Ar Alcheimera slimību saistītais SNP Rs708727 SLC41A1 var palielināt Parkinsona slimības risku: ziņojums no paplašinātā Slovākijas pētījuma 2. daļas

2.2. Ģenētiskās analīzes

Ģenētiskās analīzes tika veiktas A1 SNP rs11240569, rs708727 un rs823156 508 PD pacientu grupā (salīdzinājumā ar 150 pacientiem izmēģinājuma pētījumā) un 472 kontroles grupu grupā (pret 120 kontrolēm izmēģinājuma pētījumā) [37]. Tādējādi PD pacientu un kontroles probandu skaits šajā pētījumā tika palielināts attiecīgi par 3{10}} un 3,9 reizēm, salīdzinot ar izmēģinājuma pētījumu.

Daudzi cilvēki novecojot piedzīvo atmiņas zudumu, bet cilvēkiem ar Parkinsona slimību atmiņas izmaiņas var būt izteiktākas. Tomēr mums nevajadzētu domāt, ka cilvēki ar Parkinsona slimību cieš no atmiņas pasliktināšanās, jo ir lietas, ko mēs varam darīt, lai palīdzētu viņiem saglabāt atmiņu.

Pirmkārt, konsekventa smadzeņu apmācība var palīdzēt cilvēkiem ar Parkinsona slimību uzlabot atmiņu. Šīs darbības var ietvert: Sudoku nodarbības, galda spēļu spēlēšanu, mīklu risināšanu un daudz ko citu. Veicot šīs aktivitātes, viņi var vingrināt atmiņu, uzlabot smadzeņu darbību un palīdzēt uzturēt garīgo stāvokli.

Otrkārt, diēta arī ļoti būtiski ietekmē Parkinsona slimības pacientu atmiņu. Uzturā mēs varam pievienot dažus ar olbaltumvielām un uzturvielām bagātus pārtikas produktus, piemēram, zivis, pupiņas, riekstus utt. Šie pārtikas produkti var palīdzēt mums saglabāt veselību un uzlabot atmiņu.

Visbeidzot, regulāri vingrinājumi var arī palīdzēt cilvēkiem ar Parkinsona slimību uzlabot atmiņu. Vingrojumi ne tikai palīdz mums palikt fiziski veseliem, bet, vēl svarīgāk, uzlabo mūsu smadzeņu darbību. Regulāri vingrojot, viņi var uzlabot savu sirds un plaušu darbību, uzlabot muskuļu un kaulu elastību un uzlabot atmiņu.

Kopumā tas, vai cilvēkiem ar Parkinsona slimību ir atmiņas pasliktināšanās, ir atkarīgs no viņu dzīvesveida un ēšanas paradumiem, kā arī no tā, vai viņi pievērš uzmanību tādām lietām kā smadzeņu apmācība un vingrinājumi. Kamēr mēs pievēršam uzmanību šiem aspektiem, uzskatu, ka Parkinsona slimības pacientu atmiņu var efektīvi uzlabot. Var redzēt, ka mums jāuzlabo atmiņa. Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls ar daudziem unikāliem efektiem, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Maltās gaļas efektivitāti nodrošina dažādas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp karbonskābe, polisaharīdi, flavonoīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību, izmantojot dažādus kanālus.

Noklikšķiniet uz zināt veidus, kā uzlabot smadzeņu darbību

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) mūsu kopējā kohortā (PD gadījumi + kontroles probandas), kas ir aptuveni salīdzināms ar mazāko alēļu kopējo populācijas fq diapazonu (MATPFR), par ko ziņo gnomAD un ExAC datubāzes, šādi: fqo (novērots) pret (ziņots) {{1 }}% ​​pret 29-30%.

Nelielā alēle fq rs708727 (G > A) mūsu kopējā grupā bija augstāka nekā MATPFR gnomAD un ExAC datu bāzēs (fq, salīdzinot ar=40% pret 29-30%), bet bija salīdzināma ar rs708727 mazā alēle fq, par kuru ziņots Eiropas iedzīvotājiem ALFA datubāzē (41%). rs823156 (A > G) mazās alēles fq mūsu kopējā kohortā bija 17% un tādējādi bija zemāka par MATPFR gnomAD un ExAC datu bāzēs (23–30%), bet bija salīdzināma ar rs823156 mazās alēles fq, par ko ziņots Eiropas iedzīvotājiem gadā. ALFA datubāze (18%).

Rs9438393 (A > G) mazās alēles biežums kopējā kohortā bija 40%, un tāpēc tas bija ievērojami augstāks par MATPFR 26–29%, kas ziņots gnomAD un TOPMED datu bāzēs, bet bija salīdzināms ar rs9438393 minor. ALFA datubāzē norādītais alēļu biežums Eiropas iedzīvotājiem (41%). Nelielā rs56152218 alēle (T > C) kopējā kohortā bija sastopama ar fq 38%, kas ir MATPFR robežās 32–46%, par ko ziņoja ALSPAC, TOPMED un ALFA (Eiropas populācijas) datubāzes.

Interesanti, ka Vjetnamas, Korejas un Kataras populācijās mazā alēle ir T, nevis C, kā tas novērots Eiropas populācijā [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{0} }rs56152218, skatīts 2021. gada 2. augustā)]. Tika konstatēts, ka mazās alēles fq rs61822602 (G > T) ir 12%. Tas ir salīdzināms ar T alēļu frekvencēm, par kurām ziņo datu bāzes ALSPAC un TWINSUK (attiecīgi 12% un 13%), taču tas ir daudz augstāks par T alēles fq, par kuru ziņots Eiropas populācijā ALFA datubāzē (6%).

Visi pārbaudītie A1 SNP mūsu PD un kontroles grupās bija Hārdija – Veinberga līdzsvarā (HWE; 4. tabula).

Pēc tam mēs aprēķinājām mazākās alēles un genotipu, kas satur mazāko alēli, izredžu attiecības (OR) katram pārbaudītajam SNP. Šie rezultāti ir apkopoti 5. tabulā. GA genotips rs708727 bija saistīts ar PD (OR=1.42 (1.08–1.87), p=0.01) mūsu populācijā. Turklāt mēs pārbaudījām konkrētu genotipu kombināciju saistību ar katru pārbaudīto SNP ar PD recesīvos, dominējošos un pilnīgi dominējošos ģenētiskajos modeļos (6. Saskaņā ar iepriekšējiem datiem mēs identificējām rs708727 mazās alēles (A) saistību ar PD dominējošajos (GG pret GA + AA) un pilnībā dominējošos (GG + AA pret GA) ģenētiskajos modeļos (ORD {{16} },36 (1,05–1,77), p=0,02 un ORCOD=1,34 (1,04–1,72), p=0,02). Pārējie SNP pārbaudītajos ģenētiskajos modeļos neuzrādīja saistību ar PD (6. tabula).

Mēs arī pārbaudījām populācijas proporciju vienlīdzību jebkurai genotipiskajai kombinācijai, kas sastāv no pārbaudīto SNP dupletiem, tripletiem, četriniekiem, piecniekiem vai sekstupletiem PD kohortā (N {0}}) un kontroles grupā ( N=100), lai pārbaudītu pārbaudīto A1 SNP mijiedarbības ietekmi uz uzņēmību pret PD attīstību mūsu populācijā. Kopumā 12 genotipu kombinācijas (divi dupleti, septiņi tripleti un trīs četrinieki, 7. tabula) ar nozīmīgi (p < 0.05, 10 genotipi; p < 0,06, divi genotipi). ) tika identificēti dažādi PD un kontroles kohortu skaits (7. tabula). Ievērojot Koena kritērijus [39], kas apraksta proporciju atšķirības, tikai triplets GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) no 12 genotipiem uzrādīja "vidēja" izmēra atšķirību, ko definēja Koena h(2arcsin√ prp1). –2arcsin√ prp2) Lielāks vai vienāds ar 0,5.

Pārējo 11 genotipu h vērtība svārstījās no 0.32 līdz 0.46 un tādējādi atradās h intervālā no 0.2 līdz 0.5, kas definē nelielas proporciju atšķirības (7. tabula) [39]. Tāpēc triplets GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) varētu būt klīniski nozīmīgs, un turpmāk jāveic šī genotipa pētījumi par jutību pret PD. Attiecībā uz rs11240569, rs708727 un rs823156 mēs veicām tāda paša veida analīzi, izmantojot avota datus no 508 PD pacientu kohortas un 472 kontroles grupu. Četri genotipi, divi dupleti (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) un divi tripleti (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + GG(rs708727) + GG(rs708727) (23)156rs,458 Tika identificēti + GG(rs708727) + AG(rs823156) ar ievērojami (p < 0,05) atšķirīgu skaitu PD un kontroles grupās. Koena h, kas aprēķināta katram no četriem genotipiem, bija zem sliekšņa 0,2 [39], un tādējādi atšķirība starp populācijas proporcijām starp pārbaudītajām grupām visos četros gadījumos bija niecīga.

Novecošana, kam seko vīriešu dzimums, tiek uzskatīta par visievērojamāko riska faktoru idiopātiskas PD sākumam [37]. Mūsu izmēģinājuma pētījumā idiopātiskās PD sākuma vecums 15 0 PD pacientu grupā nebija korelēts ar SNP rs11240569, rs708727 un rs823156 genotipisku kombināciju [37]. Šeit mēs esam korelējuši PD sākuma vecumu ar (1) katras genotipiskās kombinācijas klātbūtni SNP rs11240569, rs708727 un rs823156 508 PD pacientu grupā (2. attēls) un (2) ar katras no tām klātbūtni. SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 un rs61822602 genotipiskā kombinācija PD pacientu apakšgrupā, kas nejauši izvēlēta no PD kohortas A3 veicinošajai sekrēcijai. Apmēram sākuma vecumu vienvirziena ANOVA analīze atklāja, ka nebija būtiskas (p < 0,05) atšķirības starp genotipiskām apakšpopulācijām katrā no pārbaudītajām SNP gan lielajā PD kohortā, gan PD apakšgrupā. pacientiem. Tādējādi neviens konkrēts genotips pārbaudītajos SNP neietekmē PD idiopātiskās formas sākuma vecumu. Tas pilnībā atbilst mūsu izmēģinājuma pētījumā [37] izdarītajam secinājumam.

Mēs esam arī veikuši tāda paša veida analīzi katram no pārbaudītajiem SNP sieviešu un vīriešu apakšpopulācijās, kas tika iegūtas no lielās kohortas (N=508) un apakšgrupas (N=96). ) PD pacientu. Kā parādīts papildattēlos S1–S3, nav būtiskas (p < 0.05) saistības starp sākuma vecumu un kādas konkrētas genotipu kombinācijas klātbūtni pārbaudītajos SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs9438393, rs56122215615. un rs61822602 apakšgrupās, kas sadalītas pēc dzimuma, tika iegūts vai nu no lielās PD kohortas (NM=306, NF=202), vai no PD apakšgrupas, kas atlasīta A1 promotora sekvencēšanai (NM {{20}). }, NF=42).

2.3. RandomForest Machine Learning (RF-ML)

Visi A1 SNP tika pārbaudīti, lai noteiktu to spēju atšķirt PD pacientus no kontroles ar RF-ML. RF-ML algoritms tika apmācīts, izmantojot mūsu datus, un tika novērtēta atsevišķu SNP diskriminējošā nozīme ar tehnisko konstrukciju, kas pazīstama kā grafa dziļums [37, 40]. Tāpat kā mūsu izmēģinājuma pētījumā [37], pārbaudīto SNP prognozēšanas spēja tika vizualizēta un kvantificēta attiecīgi ar ROC (uztvērēja darbības raksturlielumu) līknēm un AUC (platība zem ROC līknes). Prognozētāju diskriminācijas spēja ir norādīta AUC intervālā no 100% (maksimālā diskriminācijas spēja) līdz 50% (minimālā diskriminācijas spēja); AUC < 50% atbilst nediskriminējošai spējai.

RF algoritms tika apmācīts šādos režīmos: (1) ar trim vai sešiem (8. tabula) konkrētiem A1 SNP (katrs SNP, trīs genotipi (AMAM/AMAm/AmAm, kur AM apzīmē galveno alēli un Am mazo alēli), kā prognozētājs (trīs vai seši RF modeļi, viens katram SNP), (2) ar pārī savienoto SNP genotipiskajiem dupletiem kā prognozētājiem (trīs RF modeļi (trīs SNP) vai 15 RF modeļi (seši SNP), pa vienam katram SNP pārim. SNP; 8. tabula, (3) ar trīs SNP genotipiskajiem tripletiem kā prognozētājiem (viens RF modelis (trīs SNP) vai 20 RF modeļi (seši SNP), viens katram SNP tripletam; 8. tabula), (4) ar sešu SNP genotipiskie četrinieki kā prognozētāji (15 RF modeļi, pa vienam katram četriniekam; 8. tabula), (5) ar sešu SNP genotipiskiem pieciniekiem kā prognozētājiem (seši RF modeļi, viens katram pieciniekam; 8. tabula) un ( 6) ar genotipisku sekstupletu (viens RF modelis, 8. tabula).

Tādējādi, ja kā prognozētājus izmantoja A1 SNP singletonus, dupletus, tripletus, četrkāršus, piecniekus un sešpadsmitniekus, tiem nebija iespējas atšķirt PD pacientus un kontroles grupas (8. tabula). Tādējādi, saskaņā ar RF-ML analīzi un saskaņā ar izmēģinājuma pētījumu [37], A1 SNP nav potenciālas kalpot par diskriminatoriem starp kontroles grupām un PD pacientiem, un attiecībā uz PD tiem nav paredzamas vai diagnostiskas vērtības Slovākijas populācijā. .

3. Diskusija

PARK16 lokuss ir ieguvis uzmanību zinātnieku aprindās, jo tas ir saistīts ar PD un tā apspriesto lomu, nosakot uzņēmību pret šo sarežģīto slimību. 2019. gadā mēs ziņojām par izmēģinājuma pētījumu, kurā analizējām trīs A1 SNP, proti, rs11240569, rs708727 un rs823156, saistību ar idiopātisko PD formu Slovākijas (rietumslāvu) populācijā. Mūsu pētījumā netika konstatēta ziņotā rs11240569 un rs823156 saistība ar jutību pret PD galvenokārt Āzijas/Austrumu populācijās [37]. Nekādu saistību nevarēja apstiprināt, izmantojot bieži sastopamu statistiku (konservatīvas ģenētiskās analīzes) vai RF-ML analīzi [37].

Tomēr mūsu izmēģinājuma pētījuma galvenais ierobežojums bija salīdzinoši zemais pacientu / probandu skaits PD un kontroles grupās (attiecīgi 150 un 120). Mēs uzsvērām, ka no statistikas viedokļa dati bija jāinterpretē piesardzīgi, jo abās kohortās izlases lielums ir mazs un veikto analīžu statistiskā jauda bija zema [37]. Tomēr, izmantojot ML pieeju, kas prasa ievērojami mazākus paraugus nekā parastā bieži sastopamā statistika vai aptuvenais Beijesa aprēķins, mēs varējām ar pārliecību pārbaudīt konkrētu A1 SNP spēju atšķirt PD pacientus un kontroles grupas. Visos gadījumos ML pieeja būtībā atklāja nulles SNP rs11240569, rs708727 un rs823156 diagnostisko un paredzamo nozīmi Slovākijas populācijā [37].

Šajā pētījumā mēs esam pārbaudījuši ne tikai trīs iepriekš minētos SNP, bet arī trīs SNP (rs9438393, rs56152218 un rs61822602), kas lokalizēti A1 promotora reģionā. Šie SNP ir identificēti, sekvenējot 96 PD paraugus, kam seko kontroles paraugu RFLP analīze un sekvencēto PD paraugu RFLP pārbaude. Mūsu ģenētiskās analīzes būtībā nav atklājušas neviena no trim nesen pētītajām SNP saistību ar PD. Tas pats attiecas uz rs11240569 un rs823156, kas tika analizēti PD un kontroles apakšgrupās (96/100), kā arī 508 PD pacientu un 472 kontroles grupās. Šie rezultāti pilnībā saskan ar izmēģinājuma pētījuma rezultātiem [37]. Tomēr lielajās grupās rs708727 ir saistīta ar paaugstinātu PD risku Slovākijas populācijā.

Cik mums zināms, neviens pētījums vēl nav tieši saistīts ar A1 SNP rs708727 ar mainītu PD attīstības risku [19, 37]. Mūsu paplašinātajā pētījumā (salīdzinot ar izmēģinājuma pētījumu [37]), mazā alēle A rs708727 ir saistīta ar paaugstinātu PD sākuma risku, pārbaudot dominējošā stāvoklī [40] (ORD=1.36 (1,05–1). 1.77), p=0.02) vai pilnībā dominējoši [41] (ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0.02) modeļi (5. tabula). Tādējādi nelielas alēles (A) klātbūtne rs708727 var būt saistīta ar paaugstinātu PD attīstības risku. Tā kā Sanchez-Mut et al. [27] un Wang et al. [42] ir skaidri parādījuši, ka mazās alēles A klātbūtne rs708727 maina PM20D1 promotora metilēšanu (un līdz ar to arī tā ekspresiju) no devas atkarīgā (kvantitatīvā) veidā, kas ir vislabāk piemērotie ģenētiskie modeļi mūsu pētījumā. norāda, ka vienas rs708727 A alēles klātbūtne ir pietiekama, lai mainītu jutību pret PD rašanos. PD jutība (fenotips) par to, vai rs708727 (genotips) ir viena vai divas mazās alēles kopijas, vēl ir sīkāk jāizskaidro.
Sanchez-Mut et al. ir identificējuši PM20D1 (lokalizēts PARK16 lokusā un kodē peptidāzes M20-domēnu, kas satur vienu proteīna enzīmu ar hidrolāzes un peptidāzes aktivitātēm; N-taukskābju acilaminoskābes sintāze/hidrolāze) kā metilēšanas un ekspresijas kvantitatīvu iezīmi. lokuss (mQTL), kas savienots ar ar AD risku saistītu haplotipu, kas parāda pastiprinātājam līdzīgas īpašības un saskaras ar PM20D1 promotoru, izmantojot no haplotipa atkarīgu, CTCF (CCCTC saistošo) transkripcijas faktoru mediētu hromatīna cilpu [27]. Salīdzinot paraugus no veselām kontrolēm un pacientiem ar progresējošu AD stadiju, viņi atklāja, ka PM20D1 pacientiem ar AD konsekventi parāda promotora hipermetilāciju [27]. A1 SNP rs708727 korelē ar PM20D1 DNS metilēšanas līmeni cilvēka frontālajā garozā un hipokampā [27], tāpat kā SNP rs960603 [27]. Vans un kolēģi, strādājot ar perifēro asinīm, ir ieguvuši datus, kas apstiprina, ka PM20D1 ir mQTL, ko galvenokārt mediē ar AD risku saistītais A1 SNP rs708727 [42].

Turklāt to garengriezuma dati liecina, ka hipometilācija notiek pirms simptomātiskas AD sākuma, iespējams, lai veicinātu pieaugošo PM20D1 ekspresiju, lai aktivizētu tā aizsargfunkciju [42]. AD progresu raksturo pieaugošais metilēšanas līmenis CpG salās PM20D1 promotora DMR (diferenciāli metilētā reģionā) AD pacientiem, kas galu galā izraisa gēnu transkripcijas un ekspresijas inhibīciju [27, 42, 43]. PM20D1 ir bijis saistīts arī ar diabētu [44], aptaukošanos [45] un multiplo sklerozi [46], un, tā kā tas ir lokalizēts PARK16 lokusā, tiek pieņemts, ka tā ir saistīta/saista ar PD [47].

Neskatoties uz to, ka trūkst molekulārās mehāniskās analīzes, mēs, ņemot vērā mūsu pašreizējos datus, domājam, ka AD un PD (un citām retāk sastopamām neirodeģeneratīvām slimībām) ir ne tikai "labi zināmi" patofizioloģiski mehānismi (piemēram, traucēta mitofagija, retromērs un proteasoma). funkcijas), bet arī epiģenētiskus mehānismus, piemēram, A1 rs708727-atkarīgo PM20D1 ekspresijas regulēšanu [27,42]. Mūsu darbs netieši palielina nepieciešamību detalizēti noskaidrot endogēno N-acilaminoskābju (NAA), kuras metabolizē PM20D1, lomu PD un citu neirodeģeneratīvu traucējumu patobioloģijā. Ir zināms, ka NAA un neirotransmiteru N-acilkonjugāti (NAAN) spēlē nozīmīgu lomu neiromodulācijā [48, 49]. Pierādījumus, kas saista PM20D1 ekspresiju ar N-acildopamīnu (NADA), sniedz nesenais Song et al. Šie autori ir parādījuši, ka kir6.2 (poras veidojošas ATP jutīgo K+ kanālu apakšvienības) dzēšana samazina mitohondriju skaitu un samazina ATP veidošanos, palielinot PM20D1 un aģentu līmeni, kas atvieno mitohondriju elpošanu. , ieskaitot NADA, peles vidussmadzenēs [49].

NADA ir spēcīgs 5-lipoksigenāzes (5-LOX) inhibitors, un tas izplatās tikai smadzenēs, augstākais līmenis striatumā un ļoti zems citur [48,50,51]. 5-LOX katalizē leikotriēna vai 5-HpETE (5-hidroperoksi-eikozatetraēnskābes) sintēzi no arahidonskābes, un tas ir saistīts ar neirodeģenerāciju (AD un PD), jo tas ir saistīts ar neiroiekaisumiem [51, 52]. Tāpēc mēs ierosinām, ka samazināta PM20D1 ekspresija, pēc tam zemāks NADA daudzums un palielināta 5-LOX aktivitāte būtiski veicina PD (un citu neirodeģeneratīvu slimību) patoloģiju.

Sanchez-Mut un kolēģi ir pierādījuši, ka PM20D1 pārmērīga ekspresija peles AD hipokampā uzlabo mācīšanās procesu, bet tā notriekšana palielina amiloīda aplikuma slodzi [27]. Gan Lewy tipa, gan Alcheimera tipa patoloģijas ir svarīgas ar PD saistītās demences gadījumā [53]. Nozīmīgs PD pacientu kopums slimības laikā cieš no demences pasliktināšanās [54]. Ņemot vērā šos novērojumus, mēs domājam, vai ar rs{10}}saistītā darbība, kas apklusina PM20D1, veicina PD demences rašanos un vai PM20D1 aktivitātes monitorings var kalpot kā prognostisks parametrs PD demences sākumam.

Iepriekš publicētie darbi liecina par Mg2+ transportētāju iesaistīšanos PD patobioloģijā [18–22,55]. A1, kas ir galvenais somatisko šūnu Mg homeostāzes spēlētājs, ir tieši saistīts ar PD [20–22]. Punktu mutācijas A1, kas izraisa aizvietojumus p.A350V, p.R244H un p.R285Q, domājams, ir saistītas ar PD, un tiek pieņemts, ka gan funkciju trūkums, gan funkciju mutāciju zudums A1 rada kaitīgas sekas neironiem, tādējādi veicina PD fenotipu [20–22]. Šis darbs netieši norāda uz iespēju, ka ne tikai A1 pamatfunkcijas traucējumi (Na+/Mg2+ apmaiņa), bet arī ar A1-saistītā (rs708727) epiģenētiskā PM20D1 ekspresijas (un aktivitātes) regulēšana veicina PD patobioloģija.

Šajā pētījumā mēs esam identificējuši genotipisko tripletu GG(rs7{5}}8727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) kā potenciāli klīniski nozīmīgu (h ir lielāks par 0,5 vai vienāds ar to). Interesanti, ka rs708727 ar genotipu GG ir daļa no tripleta. Tomēr, ņemot vērā iepriekšējos pētījumus, ir sagaidāms, ka genotips, kas satur mazāko alēli A rs708727, būs saistīts ar iespējamo PD risku, kas saistīts ar šo tripletu. Pašlaik mēs nevaram komentēt nevienu molekulāro/ģenētisko/epiģenētisko mijiedarbību, kas saistīta ar SNP tripletā GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602), un tādējādi par jebkādu šī tripleta iespējamo ieguldījumu summā. par PD sākuma risku.

Mūsu izmēģinājuma pētījumā mēs izmantojām RF-ML, lai novērtētu un interpretētu savus datus [37]. RF-ML datu analīzes galvenā priekšrocība ir divējāda: (1) tā ļauj kvantitatīvi noteikt SNP diskriminācijas spēju starp PD pacientiem un kontrolēm [37], un (2) tai ir nepieciešams mazāks izlases lielums, lai novērtētu PD. atsevišķu SNP vai to kombināciju diskriminējošā nozīme [37]. Turklāt RF-ML apiet p-vērtības problēmu, kas bieži saistīta ar lielākiem paraugiem, pat ja tie ir pieejami [56]. Tāpat kā mūsu iepriekšējā ziņojumā, nevienam no pārbaudītajiem A1 SNP nav pierādīts, ka mūsu grupā būtu iespējams diskriminēt PD pacientus un probandus, kas nav PD (8. Tādējādi mēs varam pieņemt, ka neviens no pārbaudītajiem A1 SNP nav piemērots kalpošanai par PD / ne-PD diskriminatoru Slovākijas populācijā.

Attiecībā uz A1 rs708727 saistību ar izmainītu PD risku mūsu RF-ML analīzes rezultāti no pirmā acu uzmetiena šķiet pretrunīgi (5. un 6. tabula pret 8. tabulu). Jakobsdotir et al. loģistikas regresijas un ROC līknes analīzes parādīja, ka pat spēcīgas ģenētiskās asociācijas automātiski negarantē efektīvu diskrimināciju starp gadījumiem un kontrolēm [57]. Neskatoties uz to, ka SNP ir slikti klasifikatori, tie var būt ļoti vērtīgi etioloģisko hipotēžu izvirzīšanai [57]. Mūsu gadījumā A1 SNP rs708727 nav klasificēšanas spēka attiecībā uz PD, tāpēc tam nav klīniskas nozīmes. Tomēr tā vājā, bet nozīmīgā saistība ar mainīto PD risku ļāva mums spekulēt par rs708727 iesaistīšanos PD patobioloģijā līdzīgā vai tādā pašā veidā, kā tas ir iesaistīts AD [27].

4. Materiāli un metodes

4.1. Pētījuma dalībnieki (pamatīpašības)

Kopumā pētījumā tika iekļauti 980 probandi (508 PD pacienti un 472 kontroles, kas atbilst iekļaujošajiem kritērijiem). PD idiopātisko formu diagnosticēja neirologi piecos PD diagnostikas centros (Martinā, Bratislavā, Trencinā, Zvolenā un Košicē) saskaņā ar MDS (Movement Disorder Society) PD diagnostikas kritērijiem. Visi pacienti tika ārstēti ar standarta anti-PD terapiju. PD pacientu vidējais vecums bija 68,4 ± 9,6 gadi. Vidējais slimības sākuma vecums bija 61,7 ± 10,7 gadi. Jaunākais gadījums tika diagnosticēts 34 gadu vecumā, bet vecākais – 89 gadu vecumā. PD grupā bija 202 sievietes (F) un 306 vīrieši (M), un tādējādi F: M attiecība bija 1:1,5.

Probandu kontroles grupa sastāvēja no ārējiem un iekšējiem pacientiem no Arodmedicīnas un toksikoloģijas klīnikas (Mārtiņa universitātes slimnīca (UHM)) un Neiroloģijas klīnikas (UHM). Kontroles pētījuma grupā tika iekļauti tikai tie pacienti, kuriem iepriekš nebija diagnosticēta neviena neirodeģeneratīva un neiropsihiska slimība, piemēram, cukura diabēts vai osteoporoze (visas slimības, kas, domājams, saistītas ar mainītu A1 ekspresiju un A1 funkcijas atcelšanu). Vidējais kontroles probandu vecums bija 68,3 ± 11,6 gadi. Kontroles grupā bija 208 sievietes un 264 vīrieši, un tādējādi kontroles grupā F:M attiecība bija 1:1,3.

PD pacientu apakšgrupa, kurā tika sekvencēts A1 promotora reģions, sastāvēja no 96 nejauši izvēlētiem subjektiem. F:M attiecība bija 1:1,3 (42 sievietes un 54 vīrieši). Vidējais pacientu vecums PD apakšgrupā bija 67.{{10}} ± 9,5 gadi. Kontroles apakšgrupā bija 41 mātīte un 59 tēviņi, līdz ar to F:M attiecība bija 1:1,4. Kontroles apakšgrupas probandu vidējais vecums bija 59,8 ± 5,0 gadi.

Šo pētījumu apstiprināja Komeniusa universitātes Jesseniusa Medicīnas fakultātes (JFM CU) ētikas komiteja. Apstiprinājums reģistrēts ar ID: EK 66/2019. Visi pētījuma dalībnieki parakstīja informētas piekrišanas veidlapas.

4.2. Paraugu apstrāde

Asins paraugi tika savākti ar EDTA apstrādātās BD Vacutainer® mēģenēs (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ ASV). Genomiskā DNS tika izolēta no svaigiem (UHM) vai saldētiem asins paraugiem (citi PD centri), izmantojot Wizard® genoma DNS attīrīšanas komplektu (Promega Corporation, Maddison, WI, ASV) saskaņā ar ražotāja protokolu. Izolēti DNS paraugi tika uzglabāti –80 ◦C temperatūrā.

4.3. Genotipēšana

Genotipēšana tika veikta 358 PD paraugiem un 352 kontroles paraugiem. Šo eksperimentu rezultāti tika analizēti kopā ar rezultātiem, par kuriem iepriekš ziņoja Cibulka et al. [37]. SNP rs11240569, rs708727 un rs823156 tika analizēti, izmantojot TaqMan® genotipēšanas zondes C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 un C_9238453_10/rs708727 (Sall, Waltham, Fishercient MA USA) tādā pašā veidā, kā ziņots iepriekš [37].

4.4. Sangera secība

Promotora reģions tika sadalīts četros pārklājošos fragmentos / amplikonos, jo tas bija pārāk garš vienam sekvencēšanas procesam. Pirms sekvencēšanas mērķa reģioni tika pastiprināti. Primers tika izstrādāts, izmantojot tiešsaistes rīku Primer3Plus [https:// primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (piekļuve 2018. gada 3. maijā)]. Katrs primeru pāris tika pārbaudīts, lai noteiktu vairāku amplifikācijas produktu klātbūtni, izmantojot PCR tiešsaistes rīku UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (piekļuve 2018. gada 3. maijā)].

Četru fragmentu amplifikācijai izmantotie praimeri un PCR programmas ir apkopotas papildu S1 un S2 tabulās. Katra fragmenta galveno maisījumu sastāvi ir apkopoti SA3. 3. un 4. fragmentā ir augsts G un C nukleotīdu saturs (attiecīgi 67,4% un 71,9%). Reakcijas iznākums tika palielināts, pievienojot 10 × GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Tartu, Igaunija). PCR produkts tika attīrīts, izmantojot NucleoSpinTM Gel un PCR tīrīšanas komplektu (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Düren, Vācija). Nākamajā solī attīrītais PCR produkts tika atšķaidīts līdz atbilstošai koncentrācijai PCR iepriekšējai sekvencēšanai (SA4, SA5). Iepriekšējā sekvencēšanas PCR tika izmantoti tikai priekšējie (fw) primeri. Reakcijas maisījums ietvēra arī BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Waltham, MA, ASV) un dideoksinukleotīdus.

Rezultātā mēs ieguvām dažāda lieluma produktu maisījumu, ko beidza ar fluorescences iezīmētiem didezoksinukleotīdiem. Pēc tam produkti tika attīrīti, izmantojot SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up komplektu (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) saskaņā ar ražotāja protokolu. 3 µL attīrīta produkta tika pārnests uz 96- iedobes plāksni kopā ar 12 µL augstas kvalitātes dejonizētu formamīdu (Applied Biosystems, Waltham, MA, ASV). Maisījums tika denaturēts 5 minūtes 95 ◦C termociklerā. Fragmenti tika atdalīti ar 8-mikrokapilāro ierīci ABI 3500 (Applied Biosystems, Waltham, MA, ASV). Sekvences tika eksportētas un vizualizētas, izmantojot Chromas programmatūru (Technelysium Pty Ltd., Dienvidbrisbena, Austrālija). FASTA faili tika augšupielādēti BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) un saskaņoti ar atsauces cilvēka genomu (versija GRCh38.p12).

Transkripcijas faktoru saistošo vietu un to izmaiņu prognozēšana tika veikta, izmantojot tiešsaistes rīku ConSite [pieejams: http://consite.genereg.net/ (pieejams 2020. gada 3. septembrī)] [38]. Tika augšupielādētas sekvences ar galveno alēli un mazāko alēli, un tika ģenerēti transkripcijas faktoru (TF) spektri. Analīze tika veikta, iepriekš nenosakot minimālo specifiku. Izmaiņas TF saistošajos profilos, pamatojoties uz variantu klātbūtni, ir apkopotas 2. tabulā.

4.5. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) analīze

Pastiprinātā PCR reakcijas maisījuma sastāvdaļas un PCR apstākļi ir apkopoti SA6 un SA7. Lai izstrādātu amplikonu ierobežojumus, tika izmantots tiešsaistes in silico rīks NEBcutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2 / (piekļuvis 2020. gada 14. februārī)]. RFLP analīzei tika izvēlēti šādi restrikcijas enzīmi: Hpy166II (rs9438393 noteikšana), NIaIII (rs56152218 noteikšana) un BmrI (rs61822602 noteikšana). Visi fermenti tika iegādāti no New England Biolabs. Variantam rs144056491 mēs nevarējām izveidot RFLP eksperimentu, jo nebija pieejams piemērots enzīms. Pēc ierobežojuma mēs gaidījām, ka SA8 apkopotie fragmenti veidos ražu. Pēc ierobežošanas produkti tika atdalīti ar agarozes gēla elektroforēzi (NIaIII un Hpy166II 1% gēls; BmrI 2% gēls) un pēc tam vizualizēti ar PharosFX instrumentu (Bio-Rad Laboratories). Katram SNV tika noteikti genotipi.

4.6. Datu analīze

Dati tika izpētīti un analizēti, izmantojot R [R Core Team (2021); R: valoda un vide statistikas skaitļošanai. R Foundation for Statistical Computing, Vīne, Austrija. URL https://www.R-project.org/, ver. 4.{13}}.5 (2021-03-31)]. Ģenētiskās asociācijas pētījums (GAS) un jaudas analīze tika veikta, izmantojot R bibliotēkas HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Diallelic ģenētisko marķieru izpēte: HardyWeinberg pakete. Journal of Statistical Software, 64(3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Andri Signorelli et al. (2021); DescTools: rīki aprakstošai statistikai. R pakotnes versija 0.99.41.], epitools [Tomas J. Aragon (2020); epitools: Epidemiology Tools. R pakotnes versija 0.{18}}.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Stefans Čempelijs (2020); pwr: jaudas analīzes pamatfunkcijas. R pakotnes versija 1.{24}}. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] un iekšēji izstrādāts kods. RandomForest paredzamā modelēšana tika veikta ar R bibliotēku randomForestSRC [Ishwaran H. un Kogalur UB (2021); Fast Unified RandomForests izdzīvošanai, regresijai un klasifikācijai (RF-SRC), R pakotnes versija 2.11.0.]. Datus vizualizēja R bibliotēkas bišu silts [Aron Eklund (2021); bišu spiets: Bišu spieta sižets, alternatīva svītru diagrammai. R pakotnes versija 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Vienvirziena ANOVA tika izmantota, lai pārbaudītu nulles hipotēzi par populācijas vidējā sākuma vecuma vienlīdzību trīs genotipu apakšpopulācijām katram SNP. Atzinumi ar p-vērtību zem 0,05 tika uzskatīti par statistiski nozīmīgiem.

5. Secinājumi

Rezumējot, mūsu dati liecina par vāju, bet nozīmīgu A1 SNP rs708727 saistību ar PD dominējošajos un pārāk dominējošajos ģenētiskajos modeļos Slovākijas populācijā. Neviens no citiem pārbaudītajiem A1 SNP (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 un rs61822602) nebija saistīts ar slimību nevienā no pārbaudītajiem ģenētiskajiem modeļiem. RF-ML analīzes atklāja, ka visi pārbaudītie A1 SNP ir slikti PD klasifikatori / prognozētāji, tāpēc to izmantošana klīniskajā praksē kā diagnostikas vai prognostiskie marķieri joprojām ir niecīga. Tomēr rs708727 saistība ar PD ļāva mums spekulēt, ka ar PD risku saistītā nelielā alēle (G > A) rs708727 veicina slimības rašanos un progresēšanu, izjaucot PM20D1 ekspresijas epiģenētisko regulējumu, kas, kā zināms, spēlē lomu. AD patobioloģijā. Šī hipotēze ir jāturpina pārbaudīt, lai sniegtu pārliecinošu apgalvojumu. Turklāt ir jānoskaidro iespējamā saistība starp ar PD saistītu demenci un rs708727.

Autora ieguldījums:

Konceptualizācija, MK; metodika, MK, MC, MG (Marian Grendar) un MB; programmatūra, MG (Marian Grendar); validācija, MC, MB un MK; formālā analīze, MK, MG (Marian Grendar), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS un MG (Milan Grofik); izmeklēšana, MC un MB; datu apkopošana, MC, MB, MG (Marian Grendar), MG (Milan Grofik), JN, VN un EK; rakstīšana — oriģinālā projekta sagatavošana, MK; rakstīšana — recenzēšana un rediģēšana, MC, MG (Marian Grendar) un ZP; vizualizācija, MK, MC un MG (Marian Grendar); uzraudzība, MK; projektu administrēšana, MC, MK, MG (Milan Grofik), JN, JB, VH, VN, EK, MS un BV; finansējuma iegūšana, MK Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Finansējums:

Šo darbu atbalstīja Slovākijas Pētniecības un attīstības aģentūra, granta numurs APVV-19-0222, un Slovākijas Republikas Izglītības, zinātnes, pētniecības un sporta ministrijas un Slovākijas Zinātņu akadēmijas Zinātnisko grantu aģentūra, granta numurs VEGA 1/0554/19, abas uz MK

Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums:

Pētījumu apstiprināja Komeniusa universitātes Jesseniusa Medicīnas fakultātes (JFM CU) ētikas komiteja. Apstiprinājums reģistrēts ar ID: EK 66/2019.

Informētas piekrišanas paziņojums:

No visiem pētījumā iesaistītajiem subjektiem tika iegūta informēta piekrišana.

Paziņojums par datu pieejamību:

Visa datu kopa ir ietverta rakstā. Iekļauto datu raksturs un apjoms ļauj veikt turpmāku metaanalīzi. Jebkura informācija par pētījumu ir pieejama pēc attiecīgā autora pieprasījuma.

Pateicības:

Pateicamies visiem pētījuma dalībniekiem un viņu ģimenes locekļiem. Mēs izsakām pateicību arī Martinam Marakam (JFM CU) par viņa kompetento tehnisko atbalstu projektam, Janam Radvanskim un Rastislavam Hekelam (abi GENETON sro) par noderīgiem padomiem A1 veicinātāja analīzēs un Terēzai Džonsai par valodas rediģēšanu rokraksts.

Interešu konflikti:

Autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Tatarkova, Z.; de Baaij, JHF; Grendars, M.; Ašenbahs, JR; Racay, P.; Boss, C.; Sponders, G.; Hoenderops, JGJ; Rentgens, M.; Turčanova Koprusakova, M.; un citi. Uztura Mg2+ uzņemšana un Na+/Mg2+ siltummainis SLC41A1 ietekmē mitohondriju enerģētikas komponentus peļu kardiomiocītos. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Jamanaka, R.; Tabata, S.; Šindo, Y.; Hota, K.; Suzuki, K.; Soga, T.; Oka, K. Mitohondriju Mg{1}} homeostāze nosaka šūnu enerģijas metabolismu un neaizsargātību pret stresu. Sci. Rep. 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Dudevs, T.; Grauffel, C.; Lim, C. Kā vietējie un svešie metālu katjoni saista ATP: ietekme uz litiju kā terapeitisku līdzekli. Sci. Rep. 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Kolišeks, M.; Zsurka, G.; Samajs, J.; Vēbers, J.; Švejens, RJ; Schweigel, M. Mrs2p ir būtiska galvenās elektroforētiskās Mg2+ pieplūdes sistēmas sastāvdaļa mitohondrijās. EMBO J. 2003, 22, 1235–1244. [CrossRef] [PubMed]

5. Šindls, R.; Vēbers, J.; Romaņins, C.; Schweyen, RJ Mrs2p veido augstas vadītspējas Mg2+ selektīvu kanālu mitohondrijās. Biofizija. J. 2007, 93, 3872–3883. [CrossRef] [PubMed]

6. Kolišeks, M.; Sponders, G.; Piļčova, I.; Cibulka, M.; Tatarkova, Z.; Verners, T.; Racay, P. Magnesium Extravaganza: Critical Compendium pašreizējiem šūnu Mg{1}} transportētājiem, izņemot TRPM6/7. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2019, 176., 65.–105. [CrossRef]

7. Kubota, T.; Šindo, Y.; Tokuno, K.; Komatsu, H.; Ogava, H.; Kudo, S.; Kitamura, Y.; Suzuki, K.; Oka, K. Mitohondriji ir intracelulāri magnija krājumi: Izmeklēšana ar vienlaicīgu fluorescējošu attēlveidošanu PC12 šūnās. Biochim. Biofizija. Acta 2005, 1744, 19.–28. [CrossRef]

8. Sponders, G.; Abdulhanans, N.; Frēlihs, N.; Mastrototaro, L.; Ašenbahs, JR; Rentgens, M.; Piļčova, I.; Cibulka, M.; Racay, P.; Kolisek, M. Na+/Mg2+ siltummaiņa SLC41A1 pārmērīga ekspresija vājina izdzīvošanas signālus. Oncotarget 2017, 9, 5084–5104. [CrossRef] [PubMed]

9. Jamaguči, H.; Wang, HG Proteīna kināze PKB/Akt regulē šūnu izdzīvošanu un apoptozi, inhibējot Bax konformācijas izmaiņas. Oncogene 2001, 20, 7779–7786. [CrossRef]

10. Vauzour, D.; Vafeiadou, K.; Raiss-Evanss, C.; Viljamss, RJ; Spensers, JP. Izdzīvošanas Akt un ERK1/2 signalizācijas ceļu aktivizēšana ir flavanonu anti-apoptotiskās iedarbības pamatā garozas neironos. J. Neurochem. 2007, 103, 1355–1367. [CrossRef]

11. Muddapu, VR; Dharšini, SAP; Čakravartijs, VS; Gromiha, MM Neirodeģeneratīvas slimības — vai vielmaiņas trūkums ir galvenais iemesls? Priekšpuse. Neirosci. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Pataks, D.; Bertets, A.; Nakamura, K. Enerģijas mazspēja: vai tas veicina neirodeģenerāciju? Ann. Neirol. 2013, 74, 506–516. [CrossRef] [PubMed]

13. Dharšini, SAP; Taguči, YH; Gromiha, MM Alcheimera slimības enerģijas krīzes izpēte, izmantojot transkripta pētījumu. Sci. Rep. 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Zariņš, G.; Shirihai, OS Mijiedarbība starp mitohondriju dinamiku un mitofagiju. Antioksīds. Redoksa signāls. 2011, 14, 1939–1951. [CrossRef] [PubMed]

15. Zhao, W.; Džans, V.; Ma, H.; Yang, M. NIPA2 regulē osteoblastu darbību, modulējot mitofagiju 2. tipa diabēta osteoporozes gadījumā. Sci. Rep. 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Nadlers, MJ; Hermosura, MC; Inabe, K.; Perraud, AL; Zhu, Q.; Stokss, AJ; Kurosaki, T.; Kinet, JP; Peners, R.; Šārenbergs, AM; un citi. LTRPC7 ir Mg. ATP regulēts divvērtīgo katjonu kanāls, kas nepieciešams šūnu dzīvotspējai. Daba 2001, 411, 590–595. [CrossRef]

17. Kolišeks, M.; Nestlers, A.; Vormann, J.; Schweigel-Röntgen, M. Cilvēka gēns SLC41A1 kodē Na+/Mg2+ apmainītāju. Am. J. Physiol. Šūnu fiziol. 2012, 302, C318–C326. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com