Pretvīrusu cinka oksīda nanodaļiņas, ko nodrošina hesperidīns un in Silico salīdzinājuma pētījums starp pretvīrusu fenoliem kā anti-SARS-CoV{2}}

Vairāk informācijas E-paststina.xiang@wecistanche.com

Kopš 2020. gada janvāra Elsevier ir izveidojis COVID-19 resursu centru ar bezmaksas informāciju angļu un mandarīnu valodā par jauno koronavīrusu COVID-19. COVID-19 resursu centrs atrodas Elsevier Connect — uzņēmuma publiskajā ziņu un informācijas vietnē. Ar šo Elsevier piešķir atļauju visus ar COVID{4}}saistītos pētījumus, kas ir pieejami COVID-19 resursu centrā, tostarp šo pētījumu saturu, nekavējoties padarīt pieejamus PubMed Central un citos publiski finansētos krātuvēs, piemēram, PVO. COVID datu bāze ar tiesībām neierobežoti atkārtoti izmantot pētījumus un veikt analīzi jebkurā formā vai ar jebkādiem līdzekļiem, apstiprinot sākotnējo avotu. Elsevier šīs atļaujas piešķir bez maksas, kamēr COVID-19 resursu centrs ir aktīvs.

KOPSAVILKUMSSmags akūta respiratorā sindroma koronavīruss 2 (SARS-CoV-2), kas izraisīja koronavīrusu (COVID-19), ir vīruss, kas visā pasaulē ir izraisījis vairāk nekā 69 613 607 miljonus infekciju un vairāk nekā 1 582 966 nāves gadījumus. Visi ārstēšanas pasākumi un protokoli tika uzskatīti par tikai atbalstošiem, nevis ārstnieciskiem. Pašreizējās koronavīrusa pandēmijas laikā farmaceitisko vai tradicionālo komplementāro un integratīvo medicīnu meklēšana ir bijusi izdevīga profilaksei, ārstēšanai un atveseļošanai. Šie fitofarmaceitiskie un uztura līdzekļi var būt ekonomiskāki, pieejamāki, drošāki un tiem ir mazākas blakusparādības. Šis ir desmit fenola salīdzināšanas pētījums in silicopretvīrusulīdzekļi pret SARS-CoV-2, kā arī visaktīvākā metabolīta izolēšana no dabīgiem avotiem. Pēc tam tika sagatavotas arī cinka oksīda nanodaļiņas (ZnO NP), izmantojot šos metabolītus kā reducētāju. Visiem pārbaudītajiem savienojumiem bija paredzama anti-SARS-CoV-2 aktivitāte.Hesperidīnsuzrādīja augstāko dokstacijas punktu skaitu, tas liek mums to izolēt no apelsīnu mizām, un mēs apstiprinājām tā struktūru ar parasto spektroskopisko analīzi. Turklāt hesperidīna cinka oksīda nanodaļiņu sintēzi raksturoja UV, IR, XRD un TEM. Hesperidīna un ZnO NP pretvīrusu aktivitāte in vitro tika novērtēta pret A hepatīta vīrusu kā RNS vīrusu piemēru. Tomēr ZnO NP un hesperidīns uzrādīja pretvīrusu aktivitāti pret HAV, bet ZnO NP uzrādīja augstāku aktivitāti nekāhesperidīns. Tādējādi hesperidīns un tā mediētās ZnO nanodaļiņas ir gatavi pretvīrusu līdzekļi, un ir nepieciešami turpmāki pētījumi pret SARS-CoV-2, lai tos izmantotu kā potenciālu ārstēšanu.

Atslēgvārdi: SARS-CoV-2 Nutraceuticals Molekulārā dokstacija Cinka oksīda nanodaļiņas Hesperidīns

1. Ievads

Pašreizējā COVID{0}} pandēmija ir izraisījusi vairāk nekā 69 miljonus infekciju un vairāk nekā 1,5 miljonus nāves gadījumu visā pasaulē, 2,3 miljonus infekciju un vairāk nekā 55 nāves gadījumus Āfrikā un vairāk nekā 119 nāves gadījumus Āfrikā. } infekcijas un vairāk nekā 6000 nāves gadījumu Ēģiptē [1]. Lielākajai daļai cilvēku, kas inficēti ar SARS-CoV-2, simptomi ir viegla vai vidēji smaga elpceļu slimība, kas var izveseļoties bez konsultēšanās ar ārstu. Tomēr cilvēkiem ar hroniskām slimībām, piemēram, sirds un asinsvadu slimībām, diabētu, hroniskām elpceļu slimībām vai vēzi, ir lielāks akūtu elpceļu simptomu attīstības risks. COVID-19 pārnešana tiek novērsta, ievērojot sociālo distanci, mazgājot rokas vai izmantojot sterilizāciju ar alkoholu un nepieskaroties sejai. Kur tas tiek pārnests caur siekalu pilieniem no cilvēka deguna, kad inficēts indivīds klepo vai šķauda [1]. Visi pasākumi un protokoli tika uzskatīti par tikai atbalstošiem, bet ne ārstnieciskiem. Tomēr ir daudzi pašreizējie klīniskie pētījumi, kuros tiek novērtētas iespējamās zāles [1]. Tā kā COVID{17}} tika atzīts par globālu pandēmiju, radās nepieciešamība meklēt farmaceitisko vai tradicionālo, papildinošo un integratīvo medicīnu, lai palīdzētu profilaksē, ārstēšanā un atveseļošanā [2].

Dabiskie produkti ir neizmantoti savienojumu avoti, kurus var izmantot dažādu slimību profilaksē un ārstēšanā. Turklāt dabiskie savienojumi bieži ir bijuši lētāki un drošāki zāļu kandidāti pret vairākām slimībām, tika ziņots, ka daudziem uztura savienojumiem irpretvīrusu aktivitātes[3]. Pēdējā desmitgadē skaits jaunupretvīrusu zālesir ievērojami pieaudzis. Dabiski produkti tieši vai netieši palīdz atklāt pretvīrusu zāles [4].

Tāpēc dabisko savienojumu bibliotēku skrīnings ar skaitļošanas skrīninga metodēm, piemēram, molekulāro dokstaciju, var ietaupīt gan laiku, gan naudu zāļu izstrādē [3]

No otras puses, cinku (Zn) saturoši savienojumi ir parādījušipretvīrusu īpašībaspret vairākiem vīrusiem atbilstoši tādiem fiziskiem procesiem kā vīrusa pievienošana, vīrusu infekcija un pārklājuma noņemšana. Papildus vīrusu proteāzes un polimerāzes inhibīcijai [5]. Parasti Zn ir būtisks elements, kas atrodams mūsu ķermeņa audos, piemēram, muskuļos, smadzenēs, ādā, kaulos. Tā ir arī būtiska sastāvdaļa dažādās enzīmu sistēmās, kas iesaistītas metabolismā un nukleīnskābju un olbaltumvielu biosintēzē [5].

Jāņem vērā, ka ZnO NP organismā uzsūcas vieglāk nekā pats cinks. ZnO NP pašlaik izmanto pārtikas rūpniecībā kā piedevas un iepakojumā. Turklāt ASV Pārtikas un zāļu pārvalde ZnO klasificēja kā drošu vielu. Tāpēc ZnO NP ir pievilcīgi izmantošanai biomedicīnā. ZnO NP raksturo zemas ekonomiskās izmaksas un zema toksicitāte, tāpēc ZnO NP var plaši izmantot biomedicīnai kā antibakteriālas, pretvēža, pretdiabēta, pretiekaisuma, zāļu piegādes un brūču dzīšanas zāles [6].

Nesen tika ziņots, ka Zn saturošiem savienojumiem ir anti-SARS-CoV-2 aktivitāte [7] Tādējādi Zn saturošas zāles parasti tiek parakstītas COVID-19 aizsardzības protokolos. Līdz ar to īpaša uzmanība ir jāpievērš ZnO NP zaļajai sintēzei.

Šajā darbā vairāki fitofarmaceitiskie fenola savienojumi no bieži lietotiem ārstniecības augiem un pārtikas produktiem (uztura preparātiem) tiek pakļauti molekulārai in silico izpētei, lai izpētītu pretvīrusu aktivitāti pret SARS CoV{0}} galveno proteāzi (Mpro) un eksperimentāli augstāko savienojuma punktu savienojumu. tiks pārbaudīts līdzās tā mediētajām ZnO nanodaļiņām pret A hepatīta vīrusu (HAV), RNS vīrusu, kas līdzīgs SARS−COV- 2.

2. Materiāli un metodes

2.1. Molekulārā dokstacija

Galvenā proteāze (Mpro) ir svarīgs enzīms, ko kodē koronavīrusa genoms un kam ir būtiska loma vīrusa replikācijas un transkripcijas procesā, padarot to par piemērotu zāļu mērķi SARS-CoV-2. Lai atklātu atsevišķu polifenolu savienojumu, piemēram, rutīna, korilagīna, diosmīna, miricetīna-3-O-ksilozil-(1→2)-ramnosīda, epigallokatehīna-3-O-galāta, inhibēšanas mehānismu,hesperidīns, lioniresinols, miricetīns, naringenīns un kvercetīns 3-O-glikuronīds pret SARS-CoV-2 Mpro (6lu7) [8] kristālisko struktūru, kas tika izmantoti ar izšķirtspēju 2,1 Aᵒ. To izmantoja in silico molekulārajai dokstacijai. Šis proteīns sastāv no diviem polipeptīdiem, kas pazīstami kā protomēri A un B. Šim dimēram ir kristalogrāfiska simetrija gar divkāršu asi. Tas satur trīs domēnus; I domēnam (8.–101. atlikums), II domēnam (102.–184. atlikumi) ar antiparalēlu lokšņu struktūru un III domēnam (201.–303. atlikumi) ir piecas spirāles, kas sakārtotas kā antiparalēlas sfēriskas kopas. Kur III domēns ir savienots ar II domēnu ar garas cilpas reģionu (atlikumi 185–200). SARS-CoV-2, Mpro, piemīt Cys-His saistītā katalītiskā aktivitāte, kur substrāta saistīšanās vieta atrodas plaisā starp domēnu I un domēnu II [8], kā parādīts 1. attēlā. , molekulārās dokstacijas procedūras veica Šveices doku dienests [9]. Izmantojot EADock DSS, kas veic aklo dokstaciju, un tā CHARMM enerģijas tika novērtētas režģī, kur vislabvēlīgākās enerģijas tika novērtētas ar FACTS un sagrupētas. Šīs kopas var vizualizēt un interpretēt, izmantojot Chimera, kā ziņots literatūrā [10].

2.2. Augu materiāli, ieguve un izolācija

Apelsīnu mizas (500 g) iegādātas vietējā sulu ražotnē. Apelsīnu mizas (200 g) ekstrahēja ar 2 l karsta destilēta ūdens līdz izsīkumam. Ekstrakts tika filtrēts un iztvaicēts, lai vakuumā kļūtu vairāk koncentrēts. Ūdens ekstrakts tika sadalīts ar CH2Cl2, pēc tam ar butanolu. Butanola subfrakcija tika uzklāta uz 3 MM Whatman filtrpapīra loksnēm, izmantojot BAW kā eluentu [12,11], lai ultravioletā (UV) gaismā iegūtu galveno tumši purpursarkano joslu. Tumši purpursarkanā josla tika izolēta un macerēta metanolā, pēc tam iztvaicēta vakuumā, izmantojot rotācijas iztvaicētāju. Žāvētais materiāls tika uzklāts uz Sephadex LH -20 kolonnu, izmantojot EtOH/H2O (1:1) kā eluentu, lai iegūtu 120 mghesperidīns.

2.3. Kodolmagnētiskā rezonanse (KMR)

1H-kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektri tika reģistrēti ar Bruker Avance III, 400 MHz NMR spektrometru un 100 MHz 13C KMR. 1H ķīmiskās nobīdes (δ) tika mērītas ppm attiecībā pret TMS un 13C-NMR ķīmiskajām nobīdēm uz dimetilsulfoksīdu-d6 un pārveidotas TMS skalā, pievienojot 39,5.

2.4. Cinka oksīda nanodaļiņu (ZnO NP) sintēze

ar 500 mg cinka acetāta, kas izšķīdināts 50 ml divreiz destilēta ūdens un karsēts verdoša ūdens vannā 20 minūtes. Pēc tam reakcijai pievienoja piecus pilienus amonija hidroksīda, lai paaugstinātu pH līdz 12, kur veidojas ZnO NP nogulsnes. Maisījumu atstāja pusstundu, lai pilnībā reducētu cinka acetātu līdz ZnO NP. Izveidotās nogulsnes centrifugēja ar ātrumu 8000 apgr./min, kam sekoja divas reizes mazgāšana ar divreiz destilētu ūdeni un divas reizes ar etanolu, lai pēc žāvēšanas liofilizētā veidā iegūtu baltas ZnO NP granulas.

2.5. Metāla nanodaļiņu raksturojums

2.5.1. UV-vis spektrālā analīze

ZnO NP preparāti tika pārbaudīti, izmantojot UV spektrofotometru, Shimadzu, UV-1601 (Shimadzu Corporation, Japāna). UV spektri tika reģistrēti no 200 līdz 400 nm.

2.5.2. FT-IR analīze

Sintezēto cinka oksīda nanodaļiņu un hesperidīna savienojuma funkcionālās grupas tika raksturotas, izmantojot FTIR 6100 spektrometru (Jasco, Japāna) diapazonā no 4000 līdz 400 cm−1.

2.5.3. Transmisijas elektronu mikroskopija (TEM)

Hesperidīna mediēto ZnO NP morfoloģiju un daļiņu izmēru noteica TEM (JEOL-JEM-1011, Japāna). Nanodaļiņu suspensijas pilieni tika novietoti uz vara režģa, kas pārklāts ar oglekli, un pirms TEM attēla ierakstīšanas šķīdinātājs tika iztvaicēts istabas temperatūrā.

2.5.4. Rentgenstaru difrakcija (XRD)

ZnO NPs rentgenstaru difrakcijas modelis, kas reģistrēts ar PANLYTICAL rentgenstaru difraktometru, izmantojot Cu K starojumu ar viļņa garumu 1d706; =0.1541 nm skenēšanas diapazonā 21d703;=20− 70∘.

2.6. Pretvīrusu aktivitātes novērtējums

Pretvīrusu skrīnings tika veikts, izmantojot plāksnes inhibīcijas testu Reģionālajā mikoloģijas un biotehnoloģijas centrā (RCMB, Al Azhar University, Kaira, Ēģipte).

2.6.1. Zīdītāju šūnu līnija

Vero šūnas, kas iegūtas no Āfrikas zaļo pērtiķu nierēm, tika iegūtas no Amerikas tipa kultūras kolekcijas (ATCC, Manassas, VA, ASV).

Vero šūnas tika pavairotas Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (DMEM), kas papildināta ar 10 procentiem termiski inaktivētu liellopu augļa serumu (FBS), HEPES buferšķīdumu, 1 procentu L-glutamīnu un 50 ug/ml gentamicīna. Visas šūnas tika kultivētas 37 ◦C mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO2 un tika subkultivētas divas reizes 7 dienas [14].

2.6.2. Citotoksicitātes novērtējums

hesperidīna un ZnO NP tika pievienoti pēc 24 stundu implantācijas. Pārbaudīto paraugu sērijveida divkārši atšķaidījumi (sākot no 3000 ug/ml līdz 2 ug/ml) tika pievienoti konfluentiem šūnu monoslāņiem, kas tika izdalīti 96-iedobēs, plakanu dibenu mikrotitrēšanas plāksnēs (Falcon, Džersija, Ņūdžersija, ASV ), izmantojot daudzkanālu pipeti. Mikrotitrēšanas plāksnes 2 dienas inkubēja 37 ◦C mitrinātā inkubatorā ar 5 procentiem CO2. Katrai pētāmo paraugu koncentrācijai tika izmantotas trīs iedobes. Kontroles šūnas tika inkubētas bez testa paraugiem un ar vai bez DMSO.

Pēc inkubācijas perioda dzīvotspējīgo šūnu ražu noteica ar MTT kolorimetrisko testu [15]. Tika uzzīmēta saistība starp izdzīvojušajām šūnām un pārbaudīto paraugu koncentrāciju, lai iegūtu Vero šūnu līnijas izdzīvošanas līknes pēc apstrādes ar norādītajiem savienojumiem. 50 procentu citotoksiskā koncentrācija (CC50), koncentrācija, kas nepieciešama, lai izraisītu toksisku iedarbību 50 procentos neskartu šūnu, tika aprēķināta no katras koncentrācijas devas-atbildes līknes grafiskajiem diagrammām, izmantojot GraphPad Prism programmatūru (Sandjego, Kalifornija, ASV). Katra hesperidīna un ZnO NP maksimālā netoksiskā koncentrācija [MNTC] tika noteikta un izmantota turpmākiem bioloģiskiem pētījumiem.

2.6.3. Vīrusu izplatīšanās

HAV citopatogēnais HAV HM175 celms (ATCC VR-1402) tika pavairots un pārbaudīts saplūstošās Vero šūnās [16]. Infekcijas vīrusi tika uzskaitīti, nosakot 50 procentu audu kultūras infekciozo devu ar astoņām iedobēm katrā atšķaidījumā un 20 μL inokulāta katrā iedobē, izmantojot Spīrmena-Kārbera metodi [17].

3. Rezultāti un diskusijas

Desmit uztura fenola savienojumi tika atlasīti pēc to pieejamības un izplatības kā farmaceitiskās zāļu formas, kas iegūtas no dabīgiem barojošiem pārtikas avotiem.

Šīs uzturvielas bija diosmīns, rutīns, naringenīns, kvercetīna 3-oglukuronīds, miricetīna 3-O-ksilozil-(1→2)-ramnosīds, miricetīns, epigallokatehīns-3-O-gallāts, korilagīns un lioniresinols. Hesperidīns, diosmīns un rutīns ir plaši pieejami farmācijas veikalos ar dažādiem tirdzniecības nosaukumiem, un tos var iegūt no dažādiem dabīgiem barojošiem pārtikas produktiem, par kuriem ziņots, ka tiem piemīt pretvīrusu īpašības, piemēram, ir ziņots, ka hesperidīns no citrusaugļu mizām ir.pretvīrusu aktivitāte[18]. Pamatojoties uz in silico skrīningu, tika arī prognozēts, ka hesperidīns būs vērsts uz mijiedarbības vietu starp SARS-CoV-2 Spike un ACE2 receptoriem, tādējādi bloķējot vīrusa iekļūšanu cilvēka plaušu šūnās. Tāpēc hesperidīns varētu būt daudzsološs profilaktisks līdzeklis pret COVID-19 [19].

Turklāt naringenīns no citrusaugļu mizām tika ziņots kā pretvīrusu līdzeklis pret Zikas vīrusu [20], rutīns [21] uzrādīja nozīmīgus rezultātus kā pretvīrusu līdzeklis [19]. Zaļās tējas epigallokatehīns{3}}O-galāts saturpretvīrusu iedarbībapret vairākiem DNS un RNS vīrusiem [22]. Korilagīns novērš aknu bojājumus, kavējot HCV replikāciju un modulējot oksidatīvo stresu [23]. Ir ziņots par anti-HIV aktivitāti miricetīnam un tā glikozilētajiem atvasinājumiem [24]. Turklāt ziņots par vairākiem lignāniempretvīrusuīpašības [25].

3.1. Molekulārā dokstacija

Pašreizējā pētījumā tika mēģināts interpretēt un atbalstīt eksperimentālos atklājumus par galvenās proteāzes COVID{0}} inhibīcijas mehānismu. Desmit polifenolu savienojumi tika savienoti, izmantojot Swiss Dock Server, kur šiem polifenoliem tika piemērotas uz receptoriem balstītas pieejas. Covid-19 proteāzes 6lu7 kristāliskā struktūra, kas pieņem sirds formu, ar diviem identisku apakšvienību dimēriem un divām aktīvām vietām. plaša spektra inhibitoram jābūt vērstam pret sikspārņu koronavīrusa priekšteča aktīvo vietu His 41 un Cys 148, kā tas ir PBP ierakstā 4yoi. Šajā pētījumā tika noskaidrots fenola savienojumu saistīšanās veids ar kristālisko struktūru 6lu7, izmantojot molekulāro dokstaciju (2. att.). Docking pētījums apstiprināja, ka hesperidīns var veidot elektrostatisku mijiedarbību ar THR 25, LEU 27, His 41 un Gly143 atlikumiem, vienlaikus veidojot pi-stacking mijiedarbību ar TYR 118, kā norādīts 1. tabulā.

Lielākajai daļai polifenolu savienojumu bija inhibējoša aktivitāte plaisas apgabalā starp II, III (atlikumi 185–200) un I domēnu, kā redzams 2. attēlā, savukārt 1. tabulā polifenolu savienojumi tika uzskaitīti atbilstoši to saistīšanās enerģijām. RMSD saistība ar sākotnējo saistīšanas režīmu (pilna piemērotība (zilā, kreisā X ass)) un enerģiju (vienkāršā piemērotība (sarkanā, labā y ass)) tika parādīta A attēlā (piegādes fails). . Hesperidīna dokstacijas režīms tika parādīts (B att. SARS-CoV-2 Mpro un C att. HAV 3C proteināzei [26], 2HAL kristāla struktūra), miricetīns (D, 1., 2. att.), diosmīns. (E 1., 2. att.), epigallokatehīns-3-O-gallāts (F1.,2. att.), rutīns (G1.,2. att.), kvercetīna 3-O-glikuronīds (H 1.,2. att.), korilagīns (I1, 2. attēls), miricetīns (J1, 2. attēls), naringenīns (L1, 2. attēls) un lioniresinols (M1, 2. attēls) papildu failā.

3.2. Hesperidīna izolēšana un identificēšana

Tā kā hesperidīnam bija visaugstākais dokstacijas rezultāts, mēs to izolējām no pārtikas atkritumiem (apelsīnu mizām), un tika novērtēta tā pretvīrusu aktivitāte pret HAV (vienu no RNS vīrusiem).

Butanola frakcija no apelsīnu mizu ūdens ekstrakta tika uzklāta uz Whatman filtrpapīra loksnēm, izmantojot BAW kā eluentu, tādējādi preparatīvajā papīra hromatogrāfijā tika novērota galvenā flavonoidāla rakstura tumši violeta josla. Galvenās tumši purpursarkanās joslas eluēšana ar metanolu noveda pie tīra savienojuma izolēšanas, un tā identitāte tika apstiprināta ar 1H,13C kā hesperidīnu [27] šādi: 1H KMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 5,50 (dd, J=12,2, 3,4 Hz, 1H, H-2), 2,78 (dd, J =3,24 Hz un 17,16, 1H, H{{22} }ax), 3,26 (dd, J=17,16, 8,22 Hz, 1H, H-3ekv.), 6,14 (brs, 1H, H-6), 6,12 (brs, 1H , H-8), 4,97 (d, J =7,2 Hz, 1H, H-1′′), 4,53 (s, 1H, H-1′′' ), 1,09 (d, J=6,2, 3H, ramnozes CH3). 13C KMR (101 MHz, DMSO-d6) 8 78,89 (C{61}}), 42,74 (C{64}). }), 197,48 (C-4), 163,50 (C-5), 96,85 (C-6), 165,60 (C-7), 96,00 (C{{79}). }), 162,96 (C-9), 103,79 (C-10), 131,35 (C-1′), 118,42 (C-2′), 146,92 (C{-10). 94}}′), 148,43 (C-4′), 112,50 (C-5′), 114,60 (C-6′), 56,15 (O-Me), 99,91(C{) {109}}′′), 73,45 (C-2′′), 76,73 (C-3′′), 70,06 (C-4′′), 75,98 (C{121) }}′′), 66,50 (C-6′′), 101,06 (C-1′′'), 70,73 (C-2′′'), 71,17 (C{133) }}′′'), 72,53 (C-4′′'), 68,78 (C-5′′'), 18,29 (ramnozes CH3; C-6′′').

3.3. ZnO nanodaļiņu veidošanās

Cinka acetāta šķīduma pievienošana hesperidīna šķīdumam ūdens vannā, kas uzsildīta līdz 80 ◦C, pēc tam pievienojot dažus pilienus amonjaka, izraisīja ZnO NP nogulsnēšanos [13].

3.3.1. UV analīze

Maksimālais absorbcijas maksimums ZnO NP, kas sintezēti ar hesperidīna palīdzību, uzrādīja maksimumu pie 335 nm (3.a att.), kas apstiprina ZnO NP veidošanos [28]. ZnO nanomērogā ir īsāki viļņu garumi, salīdzinot ar standarta ZnO absorbcijas modeli, saskaņā ar ziņojumiem, ka materiālu oksīdiem parasti ir īsāki viļņu garumi un ka nanomēroga materiāliem mēdz būt īsāki viļņu garumi [29].

3.3.2. ZnO NP un hesperidīna FT-IR analīze

Sagatavoto ZnO NP un hesperidīna FT-IR spektri (3.b att.) tika savākti spektrālā platuma diapazonā no 400 līdz 4000 cm−1. Kur parādīti O-H grupu maksimumi, kas stiepjas ūdenī ap 3546,04, 3478,29 un 3421,80 cm. − 1 apzīmē hesperidīna O-H grupas un ap 3382,99 cm − 1 ZnO NP. Aromātiskās daļas tika apstiprinātas ar oglekļa dubultsaites stiepšanu pie 2918,50 cm−1. Alkoholiskā –CO–H lieces vibrāciju apstiprina pīķa klātbūtne pie 1096,12 cm− 1. ZnO NP stiepšanās režīmu raksturīgās joslas ir piešķirtas pie 542,9 un 891,2 cm− 1 [13,30].

3.3.3.TEM analīze

TEM analīze tika veikta ar zemas izšķirtspējas un augstas izšķirtspējas transmisijas elektronu mikroskopiem un parādīja sešstūrainu ZnO NP veidošanos ar daļiņu izmēru diapazonā no 20 līdz 30 nm, 4. att.

3.3.4. XRD analīze

ZnO NP rašanos un to strukturālo iezīmju izpēti apstiprināja rentgenstaru difrakcija (XRD), 5. att.. Flavonoīda hesperidīna mediētie ZnO NP uzrādīja maksimumus ar 2θ vērtībām, kas identificētas pie 31,618◦, 34,334◦, 36,161◦, 47,5. ◦, 56,440◦, 62,727◦, 66,245◦, 67.864◦ un 68,925◦, kas atbilst (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112) un (201). Šie maksimumi tika saskaņoti ar datu kartes virsotnēm (00– 003-0888).

Tika aprēķināts, ka ZnO NP kristāla izmērs ir 27, 73 nm. Šie dati ir ļoti līdzīgi TEM mērījumiem. Lai aprēķinātu kristāla izmēru, mēs izmantojam Šerera vienādojumu

Kristāla izmērs {{0}} (0,9 x λ)/ (dcosθ)

Θ=2θ/2, d=pilns platums pie maksimālās pīķa intensitātes puses (rados), λ =0.154060 nm

3.4. Pretvīrusu darbība

3.4.1. Citotoksicitātes novērtējums pret Vero šūnām

Abi hesperidīna un ZnO NP paraugi uzrādīja 50 procentu šūnu citotoksiskās koncentrācijas (CC50)=620,8 ± 34,6 un 243,7 ± 12,7 ug/ml, attiecīgi. Kā parādīts zīm. K. & L., suppl. un vērtības tika norādītas attiecīgi C un D tabulās. Pēc tam šie savienojumi tika pārbaudītipretvīrusu iedarbībapret HAV pie maksimālās netoksiskās koncentrācijas (MNTC), izmantojot plāksnīšu testa metodi, kas parādīta M attēlā (papildu fails).

3.4.2. Anti-HAV darbība

Ir ziņots, ka flavonoīdiem ir pretvīrusu iedarbība gan in vivo, gan in vitro [31]. Tika ziņots, ka dažu flavonoīdu darbības mehānisms pret HIV (arī RNS vīrusu) ir saistīts ar citokīnu mediētās olbaltumvielu fosforilācijas inhibīciju. Jāņem vērā arī tas, ka COVID-19 infekcijas gadījumā palielinās citokīnu mediētā fosforilēšanās signalizācija, izraisot daudzu citoskeleta proteīnu fosforilēšanos. Tāpēc flavonoīdi, kas ietver hesperidīnu, var kavēt olbaltumvielu fosforilēšanos, kas savukārt izraisa spēcīgu pretvīrusu aktivitāti un citu šūnu infekciju novēršanu [32]. Ir ziņots, ka ZnO NP ir arī pretvīrusu aktivitāte [32, 33].

Zn saturoši savienojumi ziņoja, ka tie ietekmē dažādus vīrusu replikācijas ciklu posmus, piemēram, vīrusa inaktivāciju, vīrusa pārklājuma inhibīciju, vīrusa genoma transkripciju, vīrusu proteīnu translāciju un poliproteīnu apstrādi. Jāņem vērā arī tas, ka aktivitāte ir atkarīga no vīrusa veida un cinku saturošo savienojumu koncentrācijas [34].

Mūsu pētījumā saplūstošie Vero šūnu monoslāņi tika inficēti ar fiksētiem HAV vīrusa atšķaidījumiem. Pēc inkubācijas inokulāts tika noņemts un aizstāts ar serumu nesaturošu MEM, kas satur 1, 5 procentus karboksimetilcelulozes. Pēc tam šūnas tika inkubētas, ļaujot vīrusam veidot plāksnes. Šūnas tika fiksētas 2 stundas 25 ◦ C temperatūrā ar formaldehīdu, kas tika pievienots tieši barotnei līdz koncentrācijai 5 procenti. Fiksētās šūnas tika plaši mazgātas ar ūdeni, pirms tās 30 minūtes iekrāsoja ar šķīdumu, kas satur 1 procentu kristālvioletas un 10 procentus etanola. Pēc skalošanas ar ūdeni tika saskaitīts plankumu skaits un aprēķināti vīrusu titri (skaiti). Divu pārbaudīto paraugu, hesperidīna un ZnO NP, pretvīrusu iedarbība pret HAV pie maksimālās necitotoksiskās koncentrācijas (MNCC) ir parādīta B tabulā (papildu fails). Cinka oksīda nanodaļiņām bija lielāka aktivitāte nekā hesperidīnam salīdzinoši zemās koncentrācijās lielā virsmas laukuma un mazā daļiņu izmēra dēļ, kas palielināja cinka oksīda nanodaļiņu aktivitāti. No tabulas B, T attēls (papildu fails). Gan hesperidīna, gan ZnO NP uzrādīja pretvīrusu aktivitāti pret A hepatīta vīrusu (HAV) ar 44,75 un 58,83 procentiem pie maksimālās necitotoksiskās koncentrācijas un EC50, kas vienāda ar attiecīgi 72,4 un 176,3 ug/ml, kā parādīts A un B tabulā (papildu fails).

4. Secinājumi

Pašreizējā pandēmiskā slimība COVID{0}} izraisa lielu saslimstību un mirstību visā pasaulē. Mūsu pētījumā iekļautajiem uztura līdzekļiem un fitofarmaceitiskajiem fenola savienojumiem ir labi dokstacijas rādītāji, un tie varētu būt ideāls mērķis SARS-CoV ārstēšanai-2. Hesperidīnam, kas izolēts no pārtikas atkritumiem apelsīnu mizām, starp citiem pārbaudītajiem savienojumiem ir visaugstākais dokstacijas rādītājs (-8,84 Kcal/mol) pret SARS-CoV-2 galveno proteāzi. Hesperidīns spēj reducēt cinka jonus, lai sagatavotu ZnO NP ar sešstūra formu un daļiņu izmēru aptuveni 25 nm. Hesperidīna mediētajiem ZnO NP ir lielāka pretvīrusu aktivitāte nekā pašam hesperidīnam ar procentuālo daudzumu 44,75 un 58,83 procenti pie maksimālās necitotoksiskās koncentrācijas. Būtu jāveic vairāk pētījumu par hesperidīnu, citiem uztura līdzekļiem, fitofarmaceitiskajiem savienojumiem un to ZnO NP, lai atrastu drošus, lētus un potenciālus SARS-CoV{15}} pandēmijas ārstēšanas veidus.

Autoru ieguldījums Gouda H. Attia, Yasmin S. Moemen, Mahmoud Youns, Ammar M. Ibrahim, Randa Abdou, Mohamed A. El Rey Gouda H. Attia un Mohamed A. El Raey izstrādā manuskriptu. Gouda H. Attia, Ammar M. Ibrahim un Mohamed A. El Rey veica hromatogrāfisko atdalīšanu un veica tīra izolētā hesperidīna struktūras noskaidrošanu. Gouda H. Attia, Randa Abdou un Mohamed A. El Raey veica ZnO zaļo sintēzi. NP un aprakstiet tā īpašības. Yasmin S. Moemen veica visus molekulārās dokstacijas pētījumus, un Mohameds A. El-Rejs ierosina proteīnu.

Mahmoud Youns un Randa Abdou veica pretvīrusu un citotoksicitātes testus un to datu analīzi. Visi autori bija atbildīgi par manuskripta galīgās versijas sagatavošanu un rakstīšanu un galīgā manuskripta apstiprināšanu.

Finansējums

Šim darbam finansējums netika saņemts.

Pētniecības ētika

Mēs arī apstiprinām, ka jebkurš šajā manuskriptā aplūkotā darba aspekts, kas saistīts ar cilvēkiem, ir veikts ar visu attiecīgo institūciju ētisku apstiprinājumu un ka šādi apstiprinājumi ir apstiprināti manuskriptā.

Tika iegūts IRB apstiprinājums (nepieciešams pētījumiem un 3 vai vairāk gadījumu sērijai)

Rakstiska piekrišana publicēt potenciāli identificējošu informāciju, piemēram, informāciju par gadījumu un fotogrāfijas, tika iegūta no pacienta(-iem) vai viņu likumīgā(-iem) aizbildņa(-iem).

Konkurējošo interešu deklarācija

Autori neziņo par interešu deklarācijām.

Pateicības

Mēs esam pateicīgi Najran Universitātes Zinātniskās pētniecības dekanātei, KSA, par finansējuma nodrošināšanu šī projekta īstenošanai (NU/MID/18/024).

A pielikums. Papildu dati

Ar šo rakstu saistītos papildu materiālus tiešsaistes versijā var atrast vietnē DOI: https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.111724.

Gouda H. Attiaa,b , Yasmine S. Moemenc , Mahmuds Junssd , Ammar M. Ibrahime ,  Randa Abduf,g , Mohameds A. El Rejsh, *  

a Farmakognozijas katedra, Farmācijas koledža, Najran University, Najran, Saūda Arābija
b Farmakognozijas katedra, Farmācijas fakultāte, Kafr El-Shiekh, Kafr El-Shiekh, Ēģipte
c Menufijas universitātes Nacionālā aknu institūta klīniskās patoloģijas nodaļa, Menufija, Ēģipte
d Helvanas universitātes Farmācijas fakultātes Bioķīmijas un molekulārās bioloģijas katedra, Kaira, Ēģipte
e Lietišķās medicīnas zinātņu koledža, Najran University, Najran, Saūda Arābija
f Farmakognozijas katedra, Umm Al-Kuras Universitātes Farmācijas fakultāte, Meka, Saūda Arābija
g Farmakognozijas katedra, Farmācijas fakultāte, Helwan University, Kaira, Ēģipte
h Fitoķīmijas un augu sistemātikas departaments, Farmācijas nodaļa, Nacionālais pētniecības centrs, Dokki, Kaira, Ēģipte

Atsauces

[1] Pasaules Veselības organizācija, PVO koronavīrusa slimība (COVID-19), 2020 (Piekļuve 2020. gada 22. oktobrī), https://www.worldometers. info/koronavīruss/#valstis.

[2] J. Hanters, S. Ārents, J. Goldenbergs, G. Jangs, J. Bērdslijs, D. Merts, S. Līds, Ātrās pārskatīšanas protokols: cinks COVID profilaksei vai ārstēšanai-19 un citi ar koronavīrusu saistītas elpceļu infekcijas, Integr. Med. Res. 9 (2020), 100457. [3] GJ Kotwal, Antiviral nutraceuticals from granātābolu (Punica granatum) sula, Handb. Nutraceuticals, Vol. I, CRC Press, 2009, 338.–346. lpp.

[4] L.-T. Lin, W.-C. Hsu, C.-C. Lin, Pretvīrusu dabīgie produkti un augu izcelsmes zāles, J. Tradit. Papildināt. Med. 4 (2014) 24.–35.

[5] A. Kumar, Y. Kubota, M. Chernov, H. Kasuya, Cinka papildināšanas iespējamā loma COVID profilaksē un ārstēšanā-19, Med. Hipotēzes (2020), 109848.

[6] J. Jiang, J. Pi, J. Cai, The Advancing of cinka oksīda nanodaļiņu izmantošanai biomedicīnā, Bioinorg. Chem. Appl. (2018), https://doi.org/10.1155/2018/1062562.

[7] AJW Te Velthuis, SHE van den Worm, AC Sims, RS Baric, EJ Snijder, MJ van Hemert, Zn2 plus inhibē koronavīrusa un arterivīrusa RNS polimerāzes aktivitāti in vitro un cinka jonofori bloķē šo vīrusu replikāciju šūnu kultūrā, PLoS Patogs. 6 (2010), e1001176.

[8] Z. Jin, X. Du, Y. Xu, Y. Deng, M. Liu, Y. Zhao, B. Zhang, X. Li, L. Zhang, C. Peng, Structure of M pro from SARS- CoV-2 un tā inhibitoru atklāšana, Nature (2020) 1.–5.

[9] A. Grosdidier, V. Zoete, O. Michielin, SwissDock, olbaltumvielu mazo molekulu dokstacijas tīmekļa pakalpojums, kura pamatā ir EADock DSS, Nucleic Acids Res. (2011), https://doi.org/ 10.1093/nar/gkr366.

[10] A. Kucukelbir, FJ Sigworth, HD Tagare, Cryo-EM blīvuma karšu vietējās izšķirtspējas kvantifikācija, Nat. 11. metode (2014) 63.–65.

[11] HH Barakat, M. El-Raey, SA Nada, I. Zeid, M. Nawwar, Eugenia supra-axillaris lapu konstitutīvie fenoli un hepatoprotektīvā aktivitāte, EJ Chem. 54 (2011) 313–323.

[12] SM Osman, WA El Kashak, M. Wink, MA El Raey, jauni izorhamnetīna atvasinājumi no Salsola imbricata Forssk. Lapas ar izteiktu pretiekaisuma darbību, Pharmacogn. Mag. 12 (2016) S47.

[13] GH Attia, HS Alyami, MAA Orabi, AH Gaara, MA El Raey, sudraba un cinka nanodaļiņu pretmikrobu aktivitāte, ko nodrošina baklažānu zaļais kausiņš, Int. J. Pharmacol. 16 (2020) 236–243.

[14] P. Vijayan, C. Raghu, G. Ashok, SA Dhanaraj, B. Suresh, Antiviral activity of medical plants of Nilgiris, Indian J. Med. Res. 120 (2004) 24.–29.

[15] T. Mosmann, Ātrā kolorimetriskā pārbaude šūnu augšanai un izdzīvošanai: pielietojums proliferācijas un citotoksicitātes pārbaudēm, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-63.

[16] W. Randazzo, J. Piqueras, J. Rodríguez-Díaz, R. Aznar, G. S´anchez, Improving efektivitāti of viability-qPCR for selective detection of infekciozā HAV pārtikas un ūdens paraugos, J. Appl. Microbiol. 124 (2018) 958–964.

[17] RM Pinto, JM Diez, A. Bosch, Resnās zarnas karcinomas šūnu līnijas CaCo-2 izmantošana in vivo amplifikācijai un enterālo vīrusu noteikšanai, J. Med. Virol. 44 (1994) 310-315.

[18] Z. Ding, G. Sun, Z. Zhu, Short communication Hesperidīns mazina A gripas vīrusa (H1N1) izraisītu plaušu bojājumu žurkām, pateicoties tā pretiekaisuma iedarbībai, Antivir. Tur. 23 (2018) 611–615.

[19] C. Wu, Y. Liu, Y. Yang, P. Zhang, W. Zhong, Y. Wang, Q. Wang, Y. Xu, M. Li, X. Li, SARS terapeitisko mērķu analīze. CoV-2 un potenciālo zāļu atklāšana ar skaitļošanas metodēm, Acta Pharm. Grēks. B (2020).

[20] AHD Cataneo, D. Kuczera, AC Koishi, C. Zanluca, GF Silveira, TB de Arruda, AA Suzukawa, LO Bortot, M. Dias-Baruffi, WA Verri, Citrusaugļu flavonoīds naringenīns pasliktina cilvēka in vitro infekciju. Zikas vīrusa šūnas, Sci. Rep. 9 (2019) 1.–15.

[21] Y.-J. Lin, Y.-C. Čangs, N.-W. Hsiao, J.‑L. Hsieh, C.-Y. Vanga, S.-H. Kungs, F.-J. Tsai, Y.-C. Lan, C.‑W. Lins, fisetīns un rutīns kā enterovīrusa A71 3C proteāzes inhibitori, J. Virol. Metodes 182 (2012) 93-98.

[22] K. Kaihatsu, M. Yamabe, Y. Ebara, Epigallokatehīna-3-O-gallāta un tā taukskābju esteru pretvīrusu darbības mehānisms, Molecules 23 (2018) 2475.

[23] BU Redijs, R. Mulliks, A. Kumars, G. Šarma, P. Bags, CL Rojs, G. Sudha, H. Tandons, P. Deivs, A. Šukla. Dabisks mazo molekulu inhibitors korilagīns bloķē HCV replikāciju. un modulē oksidatīvo stresu, lai samazinātu aknu bojājumus, Antiviral Res. 150 (2018) 47–59.

[24] Dž. Tur. 14 (2017) 1.–6.

[25] RB Teponno, S. Kusari, M. Spiteller, Jaunākie sasniegumi lignānu un neolignānu pētījumos, Nat. Prod. Rep. 33 (2016) 1044–1092.

[26] J. Yin, MM Cherney, EM Bergmann, J. Zhang, C. Huitema, H. Pettersson, LD Eltis, JC Vederas, MNG James, Episulfīda katjons (tiirāna gredzens), iesprostots HAV 3C proteināzes aktīvajā vietā inaktivēts ar ketonu inhibitoriem uz peptīdu bāzes, J. Mol. Biol. 361 (2006) 673–686.

[27] VM Chari, M. Jordan, H. Wagner, PW Thies, 13C-KMR pētījums par acillinarīna struktūru no Valeriana wallichii, Phytochemistry 16 (1977) 1110–1112.

[28] N. Srinivasan, C. Rangasami, JC Kannan, Sintēzes struktūra un optiskās īpašības cinka oksīda nanodaļiņām, Int J Appl Eng Res. 10 (2015) 343–345.

[29] S. Fakhari, M. Jamzad, H. Kabiri Fard, Green synthesis of cinka oksīda nanodaļiņas: salīdzinājums, Green Chem. Lett. Rev. 12 (2019) 19.–24.

[30] N. Bala, S. Saha, M. Chakraborty, M. Maiti, S. Das, R. Basu, P. Nandy, Green synthesis of cink oksīda nanodaļiņas, izmantojot Hibiscus subdariffa lapu ekstraktu: temperatūras ietekme uz sintēzi, anti -baktēriju aktivitāte un pretdiabēta aktivitāte, RSC Adv. 5 (2015) 4993–5003.

[31] H. Zakarjans, E. Arabjans, A. Oo, K. Zandi, Flavonoīdi: daudzsološi dabiski savienojumi pret vīrusu infekcijām, Arch. Virol. 162 (2017) 2539–2551.

[32] M. Buhadū, D. Memons, B. Mejers, KM Vaits, V. V. Rezeljs, M. Marrero, B. Dž. Polako, J. Melniks, S. Ulferts, RM Kāke, SARS-CoV globālā fosforilācijas ainava-2 infekcija, 182. šūna (2020) 685–712.

[33] H. Gafari, A. Tavakoli, A. Moradi, A. Tabarrei, F. Boharei-Salim, M. Zahmatkešans, M. Farahmands, D. Džavanmards, SJ Kiani, M. Esghaei, H1N1 gripas vīrusa infekcijas inhibīcija ar cinka oksīda nanodaļiņām: vēl viens jauns nanomedicīnas pielietojums, J. Biomed. Sci. 26 (2019) 1.–10.

[34] SA Read, S. Obeid, C. Ahlenstiel, G. Ahlenstiel, The role of cink in antiviral immunity, Adv. Nutr. 10 (2019) 696–710.