Cistanches Salsa pretizplatīšanās ietekme uz labdabīgas prostatas hiperplāzijas progresēšanu Ⅰ
Oct 18, 2022
Abstract:Cistanche TubulosaTo lieto tradicionālajā medicīnā, lai ārstētunieru mazspēja, neirastēnija, sexual dysfunction diseases, unlabdabīga prostatas hiperplāzija(BPH). Šī pētījuma mērķis bija izpētīt mehānismu, ar kura palīdzību C. tubulosa ekstrakts (CSE) izraisaantiproliferatīva iedarbība uz prostatas audiemno LPH izraisītām žurkām. CSE ietekme uz LPH tika novērtēta, ņemot vērā prostatas svaru, serulna dihidrotestosterona (DHT) veidošanos un 5o-reduktāzes 1. un 2. tipa mRNS ekspresiju BPH izraisītu žurku prostatas audos. Turklāt prostatas dziedzera morfoloģijas histoloģiskai izmeklēšanai tika veikta hematoksilīna un eozīna (H&E) krāsošana, un proteīna ekspresijas līmeņi prostatas audos tika pētīti ar Western blot analīzi. CSE ārstēšana samazināja prostatas svaru, DHT koncentrāciju serumā un 1. un 2. tipa 5o-reduktāzes mRNS ekspresiju BPH izraisītu žurku prostatas audos. Turklāt CSE ārstēšana nomāca šūnu proliferāciju, regulējot ar iekaisumu saistīto proteīnu (inducējamās slāpekļa oksīda sintāzes un ciklooksigenāzes 2) un ar apoptozi saistīto proteīnu (kaspāzes -3 un Bcl-2 ģimenes proteīnu) ekspresijas līmeni. CSE var būt potenciāls BPH terapeitiskais kandidāts, jo tas spēj regulēt iekaisuma un ar apoptozi saistīto proteīnu ekspresiju.
Atslēgvārdi:labdabīga prostatas hiperplāzija, Cistanche Tubulosa, dihidrotestosterons, iekaisums, apoptoze, Bcl-2.
Ievads
Cistanche Tubulosair parazitārs augs, kura dzimtene ir Ķīnas ziemeļrietumi. Tās kāts ir svarīga tradicionālā austrumu medicīna, ko izmanto ārstēšanainieru mazspējaunneirastēnija(Deng et al.2004). Ir ziņots arī par C.tubulosa efektivitāti, ārstējotseksuālās disfunkcijas slimības, piemēram,impotenceunlabdabīga prostatas hiperplāzija(BPH) korejiešu medicīnas grāmatā ar nosaukumu DonguiBogam. Feniletanoīdu glikozīdi (PhG) ir šī auga galvenās aktīvās sastāvdaļas (Jimenez un Riguera, 1994). Ir pierādīts, ka daudziem PhG ir plašs bioloģisko īpašību klāsts, tostarp antioksidanta un pretaudzēju iedarbība. Akteozīds, PhG no C. tubulosa, inhibē apoptozi, ko izraisa 1-metil-4-fenilpiridīnija jons (MMP*) smadzenīšu granulu neironos (Pu et al. 2003). Lai gan ir veikti pētījumi par C. tubulosa fizioloģiskajām funkcijām, molekulārais(-ie) mehānisms(-i), kas ir C. tubulosa ietekmes uz LPH pamatā, nav pētīts.
LPH raksturo prostatas paplašināšanās, ko izraisa ne-vēža augšana dziedzerī (Andriole et al. 2004). BPH izplatības un saslimstības palielināšanās notiek sabiedrības novecošanas kontekstā. Līdz 2030. gadam 20 procenti ASV iedzīvotāju būs 65 gadus veci vai vecāki, un šis skaitlis ietvers vairāk nekā 20 miljonus vīriešu (Parsons, 2010). Lai gan LPH ir bieži sastopama slimība gados vecākiem vīriešiem, tās etioloģija un patoloģija LPH nav pilnībā definētas, un pašlaik nav ideālas LPH ārstēšanas metodes (Djavan et al.2010).
LPH ārstēšanas iespējas ietver farmakoloģiskās un ķirurģiskās stratēģijas.
Pēdējos gados ķirurģisko iejaukšanos skaits pacientiem ar LPH pacientiem ir samazinājies par labu farmakoloģiskai ārstēšanai (Emberton et al. 2011). Ņemot vērā LPH raksturu, farmakoloģiskā ārstēšana prasa ilgstošu un nepārtrauktu medikamentu lietošanu. Tāpēc ilgstoša un nepārtraukta zāļu panesamība ir ļoti svarīgs jautājums. BPH ārstēšanai tiek izmantoti dažādi farmakoloģiskie līdzekļi, piemēram, 5a-reduktāzes inhibitori (finasterīds un du-tasterīds) un a-adrenoreceptoru antagonisti (alfuzosīns, terazosīns, doksazosīns, tamsulosīns) (Lepor 2011;
Untergasser et al.2005).Galvenie farmakoloģiskie līdzekļi LPH ārstēšanai ir 5a-reduktāzes inhibitori, kas, kā zināms, regulē vēlīnā 5o-dihidrotestosterona līmeni, un o-adrenerģiskie blokatori (Tiwari et al. 2005). Lai gan tiek uzskatīts, ka šie farmakoloģiskie līdzekļi ievērojami kavē LPH progresu, daudzos pētījumos ir ziņots par to nevēlamajām blakusparādībām (Patel un Chapple, 2006). Piemēram, ir ziņots, ka finasterīds izraisa dažādas blakusparādības, tostarp reiboni, muskuļu augšanas traucējumus un smaga miopātija, pateicoties tās strukturālajai līdzībai ar steroīdiem hormoniem (McConnell et al. 2003; Uygur et al. 1998). Tā kā šiem farmakoloģiskajiem līdzekļiem ir nevēlamas blakusparādības, augu izcelsmes līdzekļu atrašanai, kas efektīvi ārstē LPH, ir ievērojama medicīniska vērtība.
Lai novērtētu C. tubulosa ietekmi uz LPH, mēs parādījām, ka C. tubulosa ekstrakts (CSE) var modulēt nelīdzsvarotību starp prostatas šūnu augšanu un apoptozi testosterona izraisītos BPH žurku modeļos.
Materiāli un metodes Materiāli un reaģenti
C.tubulosa tika iegādāts no Omniherb Co.Ltd. (Daegu, Korejas Republika) un finasterīds tika iegūts no Merck and Co.Inc. (Ņūdžersija, ASV). Testosterons, fenilmetilsulfonilfluorīds (PMSF), Triton X-100, propīdija jodīds (PI), Nonidet P-40(NP-40) un olbaltumvielu inhibitoru kokteilis (PIC) tika iegādāti no Sigma-Aldrich. Chemical Co. (St. Louis, Misūri, ASV). GAPDH oligonukleotīdu praimeri un 1. un 2. tipa 5o-reduktāze tika iegādāta no Bioneer (Deajeon, Koreja), un SYBR Primix Ex Taq tika iegādāts no Takara (Shuzo, Shiga, Japāna). Antivielas pret anti-iNOS (M{{9}) }), COX-2(C-20), poli(ADP-ribozes)polimerāze-1(PARP-1,(D-1), kaspāze{{ 16}} (H-277), Bcl-2(C-2), Bcl-xL(H-5), Bax(B-9) un anti- -aktīns(ACTBD11B7) tika iegādāts no Santa Cruz Biotechnology (Santakrusa, Kalifornija, ASV). Antiviela pret PCNA tika iegādāta no BD Biosciences, Pharmingen (Sandjego, Kalifornija, ASV). C sagatavošana . tubulosa ekstrakts (CSE)
C. tubulosa augi tika iegādāti no Omniherb Co.Ltd. (Yeongcheon, Kyungpook, Korejas Republika). Viņiem bija mitruma saturs<13% by="" weight="" and="" were="" air-dried.="" afterward,="" herbs="" underwent="" extraction="" with="" 50%(v/v)="" ethanol-water="" at="" 60="" ℃for="" 8="" h.="" the="" extract="" obtained="" was="" filtered="" through="" 20="" μm="" cartridge="" paper,="" and="" ethanol="" was="" removed="" by="" vacuum="" rotary="" evaporation="" (eyela,="" japan).="" the="" concentrate="" was="" subsequently="" freeze-dried,="" and="" the="" yield="" was="" found="" to="" be="" 12%="" w/w.="" the="" experiment="" was="" performed="" by="" dissolving="" the="" dry="" extract="" in="" distilled="" water,="" and="" the="" rest="" of="" extract="" was="" stored="" at="" -20="" ℃.="" the="" identities="" of="" the="" active="" components="" of="" the="" extract,as="" determined="" by="" hplc,="" were="" reported="" previously(jiang="" and="" tu="">
Dzīvnieki
Desmit nedēļas veci Sprague-Dawley žurku tēviņi (200 ± 20 g) tika iegādāti no Daehan Biolink (Daejeon, Korejas Republika). Dzīvnieki tika izmitināti apstākļos, kas atbilda laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas vadlīnijām, kuras pieņēma un izsludināja Sangji Universitātes Institucionālā dzīvnieku aprūpes komiteja (reģ. Nr.{5}}). Pirms eksperimenta sākšanas žurkas tika aklimatizētas laboratorijas apstākļos 2 nedēļas. Viņiem tika nodrošināta brīva piekļuve pārtikai un ūdenim 4 nedēļas, un visā eksperimenta laikā tie tika uzturēti 12 stundu gaismas / 12 stundu tumšā ciklā nemainīgā 22 ± 2 grādu temperatūrā un relatīvajā mitrumā 55 ± 9 procenti. Žurkas nejauši tika iedalītas vienā no 4 grupām (n=6): kontroles grupa (Con, normāla prostata ar nesēja šķīdumu: fosfātu buferšķīdums (PBS) 200 μL, po); BPH inducētā grupa (BPH), BPH izraisīta grupa, kas tika ārstēta ar finasterīdu (5 mg/kg/dienā, po,(Fina)); BPH izraisīta grupa, kas tika ārstēta ar CSE (200 mg/kg/dienā; po). Kontroles grupas žurkas tika izgrieztas un pēc tam sašuva, neizņemot sēkliniekus pēc anestēzijas ar zoletil@50 (20 mg/kg, ip);pārējo grupu žurkas tika kastrētas.Pēc 3 dienu atveseļošanās BPH izraisītajām grupām injicēja testosterona propionātu (10mg/kg). /dienā, ip, izšķīdināts kukurūzas eļļā) atsevišķi vai kopā ar CSE vai finasterīdu katru dienu 4 nedēļas.Divdesmit četras stundas pēc pēdējās ievadīšanas visas žurkas tika nogalinātas pēc anestēzijas ar zoletil@ 50 (20 mg/kg, ip). Asins paraugi tika ņemti no astes dobās vēnas, un serums tika atdalīts ar centrifugēšanu un uzglabāts -80 grādos. Tika izņemts un nosvērts viss prostatas dziedzeris (Guo). et al.2004).
Prostatas svara un ķermeņa svara attiecība
Prostatas audi tika izgriezti, izskaloti un nekavējoties nosvērti. Prostatas svara un ķermeņa svara attiecība (PW/BW attiecība) tika aprēķināta, kā aprakstīts tālāk.
PW/BW attiecība
= (katra dzīvnieka prostatas masa no eksperimentālās grupas/katra dzīvnieka ķermeņa masa no eksperimentālās grupas) x 100 prostatas svara augšanas kavēšana
Pēc pētījuma pabeigšanas prostatas tika noņemtas un nosvērtas. Augšanas kavēšanas procentuālā daļa tika aprēķināta šādi: 100-[(ārstētā grupa-kontroles grupa)(BPH grupa-kontroles grupa) × 100]. Dihidrotestosterona (DHT) koncentrācijas serumā analīze
DHT koncentrācija serumā tika noteikta ar komerciālu ELISA (ALPCO Diagnostics, Seilema, Ņūhempšīra, ASV). Kā teikts, tika veikta saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
Histoloģiskā analīze
Prostatas audi katrā grupā tika fiksēti 4 procentu formalīna šķīdumā, iestrādāti parafīnā un pēc tam sagriezti 4 pm sekcijās. Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E) histoloģiskai izmeklēšanai. Attēli tika iegūti, izmantojot mikroskopu SZX10 (Olympus, Tokija, Japāna). Histoloģisko analīzi un prostatas epitēlija audu biezumu (TETP) noteica profesionāls histologs no Seulas Medicīnas zinātnes institūta (Seula, Koreja), izmantojot Leica Application Suite (LAS, 3.3.0 versija) programmatūra objektīvai histoloģiskās analīzes novērtēšanai. Kvantitatīvā reālā laika polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) analīze
Katra dzīvnieka prostatas audi tika homogenizēti, un kopējā RNS tika izolēta, izmantojot Easy-Blue@ Reagent (Intron Biotech-nology Inc., Gyeongi-do, Korejas Republika) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kopējā RNS tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot Epoch@micro-volume spektrofotometra sistēmu (BioTek Instruments, Inc. Winooski, Vērmonta, ASV). Kopējā RNS no aknām un viscerālajiem taukaudiem tika pārveidota par cDNS, izmantojot lielas ietilpības cDNS reversās transkripcijas komplektu (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, ASV). PCR amplifikācija tika veikta, izmantojot SYBR green (Applied Biosystems) korporāciju. ). Oligonukleotīdu praimeri 1. tipa 5o-reduktāzei, kas izstrādāti no žurkas, bija GGAAGG TTT CAT GGCCTT CG (uz priekšu) un TCG AGG GCA GCT GTA TG (reverse), 5o-reduktāzes 2. tipa praimeri, kas izstrādāti no žurkām, bija ATG. GGG ACC CTG ATC CTG TG (uz priekšu) un CGA CAC CACAAA GGA AGG CA (reverse), un GAPDH praimeri, kas tika izmantoti kā mājas uzturēšanas gēns un izstrādāti no žurkām, bija TGA TTC TAC CCA CGG CAA GT (uz priekšu) un AGC. ATC ACC CCA TTT GAT GT (reversā). Reversā transkripcija tika veikta, izmantojot termociklu (Gene Amp⑧ PCR sistēma 9700, Applied Biosystems), un rezultāti tika izteikti kā optimālā blīvuma attiecība pret GAPDH. Western blot analīze
Prostatas audino katra dzīvnieka tika homogenizēts komerciālajā līzes buferšķīdumā PRO-PREP⑧ (Intron Biotechnology Inc.) un inkubēts 25 minūtes uz ledus, lai izraisītu šūnu līzi. Audu ekstrakti tika centrifugēti pie 16 000g (4 grādi) 20 minūtes, un supernatants tika pārnests uz tīru mēģeni. Proteīna koncentrācija tika novērsta ar tipiskām histoloģiskām izmaiņām, tostarp sabiezinātu dziedzera epitēliju, vakuolētu citoplazmu, kas vērsta uz dziedzera lūmenu, un samazinātu dziedzera luminālo laukumu (3.A att.). CSE ievadīšana 4 nedēļas nomāca šos tipiskos hiperplastiskos modeļus, kas atspoguļo histoloģiskas izmaiņas no normāliem prostatas audiem uz prostatas hiperplāziju. Īsumā, ar finasterīdu un CSE ārstēto grupu histoloģiskā izmeklēšana parādīja skaidru tendenci uzlabot prostatas hiperplāziju. Turklāt, kā parādīts 3.B attēlā, TETP analīze parādīja, ka visvairāk sabiezējuši epitēlija audi tika novēroti BPH izraisītām žurkām, salīdzinot ar citām pētījuma grupām, un grupās, kas ārstētas ar finasterīdu un CSE, tika konstatēts ievērojams prostatas biezuma samazinājums. .
Lai novērtētu prostatas epitēlija šūnu proliferāciju, mēs pārbaudījām PCNA olbaltumvielu ekspresiju BPH izraisītu žurku prostatas audos. Kā parādīts 3.C attēlā, Western blot analīze liecināja par PCNA proteīna ekspresijas palielināšanos BPH izraisītajā grupā, salīdzinot ar PCNA līmeni kontroles grupā. Tomēr, salīdzinot ar BPH izraisīto grupu, ar finasterīdu un CSE ārstētajām grupām bija samazināta PCNA proteīna ekspresija, kas norāda uz to antiproliferācijas iedarbību BPH.
2. att. Cistanche Tubulosa ekstrakta (CSE) ievadīšanas ietekme uz seruma dilhidrotestosterona (DHT) veidošanos un 5a-reduktāzes 1. un 2. tipa mRNS līmeni labdabīgas prostatas hiperplāzijas (BPH) izraisītu žurku modeļu prostatas audos. (A) DHT koncentrācija serumā tika noteikta, izmantojot ELISA testu. (B) 5a-reduktāzes 1. un 2. tipa mRNS ekspresija prostatas audos tika analizēta ar kvantitatīvu reālā laika PCR. Parādītie dati atspoguļo vidējo ± SEM 6 žurkām grupā."<><0.001 vs.con=""><0.001 vs.bph="">
