecojošu peļu sirdīs, mēs izmantojām Western blot, lai noteiktu NADPH oksidāzes proteīna ekspresiju sirds audos. NADPH oksidāzes apakšvienības p47-phox,p67-phox un gp91-phox ekspresija bija ievērojami palielināta D-gal izraisītām novecošanas pelēm. Tomēr AOS samazināja šo NADPH oksidāzes apakšvienību ekspresiju atkarībā no devas (6.C-D attēls).

Tā kā MDA tiek uzskatīts par iespējamo biomarķieri lipīdu peroksidācijai dzīvos organismos, mēs noteicām MDA koncentrāciju, lai novērtētu oksidatīvā stresa stāvokli in vivo . Kā parādīts 6E-F attēlā, paaugstināts oksidatīvā stresa statuss D-gal izraisītām novecojošām pelēm tika apstiprināts ar augstāku MDA koncentrāciju serumā un sirds homogenātos. AOS ievadīšana samazināja MDA līmeni atkarībā no devas, salīdzinot ar D-gal grupu. Kopumā šie dati liecināja, ka AOS ievērojami samazināja ROS veidošanos un oksidatīvā stresa stāvokli D-gal izraisītās novecošanās pelēm.

4|DISKUSIJA

Novecošana ir hroniskas un ar vairākiem orgāniem saistītas sistēmiskas izmaiņas organismā. Ar vecumu saistītās sirds un asinsvadu slimības un ar to saistītais finansiālais slogs ir kļuvuši par galveno pasaules mēroga izaicinājumu.30,31 Tādēļ sirds novecošanas molekulārie mehānismi ir rūpīgi jāizpēta, un jaunām pretnovecošanās intervencēm būs liela nozīme. uzlabot veselību, kā arī aizkavēt novecošanas izraisītu sirds mazspēju.

Algināts ir lineārs polisaharīdu kopolimērs, kas iegūts no brūnajām jūras aļģēm. Tā augstās molekulmasas un viskozitātes dēļ alginātam ir grūti šķērsot šūnu membrānas un bioloģiskās barjeras, kas ierobežo tā izmantošanu. AOS, kas iegūta no algināta hidrolīzes, ir piesaistījusi arvien lielāku uzmanību tā zemākas molekulmasas un viskozitātes dēļ. AOS ir ūdenī šķīstošs, netoksisks, neimunogēns un bioloģiski noārdāms savienojums, un tam ir daudz labāka bioloģiskā aktivitāte nekā alginātam. Pierādījumi liecina, ka AOS kā antioksidanta oligosaharīds spēj aizsargāt neirodeģeneratīvās slimības un akūtu doksorubicīna kardiotoksicitāti, inhibējot endoplazmatiskā tīkla stresu un oksidatīvo stresu.5 Nesenie pētījumi ir parādījuši, ka jūrā iegūta AOS uzrāda daudzsološu bioloģisko aktivitāti samazināšanā. hiperlipidēmija, hiperglikēmija un hipertensija un aptaukošanās nomākšana.27 Tomēr AOS spēja aizsargāt pret novecošanos nav pierādīta.

Iepriekšējie pētījumi liecina, ka novecojošai sirdij ir unikālas histoloģiskās un funkcionālās iezīmes, tostarp progresējoša sirds pārmodelēšana un sirds rezerves pasliktināšanās.25,32 Sirds iekšējā novecošana galu galā var palielināt neaizsargātību pret dažādiem stresa faktoriem un veicināt sirds un asinsvadu slimību attīstību. . D-gal izraisīti priekšlaicīgas novecošanas modeļi uzrāda līdzīgus sirds izmaiņu fenotipus, salīdzinot ar dabisko novecošanos grauzējiem.*4 Šajā pētījumā mēs parādījām, ka D-gal izraisītām novecojošām pelēm ir anomāla miokarda arhitektūra un palielināta kolagēna uzkrāšanās miokarda intersticiālajā daļā. un perivaskulārajos reģionos, un AOS ievadīšana kavēja D-gal izraisīto sirds remodelāciju C57BL/6J pelēm. Tikmēr mēs noskaidrojām, ka AOS novērsa sirds disfunkciju D-gal izraisītām novecošanas pelēm, tostarp daļēji saglabāja EF procentus un FS procentus, un samazināja ANP un BNP ekspresiju. Ehokardiogrāfija tika izmantota arī, lai analizētu peļu sirds struktūras izmaiņas. D-galaktozes pelēm bija tendence palielināt LVEDD un LVPWd, taču nebija statistiski nozīmīgas atšķirības salīdzinājumā ar kontroles pelēm. Tomēr LVESD ievērojami palielinājās D-gal izraisītām novecošanas pelēm, un AOS samazināja LVESD atkarībā no devas. Šīs parādības iemesls var būt tas, ka D-galaktozes imitācijas paātrinātas novecošanas modelim ir salīdzinoši īss modelēšanas laiks, kas galvenokārt ietekmē mitohondriju funkciju, kā parādīts zemāk, un izraisa sirds disfunkciju. Notika lielas sirds struktūras izmaiņas, taču tās neizraisīja statistiski nozīmīgas atšķirības. Turklāt mūsu dati arī parādīja, ka AOS ievadīšana būtiski samazināja novecošanās marķieru p53 un p21 ekspresiju atkarībā no devas. Lai turpinātu izpētīt iespējamos mehānismus, kas veicina AOS aizsargājošo spēju pret novecošanos, tika analizēts ar vecumu saistīts mitohondriju kompromiss.

Sirdī ir daudz mitohondriju, pamatojoties uz tās neparasto pieprasījumu pēc ATP. Mitohondriji ģenerē ATP, taukskābju un ogļhidrātu oksidatīvi fosforilējot. Turklāt šī procesa laikā pastāvīgi rodas arī brīvie radikāļi. Ir vērts atzīmēt, ka mitohondriju homeostāze ir ļoti svarīga kardiomiocītu funkcijas un dzīvotspējas uzturēšanai. 3 grāds Patiešām, neatkarīgi pētījumi par novecojošu sirdi ir parādījuši, ka kardiomiocītu mitohondriji tiek bojāti novecošanas laikā.3738 Vecu grauzēju ultrastrukturālā morfometriskā analīze. miokardā ir palielināti un pietūkuši mitohondriji, ar matricas novirzi un kristālu zudumu." Šajā pētījumā, salīdzinot ar kontroles pelēm, daži D-gal peļu kardiomiocītu mitohondriji tika palielināti, pietūkums un daļējs cristae zudums. Ārstēšana ar AOS mazināja sirds mitohondriju ultrastruktūras iznīcināšanu D-gal izraisītām novecojošām pelēm. Paralēli D-gal izraisīja būtisku sirds MMP līmeņa pazemināšanos, un AOS ievadīšana aizsargāja pret D-gal mediētu. MMP samazināšanās. Šie rezultāti liecināja, ka AOS neļāva sirds mitohondrijiem iznīcināt D-gal izraisītas novecošanas pelēm.

Ir atzīmēts, ka novecojušas sirds patoģenēzē ir iesaistīti vairāki apdraudēti mitohondriju procesi, tostarp mitohondriju bioģenēzes izmaiņas un izņemšana. Tikmēr mitohondriju disfunkcija un traucēta iznīcināto mitohondriju noņemšana, savukārt, palielina novecojušas sirds neaizsargātību pret stresa traumām." Mitohondriju bioģenēzi galvenokārt regulē kodolu kodētu koaktivatoru un transkripcijas faktoru kopums. Peroksisomu proliferatora aktivēts receptors y Ir pierādīts, ka koaktivators 1a (PGC-1a), kas ir ļoti svarīgs enerģijas homeostāzes uzturēšanai, spēlē galveno lomu mitohondriju bioģenēzes un funkcijas regulēšanā.4 Samazināta PGC-1izpausme un aktivitāte ir saistītas uz sirds novecošanos un sirds mazspējas attīstību."2 Iepriekšējais pētījums parāda, ka ar vecumu saistītā p53 aktivācija tieši izraisa mitohondriju kompromisu, apspiežot vairākus galvenos mitohondriju bioģenēzes regulatorus, tostarp PGC-1a. 43 Uzkrājošie pierādījumi liecina arī par to, ka PGC{15}o aktivizēšana ar farmakoloģisku vai ģenētisku iejaukšanos novērš ar novecošanos saistītas izmaiņas sirdī." Sirtuīni (SIRT) ir atzīti par neaizstājamiem novecošanās procesa regulatoriem. SIRT3, kas lokalizēts mitohondriju matricā, spēlē svarīgu lomu mitohondriju bioenerģētikas uzturēšanā, mitohondriju metabolisma modulēšanā un dzīves ilguma regulēšanā. Ir pierādīts, ka Sirt3 deficīts izraisa sirdsdarbības traucējumus un pasliktina mitohondriju bioenerģētiku pelēm. 45 Šajā pētījumā mēs parādījām, ka ievērojama PGC-1a un SIRT3 proteīna ekspresijas samazināšanās tika novērota D-gal izraisītas novecošanas peļu sirds audos, un AOS ievērojami palielināja PGC-1a. un SIRT3 proteīna ekspresija atkarībā no devas. Turklāt mtDNS zondes PCR rezultāts parādīja, ka mtDNS kopiju skaits ievērojami samazinājās D-gal izraisītām novecošanas pelēm, un AOS ievērojami palielināja mtDNS kopiju skaitu atkarībā no devas. Kopumā šie dati liecināja, ka AOS regulēja mitohondriju bioģenēzi D-gal izraisītām novecošanas pelēm.

Kā minēts iepriekš, efektīva traucētu mitohondriju noņemšana ir ļoti svarīga kardiomiocītu homeostāzes uzturēšanai. Plaši zināms mehānisms, kā mitohondriji tiek apgriezti, ir autofagija. Tiek ierosināts, ka autofagijai ir izšķiroša loma sirds homeostāzes regulēšanā bazālajā stāvoklī, kā arī reaģējot uz stresu.46,47 Tomēr novecojošā sirdī autofagija parasti tiek samazināta. Zemāks autofagijas līmenis novecošanas procesa laikā samazina iznīcināto organellu un toksisko proteīnu degradāciju un izraisa disfunkcionālu un patoloģisku mitohondriju uzkrāšanos, kas galu galā izraisa globālu sirds disfunkciju. Ir pierādīts, ka autofagijas stimulēšana uzlabo sirds darbību grauzēju modeļos, noņemot disfunkcionālos mitohondrijus, tādējādi optimizējot kopējo šūnu vidi un galu galā atvieglojot ar novecošanos saistītu patoloģiju sirdī.48 Šajā pētījumā mēs parādījām, ka autofagijas līmenis sirdī ievērojami samazinās. D-gal izraisītu novecojošu peļu audos, un AOS ievērojami uzlaboja autofagijas līmeni atkarībā no devas. Šīs izmaiņas atklāja, ka AOS uzlaboja ar vecumu saistītu traucētu mitohondriju efektīvu noņemšanu, regulējot autofagiju. Kā minēts iepriekš, lielākā daļa ROS ražošanas, kas rodas no mitohondriju elektronu transportēšanas ķēdes (ETC) kompleksiem, rodas kā mitohondriju oksidatīvās fosforilācijas blakusprodukts.4 Eksperimentālie pierādījumi liecina, ka bojātie mitohondriji novecošanas gaitā rada lielāku daudzumu. ROS, pastiprina brīvo radikāļu radītos bojājumus un galu galā noved pie progresīvas atgriezeniskās saites mitohondriju sabrukšanas spirāles.4 Tas savukārt izraisa vairāk ROS, bojājot ETC, izraisot turpmāku ROS veidošanos un galu galā novedot pie bioenerģētikas kļūmes. . Papildus ETC nikotīnamīda adenīna dinukleotīda fosfāta (NADPH) oksidāze ir galvenais ROS ekstramitohondriju avots, kas var būt atbildīgs par oksidatīvo stresu novecošanās procesā un saasināt mitohondriju oksidatīvos bojājumus. Papildus šiem mehānismiem nesenais pētījums arī parādīja, ka mazāka mitohondriju ROS veidošanās veicina zema līmeņa mtDNS līdzsvara stāvokļa bojājumus.47 Augstāks mitohondriju bāzes ekscīzijas remonts (BER) un zems mitohondriju bojājums ilgstošiem zīdītājiem vispārējais veicina to izcilo ilgmūžību. Nesenais ziņojums liecina, ka NADPH oksidāzes inhibitors nomāc mitohondriāla disfunkciju D-gal izraisītu novecojošu žurku ventrālajā kohleārajā kodolā. MDA tiek uzskatīts par iespējamu biomarķieri lipīdu peroksidācijai dzīvos organismos, un MDA koncentrāciju var izmantot, lai novērtētu oksidatīvā stresa stāvokli in vivo . Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka AOS ievadīšana mazināja ROS veidošanos, pazemināja NADPH oksidāzes ekspresiju un samazināja MDA līmeni D-gal izraisītās novecošanās pelēm. Mūsu pašreizējie rezultāti liecināja, ka AOS efektīvi samazināja oksidatīvā stresa stāvokli D-gal izraisītām novecošanas pelēm, kas varētu būt vēl viens svarīgs AOS aizsardzības faktors, lai mazinātu mitohondriju bojājumus.

Šajā pētījumā mēs vispirms noskaidrojām, ka AOS atvieglo D-gal izraisītu sirds novecošanos, uzlabojot mitohondriju bioģenēzi, saglabājot mitohondriju integritāti un uzlabojot traucētu mitohondriju efektīvu noņemšanu C57BL / 6J pelēm. Turklāt AOS samazina arī ROS veidošanos un oksidatīvā stresa stāvokli, kas savukārt vēl vairāk kavē sirds mitohondriju iznīcināšanu. AOS var būt efektīvs terapeitisks līdzeklis sirds novecošanās mazināšanai. Šajā pētījumā mēs izmantojām tikai peļu tēviņus un neizpētījām dzimumu atšķirības uz AOS ietekmi. Ir ļoti interesanti, ka dendritisko šūnu specifiskā starpšūnu adhēzijas molekula{7} satver neintegrīna (DC-SIGN) ligandu. 1 (DSCL1, pretiekaisuma līdzeklis) ārstēšana samazina makrofāgu polarizāciju un diastolisko disfunkciju novecojošās mātītes, bet ne vīriešu peļu sirdī.52 Šis raksts liecina, ka turpmākajos pētījumos būtu ļoti svarīgi salīdzināt dzimumu atšķirības.

Visbeidzot, mūsu atklājumi liecināja, ka AOS mazināja D-gal izraisītu sirds novecošanos, regulējot miokarda mitohondriju darbību un integritāti pelēm. AOS piemīt plašs daudzsološu bioloģisko aktivitāšu klāsts, un tas var būt efektīvs terapeitiskais līdzeklis sirds novecošanās mazināšanai.

Šis raksts ir iegūts no J Cell Mol Med. 2021;25:7157–7168. wileyonlinelibrary.com/journal/jcmm|7157