Leontopodium Alpinum (Edelweiss) Callus kultūras ekstrakta pretnovecošanās iedarbība, izmantojot transkripta profilēšanu

Lūdzu, noklikšķinietoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstract:Ēdelveiss (Leontopodium Alpinum) Asteraceae ģimenē ir savvaļas puķe, kas aug akmeņainās kaļķakmens vietās. Šeit mēs pētījām ēdelveisa kallus kultūras ekstrakta (Leontopodium Alpinum kallus kultūras ekstrakta; LACCE) efektivitāti, izmantojot vairākus testus no in vitro līdz in vivo, kā arī transkripta profilēšanu. Vairāki in vitro testu rezultāti parādīja LACCE spēcīgu antioksidantu aktivitāti, reaģējot uz UVB ārstēšanu. Turklāt LACCE nomāca iekaisumu un grumbu veidošanos; tomēr mitrinošo aktivitāti palielināja LACCE. Klīniskais tests in vivo parādīja, ka pastāvīga LACCE lietošana uz sejas un ādas audiem uzlaboja pretperiorbitālās grumbas, ādas elastību, ādas blīvumu un ādas biezumu, salīdzinot ar placebo. RNS sekvencēšanas rezultāti parādīja, ka vismaz 16,56 procenti cilvēka gēnu tika ekspresēti keratinocītu šūnās. LACCE pārregulēti gēni, kas kodē vairākus KRT proteīnus; DDIT4, BNIP3 un IGFBP3 bija iesaistīti attīstības procesa pozitīvajā regulēšanā, ieprogrammētā šūnu nāvē, keratinizācijā un kornifikācijas veidošanā, veidojot ādas barjeras, kas sniedz daudzas priekšrocības cilvēka ādai. Turpretī pazemināti regulētie gēni bija uz stresu reaģējoši gēni, tostarp metāls, oksidēšanās, ievainojumi, hipoksija un vīrusu infekcija, kas liecina, ka LACCE neizraisīja kaitīgu stresu uz ādas. Mūsu visaptverošais pētījums parādīja, ka LACCE ir daudzsološs līdzeklis pretnovecošanās kosmētikā.

Atslēgvārdi:pretnovecošanas; kalluss; ēdelveiss;ādas šūnas; transkripts

1. Ievads

Ēdelveiss (Leontopodium noble sub sp. Alpinum(Cass.) Greuter) Asteraceae dzimtā ir savvaļas puķe, kas aug akmeņainās kaļķakmens vietās lielos augstumos, piemēram, Šveices Alpos [1,2]. Īso balto ziedu retuma dēļ ēdelveiss pārstāv skaistumu un tīrību, kas saistīta ar Alpiem un Karpatiem. Turklāt daudzas valstis, tostarp Austrija, Bulgārija, Rumānija, Slovēnija un Šveice, ēdelveisu uzskata par valsts simbolu.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Ilgu laiku ēdelveiss ir izmantots kā tradicionālā medicīna pret sāpēm vēderā, bronhītu, caureju, dizentēriju un drudzi [3, A]. Nesen vairāki pētījumi ir parādījuši ēdelveisa ekstraktu efektivitāti pelēm un žurkām [3], kā arī cilvēka keratinocītiem un endotēlija šūnām [4]. Turklāt ēdelveisa sakņu ekstrakti satur sastāvdaļas, kas uzlabo holīnerģisko neirotransmisiju, norādot uz tā potenciālu pretdemences līdzekļiem [5] un antioksidantiem, piemēram,

leontopodskābe A un 35-kofeoilhinskābe, ko var izmantot kā pretnovecošanās līdzekli [6]. Turklāt ēdelveisa ekstraktiem bija antibakteriāla iedarbība pret Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneimoniju un Streptococcus pyogenes, kas liecina par to iespējamu etnomedicīnas lietošanu elpošanas un vēdera slimību ārstēšanai [7].

Vairākos iepriekšējos pētījumos ir analizēti ēdelveisa ekstraktu savienojumi. Piemēram, kapilārās hromatogrāfijas metode atklāja 12 farmakoloģiski svarīgus savienojumus, tostarp flavonoīdus, kofeīnskābi un leontopodskābi, no ēdelveisa gaisa daļām [8]. Lai iegūtu antioksidantus no ēdelveisa augiem, ir izstrādātas centrbēdzes sadalīšanas hromatogrāfijas (CPC) un augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) metodes [6]. Ir zināms, ka ēdelveisa ekstraktu aktīvie savienojumi starp gaisa daļām un saknēm ir dažādi[3]. Piemēram, ēdelveisa matainās saknes ražo farmakoloģiski aktīvus lignānus, piemēram, login un 5-metoksilogīnu, ko var stimulēt vairākas citas sastāvdaļas, piemēram, sudraba nitrāts, saharoze, metiljasmonāts un rauga ekstrakts [ 9].cistanche ekstrakta priekšrocībasTurklāt 11 dažādu Leontopodium sugu vielmaiņas modeļi ir atklāti ar kodolmagnētiskās rezonanses (1H NMR) spektroskopiju un šķidruma hromatogrāfijas-masas spektrometriju (LC-MS) to taksonomijas attiecībās [10].

Cistanche varētu novērst novecošanos

Augu kallusu var definēt kā neorganizētas vai nediferencētas šūnu masas, kuras var viegli izraisīt, ievainojot augu brūci, vai mākslīgi veicot in vitro sistēmu. Augu kaluss tiek mākslīgi kultivēts, pievienojot barības vielas un augu augšanas regulatorus antiseptiskos augšanas apstākļos. Šobrīd bioreaktorā ir iespējams ražot lielu skaitu specifisku augu šūnu ar vienādu kvalitāti. Turklāt augu šūnai piemīt spēja, ko dēvē par totipotenci, kas ir augu šūnas ģenētiskais potenciāls ražot visu nobriedušu augu [11]. Tādējādi no konkrētā auga kalusa ir iespējams ģenerēt nobriedušu augu. Turklāt kallus var plaši izmantot augu atjaunošanai, lai saglabātu retus un apdraudētus augus [12,13].

Tāpat kā dzīvnieku šūnas, arī augu šūnas spēj atvieglot augu stimulāciju un atjaunošanos pēc traumām [14]. Lai gan augu cilmes šūnas tiek uzskatītas par jauniem materiāliem kosmētikas nozarē, pieejamie materiāli ir ierobežoti. Ir svarīgi identificēt jaunus augu avotus un novērtēt to funkcionālās sastāvdaļas, kas saistītas ar kosmētiku.

Ēdelveisa ekstrakti ir labi pazīstami ar to izmantošanu farmaceitiskajos līdzekļos; tomēr reti tiek ziņots par ēdelveisa ekstrakta kā dabīgas kosmētikas avota ietekmi. Šeit mēs pētījām ēdelveisa kalusa ekstrakta (Leontopodium Alpinum callus kultūras ekstrakts; LACCE), kas iegūts no ēdelveisa lapām, efektivitāti, izmantojot vairākus testus no in vitro līdz in vivo, un atklājām LACCE izraisīto molekulāro mehānismu, izmantojot transkripta profilēšanu.

2. Materiāli un metodes

2.1. Edelweiss Callus ražošana

Ēdelveisa sēklas tika iegādātas komerciāli. Edelveisa sēklas tika mērcētas 70 procentu etanolā 30s, pēc tam mazgājot ar destilētu ūdeni. Atkal sēklas 20 minūtes sakrata 0,3 procentu nātrija hipohlorītā (Vako, Osaka, Japāna) un nomazgāja ar destilētu ūdeni. Sterilizētās sēklas tika diedzētas uz pamata Murashige un Skoog (MS) barotnes (Duchefa Biochemie, Hārlema, Nīderlande). Edelveisa lapas aseptiskā stāvoklī tika sagrieztas mazos gabaliņos (0,5–1 cm). Mēs ierosinājām augu šūnu agrīno stadiju MS barotnē, kas satur 0.5-3 mg/mL 6-benzilaminopurīna (6-BAP) (Duchefa Biochemie) un 0.{13}} mg/mL 2,4-dihlorfenoksietiķskābes (2,4-D) (Duchefa Biochemie) tumsā 25±2 grādu temperatūrā [15]. MS barotnes pH tika noregulēts uz 5,8, izmantojot 1 N NaOH (Duchefa Biochemie). Inducētais kalluss tika izplatīts Petri trauciņā. Izvēlētā kallusa līnija tika kultivēta bioreaktorā BIO-FD&C Co., Ltd., Inčhonā, Korejā, Pretnovecošanās pētniecības institūtā. Kultivētais kalluss tika novākts un trīs reizes mazgāts ar destilētu ūdeni.Cistanče ČingishhansKalluss tika dehidrēts, izmantojot saldēšanas žāvētāju (IlShinbioBase, Dongducheonsi, Koreja) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Žāvēto ēdelveisa kallusu maisīja destilētā ūdenī 50 grādu temperatūrā 8 stundas. Kalusa ekstrakti tika iegūti ar termisko ekstrakciju 98 grādu temperatūrā 10 minūtes.

2.2. Cilvēka ādas šūnu kultūra

Edelveisa ekstraktu novērtētā ietekme uz cilvēka ādas šūnām, keratinocītu (HaCaT) šūnām un normālu cilvēka Detroitas 551 fibroblastu (ATCC, Manasasa, VA, ASV) tika kultivēta Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Welgene, Gyeongsan-si, Koreja) ) papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa serumu (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un 1 procentu antibiotiku-pretsēnīšu līdzekli (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) 37 grādos ar 5 procentu CO2 stāvokli.

2.3. Šūnu metaboliskās aktivitātes novērtējums ar MTT testu

Lai novērtētu LACCE citotoksicitāti uz cilvēka ādas šūnu augšanu, pavairošanu un izdzīvošanu, MTT({{0}}(45-dimetiltiazol-2-il){{3} },5-difeniltetrazolija bromīda) tests tika veikts, kā aprakstīts iepriekš[16,17]. Īsāk sakot, HaCaT un Detroitas 551 šūnas ar blīvumu 5 × 10* šūnas vienā iedobē, tika inkubētas 96-iedobes plāksnē 24 stundas. Pēc tam galīgā koncentrācija 0,1 procenti , 0,5 procenti un 1 procents LACCE tika apstrādāti 24 stundas. Destilēts ūdens tika izmantots kā kontrole. Pēc LACCE apstrādes barotne tika noņemta, pēc tam pievienoja 4 μLof 5 mg/ml MTT (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) un inkubēja 4 stundas. Pēc barotnes noņemšanas pievienoja 100 μL dimetilsulfoksīda (DMSO) (Sigma) un izšķīdināja 10 minūtes.cistanche dzīves pagarināšanaViļņa garuma absorbcija tika mērīta pie 570 nm, izmantojot Thermo Scientific Multiskan GO Microplate spektrofotometru (Fisher Scientific Ltd., Vantaa, Somija). Šūnu dzīvotspēja tika iegūta, izmantojot šādu formulu. Šūnu dzīvotspēja (procentos)=(absorbcijas daudzums apstrādātajām šūnām/kontroles šūnu absorbcijas daudzums) × 100.

2.4. Antioksidantu aktivitātes novērtējums ar DPPH testu

LACCE antioksidanta aktivitāte tika noteikta DPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazīnhidrāta) testā, kā aprakstīts iepriekš [18]. Īsumā, 0.1 ml galīgās koncentrācijas 0,1 procenti , {{10}},5 procenti un 1 procents LACCE tika apstrādātas ar 0,1 ml 0,1 mM DPPH (Sigma-Aldrich) 0,4 ml etanola klātbūtnē. Mēs izmantojām 0,001 procentu askorbīnskābi (C vitamīnu) (Sigma-Aldrich) kā pozitīvu kontroli. Paraugi tika labi sajaukti 10 sekundes un inkubēti istabas temperatūrā tumšos apstākļos 30 minūtes. Viļņa garuma absorbcija tika mērīta pie 517 nm, izmantojot Thermo Scientific Multiskan GO Microplate spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Radikālās attīrīšanas aktivitāte tika aprēķināta, izmantojot šādu formulu. Attīrīšanas aktivitāte (procentos)=[1-(pārbaudāmā parauga absorbcija/kontroles absorbcija)] × 100.

2.5. Antioksidantu aktivitātes novērtējums ar ūdeņraža peroksīda (H2O2) testu

Ūdeņraža peroksīds šūnās rada skābekļa brīvos radikāļus, izraisot šūnu nāvi. Mēs pārbaudījām šūnu mirstības līmeni, ko izraisīja ūdeņraža peroksīds ar LACCE apstrādātajos paraugos. HaCaT šūnas ar blīvumu 5 × 105 šūnas vienā iedobē tika inkubētas 24-iedobes plāksnē 24 stundas. Pēc tam galīgās koncentrācijas 0,1 procenti, 0,5 procenti un 1 procents LACCE tika apstrādātas 1 mM H, O klātbūtnē 8 stundas. Kā pozitīvā kontrole tika izmantota 0,033% NAC (Sigma-Aldrich). MTT tests tika izmantots, lai izmērītu ar LACCE apstrādāto paraugu šūnu izdzīvošanas līmeni, ko izraisīja HO2. Turklāt mēs novērojām šūnu morfoloģiju, krāsojot metilēnzilo (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV).

2.6. Reāllaika reversā transkripcija (RT)-PCR

Lai pārbaudītu LACCE ietekmi uz grumbu novēršanu, mitrināšanu un pretiekaisuma iedarbību, mēs veicām reāllaika RT-PCR ar zināmiem primeriem, kas pastiprina marķieru gēnus, izmantojot QuantiTect Primer Assays (Qiagen, Hilden, Vācija) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Detroitas 551 šūnas ar blīvumu 5 × 10 4 šūnas vienā iedobē tika inkubētas 96-iedobes plāksnē 24 stundas. Pēc tam galīgās koncentrācijas 0,1 procenti , 0,5 procenti un 1 procents LACCE tika apstrādātas 24 stundas. cDNS tika sintezēta no attiecīgajām Detroitas 551 šūnām, kas apstrādātas ar dažādām LACCE koncentrācijām, izmantojot SuperPrep Cell Lysis & RT komplektu qPCR (Toyobo, Osaka, Japāna), kas satur līzes reaģentus un RT reaģentus saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Lai iegūtu pretgrumbu efektu LACCE ārstēšanā, gēna, kas kodē Matrix Metalloproteinase-2(MMP-2), ekspresija tika kvantificēta ar reāllaika RT-PCR, izmantojot Thunderbird SYBR qPCR Mix komplektu (Toyobo). pamatojoties uz ražotāja norādījumiem. Lai novērtētu mitrināšanu, izmantojot LACCE apstrādi, gēna, kas kodē Aquaporin 3 (AOP3), ekspresija tika pārbaudīta ar reāllaika RT-PCR. Pretiekaisuma testa gadījumā HaCaT šūnas ar blīvumu 5 × 10 4 šūnas vienā iedobē tika inkubētas 96-iedobes plāksnē 24 stundas. Pēc barotnes noņemšanas UVB tika apstarota uz HaCaT šūnām. UVB apstarošanai CL-1000 UV kastē (Analytik Jena AG, Jena, Vācija) izmantoja 5 mJ/cm'. Pēc tam galīgās koncentrācijas 0,1%, 0,5% un 1% LACCE tika apstrādātas 4 stundas. Mēs izmantojām deksametazonu (Dex) (Sigma-Aldrich) kā pozitīvu kontroli. LACCE terapijas pretiekaisuma iedarbībai COX2 un iNOS kodējošo gēnu ekspresija tika kvantitatīvi noteikta ar reāllaika RT-PCR. Atsevišķu gēnu ekspresija tika normalizēta līdz GAPDH gēna ekspresijai. 2.7. LACCE kā kosmētikas aģenta klīniskais novērtējums Vioo

Uzņēmums Ellead pēc apstiprināšanas, pamatojoties uz standarta darbības procedūrām (3. versija,) veica klīnisko pētījumu par LACCE efektivitātes novērtēšanu sejas pacelšanas un periorbitālo grumbu, ādas elastības, dermas blīvuma un ādas biezuma uzlabošanā.{1} }) (Ellead, Seongnam, Koreja) Ellead IRB saskaņā ar Korejas labas klīniskās prakses vadlīnijām (B1-2015-4-002), ko aprakstījusi Pārtikas un zāļu drošības ministrija (MFDS) un Ellead standarta darbības procedūras (EL-P{). {4}}).

Lai pārbaudītu LACCE iedarbību in vivo, mēs veicām LACCE klīnisko novērtējumu četriem dažādiem faktoriem: sejas liftingam un periorbitālo grumbu uzlabošanai, ādas elastībai, dermas blīvumam un ādas biezumam. Lai to izdarītu, klīniskajā novērtējumā četru nedēļu laikā piedalījās 21 brīvprātīgā sieviete, kuras vidējais vecums bija 48,04 ± 4,28 gadus un kuri tika sadalīti 12 brīvprātīgajos vecumā no 40 gadiem un deviņos brīvprātīgajos vecumā no 50 gadiem.

Klīniskais tests tika veikts trīs dažādos laika punktos, sākotnējais, 2 nedēļas un 4 nedēļas, visiem brīvprātīgajiem. No nedēļas pirms pētījuma sākuma līdz beigām visiem brīvprātīgajiem netika veiktas papildu procedūras, lai uzlabotu ādu, kosmētiku un higiēniskos līdzekļus, kas varēja ietekmēt rezultātus. Pēc brīvprātīgo sejas mazgāšanas, izmantojot tīrīšanas putas, brīvprātīgie vismaz 30 minūtes stāvēja kontrolētā telpā ar nemainīgu temperatūru (20-24 grādi) un mitrumu (40 procenti -60 procentu relatīvais mitrums). . Mēs veicām mērījumus nejauši brīvprātīgo sejas kreisajā vai labajā pusē. Mūsu tests bija dubultmaskēts tests, kurā ne subjekti, ne pētnieki nezināja, kurš produkts ir testa paraugs. Formulācijas samazināto un palielināto likmju aprēķināšanai ir aprakstītas 1. tabulā.

2.8. Sejas pacelšanas un periorbitālo grumbu uzlabošanas mērīšana

Sākotnēji visiem brīvprātīgajiem tika mērītas periorbitālās grumbas, ādas elastība, dermas blīvums, ādas biezums uz vaiga un sejas pacelšana mutes kaktā. Pēc tam divi dažādi paraugi, LACCE un placebo (kontrole), tika uzklāti uz norādīto sejas zonu divas reizes dienā (no rīta un vakarā). Brīvprātīgie tika sadalīti divās dažādās grupās: I grupā (LACCE tika lietots sejas kreisajā zonā, bet placebo tika lietots labajā sejas zonā) un II grupā (placebo tika lietots kreisajai sejas zonai, bet LACCE tika piemērots sejas zonai). labā sejas zona). Divas un četras nedēļas pēc ārstēšanas tika veikti tie paši mērījumi, lai novērtētu LACCE iedarbību salīdzinājumā ar placebo.

Periorbitālās grumbas tika analizētas, izmantojot optisko 3D (dimensiju) ādas mērīšanas sistēmu PRIMOS High Resolution (Canfield Scientific, Parsippany, NJ, ASV), kas ir ideāli piemērota ādas mikrostruktūras un grumbu izpētei. Divi dažādi raupjuma parametri: Ra (vidējais raupjums), kas ir nelīdzenuma profila profila augstumu absolūto vērtību vidējais lielums, un Rg (vidējais kvadrātveida raupjums), kas ir profila profila augstumu vidējais kvadrātveida vidējais lielums. tika izmērīts raupjuma profils.

Šis raksts ir izvilkts no Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes