Anastatīna atvasinājumi mazina miokarda išēmijas un reperfūzijas bojājumus, izmantojot antioksidatīvas īpašības

Lai iegūtu sīkāku informāciju, sazinieties artina.xiang@wecistanche.com

Abstrakts:(±)-Anastatīni A un B ir flavonoīdi, kas izolēti no Anastatica hierochuntica. Iepriekšējā pētījumā tika izstrādāti divdesmit četri di- un trīsaizvietoti jauni anastatīnu atvasinājumi un novērtētas to sākotnējās antioksidanta aktivitātes. Šajā pētījumā tika tālāk pētīta miokarda išēmijas-reperfūzijas (I/R) aizsargājošā iedarbība un 24 atvasinājumu sistemātiskā antioksidanta spēja. 13. savienojums bija visspēcīgākais starp visiem pētītajiem savienojumiem, kas palielināja H9c2 šūnu izdzīvošanu līdz 80,82 procentiem. Savienojuma 13 antioksidanta spēja tika novērtēta kā dzelzs reducējošā antioksidanta spēja, 2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazolīns-6-sulfonskābe) radikāļu attapšanas spēja un 2,2-difenils {20}}pikrilhidrazila testi. Tika novērots, ka savienojums 13 ievērojami samazināja infarkta apgabalus un uzlaboja histopatoloģiskās un elektrokardiogrammas izmaiņas žurkām ar miokarda I/R traumu. Turklāt savienojums 13 samazināja seruma laktātdehidrogenāzes, kreatīnkināzes un malonildialdehīda noplūdes ātrumu no žurku miokarda audiem un palielināja glutationa un superoksīda dismutāzes aktivitātes līmeni pēc tam.miokarda I/R traumasžurkām. Kopumā mēs secinājām, ka savienojumam 13 bija spēcīga kardioprotektīva iedarbība pret miokarda I / R bojājumiem gan in vitro, gan in vivo, pateicoties tā plašajai antioksidanta iedarbībai.

Atslēgvārdi: flavonoīdu atvasinājumi; H9c2 šūnas; hipoksija/reoksigenācija; kardioprotektīva iedarbība

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu vairāk informācijas par produktu

1. Ievads

Sirds išēmiskā slimība (IHD) ir galvenais nāves cēlonis visā pasaulē [1]. Savlaicīga asinsrites atjaunošana var efektīvi uzlabot slimības klīnisko iznākumu; tomēr reperfūzija nav bez riska, ņemot vērā pašas reperfūzijas izraisīto šūnu bojājumu apmēru. Tāpēc ir ārkārtīgi svarīgi izstrādāt efektīvas terapeitiskās stratēģijas pret miokarda išēmijas-reperfūzijas (I/R) bojājumiem [2]. Miokarda I/R traumas mehānisms ir ļoti sarežģīts; tas ietver apoptozi, oksidatīvo stresu [3], kalcija pārslodzi [4] un iekaisumu [5].Oksidatīvais stressvar izraisīt apoptozi, izmantojot dažādus signālu transdukcijas ceļus, tostarp signālu regulētu kināzi (ERK), c-Jun aminoterminālo kināzi (JNK), p53 (audzēja proteīna p53) aktivāciju un p66shc variantu. Turklāt pārmērīga reaktīvo skābekļa sugu (ROS) ražošana var izraisīt neatgriezeniskus bojājumus šūnu membrānām un šūnu molekulām, piemēram, DNS, nukleīnskābēm, olbaltumvielām, lipīdiem un sākt ķēdes reakcijas, vēl vairāk bojājot miokarda audus. Oksidatīvajam stresam [6], ko izraisa nelīdzsvarotība starp brīvo radikāļu veidošanos un ROS izvadīšanu, ir svarīga loma I/R traumas I patoģenēzē. Tāpēc stratēģijas, kas aizsargā miokardu no oksidatīvā stresa, tiek ļoti rūpīgi pārdomātas. miokarda I/R traumas gadījumā. Tāpēc, ņemot vērā to iespējamās brīvo radikāļu attīrīšanas spējas, uz antioksidantiem balstītas stratēģijas ir noderīgas I/R traumu pārvaldībā.

Klīniskajos pētījumos antioksidantus izmantoja, lai samazinātumiokarda I/R traumasgalvenokārt tiek iedalīti divos veidos: fermenti un neenzīmi. Fermenti, piemēram, katalāze un glutationa peroksidāze, samazina ūdeņraža peroksīda koncentrāciju, lai novērstu šūnu bojājumus; neenzīmu antioksidanti, piemēram, E vitamīns, C vitamīns, karotīns utt., Vājina audu oksidatīvā stresa reakciju, lai samazinātu audu bojājumus un veicinātu funkcionālo atjaunošanos. Tomēr abu piemērošanai pašlaik ir noteikti ierobežojumi. Fermentu preparātu lielā molekulmasa neveicina uzsūkšanos [8]. Pastāv arī noteiktas problēmas ar neenzīmu stabilitāti, kas izraisa sliktu zāļu stabilitāti, tāpēc tās viegli oksidējas [9].FlavonoīdiIr ziņots, ka tiem kā sava veida neenzīmu antioksidantiem piemīt dažādas spēcīgas īpašības, tostarp antioksidants, pretvēža, antiapopotisks un sirds un asinsvadu aizsardzība [10]. Tie novērš ļoti reaktīvu oksīdu veidošanos un kavē oksidatīvās reakcijas, attīrot ROS, piemēram, ūdeņraža radikāļus un peroksinitrītu. Anastatīni A un B [11] ir flavonoīdi ar hepatoprotektīvu aktivitāti. Anastasius A un B ir Anastatica hierochuntica (Anastatica apakštipa, Brassicaceae dzimtas) aktīvie komponenti. Pašlaik ir ļoti maz ziņojumu par anastatīnu A un B ķīmisko sintēzi un strukturālajām modifikācijām. 2003. gadā tika izolēti aktīvie Anastatica hierochuntica savienojumi, un tiem atklājās hepatoprotektīva iedarbība pret D-galaktozamīna izraisītu citotoksicitāti primāri kultivētos peļu hepatocītos. Nakashima un Eman ir arī pierādījuši, ka savienojumiem ir in vitro antioksidanta un pretvēža iedarbība. Tomēr anastatīnu A un B un to atvasinājumu farmakoloģiskā iedarbība, kā arī to sintēzes procedūras joprojām nav skaidras. Tāpēc mūsu mērķis bija sintezēt anastatīnus A un B un dažus to atvasinājumus un novērtēt to antioksidantu aktivitāti hipoksijas /reoksigenācija(H/R) modelis, kas ir efektīvs miokarda I/R bojājumu pētīšanai [12].

Iepriekšējā pētījumā mēs sintezējām anastatīnus A un B un to analogus un novērtējām to antioksidantu spējas, izmantojot H2O2 (ūdeņraža peroksīda) izraisīto oksidatīvo bojājumu šūnu kultūras modeli13. Mūsu iepriekšējie rezultāti parādīja, ka anastatīniem A un B ir spēcīgas hepatoprotektīvas aktivitātes, kas, šķiet, ir saistītas ar to antioksidanta spējām.

Šajā pētījumā anastatīni A un B un 24 to atvasinājumi tika sintezēti un novērtēti attiecībā uz antioksidantu spējām, izmantojot samazināšanas jaudas un radikāļu attīrīšanas testus. Turklāt, lai novērtētu savienojumu kardioprotektīvo iedarbību, tika izmantots vienkāršs H/R H9c2 šūnu modelis un miokarda I/R traumas žurkas modelis.

2. Rezultāti

2.1.H/R modeļa izveide

Na2S, O4 apstrādes koncentrācija tika novērtēta, kā parādīts 1.A attēlā, un H9c2 šūnu izdzīvošanas rādītājs tika samazināts, palielinoties Na2S2O4 koncentrācijai. Zem 4 mM Na, S, Oa šūnu dzīvotspēja samazinājās līdz mazāk nekā 50 procentiem (attiecīgi 13,7, 25 un 43,4 procenti pie reoksigenācijas laika 2,1 un 0 h) , un šūnu dzīvotspējas samazināšanās līmenis bija zemāks. Tāpēc, lai imitētu hipoksijas ārstēšanu, tika izmantota 4 mM Na2S2O4 koncentrācija. Attēlā 1B parādīts, ka 4 mM Na2S2O4 apstrāde 2 stundas bez reoksigenācijas (0 h) ievērojami samazināja šūnu dzīvotspēju un saglabājās stabila. 4 mM NazS2O4 koncentrācijas apstākļos 2 h imitējošas hipoksijas gadījumā 2 h reoksigenācijas samazināja šūnu izdzīvošanas līmeni līdz 17,37 procentiem (1.C attēls). Kā skaidri parādīts 1.D attēlā, 10 μM resveratrola apvērsa H/R izraisīto samazināto šūnu dzīvotspēju, kas bija spēcīgāka par tādu pašu gallskābes koncentrāciju (74,34 pret 60,44 procentiem gallskābei).

Rezultātā tika izveidots hipoksijas/reoksigenācijas modelis, izmantojot Na2S, O4 galīgajā koncentrācijā 4 mM 2 h imitējošas hipoksijas laikā, kam sekoja kultivēšana normālā DMEM (Ērgļa barotnes Dulbeko modifikācija)/augstā glikozes koncentrācijā, lai imitētu reoksigenācijas bojājumus. . Resveratrols ar galīgo koncentrāciju 10 μM tika izmantots kā pozitīva kontrole.

2.2. Anastatīni un to denioatijas uzlabo H9c2 šūnu dzīvotspēju, kas pakļautas H/R ārstēšanai

Pirmkārt, mēs pārbaudījām anastatīnu A un B (attēls 2A, B) un to atvasinājumu ietekmi uz H9c2 šūnu dzīvotspēju MTT(3-(4,5)-dimetiltiahiazo(-z-y1){{ 10}},5-difeniltetrazoliumromīda) tests [13]. Savienojumi 20a, 21a, 22a, 20b, 22b, 20c, 20c', 21c, 22c, 10 un 11 nebija būtiski citotoksiski H9c2 šūnām (3A, B attēls, S2 tabula). Anastatīni A un B, to atvasinājumi un resveratrols (pozitīvā kontrole) mainīja hipoksijas izraisītos šūnu bojājumus (4. attēls). Modeļa grupā šūnu dzīvotspēja tika samazināta līdz 20,31 procentiem, ko resveratrols palielināja līdz 82,68 procentiem, un anastatīns A un savienojumi 22b, 22c, 24b, 24c, 13 un 14 palielināja šūnu izdzīvošanas līmeni līdz vairāk nekā 70 procentiem ( 71,49,71.00, 76,50, 73,24, 77,57, 80,82 un 77,13 procenti). Tāpēc savienojumam 13 (attēls 2C) bija visspēcīgākā aizsargājošā iedarbība starp anastatīnu atvasinājumiem no H/R bojājumiem, un to izmantoja turpmākajos eksperimentos.

2.3. Savienojums 13 mazina H/R izraisītus šūnu bojājumus un oksidatīvo stresu

Lai izpētītu savienojuma antioksidantu spēju, trīsoksidatīvais stressLai novērtētu savienojumu antioksidantu spēju, tika atlasīti indikatori LDH (laktāta dehidrogenāze), GSH (L-glutationa) un SOD (superoksīda dismutāze). LDH ir stabils citoplazmas enzīms, kas atrodas miokarda šūnās, kas pēc miokarda šūnu membrānas bojājumiem ātri izdalās no šūnas uz šūnu barotni. Jo nopietnāks ir ievainojums, jo augstāks ir LDH līmenis barotnē. Attēlā 5A parādīts, ka 2 h hipoksijas, kam sekoja 2 h reoksigenācija, ievērojami palielināja LDH izdalīšanos (478,98 U/L pret 55,84 U/Lin tukšajā grupā, p<0.001), which="" was="" inhibited="" by="" resveratrol="" (284.07="" u/l="" vs.="" the="" model="" group=""><0.01) and="" compound="" 13(276.61="" u/l="" vs.the="" model="" group,=""><0.001).gsh can="" act="" as="" a="" hydrogen="" donor="" for="" glutathione="" catalase="" (cat),="" eliminating="" o2-="" and="" its="" derivatives="" in="" the="" organism,="" thereby="" cells="" are="" protected="" from="" oxidant="" damage.="" additionally,="" sod="" can="" catalyze="" the="" disproportionation="" of="" superoxide="" anions="" and="" protect="" cells="" from="" damage.="" as="" shown="" in="" figure="" 5b,="" c,="" compound="" 13="" significantly="" increased="" gsh="" release="" and="" sod="" activity=""><0.01）. it="" increased="" gsh="" level="" to="" 39.93="" μmol/gprot="" which="" was="" higher="" than="" the="" level="" in="" the="" model="" group="" （18.2="" μmol/gprot）="" but="" slightly="" lower="" than="" that="" in="" the="" resveratrol="" group.="" additionally,="" it="" reversed="" h/r-induced="" reduction="" in="" sod="" activity="" by="" increasing="" sodlevel="" from="" 12.00="" u/mgprot="" to="" 22.98="" u/mgprot.="" these="" findings="" demonstrate="" that="" compound="" 13="" has="" a="" protective="" effect="" on="" h9c2="" cells="" subjected="" to="" h/r="">

2.4. Savienojuma 13 antioksidanta kapacitāte

Vitamin C(Vc) was used as an antioxidant control in order to evaluate the antioxidant effects of resveratrol and compound 13 intuitively. FRAP assay was used to evaluate the reducing power of the compound that can transfer ions from Fe3+ into Fe2+ to determine the antioxidant capacity of compounds. The results of the experiment showed that the reducing power of compound 13 was 354.80 mg/mmol, significantly stronger than the values obtained for the positive control Vc (127.47 mg/mmol) and resveratrol (261.91 mg/mmol) (Figure 6A).ABTS (2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)and DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) are stable free radicals insolvent, but when a radical scavenger is added to the solvent, the result is a reduction in the number of free radicals and the degree of reduction in the number of free radicals is directly proportional to the antioxidant capacity. Figure 6B, C show the ABTS and DPPH radical scavenging abilities of compound 13. The results indicate that compound 13 had the strongest scavenging activity on ABTS and DPPH with EC50 values of 1.38 and 0.07 mM, respectively. The antioxidant capacities of the compounds tested in all three antioxidant assays followed the same trend: compound 13>resveratrols. Tāpēc savienojuma 13 antioksidanta spēja var būt augstāka nekā citiem tipiskiem antioksidantiem.

2.5. Anastatīna 13. atvasinājuma ietekme uz miokarda I/R traumām žurkām

2.5.1. Savienojuma 13 ietekme uz oksidatīvo stresu un antioksidantu enzīmu aktivitātēm

Miokarda traumas līmenis tika novērtēts, nosakot oksidatīvā stresa marķieri un antioksidantu enzīmu aktivitātes. Tika novērtēta savienojuma 13 ietekme uz MDA (malondialdehīda) aktivitāti miokarda audos, kā arī LDH, CK (kreatīna kināzes), GSH un SODin seruma līmenis. Kā parādīts 7. attēlā, I/R traumas rezultātā palielinājās LDH (7.A attēls) un CK (B attēls) līmenis un ievērojami samazinājās GSH (7.C attēls) un SOD aktivitātes (7D attēls) (p<0.001). the="" level="" of="" mda(figure="" 7e)increases="" after="" i/r="" injury,="" which="" is="" a="" critical="" diagnostic="" marker="" of="" i/r="" injury.="" however,="" pretreatment="" with="" a="" positive="" control="" drug="" and="" different="" concentrations="" of="" compound="" 13="" significantly="" alleviated="" these="" injuries.="" ldh="" activity="" obtained="" for="" the="" i/r="" model="" group="" was="" 771.37="" u/ml,="" which="" was="" remarkably="" decreased="" to="" 416.129="" u/ml="" under="" resveratrol="" treatment.="" in="" the="" high-and="" low-dose="" 13="" groups,="" ldh="" activity="" decreased="" to="" 408.05="" and="" 462.81="" u/ml,="" respectively="" similar="" trends="" were="" observed="" for="" other="" myocardial="" injury="" markers,="" including="" the="" level="" of="" ck,="" gsh,="" sod,="" and="" mda="" release.="" these="" results="" indicated="" that="" compound="" 13="" exerted="" protective="" effects="" against="" oxidative="" stress-induced="" i/r="" injury="" in="" a="" dose-dependent="">

2.5.2. 13. savienojuma ietekme uz elektrokardiogrammas (EKG) izmaiņām un sirdsdarbības ātrumu

Tipiskas EKG (elektrokardiogrammas) izmaiņas, ko izraisa miokarda I/R bojājums, ir parādītas 8. attēlā. Salīdzinot ar parasto EKG (8.A attēls), miokarda I/R bojājums var izraisīt ORS (elektrokardiogrāfiskā viļņa daļa) amplitūdas palielināšanos (8.B attēls); QRS viļņu un ST viļņu saplūšana (8.C attēls); ST segmenta (intervāls starp S vilni un T vilni) pacēlums (8.D attēls); un ST segmenta inversija (8.E attēls). Pēc 15 minūtēm LAD liģēšanas QRS amplitūda tika ievērojami palielināta no aptuveni 0,5 mV līdz 1,2 mV modeļu grupā (9.A attēls), savukārt zemāks QRS amplitūdas pieaugums tika novērots visās ārstēšanas grupās (no plkst. aptuveni 0,4 mV līdz 1, 0,8 un 0,6 mV attiecīgi resveratrolam, zemas devas 13 un lielas devas 13 grupai) (9.B-D attēls ). Turklāt līdzīga tendence tika novērota pie nosiešanas 30 min. Reperfūzijas laikā QRS amplitūda sāka samazināties; tomēr QRS vilnis modeļu grupā saglabājās augstākais visā periodā. Pēc 20 minūšu reperfūzijas QRS amplitūda modeļu grupā samazinājās līdz aptuveni {{30}},8 mV, vērtība ārstēšanas grupā bija aptuveni 0,6, 0,5, 0,5 mV. attiecīgi resveratrola, zemas devas 13 un lielas devas 13 grupai. Kopumā ārstēšana ar resveratrolu, mazo devu 13 un lielo devu 13 samazināja patoloģisko QRS amplitūdas pieaugumu, salīdzinot ar modeļa grupu gan išēmijas, gan agrīnas reperfūzijas procesa laikā, ko var saistīt ar to miokarda aizsargājošo aktivitāti.

Kopā ar EKG uzraudzību tika rūpīgi konstatētas sirdsdarbības ātruma izmaiņas. Kā parādīts S3 tabulā, 30 minūšu liģēšana dramatiski samazināja sirdsdarbības ātrumu visās grupās, kamēr netika konstatētas būtiskas atšķirības nevienā no ārstēšanas grupām un modeļu grupām. Pēc 2 stundu reperfūzijas sirdsdarbības ātrums palielinājās, bet nevienā no grupām netika konstatētas būtiskas izmaiņas.

2.5.3. 13. savienojuma ietekme uz infarkta zonu un histopatoloģiskām izmaiņām

Lai novērtētu miokarda bojājuma līmeni, sirds audi tika iekrāsoti ar TTC (2,35-trifeniltetrazolija hlorīds) un tika konstatētas histopatoloģiskas izmaiņas. Kā parādīts 10. attēlā, viltus grupā pēc TTC krāsošanas netika novērotas izmaiņas miokardā, savukārt I/R grupā tika novērota aptuveni 30 procentu skala balto infarkta zonu. Resveratrola grupā un 13 mazo devu grupās infarkta apgabali tika ievērojami samazināti līdz aptuveni 10 procentiem, un infarkta zona 13 lielas devas grupās tika samazināta līdz aptuveni 5 procentiem. 10. attēlā parādīts HE (hematoksilīna-eozīna) krāsojuma izmeklēšanas rezultāts: modeļa grupas audu sekcijās tika novērota sirds šūnu, daļēji izšķīdušo membrānu un kodolu palielināšanās, kā arī iekaisuma šūnu infiltrācija. Tomēr pirmapstrāde ar savienojumu 13 ievērojami atviegloja šīs histopatoloģiskās izmaiņas. TTC krāsošanas un HE krāsošanas rezultāti liecināja, ka savienojums 13 var samazināt I/R izraisītu miokarda infarktu atkarībā no devas.

3. Diskusija

Lai noskaidrotu anastatīnu A un B potenciālo antioksidantu aktivitāti, mūsu laboratorija sintezēja 24 anastatīnu atvasinājumus un veica sākotnējo analīzi par savienojumu citotoksicitāti pret PC-12 un to citoprotektīvo aktivitāti HO izraisītā oksidatīvā bojājumā [13]. . Šajā pētījumā mēs galvenokārt veicām padziļinātu bioloģisko novērtējumu 13 no 24 atvasinājumiem ar spēcīgākajām antioksidantu aktivitātēm.

Šajā pētījumā H9c2 šūnās tika konstatēts miokarda I/R bojājums, indukējot H/R ārstēšanu. Pētījuma rezultāti norādīja, ka anastatīni A un B un to pētītie atvasinājumi uzlaboja H9c2 šūnu dzīvotspēju pēc H/R apstrādes. Tika konstatēts, ka 13. savienojums ir visspēcīgākais starp 26 pētītajiem savienojumiem, un tāpēc tika izvēlēts turpmākai novērtēšanai. LDH (šūnu bojājumu marķieris), SOD un GSH (oksidatīvā stresa marķieri) aktivitātes tika konstatētas H9c2 šūnu supernatantos pēc H/R apstrādes. Mēs noskaidrojām, ka pirmapstrāde ar testa savienojumiem ievērojami samazināja LDH līmeni un palielināja SOD un GSH līmeni šūnās. Tādējādi mēs izvirzījām hipotēzi, ka anastatīna atvasinājumiem bija kardioprotektīva aktivitāte, ko var saistīt ar to spēju nomākt oksidatīvo stresu. DPPH un ABTS testi tiek izmantoti, lai novērtētu savienojuma radikāļu attīrīšanas spēju [14]. Rezultātā savienojumam 13 bija augsta antioksidanta jauda, ​​un tas iznīcināja ABTS un DPPH ar zemām EC50 vērtībām, vēl vairāk norādot uz oksidatīvā stresa nomākšanu. LAD liģēšana ir izplatīta metode, ko izmanto, lai izveidotu miokarda I/R modeļus. Novērtējot QRS kompleksa amplitūdu pirms išēmijas, pēc išēmijas un pēc reperfūzijas, mēs atklājām, ka pirmapstrāde ar savienojumu 13 var ievērojami atvieglot ventrikulāro aritmiju išēmijas un agrīnas reperfūzijas laikā. Turklāt 13. savienojums ietekmēja arī infarkta apgabalus un miokarda infarkta histopatoloģiskās izmaiņas. Šie rezultāti kopā ar konstatējumiem, ka savienojums 13 nomāca oksidatīvo stresu un paaugstināja antioksidantu enzīmu līmeni žurku serumā atkarībā no devas, parādīja, ka savienojumam 13 ir spēcīga iedarbība pret miokarda bojājumiem.

Noslēgumā jāsaka, ka anastatīna atvasinājumiem bija spēcīgas antioksidanta spējas, un savienojumam 13 bija visaugstākā antioksidanta aktivitāte starp pārbaudītajiem savienojumiem. Joprojām ir jāapspriež mehānismi, kas ir atbildīgi par anastatīnu atvasinājumu ietekmi uz oksidatīvo stresu saistītajiem signalizācijas ceļiem. Astaksantīns (karotinoīda apakštips) var novērst ROS un vēl vairāk atvieglo išēmijas/reperfūzijas bojājumus [15]. Zāles, kas var novērst ROS veidošanos, varētu būt daudzsološas ar oksidatīvo stresu saistītās slimībās [4], piemēram, šūnu terapijā un sirds un asinsvadu slimībās. Turklāt ROS nomāc hipoksijas izraisītā faktora -1 (HF-1) mērķa gēna ekspresijas hipoksisko indukciju, kam, kā ziņots, ir kardioprotektīva iedarbība uz išēmijas-reperfūzijas bojājumu [16]. Mēs izvirzām hipotēzi, ka ROS un HIF-1 regulējošajam proteīnam var būt izšķiroša nozīme savienojuma 13 kardioprotektīvajā iedarbībā. Tournefolic acid B (TAB), kas iegūta no ķīniešu augu izcelsmes zālēm, aizsargā pret miokarda I/R bojājumiem [17]. ]. Pētījums atklāja TAB svarīgo lomu endoplazmatiskā retikuluma (ER) stresā, apoptozē un PI3K (fosfatidilinozitola 3 kināzes)/AKT (proteīnkināzes B) ceļos miokarda I/R bojājumu ārstēšanā. Miokarda I/R bojājumos var būt iesaistīti arī citi ceļi, piemēram, mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAPK) ceļš [18] un AMPK (adenozīn-5'-monofosfāta aktivētās proteīnkināzes) signalizācijas ceļš [19]. Tāpēc nākamais solis ir sākt ar ROS un HIF-1 regulējošajiem proteīniem un izmantot TAB mediētus ceļus, lai izpētītu mehānismus, ar kuriem 13 iedarbojas uz antioksidantu un aizsargā miokarda I/R. Turklāt eksperimenti šūnu līmenī šajā pētījumā būtu jāveic arī ar cilvēka šūnu līnijām.

4. Materiāli un metodes

4.1. Šūnu kultūra

Žurku kardiomiocītu H9c2 šūnu līnija tika iegādāta no Nanjing Kebai Biotechnology Company (Nanjing, Ķīna). Šūnas tika kultivētas DMEM/augstas glikozes (Hyclone, ASV) un papildinātas ar 10 procentiem FBS (Lanzhou Minhai Biological Engineering co.LTD, Lanzhou, Ķīna) un 1 procentu penicilīna/streptomicīna (Hyclone, Marlborough, MA, ASV) mitrinātā telpā. inkubators 37 grādu temperatūrā ar 5 procentiem CO2.

4.2. Šūnu dzīvotspējas tests

Šūnu dzīvotspēja tika mērīta, izmantojot MTT testu. H9c2 šūnas tika iesētas 96-iedobes plāksnē ar ātrumu 1 × 10* šūnas/iedobē 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar anastatīniem A un B un to atvasinājumiem 48 stundas vai iepriekš apstrādātas ar anastatīniem A un B, un to atvasinājumiem, kam sekoja H / R apstrāde. Pēc tam pievienoja MTT (20 μL/iedobē) un kultivēja 37 grādu temperatūrā 4 stundas. Absorbcija tika mērīta pie 578 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (Tecan, Infinite 50). Šūnu dzīvotspēja tukšajā grupā tika uzskatīta par 100 procentiem.

4.3. Hipoksijas/reoksigenācijas (H/R) modelis un zāļu pārvalde

4.3.1.H/R modelis

NazS, O4 tika izmantots, lai atdarinātu hipoksisku stāvokli, kas reaģē ar [20] skābekli un samazina skābekļa spriegumu. Lai noteiktu optimālās Na2S, O4 koncentrācijas, tika veiktas dažādas septiņas koncentrācijas 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 vai 6 mM. Lai izvēlētos optimālo hipoksijas laiku, pēc Na2S2O4 šķīduma apstrādes tika veiktas 0,5, 1,2, 3 vai 4 stundu kultūras. Kultivēšana normālā DMEM/augsta glikozes barotnē 0, 1, 2, 3 vai 4 stundas tika veikta, lai atdarinātu reoksigenācijas laiku [21].

4.3.2. Zāļu pārvalde

Zāļu ievadīšanai anastatīni A un B un to atvasinājumi (ķīmiskās struktūras S1 tabulā) tika iedalīti divās grupās: anastatīni A un tā atvasinājumi un anastatīni B un tā atvasinājumi. Resveratrols, kuram, kā ziņots, ir kardioprotektīvs efekts, pateicoties tā antioksidanta aktivitātei, tika izmantots kā pozitīva kontrole. Lai noteiktu pozitīvās kontroles koncentrāciju, resveratrols un cits antioksidanta savienojums, gallskābe (3-100 μM）), tika novērtēti, izmantojot MTT testu, kurā šūnas tika apstrādātas 48 stundas 【22】. Kopumā H9c2 šūnas tika iepriekš apstrādātas ar anastatīniem A un B un to atvasinājumiem (10 uM galīgā koncentrācija), kā arī 10 uM resveratrola 30 minūtes pirms H / R apstrādes.

4.4.Antioksidantu kapacitātes novērtējums

4.4.1. Dzelzs reducējošo antioksidantu jaudas (FRAP) tests

FRAP tests tika veikts saskaņā ar Oivuana metodi 【23】. Kopā ar pipeti tika ievadīti 25 μL 1% kālija fericianīda K3Fe (CN) 6 un 10 μL savienojuma 13, c vitamīna (askorbīnskābe, Vc) un resveratrola (0).{8} tika pievienoti } mM) plus 1 × PBS (pH=6,6). Maisījumu 20 minūtes turēja 50 grādu ūdens vannās, kam sekoja ātra ledus dzesēšana. Pēc tam secīgi pievienoja 25 μl 10% trihloretiķskābes (TCA), 0,1% dzelzs hlorīda (FeCl) un destilētu ūdeni. Maisījums tika pārnests uz 96-iedobes plāksni, un absorbcija tika analizēta pie 650 nm. Vc šķīdums (20-200 ug/mL) tika izmantots, lai izveidotu standarta līkni. Antioksidantu spējas tika aprēķinātas no lineārās kalibrēšanas līknes un attēlotas kā Vc ekvivalenti.

4.4.2.ABTS metode

ABTS radikāļu attīrīšanas aktivitāte [24] tika veikta saskaņā ar Sugahara et al. un Re et al. ABTS šķīdums tika atšķaidīts, lai absorbcijas spektrofotometriski pielāgotu pie 650 no 0,70±0.02 nm, un ABTS attīrīšanas aktivitātes tika mērītas saskaņā ar šādu formulu: E=((Acontrol-Ablank)-(A2 -A1)/(A control-Ablank)) × 10, kur kontrole ir kontroles reakcijas absorbcija, kas satur 130 μL ABTS · plus darba šķīdums un 5,5 μL parauga šķīdinātāja (DMSO), un tukšais ir 130 μL nātrija acetāta buferšķīduma un 5,5 μL DMSO absorbcija. A ir 130 μL ABTS plus darba šķīduma (nātrija acetāta buferšķīduma) un 5,5 μL savienojuma 13 (002-20 mM) absorbcija, un Az ir 130 μL nātrija acetāta buferšķīduma un 5,5 μL (savienojuma) absorbcija. 0.02-20 mM). Visi maisījumi tika maisīti 30 sekundes un inkubēti istabas temperatūrā 10 minūtes, kam sekoja absorbcijas mērīšana pie 650 nm. ECs0 tika aprēķināts, izmantojot lineāro attiecību starp savienojuma koncentrāciju un ABTS inhibīcijas procentuālās daļas varbūtību.

4.5. Išēmijas-reperfūzijas modelis

4.5.1.Dzīvnieku kopšana

Sprague Dawley (SD) žurkas tika iegūtas no PLA Militārās Medicīnas zinātņu akadēmijas laboratorijas dzīvnieku centra (Pekina, Ķīna). Piecdesmit SD žurku tēviņi, kas sver no {{0}} g, tika aklimatizēti vienu nedēļu istabas temperatūrā 23±1 grādi ar 12 stundu gaismas/tumsas ciklu, kā arī tika nodrošināta barība un ūdens. Žurkas tika sadalītas piecās grupās: tukšā grupa (žurkām netika veikta ārstēšana, bet fiktīva operācija), modeļa grupa (žurkām tika veikta transportlīdzekļa ārstēšana un MI/R operācija), resveratrola grupa (žurkas saņēma 200 mg/kg resveratrola un MI/R). operācija), mazas devas 13 grupa (žurkas saņēma 100 mg/kg savienojuma 13 un MI/R operāciju) un lielas devas 13 grupa (žurkas saņēma 200 mg/kg 13. savienojumu un MI/R operācija). Savienojumi tika formulēti 0,5% nātrija karboksimetilcelulozē un tika doti suspensijas veidā pa 1 ml/kg iekšķīgi vienu reizi dienā septiņas dienas. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu rokasgrāmatu par laboratorijas dzīvnieku aprūpi un izmantošanu un apstiprinājusi Tjandzjiņas Zinātnes un tehnoloģijas universitātes akadēmiskā komiteja.

4.5.2. Eksperimentālais protokols

Sprague Dawley žurkas tika anestēzētas ar 20 procentiem uretāna (0,8 ml/100 g), un pēc tam mēs veicām miokarda išēmiju ar kreisās priekšējās lejupejošās (LAD) nosiešanu. Sirds tika pakļauta caur kreiso krūšu kurvja griezumu un novietota uz 4-0 zīda šuves, lai veiktu reģionālo išēmiju 30 minūtes ilgas išēmijas, kam sekoja 2 h reperfūzija. Miokarda išēmijas pierādījumus apstiprināja ST segmenta pacēlums un QRS amplitūdas palielināšanās. Eksperimenta laikā žurkas tika turētas uz ventilatora DW3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Pekina, Ķīna). Sirdsdarbības ātrums un EKG tika uzraudzīti, izmantojot bioloģisko signālu iegūšanas sistēmu MD3000 (Beijing Zhishu Duobao Biological Technology Co. Ltd, Pekina, Ķīna). Pēc išēmijas/reperfūzijas procesa uzraudzības žurkas tika nogalinātas, un tika izmantoti asins paraugi un sirds homogenāti, lai noteiktu miokarda bojājumus, izmantojot detektīvu komerciālos komplektus.

4.5.3. TTC krāsošana un HE krāsošana

Išēmiskās zonas apjoms tika kvantificēts ar trifeniltetrazolija hlorīda (TTC) krāsošanu. Sirds paraugi tika nekavējoties sasaldēti {{0}} grādos 10 minūtes un tika izgatavotas piecas plānas 1 līdz 2 mm šķēles. Pēc tam šķēles ievietoja 1% TTC fosfāta buferšķīdumā (pH{5}},0) un 20 minūtes iekrāsoja 37 grādu temperatūrā un fiksēja formalīnā. Attēli tika iegūti, izmantojot digitālo kameru, un infarkta zonas (TTC-negatīvs) un riska zonas (TTC-pozitīvs) procentuālais daudzums tika mērīts, izmantojot ImageJ programmatūru [25]. HE krāsošanai infarkta apgabals tika izgriezts un fiksēts 10 procentu formaldehīdā un pēc tam iestrādāts parafīnā. Pēc tam audi tika iekrāsoti ar HE (hematoksilīna-eozīnu) un pārbaudīti gaismas mikroskopā. Dehidrētas iegultās sekcijas un blīvējuma sekcijas pasūtīja Tianjin YiSheng Yuan Biotechnology Company (Tjaņdzjiņa, Ķīna).

4.6. Spektrofotometriskie komerciālie komplekti

Šajā pētījumā izmantotie komerciālie komplekti tika iegādāti no Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. (Pekina, Ķīna) un Nanjing Jiancheng Bioengineering Company (Nanjing, Ķīna). Žurku serumā un šūnu supernatantā miokarda bojājumu marķieris, laktāta dehidrogenāze (LDH) ), tika novērtētas kreatīnkināzes (CK), glutationa (GSH) un superoksīda dismutāzes (SOD) aktivitātes. Malondialdehīda (MDA) aktivitātes tika mērītas, izmantojot žurku sirds homogenātu. Visi komerciālie komplekti tika veikti saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

4.7.Statistikas process

Visi eksperimenti tika atkārtoti vismaz trīs reizes. Eksperimentālie dati tika apstrādāti, izmantojot GraphPad Prism7 programmatūru, un katras grupas eksperimentālais rezultāts tika izteikts kā vidējā ± standarta novirze (x± s). t-tests tika izmantots, lai salīdzinātu statistisko nozīmīgumu starp grupām. P<0.05 was="" recorded="" as="" statistically="">

Atsauces

1. Uzdensky, AB; Demjaņenko, S. Histona acetilēšana un dezacetilēšana išēmiskā insulta gadījumā. Neirāls Regēns. Res. 2021, 16, 1529–1530. [CrossRef] [PubMed]

2. Li, H.; Iņ, A.; Čens, Z.; Fengs, M.; Džans, H.; Sju, Dž.; Van, F.; Qian, L. Na/K-ATPāzes/Src/ROS pastiprināšanas signāla ceļa vājināšanās ar pNaktide uzlabo miokarda išēmijas-reperfūzijas bojājumus. Int. J. Biol. Macromol. 2018, 118., 1142.–1148. [CrossRef] [PubMed]

3. Levins, RM; Sja, L.; Vejs, V.; Šulers, C.; Leggett, RE; Lin, ADY Ganoderma Lucidum apvalka šķelto sporu ietekme uz truša urīnpūšļa oksidatīvo stresu, izmantojot in vivo išēmijas/reperfūzijas modeli. Mol. Šūna. Biochem. 2017, 435, 25.–35. [CrossRef] [PubMed]

4. Tan, Z.; Liu, H.; Dziesma, X.; Ling, Y.; Viņš, S.; Jans, Y.; Jans, Dž.; Vangs, S.; Vangs, X.; Chen, A. Honokiol pēcapstrāde uzlabo miokarda išēmijas/reperfūzijas bojājumus, uzlabojot autofagisko izplūdi un samazinot intracelulāro ROS veidošanos. Chem. Biol. Mijiedarboties. 2019., 307., 82.–90. [CrossRef] [PubMed]

5. Hauzenlojs, dīdžejs; Yellon, DM Miokarda išēmijas-reperfūzijas bojājums: novārtā atstāts terapeitiskais mērķis. Dž.Klins. Izpētīt. 2013, 123., 92.–100. [CrossRef]

6. Yu, C.; Li, D.; Li, Z.; Jū, D.; Zhai, G. Sakubitrila/valsartāna ietekme uz iekaisumu un oksidatīvo stresu doksorubicīna izraisītas sirds mazspējas modelī trušiem. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 473–484. [CrossRef]

7. Van, Y.; Če, J.; Džao, H.; Tangs, Dž.; Shi, G. Platycodin D inhibē oksidatīvo stresu un apoptozi H9c2 kardiomiocītos pēc hipoksijas/reoksigenācijas traumas. Biochem. Biofizija. Res. Commun. 2018, 503, 3219–3224. [CrossRef]

8. Pavlovičs, M.; BNáfrádi Rouster, P. Ļoti stabils enzīmu imitējošais nanokompozīts ar antioksidantu aktivitāti. J. Colloid Interface Sci. 2019, 543, 174–182. [CrossRef]

9. Qi, HZ; Vangi, WZ; Viņš, JY Deinococcus radiodurans antioksidanta sistēma. Res. Microbiol. 2019, 171, 822–831. [CrossRef]

10. Šao, L.; Šao, Y.; Yuan, Y. Pinocembrin flavanons inhibē šūnu dzīvotspēju PC-3 cilvēka prostatas vēža gadījumā, izraisot šūnu apoptozi, ROS veidošanos un šūnu cikla apstāšanos. Acta Pharmaceut. 2021, 71, 669–678. [CrossRef]