Izmainīta norepinefrīna transmisija pēc telpiskās mācīšanās pasliktina miega izraisītu atmiņas konsolidāciju žurkām

Noradrenerģisko zāļu terapeitiskā lietošana liek novērtēt to ietekmi uz izziņu par augstu prioritāti. Norepinefrīns (NE) ir svarīgs neiromodulators dažādiem kognitīviem procesiem, un tas var būtiski veicināt miega izraisītu atmiņas konsolidāciju. NE transmisija svārstās atkarībā no uzvedības un / vai smadzeņu stāvokļa un ietekmē saistīto nervu darbību. Šeit mēs novērtējām izmainītās NE transmisijas ietekmi pēc tam, kad uzzināja par hipokampu atkarīgu uzdevumu uz nervu aktivitāti un telpisko atmiņu pieaugušiem žurku tēviņiem.

Arvien vairāk pētījumu liecina, ka norepinefrīns ir cieši saistīts ar atmiņu. Norepinefrīns ir neirotransmiters, kam ir svarīga loma organismā, no kuriem viens veicina atmiņas veidošanos un uzglabāšanu.

Galvenā epinefrīna funkcija ir stimulēt nervu sistēmu un uzlabot koncentrēšanos un modrību. Tās ir īpašības, kas ir cieši saistītas ar atmiņu. Kad esam saspringtā situācijā, paaugstinās adrenalīna līmenis, nostādot smadzenes ļoti modrā stāvoklī un atvieglojot svarīgas informācijas iegaumēšanu.

Turklāt epinefrīnam var būt ilgstoša ietekme uz atmiņas veidošanos. Jaunākie pētījumi atklāja, ka, atkārtoti aktivizējot atmiņas, paaugstinās epinefrīna līmenis, kas palīdz uzlabot atmiņas saglabāšanu un noturību.

Papildus iepriekšminētajām sekām epinefrīns var ietekmēt arī atmiņu veidošanos un uzglabāšanu, ietekmējot smadzeņu neironu mijiedarbību. Šis efekts var veicināt atmiņu veidošanos un saglabāšanu, regulējot neironu tīklu savienojamību.

Rezumējot, epinefrīnam ir svarīga saistība ar atmiņu. Mums jāsaglabā pozitīva attieksme un jākoncentrējas uz sava ķermeņa un smadzeņu vingrošanu, lai palielinātu adrenalīna līmeni, tādējādi uzlabojot atmiņu un kognitīvās spējas. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls, kam ir daudz unikālu efektu, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Maltās gaļas iedarbīgumu nodrošina dažādas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp skābe, polisaharīdi, flavonoīdi utt. Šīs sastāvdaļas var dažādos veidos veicināt smadzeņu veselību.

Noklikšķiniet uz Zināt īstermiņa atmiņu, kā uzlabot

Mēs ievadījām klonidīnu (0,05 mg/kg, ip; n= 12 žurkas) vai propranololu (10 mg/kg, ip; n= 11) pēc katras no septiņām ikdienas mācību sesijām. 8-rokas radiālais labirints. Salīdzinot ar fizioloģisko šķīdumu grupu (n= 9), ar zālēm ārstētajām žurkām bija zemāks mācīšanās līmenis. Lai novērtētu zāļu ietekmi uz kortikālo un hipokampu aktivitāti, mēs reģistrējām prefrontālo EEG un lokālos lauka potenciālus no dorsālā hipokampa CA1 apakšlauka 2 stundas pēc katras mācību sesijas vai zāļu ievadīšanas. Abas zāles ievērojami samazināja hipokampu viļņošanos vismaz 2 stundas. Uz EEG balstīta miega vērtēšana atklāja, ka klonidīns paātrina miegu, vienlaikus pagarinot kluso nomoda laiku.

Propranolols palielināja aktīvo nomodu uz ātrās acu kustības (NREM) miega rēķina. Klonidīns samazināja lēno svārstību (SO) un miega vārpstu rašanos NREM miega laikā un mainīja laika savienojumu starp SO un miega vārpstām. Tādējādi NE transmisijas farmakoloģiskās izmaiņas radīja suboptimālu smadzeņu stāvokli atmiņas konsolidācijai. Mūsu rezultāti liecina, ka pēcapmācības NE veicina atmiņas konsolidācijas pamatā esošās hipokampu-kortikālās komunikācijas efektivitāti.

Klīniskā noradrenerģisko zāļu lietošana novērtē to ietekmi uz kognitīvām funkcijām, kurām ir liela nozīme1,2. Klonidīns un propranolols ir vieni no visbiežāk izrakstītajām zālēm. Klonidīnu lieto kā antihipertensīvu un pretsāpju līdzekli, bet tas ir paredzēts arī miega traucējumu ārstēšanai un kopš nesena laika uzmanības deficīta un hiperaktivitātes traucējumu (ADHD) un Parkinsona slimības ārstēšanai1,3,4. Propranololu lieto vairāku sirds un asinsvadu slimību un trauksmes ārstēšanai5.

Neskatoties uz acīmredzamo ieguvumu veselībai, norepinefrīna (NE) līmeņa farmakoloģiskās izmaiņas kā blakusparādība var pasliktināt pacientu kognitīvās spējas. NE pārraides būtiskā nozīme apzinātā (vai “tiešsaistes”) informācijas apstrādē ir vispāratzīta2,6, 7. Iepriekšējie pētījumi ir uzsvēruši NE nozīmi arī bezsamaņā (vai "smalkā") stāvoklī, piemēram, miegā8–10, kad notiek mācīšanās izraisītas molekulārās, sinaptiskās un ķēdes modifikācijas11. Pēcmācības miega laikā sākotnēji labilās atmiņas pēdas stabilizējas, atkārtoti aktivizējot atmiņu kodējošos neironu reprezentācijas hipokampā (HPC), un pēc tam tiek integrētas neokorteksā ilgstošai uzglabāšanai12.

Ir pierādīts, ka NE līmeņa farmakoloģiskā maiņa pēc mācīšanās ietekmēja atmiņas konsolidāciju dzīvniekiem 13–18 un cilvēkiem 9, 10, 19, 20. Turklāt uzvedības farmakoloģijas pētījumi atbilst NE veicinošajai lomai sinaptiskajā plastiskumā 21–25. Neskatoties uz plašiem psihofarmakoloģijas sniegtajiem pierādījumiem par NE lomu atmiņas kodēšanā un konsolidācijā, NE pārraides dinamika pēc mācīšanās nav sistemātiski raksturota. Nesenie pētījumi, uzraugot NE izdalīšanos ar augstu laika izšķirtspēju spontāni uzvedošām pelēm, ir vēl vairāk uzlabojuši agrāko darbu un ierosinājuši NE atbrīvošanās lomu miega nepārtrauktībā, kas nav ātrās acs kustības (NREM) un NREM miega mediētās atmiņas konsolidācijā26, 27.

Neokortikālās lēnās (~ 1 Hz) svārstības (SO), talamokortikālās miega vārpstas (10–16 Hz) un hipokampu viļņi (~ 150 Hz) ir NREM miega pazīmes, un tās ir identificētas kā galvenās svārstības, kas nodrošina no miega atkarīgu sistēmu līmeni. atmiņas konsolidācija28. NE ietekme uz laiku koordinētu darbību atmiņu atbalstošā kortiko-hipokampu tīklā joprojām nav pietiekami izprotama11. Prefrontālās NE izdalīšanās mikrodialīzes mērīšana žurkām atklāja pārejošu pieaugumu ~ 2 stundas pēc smakas diskriminācijas, bet prefrontālo adrenoreceptoru bloķēšana pēc tam, kad mācīšanās izraisīja atmiņas deficītu29. Dorsālajā HPC ir nepieciešama -adrenoreceptoru aktivizēšana, lai efektīvi konsolidētu emocionālo un telpisko atmiņu30,31. Gan 1-, gan -adrenerģiskie receptori ir iesaistīti miega vārpstu un hipokampu viļņošanās veidošanā26, 32, 33. Iepriekš mēs esam dokumentējuši Locus Coeruleus (LC) noradrenerģisko neironu paaugstinātu aktivitāti NREM miega laikā pēc mācīšanās34 un to koordinētu darbību. šaušana ar SO35. Nesenajā pētījumā mēs parādījām, ka anestēzētām žurkām LC fāzes aktivācija modulēja kortikālās populācijas dinamiku viena SO cikla laika skalā. Visbeidzot, naturālistiskās LC aktivitātes modeļu izmaiņas NREM miega laikā izraisīja atmiņas deficītu37, 38.

Šajā pētījumā mēs saistījām telpiskās mācīšanās trūkumu ar izmainītu neironu aktivitāti atmiņu atbalstošajā tīklā. Lai mainītu NE transmisiju, mēs izmantojām klonidīnu un propranololu, divas klīniski nozīmīgas zāles. Klonidīns nomāc LC-NE neironu darbību, aktivizējot 2- adrenoreceptorus un samazina NE izdalīšanos no LC termināliem39. Propranolols bloķē NE transmisiju, saistoties ar -adrenoreceptoriem un pēc atkārtotas ārstēšanas ar mērenu devu (< 40 mg/kg) inhibits the LC activity40,41. We report that the alteration of NE transmission during the post-acquisition period impaired spatial learning. The reduction of SO, sleep spindles, and hippocampal ripples together with the appearance of high voltage spike-and-wave patterns (HVS) was indicative of a pharmacologically induced switch to a brain state that was likely suboptimal for memory consolidation. Our results further support the view that NE transmission during NREM sleep importantly contributes to information processing within the thalamocortical and hippocampal-cortical networks, which are thought to mediate systems-level memory consolidation.

Rezultāti

Rezultāti tika iegūti no pieaugušiem (300–400 g) Sprague–Dawley žurku tēviņiem (n=38), kas nejauši sadalīti trīs zāļu apstākļos (klonidīns, propranolols un fizioloģiskais šķīdums). Katras žurkas nosacījumi un datu iekļaušana / izslēgšana ir uzskaitīti S1 papildu tabulā.

Pēcmācības klonidīns un propranolols izraisa telpiskās atmiņas deficītu.

Septiņu ikdienas sesiju laikā mēs kopā apmācījām 32 žurkas ar telpiskās atmiņas uzdevumu (1.a attēls; sīkāku informāciju skatiet sadaļā Papildmetodes). Divdesmit sešām žurkām tika implantēti hroniski elektrodi, lai uzraudzītu frontālo EEG un lokālo lauka potenciālu (LFP). hipokamps (sīkāku informāciju skatiet sadaļā Metodes). Vēl 6 žurkas bija neskartas (neimplantētas), bet ievēroja to pašu apmācības/narkotiku protokolu. Svarīgi, ka mācīšanās ātrumā starp implantētajām un neimplantētajām žurkām nebija atšķirības (papildu attēls S1). Tūlīt pēc katras mācību sesijas žurkas saņēma klonidīnu (0.05 mg/kg, ip; n=12), propranololu (10 mg/kg, ip; n=11). ), vai fizioloģisko šķīdumu (1 ml/kg, ip; n=9). Pirmajā (bez narkotikām) mācību sesijā starp grupām nebija atšķirību neviena uzvedības mainīgā dēļ (papildu tabula S1). Mācību gaitā visas žurkas aktīvi iegāja dažādās labirinta rokās (1.b attēls) un ieguva visu atlīdzību gandrīz katrā izmēģinājumā (1.c attēls); šis uzvedības modelis neliecināja par atšķirībām starp grupām vispārējā lokomotorajā aktivitātē vai ēdiena motivācijā. Lielākā daļa uzvedības mainīgo atspoguļoja mācīšanās dinamiku. Uzdevuma izpildes precizitāte pakāpeniski pieauga (atkārtoti mērījumi ANOVA, F (3.7,106.6)=12.0, p<0.0001; Fig. 1d) with the between-group difference approaching a significance level (F (2,29)=3.33, p=0.05). The overall number of errors was significantly higher in the drug-treated rats (Fig. 1e). There was a significant effect of repetition (F (5,145)=11.0, p<0.001) and between-group difference by the number of errors (F(2,29)=7.34, p=0.003). The post-hoc comparisons confirmed a higher number of errors in the drug-treated groups (clonidine: p=0.031, propranolol: p=0.002; Bonferroni post-hoc comparisons vs. saline). Notably, propranolol-treated rats made the most errors during the first trial (Fig. 1f); the latter was indicative of a memory retrieval defect. To further explore the nature of spatial memory deficit, we split the errors into working memory (WM, re-entering the maze arm within a trial) and reference memory (RM, entering unbaited maze arm) errors. There was a significant between-group difference by both WM (F (2, 29)=8.0, p=0.002) and RM (F (2, 29)=5.0, p=0.014). The posthoc comparisons showed that drug-treated rats committed significantly more RM errors (Fig. 1g). Besides, the propranolol-treated rats also made more WM errors (Fig. 1g). Despite obvious spatial memory deficit at the early stages of learning, all rats reached a similar performance level by the end of the learning period (Fig. 1d,e). The trial time was decreasing (F (3.5, 102.4)=16.1, p<0.0001), yet equally in all groups (time: F (2,29)=0.43, p=656). Finally, we used the K-means cluster analysis to split rats according to their learning speed (see Methods for details). Indeed, individual rats learned the task at different rates (Fig. 1h). Remarkably, the proportion of 'slow' learners was much higher among the drug-treated rats (Fig. 1i).

Klonidīns un propranolols nomāc hipokampu viļņus.

Mēs novērtējām klonidīna un propranolola ietekmi uz hipokampu viļņiem kā galvenos atmiņas konsolidācijas elementus12. Retrospektīvā analīze atklāja, ka 14 no 26 žurkām, kuras sākotnēji tika implantētas un apmācītas labirintā, viļņu noteikšana nebija uzticama dažādu tehnisku kļūmju dēļ. Tāpēc, lai palielinātu izlases lielumu, EEG un hipokampu LFP tika reģistrēti no papildu 6 žurkām, kuras tika ārstētas ar zālēm, bet netika pārbaudītas uz labirinta (papildu attēls S1). Tādējādi zāļu ietekme uz hipokampu viļņiem tika pārbaudīta 24 žurkām (klonidīns, n=8; propranolols, n=9 un fizioloģiskais šķīdums, n=7; S1 papildu tabula). Abas zāles ievērojami samazināja pulsācijas ātrumu vismaz 2 stundas pēc injekcijas (F(2, 23)=13.27, p=0.0002; 2.a–d attēls). Klasificējot žurku uzvedību aktīvajā nomoda (AW), klusā nomoda (QW) un NREM miegā (sīkāku informāciju skatiet sadaļā Metodes), atklājās, ka abu zāļu visizteiktākā iedarbība radās NREM miega laikā, salīdzinot ar AW un QW epizodēm (1. Proti, salīdzinot ar fizioloģisko šķīdumu grupu (n=7), pulsācijas nomākšanas pakāpe NREM miega laikā mainījās no 40,1% līdz 91,3% pēc klonidīna (n=8) un no 2,3% līdz 86 .6% pēc propranolola (n=9) injekcijas. Izņemot pārsteidzošo pulsācijas ātruma samazināšanos, netika atklāta zāļu ietekme uz pulsācijas raksturīgajām īpašībām (amplitūda: F(2, 23)=1. 12, p=0.34; jauda: F(2, 23)=3.3, p=0,056; iekšējā pulsācijas frekvence: (F(2, 23){{ 45}}.40,p=0.11), izņemot ilgāku pulsācijas ilgumu pēc klonidīna (F(2, 23)=11.47, p=0.0004; att. 2.d–f).

Klonidīna un propranolola ietekme uz uzvedības stāvokli un ar miegu saistītām EEG svārstībām. Pēc nederīgo EEG datu izslēgšanas (n{{0}} žurkas), uz EEG balstītas analīzes tika veiktas, izmantojot kopā 21 datu kopu (klonidīns, n=6; propranolols, n{{4} } un fizioloģisko šķīdumu, n=6; Papildu tabula S1). Papildus ietekmei uz hipokampu populācijas aktivitāti abas zāles ietekmēja spontānas uzvedības modeli. Starp grupām bija atšķirība kopējā laikā, kas pavadīts katrā uzvedības stāvoklī (AW: F(2, 20)=4.09, p=0.034; QW:F(2, 20){{ 16}}.84, p=0.021; NREM: F(2, 20)=4.66, p=0.023). Konkrēti, 2 stundu novērošanas periodā pēc injekcijas klonidīns pagarināja QW, bet propranolols pagarināja AW un saīsināja NREM miegu (papildu attēls S2). Neviena no zālēm neietekmēja vidējo laikmeta ilgumu nevienā uzvedības stāvoklī (F (2, 20)  2,57, p  0,10 visiem). Vieglu klonidīna sedatīvo efektu atspoguļoja ātrāks miega sākums (papildu attēls S2).

Turklāt prefrontālā EEG tika ietekmēta zālēm specifiskā veidā (3.a–c att.). Konkrēti, klonidīns palielināja sigmas (10–16 Hz) jaudu AW un QW laikā, vienlaikus samazinot to NREM miega laikā (3.d–f att.). Turklāt NREM miega laikā ar zālēm ārstētām žurkām delta (< 2 Hz) power was decreased and the power within the 5–7 Hz frequency range was increased due to the appearance of HVS (Fig. 3f). Te observed changes in the EEG power spectrum reflected drug-induced modulation of the oscillatory events like SO and sleep spindles (Figs. 3a–c and 4). In clonidine-treated rats, the SO was less frequent (Table 1) and of smaller amplitude (Supplementary Figure S3). There was no effect on the SO (half-wave) duration (F(2, 20)=2.55, p=0.11). The effect of clonidine on SO was almost immediate and lasted at least for 2 h (Fig. 4d). In clonidine-treated rats, the spindles were more frequent during AW and QW, while their occurrence was decreased during NREM sleep (Table 1). Notably, the effect of clonidine was delayed (Fig. 4h). Te spindle power was significantly decreased by clonidine (Supplementary Figure S3). No change was detected in the spindle length (F(2, 20)=0.08, p=0.92) or the intra-spindle frequency (F(2, 20)=1.09, p=0.36). Te clonidine-induced effects persisted across repeated drug treatments (Supplementary Figure S3). The SO and sleep spindles were unaffected by propranolol (Fig. 4d,h, and Supplementary Figure S3).

Pēc tam mēs novērtējām zāļu ietekmi uz laika savienojumu starp SO un miega vārpstām, kas ir vispāratzīta parādība, kas tika ierosināta kā smalkas konsolidācijas pamatā esošā tīkla koordinācijas mehānisms . Šim nolūkam mēs atlasījām NREM miega epizodes un ekstrahējām vārpstas, kas radās ± 1, 5 robežās ap SO negatīvo maksimumu. Kopumā aptuveni 1/3 vārpstu bija SO savienotas (F(2, 20)=1.03, p=0.38); tomēr vārpstas grupējums ap SO negatīvo maksimumu sadalīts starp grupām (4.i–l. att.). Ar fizioloģisko šķīdumu un propranololu ārstētām žurkām vārpstas galvenokārt radās SO augšupejošā fāzē, sasniedzot maksimālos ms pēc SO negatīvā maksimuma, savukārt ar klonidīnu ārstētām žurkām vārpstas grupējās ap SO negatīvo maksimumu (4l. attēls).

Visbeidzot, klonidīna ievadīšana veicināja HVS, augstas amplitūdas pārejošas svārstības, kas reti sastopamas apstākļos, kas nesatur zāles (1. tabula un papildu attēls S4). Pirmais HVS parādījās tik ātri kā 8,4 ± 1.0 min (diapazons: 5,4–11,3 min) pēc klonidīna injekcijas, kas bija daudz agrāk nekā pēc fizioloģiskā šķīduma (24,6±2,3 min) (diapazons: 16,6–30,7 min) vai propranolols (27,6 ± 6,2 min) (diapazons: 7,7 – 62,2 min).

Jāatzīmē, ka 5 no 6 (83,3%) ar klonidīnu ārstētām žurkām un 5 no 9 (55,5%) ar propranololu ārstētām žurkām HVS tika konstatētas AW stāvokļa laikā, savukārt HVS nebija AW laikā 5 no 6 fizioloģiskā šķīduma. -ārstētas žurkas. Ar klonidīnu ārstētām žurkām HVS līmenis bija augstāks pirmajā stundā pēc injekcijas, un šis efekts saglabājās visas dienas (papildu attēls S4). Turklāt klonidīns palielināja HVS ilgumu (papildu attēls S4) un samazināja inter-HVS biežumu (F(2, 20)=7.94, p=0.003). HVS jaudu neietekmēja klonidīns (F(2, 20)=2.28, p=0.13). Propranolola ietekme uz HVS nebija nosakāma (papildu attēls S4).

Diskusija

Šajā pētījumā mēs parādījām, ka atkārtota klonidīna (0,05 mg/kg, ip) un propranolola (10 mg/kg, ip) ievadīšana pēc ikdienas 8-rokas radiālā labirinta uzdevuma traucēta telpiskās atmiņas konsolidācija pieaugušiem žurku tēviņiem. Telpiskās atmiņas deficīts ar zālēm ārstētām žurkām bija redzams lielākā skaitā WM un RM kļūdu. Iepriekšējie pētījumi norādīja uz NREM miega labvēlīgo ietekmi uz WM, iespējams, pateicoties pastiprinātai SO aktivitātei un prefrontālo un autonomo tīklu potenciācijai 45, 46. Patiešām, parasimpātiskā aktivitāte tiek palielināta NREM miega laikā un, iespējams, veicinās NE izdalīšanos no LC, izmantojot vagālās ievades45. Tus, couleur-SOcoupling NREM miega laikā35 varētu atbalstīt nākamās dienas prefrontālo WM veiktspēju45. Mūsu rezultāti netieši atbalsta šo hipotēzi, jo LC-NE aktivitātes farmakoloģiskā nomākšana pēcmācību periodā patiešām varēja ietekmēt prefrontālo funkciju, kas ir būtiska WM kapacitātei. Telpiskās atmiņas zemākā precizitāte, kas atspoguļojās RM kļūdās, liecināja par zāļu ietekmi uz pulsācijas mediēto hipokampu kortikālo komunikāciju, kas ir galvenā sistēmas līmeņa konsolidācijas sastāvdaļa28. Visbeidzot, spēcīgākais atmiņas deficīts mācīšanās sākumā norādīja uz NE pārraides nozīmi tikko saņemtās informācijas precīzā apstrādē8–10.

Zemāks mācīšanās līmenis lielākajai daļai ar zālēm ārstēto žurku, iespējams, bija saistīts ar izmainītu ar miegu saistītu smadzeņu darbību. Patiešām, NE transmisijas farmakoloģiskās izmaiņas ietekmēja ar miegu saistīto neiraldinamiku talamokortikālajos un hipokampu tīklos, kas ir saistīti ar sistēmas līmeņa atmiņas konsolidāciju28. Konkrētāk, abas zāles dramatiski samazināja hipokampu viļņošanos, kas, domājams, ir starpnieks atmiņu kodējošu šūnu mezglu stabilizācijā 12, 47. Mūsu rezultāti parādīja, ka viļņošanās ģenerēšanas mehānismam ir nepieciešams optimāls NE līmenis, savukārt gan pastiprināta, gan samazināta LC-NE aktivitāte ir nelabvēlīga viļņiem. Tādējādi zāļu izraisītais pulsācijas nomākums pēcmācību periodā varētu izskaidrot telpiskās atmiņas deficītu. Šis rezultāts atbilst mācīšanās defektam, ko rada elektriskā pulsācijas slāpēšana 48, 49. Cik mums ir zināms, uzvedīgajiem dzīvniekiem vēl nav raksturota noradrenerģiskā ietekme uz hipokampu viļņiem. Papildus ietekmei uz hipokampu viļņiem klonidīns, bet ne propranolols, nomāc SO un miega vārpstas, kas atbilst esošajai literatūrai50,51; tas arī mainīja SO vārpstas savienojumu.

Lai gan salīdzinoši īss (~ 2 h) novērošanas periods neļāva raksturot miega / nomoda ciklu, zāļu ietekme uz prefrontālo EEG kopumā atbilda esošajai literatūrai50, 51. Mēs novērojām zāļu specifisko ietekmi uz miega / nomoda modeli un EEG jaudas spektru. Proti, klonidīns izraisīja vieglu sedāciju, paātrinot aizmigšanu un pagarinot QW, savukārt propranolols palielināja AW uz NREM miega rēķina. Abas zāles samazināja EEG jaudu zemā (<2 Hz) frequency range and increased 5–7 Hz power during NREM sleep due to the appearance of the HVSs; clonidine also reduced the sigma (10–16 Hz) power. The effects of clonidine were overall more pronounced, lasted for at least 2 h, and were consistent across daily injections. Of note, the aforementioned effects were observed during the dark (active) phase of the rat circadian cycle, while the drug-induced effects may differ during the light (inactive) phase as well as during the extended post-administration period.

Iepriekšējie farmakoloģiskie pētījumi ir atkārtoti parādījuši, ka NE pārraides modulācija pēcapmācības ietekmēja atmiņas stiprumu 13–15, 18, 29, 52, 53. Augstākā LC-NE aktivitāte modrības stāvokļu laikā ir likusi pētīt tās lomu tiešsaistes informācijas apstrādē 6, 7, savukārt smadzeņu tīklu noradrenerģiskās modulācijas loma zemas modrības stāvokļos, piemēram, miega laikā, jau sen ir bijusi ārpus fokusa. Vairākos pētījumos tika uzsvērta NE nozīme, kas darbojas caur -adrenoreceptoriem30, 31 no hipokampu atkarīgā atmiņas konsolidācijā10, 37, 38, 54, 55. Ir vispāratzīts, ka NE veicina ilgtermiņa sinaptisko plastiskumu 21–25, kas notiek bieži. Iepriekšējā pētījumā mēs ziņojām, ka relatīvo LC-NE neironu mierīgumu NREM miega laikā pārtrauca pārejošas aktivitātes lēkmes, kas, visticamāk, radās pēc mācīšanās. LCaktivitātes optoģenētiskās izmaiņas NREM miega laikā pasliktināja žurkas veiktspēju no hipokampa atkarīgā atmiņas uzdevumā. Divi jaunākie pētījumi, mērot kortikālo NE izdalīšanos, parādīja LC-vārpstas savienojumu infra-lēnā temporālā mērogā.

Papildus noradrenerģiskās aktivitātes pieaugumam pēc mācīšanās 29, 34, īslaicīgi koordinēta LC-NE neironu iesaistīšanās var ietekmēt ofine tīklus. Lai gan precīzs mehānisms, kas regulē LC aktivitātes dinamiku miega laikā, nav zināms, pastāv laika attiecības starp NE līmeni un ar miegu saistītajām svārstībām. LC-NE neironu barošanas ātrums palielinās miega vārpstu laikā un samazinās pirms vārpstas sākuma57. Mēs iepriekš esam pierādījuši laika savienojumu starp LC-NE neironu aizdegšanos un SO35 fāzi.

Nesenajā pētījumā ar žurkām uretāna anestēzijā mēs parādījām, ka fāziskā LC aktivācija pagarināja pastiprinātas uzbudināmības garozas stāvokli un palielināja prefrontālo neironu šaušanas ātrumu36. Mēs jau iepriekš ziņojām, ka pulsācijas izraisītā elektriskā LC stimulācija radīja telpiskās atmiņas defektu, iespējams, endogēnā LC aktivitātes modeļa traucējumu dēļ. Mūsu pašreizējā pētījumā klonidīna izraisīta NE atbrīvošanās nomākšana ietekmēja vārpstas ģenerēšanas tīklu, iespējams, izjaucot LC-vārpstas savienojumu. Neskatoties uz SO garozas izcelsmi, subkortikālie ievadi no talāma58 un neiromodulējošajiem kodoliem59, ieskaitot LC36, 60, ietekmē SO spatiotemporālo dinamiku. SO izraisīto SO dinamikas modulāciju vēl vairāk apstiprina šie atklājumi. Konkrēti, mēs parādījām, ka klonidīns nomāca SO veidošanos, samazināja SO amplitūdu un ietekmēja SO vārpstas savienojumu. Tiek uzskatīts, ka SO-vārpstas savienojuma epizodes norāda uz mācību satura aktivizēšanu, un savienojuma precizitāte paredz reaktivācijas spēku, kas ir labvēlīga atmiņai61–63. Tādējādi starpreģionu laika savienojumam, kas ir galvenais sistēmas līmeņa konsolidācijas elements, var būt nepieciešams optimāls NE līmenis. SO vārpstas un vārpstas pulsācijas savienojuma stiprums var būt atkarīgs no LC-NE neironu šaušanas modeļa un NE atbrīvošanās laika. NE pārraides laika un telpiskās izmaiņas var izraisīt mazāk efektīvu apstrādi un atmiņas deficītu. Ir steidzami jāturpina izpētīt šīs precīzi noregulētās laika attiecības funkcionālās sekas starp LC-NE neironu iedegšanos un ar miegu saistītajām svārstībām. Vissvarīgākais ir tas, ka miega laikā koordinētas neiromodulējošās aktivitātes izraisītāji vēl ir jānosaka.

Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka efektīvai informācijas apstrādei ir nepieciešams optimāls NE līmenis. Uzkrātie eksperimentālie pierādījumi un mūsu pašreizējie atklājumi apstiprina uzskatu, ka NE izdalīšanās smalko stāvokļu laikā veicina gan sinaptisko, gan sistēmas līmeņa konsolidāciju8,11. NE transmisijas izmaiņas būtībā ietekmēja visas talamokortikālās un hipokampu svārstības, kas saistītas ar sistēmas līmeņa atmiņas konsolidāciju. Plašās LC-NE neironu projekcijas visā smadzenēs64 nodrošina vairākus veidus, kā NE ietekmēt koordinēto darbību atmiņu atbalstošajos tīklos, tostarp talamokortikālajā, prefrontālais un limbiskais, kur rodas SO, miega vārpstas un viļņi12,65,66. Turpmākajos pētījumos sīkāk jāizpēta noradrenerģiskie mehānismi, kas ir atmiņu atbalstoša liela mēroga tīkla rašanās, uzturēšanas un atkārtotas aktivizēšanas pamatā.

Neskatoties uz dažādajiem darbības mehānismiem, ir pierādīts, ka abas zāles samazina LC aktivitāti. Proti, klonidīna inhibējošā iedarbība in vitro bija spēcīgāka uz hipokampu, salīdzinot ar prefrontāli projicējošiem LC-NEuroniem68. Klonidīns galvenokārt nomāc presinaptisko NE izdalīšanos caur 2-adrenoreceptoriem un propranolols bloķē NE transmisiju caur –adrenerģiskiem receptoriem. Turklāt propranolols var inhibēt NE atpakaļsaisti, pastiprināt NE transmisiju pie 1-adrenoreceptoriem un samazināt dopamīnerģisko transmisiju, jo tiek kavēta kateholamīnu sintēze69; tas var ietekmēt arī serotonīnerģisko transmisiju, jo tas ir saistīts ar centrālajiem 5-HT receptoriem70. Divu klīniski nozīmīgu noradrenerģisko zāļu konverģējošā iedarbība, neskatoties uz to, ka tās iedarbojas uz dažādiem adrenoreceptoriem, liecina, ka pēcapmācības periodā farmakoloģiski izmainītā NE transmisija var traucēt atmiņas atbalsta tīklu un izraisīt šo zāļu terapeitiskās lietošanas kognitīvo blakusefektu.

Metodes

Mēs izmantojām 38 Sprague–Dawley žurku tēviņus (300–400 g, Charles Rivers Laboratories, Sulzfeld, Vācija). Dzīvnieku novietnē bija vides kontrolēti apstākļi: 12 stundu gaismas/tumsas cikls (gaisma izslēgta plkst. 8:00), 20–23 grādu temperatūra un 40–60% mitrums. Žurkas tika izmitinātas pa pāriem vai atsevišķi, un tām bija ad libitum piekļuve pārtikai un ūdenim, izņemot pārtikas ierobežojumus (~ 15 g pārtikas granulu uz vienu žurku dienā) mācību eksperimenta laikā. Žurkas svars tika kontrolēts katru dienu, lai nodrošinātu, ka tas nav mazāks par 85% no žurkas svara libitum. Visi eksperimenti tika veikti, pilnībā ievērojot Eiropas Parlamenta Direktīvu 2010/63/ES, Vācijas likumu par dzīvnieku labturību (TierSchG) un Dzīvnieku labturības laboratorijas dzīvnieku rīkojumu (TierSchVersV). Pētījumu pārskatīja reģionālā dzīvnieku labturības komiteja saskaņā ar Vācijas Dzīvnieku labturības likuma (Kommission nach §15 des Tierschutzgesetzes), ētikas komisija (§15 TierSchG) un apstiprināja valsts iestāde (Regierungspräsidium, Tübingen, Baden-Württemberg). , Vācija, Referat 35, Veterinärwesen). Šis pētījums tiek veikts saskaņā ar ARRIVE vadlīnijām (https://arriveguidelines.org).

Ķirurģija un elektrofizioloģiskie ieraksti. Ķirurģiskās un reģistrācijas procedūras ir sīki aprakstītas citur 38,71. Īsumā, ar izoflurānu anestēzēta (5% indukcijai, ~ 2% uzturēšanai) žurka tika fiksēta stereotaksiskā rāmī (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) ar galvas leņķi, kas noregulēts uz nulles grādiem. Pirms kraniotomijas elektrodu ievietošanai subkutāni injicēja lokālu anestēziju (Lidocard 2%, B. Braun, Melsungen, Vācija). Elektroencefalogrammai (EEG) virs prefrontālās garozas un smadzenītēm tika piestiprinātas divas nerūsējošā tērauda skrūves (diametrs 0.86 mm). Divi atsevišķi platīna-irīdija elektrodi (FHC Inc., Bowdoin, ME), kas salīmēti kopā ar 100 līdz 200 µm attālumu starp galiem, tika uzstādīti uz paštaisītas kustīgas piedziņas un implantēti muguras HPC ( AP=-3,5 mm, L=2,0 mm, DV=2,0 mm). Tiešsaistes neironu aktivitātes uzraudzība nodrošināja precīzu muguras HPC CA1 zonas mērķēšanu elektrodeimplantācijas laikā. Pārvietojamā piedziņa ļāva papildus pielāgot elektrodu dziļumu optimālai pulsācijas ierakstīšanai labirinta treniņa laikā. Elektromiogrāfijai (EMG) kakla muskulī tika ievietots sudraba stieples elektrods. Galvaskausam tika pielīmēts 3D drukāts plastmasas rāmis, kas savienots ar vara sietu, lai aizsargātu elektrodu vadus un izolētu no elektriskā trokšņa. Tika uzraudzīta ķermeņa temperatūra (~37 grādi), sirdsdarbība un asiņu skābekļa daudzums (virs 90%). 5–7 pēcoperācijas atveseļošanās dienas laikā žurkas tika ārstētas ar antibiotiku (10 mg/kg, ip, Baytril, Bayer) un pretsāpju līdzekli (5 mg/kg, ip, Rymadil, Zoetis).

Pēc atveseļošanās pēc operācijas žurkas tika pieradinātas pie miega kastes (melns plexiglas, 20 × 20 × 80 cm) un kabeļa savienošanas procedūras. Implants tika savienots ar Neuralynx Digital Lynx iegūšanas sistēmu (Neuralynx, Bozeman, MT), izmantojot 32-kanāla galvas stadiju (Neuralynx, Bozeman, MT) un pēc pasūtījuma izgatavotu adapteri (SSD10-SS- GS, Omnetic, Mineapolisa, MN). Platjoslas (0, 1 Hz–8 kHz) ekstracelulārie signāli no EEG un HPCelectrodes tika digitalizēti ar frekvenci 32 kHz. Elektrodu novietojums HPC tika optimizēts pulsācijas noteikšanai vismaz 24 stundas pirms ierakstīšanas sākuma. Katra ierakstīšanas sesija katram dzīvniekam sākās vienā un tajā pašā laikā un ilga 2 stundas. Šis novērošanas periods tika izvēlēts, pamatojoties uz iepriekšējiem pierādījumiem, ka smalkās konsolidācijas agrīnā fāze ir atkarīga no NE8. Ieraksts tika veikts vājā apgaismojumā un diennakts ritma aktīvajā (tumšā) fāzē, kas ir optimālākā žurku apmācībai.

Telpiskās atmiņas uzdevums.

Tika izmantots tas pats labirinta uzdevums un apmācības protokols, kas detalizēti aprakstīts citur38. Žurkas tika apmācītas paceltā astoņu roku radiālā labirintā (1.a attēls). Labirints rokas (66 cm garas × 10 cm platas) ar nelielu bedri (diametrs 1 cm) galā ēdiena balvai (šokolādes piens), kas izstieptas no centrālās platformas (30 cm diametrā). Uz melnajiem aizkariem, kas ieskauj labirintu, tika fiksētas divas lielas vizuālas norādes. Intervāla laikā žurka tika novietota uz paaugstināta statīva. Žurku uzvedība tika uzraudzīta video. Pēc pieradināšanas un iepriekšējas apmācības (papildu metodes) 3 no 8 labirinta rokām tika iebarotas; atalgojuma vietas tika nejauši noteiktas katrai žurkai, un tās tika saglabātas vienādas visās apmācības sesijās (3 izmēģinājumi dienā 7 dienas). Izmēģinājums sākās, novietojot žurku uz centrālās platformas, un ilga, līdz tika savāktas visas 3 balvas vai pagāja 5 minūtes. Pēc katra izmēģinājuma labirinta virsma tika noslaucīta, lai samazinātu ožas signālus. Tika reģistrēti un analizēti šādi uzvedības mainīgie lielumi: apmeklēto labirinta roku skaits, izmēģinājuma laiks, izvēles precizitāte (aprēķināta kā attiecība starp ēsmu un kopējo apmeklēto ieroču skaitu), darba atmiņas (WM) kļūdas (atkārtotu ieeju skaits apmeklētajās grupās) , atsauces atmiņas (RM) kļūdas (ieraksti ieročos bez ēsmas).

Zāļu injekcijas

Klonidīns un propranolola pulveris (Sigma Aldrich, Burlington, MA) tika izšķīdināts fizioloģiskajā šķīdumā un injicēts intraperitoneāli (ip) 1 ml/kg tilpumā uzreiz pēc katras labirinta sesijas (klonidīns:0.05. mg/kg, ip; propranolols: 10 mg/kg, ip). Kontroles žurkas saņēma fizioloģisko šķīdumu (1 ml/kg, ip). Klonidīns nomāc NE transmisiju72, un ir pierādīts, ka 0, 05 mg/kg (ip) deva žurkām samazina LC aktivitāti līdz 60% sākotnējā līmeņa67. Propranolols, adrenoreceptoru antagonists, pēc atkārtotas ārstēšanas ar mērenu devu (<40 mg/ kg) inhibits the LC activity40,41. Besides, propranolol in a dose of 10 mg/kg (i.p.) was shown to modulate NEmediated excitability of the hippocampal neurons73 while it did not affect rat spontaneous behavior74–76. The half-life of clonidine may greatly vary between 6 and 23 h depending on the dosage, chronic use, and metabolism level75,77. Typically, the plasma peak levels are reached 60–90 min after clonidine administration. The plasma half-life of propranolol is 3 to 6 h with a peak of 1–3 h after ingestion76. The elimination half-life of propranolol is approximately 8 h (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Propranolol). This, according to the pharmacokinetics of both drugs, the drug concentration was close to the highest during the observation period of up to 2 h post-injection. Importantly, both drugs are effectively washed out within less than 24 hours.

Perfūzija un histoloģija.

Žurkas tika eitanāzētas (100 mg/kg ip, Narcoren, Merial) un transkardiāli perfūzētas ar 0,9% fizioloģisko šķīdumu, kam sekoja 4% paraformaldehīda. Smadzenes tika sagrieztas šķēlēs (50 µm), izmantojot horizontālu sasalšanas mikrotomu (Microm HM 440E, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA). Lai pārbaudītu elektrodu novietojumu, ar Nissl iekrāsotās smadzeņu sekcijas tika pārbaudītas mikroskopā (Axiovision, Zeiss, Oberkochen, Vācija).

Notikumu noteikšana.

SO, miega vārpstas un hipokampu viļņi tika konstatēti, kā iepriekš aprakstīts citur71,78. EEG signāla paraugs tika samazināts līdz 1 kHz, un frekvenču joslas caurlaide (0.3–4 Hz) tika filtrēta. SO noteikšanai tika iegūti nulles filtrētā EEG krustojumi, kas radās 0,4 līdz 1- s laika logā. Tika piešķirti divi secīgi negatīvi–pozitīvi nulles krustojumi ar negatīvu maksimālās amplitūdu zem 100 μV un no negatīvas uz pozitīvu amplitūdu no maksimuma līdz maksimumam, kas pārsniedz 120 μV kā TĀ. Vārpstas noteikšanai joslas caurlaides (10–16 Hz) filtrētā EEG tika iztaisnota un izlīdzināta. Vārpstas tika noteiktas pēc signāla amplitūdas, kas pārsniedza vidējā signāla 1,5 standarta novirzes (SD) slieksni NREM miega periodos 0, 4–2,0 s. Tika sapludinātas vārpstas, kas radās mazāk nekā 50 ms laikā. Tie HVS tika atklāti, izmantojot to pašu algoritmu ar pielāgotiem parametriem (joslas caurlaide: 5–7 Hz, slieksnis: 2,5 SD, min/maks: 0,7 s/3 s). Divi HVS, kas radās mazāk nekā 200 ms, tika sapludināti. Lai novērstu dubultu noteikšanu, HVS nesaturošos laikmetos tika identificētas miega vārpstas. Pulsāciju noteikšanai HPC LFP tika filtrēts, rektificēts un izlīdzināts. Pulsācijas tika noteiktas ar signāla amplitūdu, kas pārsniedza slieksni no 3 līdz 5 SD uz 0,025 līdz 0,5 s. Visiem notikumiem ieslēgšanas un nobīdes tika definētas kā attiecīgi augoša un dilstoša nulles šķērsošana, izmantojot 1 SD slieksni. Svārstību jauda tika aprēķināta kā Hilberta pārveidotā signāla apvalka integrālis starp notikuma ieslēgšanu un nobīdi. SO-vārpstas laika savienojums tika novērtēts, kā aprakstīts citur43. Te SO negatīvā virsotne tika izmantota kā atsauces notikums (t=0), tika iegūti vārpstu maksimumi un ieplakas, kas radās ±1,5 s robežās, un tika ģenerēta notikumu korelācijas histogramma. Tvertņu skaits tika pārvērsts notikumu ātrumā, z-transformēts un grupas vidējais lielums.

Miega vērtēšana un EEG jaudas spektrālā analīze. Miega vērtēšanas pamatā bija vizuāli atbalstīta klasifikācija secīgiem EEG un EMG signālu 10- periodiem79. EEG bez artefaktiem tika klasificēta kā aktīva nomoda (AW, zemas amplitūdas ātra EEG un augsta EMG), klusā nomoda (QW, zemas amplitūdas ātra EEG un zema EMG) un NREM (augstas amplitūdas lēna EEG un zema EMG). ). REM miega laikmeti 2 stundu ierakstīšanas laikā bija reti un netika analizēti. EEG jaudas spektri tika aprēķināti katram uzvedības stāvoklim, izmantojot Matlab (Mathworks, ASV) un FieldTrip rīklodziņu 80. EEG signāls tika segmentēts {{10}}s epohos ar a0.5-s pārklāšanos. Ātrā Furjē transformācija tika piemērota Hanninga konusveida datu segmentiem, lai aprēķinātu šo vienpusējo amplitūdas spektru. Lai atdalītu fraktāļu un svārstību komponentus EEG jaudas spektrā, mēs izmantojām neregulāras atkārtotas paraugu ņemšanas automātiskās spektrālās analīzes procedūru. Laika un frekvences diagrammas tika ģenerētas, izmantojot bīdāmu Hanninga konusveida logu un no frekvences atkarīgu 3 ciklu garumu. Frekvenču diapazons 0,05 līdz 20 Hz (0,1 Hz solis) tika izmantots SO, miega vārpstām un HVS, un 50 līdz 300 Hz (0,05 Hz soli un 9 cikli) hipokampu viļņiem.

Eksperimentālā plānošana un statistiskā analīze.

Trīsdesmit divas žurkas tika apmācītas labirintā, no kurām 19 žurkas tika implantētas ar elektrodiem un apstrādātas ar klonidīnu (n=16), propranololu (n=11) vai fizioloģisko šķīdumu (n{{4}). }) pēc katras mācību sesijas. Vēl 9 žurkas tika implantētas ar elektrodiem un izmantotas tikai elektrofizioloģijai. Uzvedības mainīgajiem tika aprēķināts sesijas vidējais rādītājs, un tie tika iesniegti atkārtotu mērījumu dispersijas analīzei (ANOVA) ar mācību sesiju kā atkārtotu faktoru un narkotiku ārstēšanu kā grupas faktoru. Siltumnīcas – Geisera korekcija tika piemērota, ja tika pārkāpts sfēriskuma pieņēmums. K-vidējo klasteranalīze tika izmantota, lai atklātu mācīšanās ātruma atšķirības starp subjektiem. Konkrēti, mēs iesniedzām izvēles precizitāti (kā noteikts sadaļā Telpiskās atmiņas uzdevuma metode) visām mācību sesijām un sadalījām laikrindas divās kopās, kas atšķiras pēc mācīšanās dinamikas. Pēc tam mēs aprēķinājām žurku proporciju katrā klasterī katrai eksperimentālajai grupai. Mainīgie lielumi, kas iegūti no elektrofizioloģiskiem signāliem, piemēram, miega sākums, laikmeta ilgums, notikumu biežums utt., tika iesniegti vienvirziena ANOVA ar narkotiku ārstēšanu kā grupas faktoru, kam vajadzības gadījumā sekoja Bonferroni posthoc testi. Pēcinjekcijas notikumu biežums tika salīdzināts, izmantojot atkārtotu mērījumu ANOVA ar 1 h laika logu un atkārtotu zāļu ārstēšanu. Pāru paraugu tests tika izmantots, lai atklātu atšķirību starp grupām peri-notikumu histogrammās. Statistiskā nozīmība (-vērtība) tika iestatīta uz p=0,05. Statistikas analīzei tika izmantota IBM SPSS statistika (v.22). Rezultātu vizualizēšanai tika izmantotas Matlab (R2014a) un Adobe Illustrator® programmatūras pakotnes.

Datu pieejamība

Pašreizējā pētījuma laikā izmantotās un/vai analizētās datu kopas pēc saprātīga pieprasījuma ir pieejamas no attiecīgā autora.

Atsauces

1. Giovannitti, JA, Toms, SM & Crawford, JJ Alpha-2 adrenerģisko receptoru agonisti: pašreizējo klīnisko pielietojumu apskats.Anesth. Prog. 62, 31–39. https://doi.org/10.2344/0003-3006-62.1.31 (2015).

2. Chamberlain, SR & Robbins, TW Noradrenerģiskā izziņas modulācija: terapeitiskās sekas. J. Psychopharmacol. 27 694–718. https://doi.org/10.1177/0269881113480988 (2013).

3. Newcorn, JH, Krone, B. & Dittmann, RW nonstimulant treatments for ADHD. Bērns pusaudzis. Psihiatr. Clin. N. Am. 31 417–435. https://doi.org/10.1016/j.chc.2022.03.005 (2022).

4. Ciaud, M. et al. Noradrenalīna un kustību ierosināšanas traucējumi Parkinsona slimības gadījumā: farmakoloģisks funkcionāls MRI pētījums ar klonidīnu. Šūnas https://doi.org/10.3390/cells11172640 (2022).

5. Middlemiss, DN, Buxton, DA & Greenwood, DT Beta-adrenoreceptoru antagonisti psihiatrijā un neiroloģijā. Pharmacol.Ter. 12, 419–437. https://doi.org/10.1016/0163-7258(81)90089-9 (1981).

6. Berridge, CW & Waterhouse, BD Te locus coeruleus-noradrenerģiskā sistēma: uzvedības stāvokļa un no stāvokļa atkarīgo kognitīvo procesu modulācija. Brain Res Brain Res Rev 42, 33–84 (2003).

7. Sara, SJ & Bouret, S. Orientēšanās un pārorientēšanās: Te locus coeruleus mediē izziņu caur uzbudinājumu. Neuron 76 (1), 130–141 (2012).

8. Sara, SJ Locus Coeruleus laikā ar atmiņu veidošanu. Curr. Atzinums. Neirobiol. 35, 87–94. https://doi.org/10.1016/j.conb.2015.07.004 (2015).

9. Groch, S. et al. Norepinefrīna ieguldījums emocionālās atmiņas nostiprināšanā miega laikā. Psihoneuroendokrinoloģija 36,1342-1350. https://doi.org/10.1016/j.psyneuen.2011.03.006 (2011).

10. Gais, S., Rasch, B., Dahmen, JC, Sara, S. & Born, J. Te atmiņas funkcija noradrenergiskās aktivitātes ne-REM miegā. J. Cogn. Neurosci. 23, 2582–2592. https://doi.org/10.1162/jocn.2011.21622 (2011).

For more information:1950477648nn@gmail.com