MiR-103a-3p trokšņa slāpēšana uzlabo kalcija oksalāta nogulsnēšanos žurkas nierēs, aktivizējot UMOD/TRPV5 asi
Jul 22, 2024
2.10. Bioinformātikas analīze un luciferāzes tests.
UMOD-mērķauditorijas atlasi miRNS, miR-103a-3p, paredzami analizējaTargetScan vietne(http://www.targetscan.org/vert_71/)un pēc tam tika apstiprināts, izmantojot luciferāzes testu. pGL{0}}vadībavektori (E1741) tika iegādāti no Promega (ASV) līdzkonstruējiet savvaļas UMOD tipu (UMOD-WT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGCUGCU-3′) un mutanta tipuUMOD (UMOD-MUT, 5′-AGCCUGUGUCUUUAAAUGAUCCU-3′). NRK-52E šūnas tika kotransfekētas armiR-103a-3p imitācija un UMOD-WT vai miR-103a-3pmīmikas un UMOD-MUT ar Lipofectamine palīdzību2000. Identiska procedūra tika veikta mīmikākontrole (pRL-TK vektori, VT1568, YouBio, Ķīna). Pēcka mēs noteicām luciferāzes aktivitāti šūnās, izmantojotDual-Luciferase Reporter Assay Kit (E1910, Promega, ASV).2.11. Hiperoksalurijas modeļa izveide in vivo.Parin vivopētījumā mēs izveidojām hiperoksalurijas žurku modelipievienojot 1% etilēnglikolu (EG) (324558, Sigma-Aldrich,ASV) uz dzeramo ūdeni. Eksperiments ar dzīvniekiem bijaapstiprinājusi Laboratorijas dzīvnieku komitejaTrešais AffiSjiņsjanas Medicīnas universitātes slimnīca(IHRM20200510). Kopā 40 vīrieši Sprague Dawley (SD)žurkas (8 nedēļas vecs, 180–210 g), iegādāti no Charles RiverTika izmantotas laboratorijas (Pekina, Ķīna).in vivopētījums. Visižurkas tika sadalītas 4 kontroles grupās, EG, EG + antagomir, un EG + antagomir-NC, ar desmit žurkām katrā grupā.Izmitināšanas laikā kontroles grupā žurkas tika nodrošinātas tikaiar krāna ūdeni; EG grupā žurkas tika ārstētasar 1% EG; EG + antagomir grupā žurkas bijaapstrādāts ar 1% EG un intravenozi injicēts ar miR-103a-3p antagomir; un EG + antagomir-NC grupā,žurkas tika ārstētas ar 1% EG un intravenozi injicētasar miR-103a-3p antagomir-NC. Pēc 4 nedēļām visas žurkasbija sacrifiko izraisa dzemdes kakla dislokācija anestēzijā(pentobarbitāla nātrijs, 40 mg/kg, P-010, Merck, ASV) unnieru audi tika savākti histoloģiskai izpētei. TheŠajā eksperimentā izmantotie miR-103a-3p antagomiri bijaiegūts no Ribobio (Guandžou, Ķīna).
2.12. Hematoksilīna-eozīna (HE) krāsošana.
Formalīna fiksētie nieru audi tika iestrādāti parafīnā CaOx nogulsnēšanās novērtēšanai. Sadalītie paraugi pirms HE krāsošanas tika atvaskoti un hidratēti. Pēc tam paraugu apstrādei tika izmantots HE krāsošanas komplekts (C0105S, Beyotime, Ķīna), ievērojot lietošanas instrukcijas. Pēc audu aizzīmogošanas kristāla nogulsnēšanās laukums tika novērots polarizējošā mikroskopā (Axio Scope.A1, Precise Instrument, Ķīna) ar palielinājumu × 100 un tika kvantificēts, izmantojot ImageJ (vīzija 1.8.0, Nacionālie veselības institūti, ASV).
5. attēls. Turpinājums.
5. attēls: miR-103a-3p klusēšana aktivizēja UMOD/TRPV5 asi, lai vājinātu NRK-52E šūnas no oksalātu izraisītiem bojājumiem. (a) Tika noteikta miR-103a-3p inhibitora ietekme uz šūnu dzīvotspēju NRK-52E šūnās, kas apstrādātas ar oksalātu, TRPV5- pārmērīgi ekspresējošu plazmīdu un siUMOD. ar MTT testu. (b) Kristālu šūnu adhēzijas tests tika izmantots, lai noteiktu CaOx nogulsnēšanos noteiktās šūnās (× 200 palielinājums, skalas josla=200 μm). (c) Fluo-4 AM komplekts analizēja Ca2+ satura mērījumus dažādās grupās. ∗∗∗p < 0:001 pret oksalātu; ###p < 0:001 pret oksalātu + TRPV5 + siNC + IC; ∧∧p < 0:01 un ∧∧∧p < 0:001 pret oksalātu + TRPV5 + siUMOD + IC. TRPV5: pārejoša receptoru potenciāla katjonu kanālu apakšģimenes V loceklis 5; UMOD: uromodulīns; MTT: metiltiazolildifeniltetrazolija bromīds; NC: negatīva kontrole; siUMOD: maza traucējoša RNS pret UMOD; I: inhibitors; IC: inhibitoru kontrole.
2.13. Imūnhistoķīmija (IHC).
Lai izpētītu TRPV5 izplatību nieru audos, mēs izmantojām Super Plus™ augstas jutības un ātras imūnhistoķīmisko komplektu (E-IR R221, Elabscience, Ķīna), lai veiktu IHC. Īsāk sakot, nieru sekcijas (4 μm) 30 minūtes karsējot tika apstrādātas ar atsvaidzināšanas/antigēna iegūšanas buferi un pēc tam inkubētas ar SP reaģenta B peroksidāzes bloķēšanas buferi istabas temperatūrā 15 minūtes. Pēc PBS mazgāšanas sekcijas reaģēja ar anti-TRPV5 antivielu (ab137028, 1/100, Abcam, UK) 37 ° C temperatūrā 2 stundas, kam sekoja sekundāra antivielu inkubācija. Pēc tam sekcijas bija nepieciešamas krāsu attīstībai DAB darba šķīdumā un iekrāsošanai hematoksilīna buferšķīdumā. Pēc atkārtotas apstrādes krāsošanas attēli tika uzņemti, izmantojot mikroskopu (CX23, Olympus, Japāna) ar palielinājumu × 100.
2.14. Statistiskā analīze.
Visi eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes atsevišķi, mērījumu datus raksturojot kā vidējo ± standarta novirzi. Atšķirības, salīdzinot vairākas grupas, tika analizētas ar vienvirziena dispersijas analīzi. Datu analīzei tika izmantota GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, ASV), un p vērtība < 0,05 norādīja uz statistiski nozīmīgu atšķirību.
3. Rezultāti
3.1. TRPV5 regulēšana
Aizsargātas NRK{0}}E šūnas noOksalātu izraisīts ievainojums. Pamatojoties uz TRPV5 galveno lomu Ca2+ transportēšanas regulēšanānieru kanāliņu šūnas, mēs vispirms veicām TRPV5 pārmērīgu ekspresiju NRK-52E šūnās. Kā parādīts 1. attēlā (a), ar qRT-PCR tika konstatēts ievērojams TRPV5 mRNS līmeņa pieaugums (p < 0:001). Western blots ir arī izmērījis augstu TRPV5 proteīna līmeni transfektētajās šūnās (1. attēls (b), p < 0:001). Pēc apstrādes ar oksalātu NRK-52E šūnās mēs atklājām, ka TRPV5 ekspresija bija pazemināta, salīdzinot ar kontroles grupas ekspresiju, kas tika novērsta, transfekējot TRPV5-pārekspresējošo plazmīdu (1. attēls (c), p < 0:001). Turklāt Western blot noteikšana sniedza līdzīgus rezultātus (1. attēls (d), p < 0:001 ). Sekojošais MTT tests liecināja par oksalātu klātbūtni un šūnu dzīvotspēju, kas pēc tam tika daļēji apgāztaTRPV5 pārmērīga ekspresija(1. attēls (e), p < 0:05). Kristālu adhēzijas noteikšana to parādījaTRPV5 pārmērīga ekspresijapārsteidzoši kavēja oksalāta izraisīto CaOx adhēziju NRK-52E šūnās (1. attēls (f)).
.
6. attēls: miR-103a-3p mazina EG izraisītu CaOx nogulsnēšanos nieru audos in vivo, aktivizējot UMOD/TRPV5 asi. (a, b) CaOx nogulsnēšanās tika mērīta ar H&E krāsošanu žurkām, kas tika ārstētas ar EG vai EG un miR-103a-3p antagomīru (×100). palielinājums, mēroga josla=200 μm). (c) Western blot tika izmantots, lai izmērītu UMOD un TRPV5 proteīna līmeni nieru audos žurkām, kas tika ārstētas ar EG vai EG un miR{{10}}a-3p antagomir. -Aktīns kalpoja kā iekšējā kontrole. (d) TRPV5 ekspresijas IHC analīze tika veikta dažādu grupu audos (× 100 palielinājums, skalas josla=200 μm). ∗∗∗p < 0:001 pret kontroli; #p < 0:05, ###p < 0:001 pret EG + antagomir-NC. HE: hematoksilīns un eozīns EG, etilēnglikols; TRPV5: pārejoša receptoru potenciāla katjonu kanālu apakšģimenes V loceklis 5; UMOD: uromodulīns; NC: negatīva kontrole; IHC: imūnhistoķīmija
3.2. Oksalāta indukcija
Samazināta UMOD ekspresija, kas bija pozitīvi saistīta ar TRPV5 bagātināšanu uz šūnu virsmas. Tika konstatēts, ka UMOD mRNS ekspresija ir pazemināta oksalātu izraisītās NRK-52E šūnās (2. attēls (a), p < 0:001), tā kā tā proteīna līmenis (2. attēls (b), p < 0:01). CoIP rezultāti apstiprināja, ka UMOD ievērojami koimunoprecipitēja TRPV5, kas marķēts ar karodziņu, un otrādi, TRPV5 koimunoizgulsnēja anti-UMOD (attēls 2 (c)). Pēc tam mēs pārregulējām UMOD ekspresiju NRK-52E šūnās, kas tika pārbaudīta ar qRT-PCR un Western blot. Ievērojamais UMOD ekspresijas paaugstināšanās, kas noteikta mRNS (2. attēls (d), p < 0:001) un olbaltumvielu līmeņi (2. attēls (e), p < 0:001), nozīmēja veiksmīgu transfekciju. Turklāt šūnu virsmas biotinilācijas testa rezultāti atklāja, ka TRPV5 bija daudz uz NRK- 52E šūnu virsmas, kas kotransficētas ar UMOD un TRPV5 pārmērīgu ekspresiju, salīdzinot ar tās negatīvo kontroli (3. attēls (a)).
3.3. UMOD
Regulēja TRPV5 aizsargājošo lomu oksalātu izraisītās šūnās. (3. attēls (a)). Lai atklātu UMOD un TRPV5 mijiedarbību oksalātu izraisītās NRK-52E šūnās, mēs veicām siUMOD transfekciju. QRT PCR noteica, ka UMOD mRNS tiek ekspresēta zemā līmenī ar siUMOD transfektētajām šūnām (3. attēls (b), p < 0:001), un līdzīgs rezultāts tā proteīna līmenis tika noteikts ar Western blot (3. attēls (c), p < 0:001). Pēc tam MTT un kristāla adhēzijas testi parādīja, ka siUMOD ievērojami kompensēja TRPV5 veicinošo ietekmi uz šūnu dzīvotspēju (3. attēls (d), p < 0:01) un TRPV5 inhibējošo ietekmi uz CaOx adhēziju (3. attēls (e)). NRK-52E šūnās, ko inducē oksalāts. Turklāt mēs izmērījām Ca2+ saturu pēc atšķirīgām transfekcijām. Kā rezultāti aprakstīti 3(f) attēlā, TRPV5 ievērojami ierobežoja oksalātu izraisītu NRK-52E šūnu intracelulārās Ca2+ koncentrācijas samazināšanos, kas tika daļēji atjaunota, pievienojot Simonu (p < 0: 001).
3.4. miR-103a-3p
Mērķtiecīgs UMOD un ir starpnieks UMOD/TRPV5 ass regulēšanā oksalātu izraisītās šūnās. Izmantojot TargetScan tīmekļa vietni, gēnu prognozēšanas rezultāts parādīja, ka miR-103a-3p var saturēt UMOD saistīšanās vietas (4. attēls (a)). Pēc tam luciferāzes tests atklāja nomākto luciferāzes aktivitāti šūnās, kas tika kotransficētas ar miR-103a-3p imitāciju un UMOD WT (4. attēls (b), p < 0:{{21 }}01). Lai izprastu miR{{10}}a-3p regulējošo ietekmi uz UMOD, mēs ieviesām miR- 103a-3p inhibīciju NRK{{14} }E šūnas ar qRT-PCR noteikšanu, kas apstiprina, ka miR-103a-3p ekspresija bija stipri pazemināta pēc miR- 103a-3p inhibitora transfekcijas ( 4. attēls (c), p < 0:001). Interesanti, ka tika pierādīts, ka UMOD mRNS ekspresija ir paaugstināta pēc miR-103a-3p inhibīcijas, kas tika acīmredzami apgāzta, pievienojot UMOD klusēšanu (4. attēls (d), p < 0:01 ). Nosakot Western blot, tika konstatēts, ka UMOD proteīna ekspresijas izmaiņas ir tādas pašas kā tās, kas notiek UMOD mRNS ekspresijā (4. attēls (e), p < 0:01). Turklāt mēs veicām glābšanas eksperimentus attiecībā uz šūnu funkcijām. Kā parādīts, UMOD/TRPV5 ass regulējošā loma šūnu dzīvotspējā (5. attēls (a), p < 0:001), CaOx adhēzija (5(b) attēls) un intracelulārā Ca2+ koncentrācija (attēls). 5(c), p < 0:01) tika pārsteidzoši mainīts ar miR- 103a-3p inhibitoru.
3.5. miR-103a-3p
Samazināta EG izraisīta CaOx nogulsnēšanās nieru audos in vivo, aktivizējot UMOD/TRPV5 asi. Lai vēl vairāk nostiprinātu mūsu atklājumus in vitro, mēs izveidojām hiperoksalurijas žurku modeli in vivo pētījumam. Kā parādīts 6(a) un 6(b) attēlā, tika novērota ievērojama CaOx kristālu nogulsnēšanās EG grupas nieru audos, salīdzinot ar to kontroles grupā, un šo tendenci mainīja miR-103a{{ 5}}p Santjagomirs (p < 0:001). Pēc tam Western blot rezultāti liecināja, ka EG spēcīgi pazemināja gan UMOD, gan TRPV5 proteīna līmeni, ko ievērojami atjaunoja miR-103a- 3p antagomirs (6. attēls (c), p < 0:05). ). Izmantojot IHC, mēs pamanījām, ka TRPV5 ekspresija bija pazemināta EG grupā, salīdzinot ar kontroles grupu, un tā tika paaugstināta EG + antagomir grupā, salīdzinot ar EG + antagomir-NC grupu (6. attēls (d)).
4. Diskusija
Saistībā ar arvien daudzveidīgāku ķirurģisko ārstēšanu pret nierakmeņiem, jāuzsver tas, kas ir ievērojamas metodes, lai novērstu to rašanos un atkārtošanos [27]. Visizplatītākā nierakmeņu sastāvdaļa ir CaOx kristāli. Ca2+-saturošu nierakmeņu veidošanos ietekmē daudzi faktori, un hiperkalkuliūrija ir līdz šim galvenais atzītais riska faktors [28]. Tsuruoka et al. pierādīja, ka caur nieru kanāliņiem samazināta Ca2+ reabsorbcija ir svarīga hiperkalciūrijas indukcijai un ka aktīvo kalcija reabsorbciju var regulēt dažādi faktori [29]. Vēlāk Worcester et al. ierosināja, ka Ca2+ līmenis urīnā pēc ēšanas bija ievērojami augstāks pacientiem ar hiperkalciūriju, salīdzinot ar kontroles grupu, pat ja parathormona sekrēcija asinīs un nieru slodze bija vienādā līmenī [30]. Kopumā tiek atzīmēts, ka nieru kanāliņu reabsorbcijas traucējumi var būt galvenais hiperkalciūrijas iemesls. Tāpēc šajā pētījumā tika pētīts pamatā esošais molekulārais mehānisms, kas regulē Ca2+ līmeni urīnā no Ca2+ reabsorbcijas viedokļa, lai piedāvātu nozīmīgus kanālus nierakmeņu profilaksei un ārstēšanai.
TRPV5 darbojas kā nieru kanāliņu epitēlija Ca2+ kanāls, kas veicina Ca2+ transportu un reabsorbciju nierēs [31]. Jang et al. norādīja, ka TRPV5 proteīna ekspresija tika atklāti pazemināta hiperkalciēmijas urīna žurku nieru audos, bet tika atjaunota, ievadot hidrohlortiazīdu, norādot, ka hidrohlortiazīda ārstēšanas mehānismu hiperkalciūrijas gadījumā var panākt, palielinot TRPV5 proteīna ekspresiju nieru audos [32]. Pētījumi ir apstiprinājuši, ka augsta oksalurija izraisa reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos, bojā nieru kanāliņu epitēlija šūnas un maina fosfatidilserīna struktūru šūnu membrānā, izraisot CaOx adhēziju ar nieru kanāliņu epitēlija šūnu virsmu [33]. Iepriekšējā pētījumā mēs atklājām, ka ievērojami samazināts TRPV5 līmenis parādījās pēc NRK-52E šūnu ievainojuma izraisīšanas ar oksalātu, kura tendence tika mainīta pēc TRPV5 pārmērīgas ekspresijas transfekcijas. Turklāt TRPV5 regulēšana uzlaboja šūnu dzīvotspēju un inhibēja CaOx adhēziju NRK-52E šūnās, ko inducēja oksa latentums, norādot, ka TRPV5 rada kritisku profilaktisku ietekmi uz oksalātu izraisītu CaOx akmeņu veidošanos nierēs.
CISTANČE KALCIJA OKSALĀTA AMELIORĀTAM
Kā primāro Ca2+ reabsorbcijas kanālu TRPV5 aktivitāti un ekspresiju var regulēt vairāki faktori [34]. Piemēram, nesen veikts pētījums apstiprināja, ka UMOD novērš nierakmeņu veidošanos, stimulējot Ca2+ reabsorbciju, izmantojot TRPV5 [35]. Turklāt tika atzīmēts, ka 87, 5% peļu ar UMOD nokautu veidoja kalcija oksalātu un kalcija fosfāta akmeņus CNT, nieru smadzenēs un papillās 15 mēnešu vecumā. Visi šie atklājumi liecināja, ka UMOD varētu mijiedarboties ar TRPV5, veidojot nierakmeņus, kas vēl nav apstiprināts. Tomēr mūsu pētījumā pirmo reizi tika konstatēta mijiedarbība, ka UMOD pozitīvi regulēja TRPV5 ekspresijas darbību ievainotās NRK{11}}E šūnās, stiprinot šūnu dzīvotspēju, samazinot CaOx adhēziju un uzlabojot Ca reabsorbciju{12} }.
miRNS ir iesaistītas nieru slimību attīstībā un progresēšanā, mērķtiecīgi regulējot mRNS. Tika konstatēts, ka miR-21 veicina oksalātu izraisītu nieru kanāliņu šūnu bojājumu, palielinot PPARA regulēšanu [36]. Turklāt Jiang et al. ziņoja, ka miR-155-5p inhibēšana, lai paaugstinātu MGP ekspresiju, var ievērojami mazināt oksalātu izraisītu oksidatīvā stresa bojājumu nierēs [37]. Tomēr daži pētījumi ir veltīti, lai noskaidrotu miRNS regulēšanas mehānismu uz UMOD, kas ietekmē nierakmeņu veidošanos. Lai iegūtu plašāku ieskatu šīs slimības patoģenēzē, šajā pētījumā tika izmantota bioinformātikas analīze un luciferāzes tests, lai atrastu miRNS, miR-103a-3p, kas potenciāli regulē UMOD. Nieru slimību pētījumos ir apstiprināts, ka miR-103a-3p ciklam ir liela ietekme uz nieru iekaisumu un fibrozi [38]. Peters et al. arī ierosināja, ka miR-103a-3p varētu uzskatīt par potenciālu biomarķieri hroniskas nieru slimības gadījumā [39]. Interesanti, ka mūsu pētījumā mēs pārbaudījām miR-103a-3p molekulāro mehānismu nierakmeņos, jo miR- 103a-3p klusēšana var mazināt oksalātu izraisītu traumu NRK-52E šūnas, aktivizējot UMOD/TRPV5 asi. Turklāt mēs vēl spēcīgāk pierādījām šo regulējošo mehānismu, veicot in vivo eksperimentus ar EG izraisītiem žurku modeļiem. Tomēr šajā pētījumā trūkst apsvērumu, jo tas ietver viena veida šūnas un salīdzinoši nelielu skaitu pētījuma mainīgo lielumu in vitro eksperimentos.
CISTANČE KALCIJA OKSALĀTA AMELIORĀTAM
5. Secinājumi
Kopumā mūsu pašreizējais pētījums atklāja, ka miR-103a-3p klusēšana uzlabo CaOx nogulsnēšanos žurku nierēs, aktivizējot UMOD/TRPV5 asi, kas veido jaunu teorētisku pamatu profilaksei, diagnostikai un ārstēšanas stratēģijām. pret nierakmeņiem no Ca2+ reabsorbcijas viedokļa.
Datu pieejamība Pētījuma laikā iegūtās analizētās datu kopas ir pieejamas no attiecīgā autora pēc pamatota pieprasījuma.
Interešu konflikti Autori paziņo, ka saistībā ar šī darba publicēšanu interešu konflikta nav.
Atsauces
[1] RE Hautmann un M. Straub, "Urīnceļi. Metabolisms un diagnostika", Urologe A, sēj. 45, Nr. 4, 181.–184. lpp., 2006. [2] Z. Kirkali, R. Rasooly, RA Star un GP Rodgers, "Urīnceļu akmeņu slimība: progress, statuss un vajadzības", Urology, sēj. 86, Nr. 4, 651.–653. lpp., 2015. gads.
[3] AL Rodgers, "Race, etniskā piederība un urolitiāze: kritisks pārskats", Urolithiasis, sēj. 41, Nr. 2, 2013. gada 99.–103. lpp.
[4] K. Sakhaee, "Nesenie sasniegumi nefrolitiāzes patofizioloģijā", Kidney International, sēj. 75, Nr. 6, 585.–595. lpp., 2009. gads.
[5] T. Knolls, AB Šūberts, D. Fālenkamps, DB Leusmans, G. Vends-Nordāls un G. Šūberts, "Urolitiāze cauri laikmetiem: dati par vairāk nekā 200,000 urīna akmeņu analīzēm" Uroloģijas žurnāls, sēj. 185, Nr. 4, 1304.–1311. lpp., 2011. [6] T. Mitchell, P. Kumar, T. Reddy u.c., "Diētiskā oksalāta un nieru akmeņu veidošanās", American Journal of Physiology. Nieru fizioloģija, sēj. 316, Nr. 3, lpp. F409–f413, 2019. [7] SR Khan, MS Pearle, WG Robertson u.c., "Nieru akmeņi", Nature Reviews. Disease Primers, sēj. 2, nē. 1. lpp. 16008, 2016.
[8] CY Pak, HJ Heller, MS Pearle, CV Odvina, JR Poindexter un RD Peterson, "Akmeņu veidošanās un kaulu zuduma novēršana absorbējošās hiperkalciūrijas gadījumā, izmantojot kombinētas diētas un farmakoloģiskas iejaukšanās", The Journal of Urology, sēj. 169, Nr. 2, 465.–469. lpp., 2003. gads.
[9] GC Curhan, WC Willett, EL Knight un MJ Stampfer, "Diētiskie faktori un nierakmeņu risks jaunākām sievietēm: medmāsu veselības pētījums II", Archives of Internal Medicine, sēj. 164, Nr. 8, 885.–891. lpp., 2004. gads.
[10] MC Nirumand, M. Hajialyani, R. Rahimi, et al., "Diētiskie augi nierakmeņu profilaksei un pārvaldībai: preklīniskie un klīniskie pierādījumi un molekulārie mehānismi", International Journal of Molecular Sciences, sēj. 19, Nr. 3. lpp. 765, 2018.
