Abstrakts.Arbutīns ir dabisks savienojums, kas iegūts no dažādiem augiem, tostarp lāču lapām, un kam ir daudzveidīga iedarbība, tostarp ādas balināšana un pretiekaisuma un oksidatīvā stresa aizsardzības īpašības. Tomēr arbutīna ietekme uz osteoblastiem joprojām nav zināma. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt arbutīna funkciju un mehānismus MC3T3-E1 peles osteoblastu prekursoru šūnu proliferācijai un diferenciācijai in vitro. Ar arbutīnu apstrādāto MC3T3-E1 šūnu proliferācija tika novērtēta, izmantojot šūnu skaitīšanas komplekta-8 testu un 5-etinil-2'-dezoksiuridīna marķēšanas testu. Turklāt šūnu cikls un apoptoze tika pārbaudīti, izmantojot plūsmas citometrijas analīzi. Arbutīna ietekme uz osteoblastu diferenciāciju tika pētīta, izmantojot sārmainās fosfatāzes (ALP) krāsošanu un pārbaudot I 1 tipa kolagēna ķēdes (COL1A1), kaulu-karboksiglutamāta proteīna (BGLAP) un Sp7 transkripcijas faktora (SP7) mRNS ekspresijas līmeņus. Lai turpinātu pētīt molekulāro mehānismu, kas ir pamatā arbutīna funkcijai osteoģenēzes veicināšanā, ar runtu saistītā transkripcijas faktora 2 (RUNX2) un -katenīna mRNS un olbaltumvielu ekspresijas līmeņi tika analizēti ar reversās transkripcijas kvantitatīvo polimerāzes ķēdes reakciju un Western blotēšanu. Arbutīns ievērojami veicināja MC3T3-E1 šūnu proliferāciju un palielināja šūnu attiecību S fāzē. Ārstēšana ar arbutīnu palielināja ALP aktivitāti un COL1A1, BGLAP un SP7 mRNS ekspresijas līmeni MC3T3-E1 šūnās. Turklāt RUNX2 un -katenīna proteīna un mRNS ekspresijas līmenis ievērojami palielinājās pēc ārstēšanas ar arbutīnu. Kopumā šie atklājumi liecināja, ka arbutīns spēja veicināt MC3T3-E1 šūnu proliferāciju un diferenciāciju, izmantojot Wnt / -catenin signalizācijas ceļu.
Saskaņā ar attiecīgiem pētījumiem,cistancheir izplatīts augs, kas pazīstams kā "brīnumaugs, kas pagarina mūžu". Tās galvenā sastāvdaļa ircistanozīds, kam ir dažādi efekti, piemēram,antioksidants, pretiekaisuma, un imūnās funkcijas veicināšana. Mehānisms starp cistanche unādas balināšanaslēpjas cistanche glikozīdu antioksidanta iedarbībā. Melanīns cilvēka ādā veidojas, oksidējoties tirozīnam, ko katalizētirozināze, un oksidācijas reakcijā ir nepieciešama skābekļa līdzdalība, tāpēc skābekļa brīvie radikāļi organismā kļūst par svarīgu faktoru, kas ietekmē melanīna ražošanu. Cistanche satur cistanozīdu, kas ir antioksidants un var samazināt brīvo radikāļu veidošanos organismā, tādējādikavē melanīna ražošanu.
Vairāk informācijas:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Ievads
Osteoporoze ir veselības un sociālekonomiska problēma, kam raksturīga zema kaulu masa un pasliktināta kaulu mikroarhitektūra, kas palielina trauslumu lūzumu risku (1,2). Eiropas Savienībā (ES) 2010. gadā osteoporozes izplatības rādītājs vīriešiem un sievietēm vecumā virs 50 gadiem bija attiecīgi 6,6 un 22,1 procenti. Ekonomiski kopējās osteoporozes izmaksas ES 2010. gadā bija ~37,4 miljardi eiro (3). Palielinoties dzīves ilgumam un pieaugot iedzīvotāju novecošanai, nākotnē arvien vairāk cilvēku var ciest no osteoporozes izraisītiem lūzumiem (4). Osteoporozi izraisa nelīdzsvarotība starp kaulu veidošanos, ko veicina osteoblasti, un rezorbciju, ko veicina osteoklasti (5). Pieejamās osteoporozes ārstēšanas metodes ietver pretrezorbcijas līdzekļus (piemēram, bisfosfonātus un denosumabu), kalcitonīnu un estrogēnu. Tomēr šiem savienojumiem ir noteikti ierobežojumi; jo īpaši tie samazina osteogēno aprites ātrumu, un, samazinot kaulu remodelācijas procesu, tie izraisa kaulu veidošanās samazināšanos (6). Estrogēnu terapija nav ideāla ilgstošai osteoporozes terapijai, jo augsts estrogēna līmenis var izraisīt dzemdes asiņošanu, krūts vēzi un sirds un asinsvadu slimības (7). Turklāt pretrezorbcijas zāles nespēj atjaunot zaudēto kaulu struktūru. Tomēr anaboliskie līdzekļi var stimulēt kaulu veidošanos un palielināt kaulu masu (8). Tāpēc ir svarīgi identificēt jaunas drošas un efektīvas zāles, kas var veicināt kaulu veidošanos.
Arbutīns (4-hidroksifenil-D-glikopiranozīds; 1. attēls) ir dabā sastopams hidrohinona atvasinājums (molekulmasa 272 Da), kas atrodas dažāda veida augos. Augsts arbutīna līmenis tika konstatēts augos, tostarp majorānā (Origanum majorana, Lamiaceae) un bumbieros (Pyrus communis, Rosaceae), un jo īpaši Ericaceae dzimtā, piemēram, lāču lapās (Arctostaphylos uva-ursi) (9). Arbutīnam ir dažādas bioloģiskas aktivitātes. Piemēram, var izmantot arbutīnu
kā ādas balināšanas līdzeklis; inhibējot tirozināzes aktivitāti melanosomās, tika konstatēts, ka arbutīns veicina depigmentāciju (10, 11). Iepriekšējais pētījums parādīja, ka arbutīnam var būt aizsargājoša loma no rentgena starojuma izraisītas apoptozes, samazinot hidroksilradikāļu intracelulāro līmeni (12). Turklāt arbutīns var kavēt osteoklastu diferenciāciju, samazinot superoksīda intracelulāro līmeni un samazinot aktivēto T šūnu kodolfaktoru 1 (13). Tomēr arbutīna ietekme uz osteoblastu darbību joprojām nav zināma. Tāpēc šī pētījuma mērķis bija izpētīt arbutīna ietekmi un mehānismus uz MC3T3-E1 peles osteoblastu prekursoru šūnu proliferāciju un diferenciāciju.
Wnt signālu ceļš var tieši un netieši ietekmēt osteoblastus un osteoklastus, palielinot kaulu veidošanos un samazinot kaulu rezorbciju (14). Kanoniskā Wnt signalizācija var regulēt osteoblastu proliferāciju, diferenciāciju un darbību vairākos līmeņos (15). Dzīvnieku modeļos Wnt/-catenin signalizācijas ceļa inhibitoru aktivitātes samazināšana, izmantojot antivielas pret izdalīto frizzled proteīnu saistītu proteīnu 1, sklerostīnu un dickkopf WNT signalizācijas ceļa inhibitoru 1 (DKK1) un glikogēna sintāzes mazmolekulāru inhibitorus. kināze 3 (GSK-3 ) var palielināt kaulu masu un samazināt lūzumu risku (16). Tāpēc Wnt signalizācijas ceļš ir potenciāls terapeitiskais mērķis jaunu medikamentu izstrādei osteoporozes ārstēšanai (17). Šajā pētījumā tika pētīta arbutīna ietekme uz MC3T3-E1 šūnu proliferāciju un diferenciāciju. Turklāt tika pārbaudīts molekulārais mehānisms, kas ir pamatā arbutīna funkcijai, inducējot MC3T3-E1 šūnu diferenciāciju.
materiāli un metodes
Ķimikālijas. Arbutīns (tīrības pakāpe, lielāka vai vienāda ar 98 procentiem) tika iegādāts no Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, Ķīna), izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmštate, Vācija) un uzglabāts koncentrācija 0,5 M. Rekombinants cilvēka DKK1 tika iegādāts no PeproTech, Inc. (Rokihila, NJ, ASV; kat. Nr. 120-30).
Šūnu kultūra. MC3T3-E1 peles kalvārijas pre-osteoblasti tika iegādāti no Ķīnas Zinātņu akadēmijas Šanhajas Bioloģijas zinātņu institūta Šūnu resursu centra (Šanhaja, Ķīna) un tika kultivēti minimāli nepieciešamajā vidē (-MEM; HyClone; GE Healthcare). Life Sciences, Logan, UT, ASV), kas papildināts ar 10 procentu liellopu augļa serumu (FBS; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Izraēla), 100 µg/ml streptomicīna un 100 V/ml penicilīns (HyClone; GE Healthcare Life Sciences). Šūnas tika turētas šūnu kultūras inkubatorā ar 5 procentiem CO2 37 °C temperatūrā. Barotne tika nomainīta katru otro dienu. 80 procentu saplūšanas šūnas tika atkārtoti iesētas audu kultūras kolbās pēc apstrādes ar 0,25 procentiem tripsīnu (HyClone; GE Healthcare Life Sciences) 1–2 minūtes 37 °C temperatūrā. Osteoblastiskās diferenciācijas eksperimentos šūnas tika apstrādātas ar osteogēnu piedevu, kas satur 50 µg/ml L-askorbīnskābi (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) un 10 mM -glicerofosfāta dinātrija sāls hidrātu (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) 9 dienas 37 gadu vecumā. ˚C. Mehānistiskos pētījumos MC3T3-E1 šūnas tika iepriekš apstrādātas ar DKK1 (0,5 µg/ml) 6 stundas 37 °C temperatūrā un pēc tam 3 dienas 37 °C temperatūrā tika apstrādātas ar arbutīnu (100 µM).
Šūnu proliferācija. Lai novērtētu arbutīna ietekmi uz šūnu proliferāciju, tika izmantots šūnu skaitīšanas komplekta{{0}} tests (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japāna). Šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 5x103 šūnas/iedobē 24 stundas 37 °C temperatūrā. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar arbutīnu dažādās koncentrācijās (0, 10, 50 un 100 µM). Pēc 24, 48 vai 72 stundām šūnas tika apstrādātas ar 9,1% CCK-8 šķīdumu, kas satur 10 µl CCK-8 un 100 µl -MEM, 1–2 stundas 37 °C temperatūrā. Katras iedobes optiskā blīvuma vērtība tika mērīta, izmantojot mikroplašu lasītāju (ELx808; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, ASV) pie viļņa garuma 450 nm. Relatīvā šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta kā attiecība starp parauga un kontroles vidējo absorbciju.
5-etinil-2'-dezoksiuridīna (EdU) marķēšanas tests. Arbutīna ietekme uz šūnu proliferāciju tika mērīta, izmantojot EdU Apollo®567 in vitro attēlveidošanas komplektu (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, Ķīna). Šūnas tika inokulētas 96-iedobes plāksnē ar blīvumu 1x103 šūnas/iedobē un inkubētas -MEM, kas satur 10 procentus FBS ar 0, 10, 50 vai 100 µM. arbutīns. Pēc 72-h inkubācijas katrā iedobē tika pievienots EdU ar koncentrāciju 50 µM pirms papildu inkubācijas 2 stundas 37 °C temperatūrā. Šūnas divas reizes mazgāja ar PBS un fiksēja ar PBS, kas satur 4 procentus paraformaldehīda, 30 minūtes istabas temperatūrā (RT). Pēc mazgāšanas ar glicīnu (2 mg/ml) un PBS šūnas tika permeabilizētas ar Triton X‑100 (0,5 procenti) 10 minūtes RT. Šūnas tika inkubētas ar 1X Apollo krāsošanas reakcijas šķidrumu RT 30 minūtes tumsā. Šūnu kodoli tika iekrāsoti ar 1X Hoechst 33342 30 minūtes RT. EdU pozitīvās šūnas tika vizualizētas ar fluorescences mikroskopiju (palielinājums, x200; Eclipse Ti; Nikon Corporation, Tokija, Japāna) piecos nejauši izvēlētos laukos.
Šūnu cikla un apoptozes analīze. MC3T3-E1 šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs ar blīvumu 2x105 šūnas/iedobē. Pēc 24-h ilgas inkubācijas šūnas tika apstrādātas ar arbutīnu koncentrācijās 0, 10, 50 un 100 µM. Šūnas tika novāktas pēc 3 dienām RT un fiksētas ar 70% etanolu 12 stundas 4 °C temperatūrā. Šūnas trīs reizes mazgāja ar PBS un 30 minūtes 37 °C tumsā krāsoja ar propīdija jodīda (PI) krāsošanas šķīdumu (Beyotime Biotechnology Institute, Haimen, Ķīna). DNS saturs tika mērīts, izmantojot FACSCalibur plūsmas citometru (BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV) ar CellQuest Pro programmatūru (versija 5.2; BD Biosciences) un ModFit LT programmatūru (versija 3.0; Verity Software House, Inc., Topsham, ME, ASV). Apoptozes analīzei šūnas, kas apstrādātas ar arbutīnu, tika novāktas un iekrāsotas ar fluoresceīna izotiocianātu, kas marķēts ar anneksīnu-V un P I (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) tumsā 15 minūtes RT. Šūnu apoptozes ātrums tika novērtēts, izmantojot FACSCalibur plūsmas citometru (BD Biosciences) ar programmatūru CellQuest Pro (versija 5.2; BD Biosciences).
Sārmainās fosfatāzes (ALP) krāsošanas tests. Osteoblastus iesēja {{0}}iedobju plāksnēs ar blīvumu 5x104 šūnas/iedobē, inkubēja -MEM, kas satur osteogēnu papildinājumu, un apstrādāja ar 0 (kontrole), 10, 50 vai 100 µM arbutīnu. Pēc 9 dienām 37 °C temperatūrā šūnas trīs reizes mazgāja ar PBS un fiksēja 4% paraformaldehīdā RT 10 minūtes. Šūnas trīs reizes skaloja ar destilētu ūdeni un pēc tam 2 h iekrāsoja, izmantojot 5-brom-4-hlor-3-indolilfosfāta/nitrozilā tetrazolija hlorīda ALP krāsu izstrādes komplektu (Beyotime Institute of Biotechnology). pie RT. Krāsotās šūnas tika attēlotas, izmantojot gaismas mikroskopu (palielinājums, x40; Eclipse Ti; Nikon Corporation).
Reversās transkripcijas kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija (RT-qPCR). Šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2x105 šūnas/iedobē. Pēc apstrādes ar arbutīnu dažādās koncentrācijās 3 dienas 37 °C temperatūrā kopējā RNS tika ekstrahēta no MC3T3-E1 šūnām, izmantojot RNAiso Plus reaģentu (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Ķīna). Kopumā 1 µg RNS tika reversi transkribēts cDNS, izmantojot PrimeScript RT reaģentu komplektu ar gDNA Eraser (Takara Biotechnology Co., Ltd.), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Reakcijas apstākļi bija šādi: 42˚C 2 minūtes, 37˚C 15 minūtes un 85˚C 5 sekundes. qPCR tika veikta, izmantojot vienādus cDNS daudzumus no katra parauga 20 µl kopējā tilpumā ar ABI 7500 Fast Real-Time PCR sistēmu (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ASV), izmantojot SYBR premiksu Ex Taq II (Takara). Biotechnology Co., Ltd.). Tika izmantoti šādi termociklēšanas apstākļi: sākotnējā denaturācija 95 ˚C 30 sekundes, kam sekoja 40 cikli 95 ˚C 5 sekundes un 60 ˚C 34 sekundes. Pastiprināšanas specifika tika novērtēta ar kušanas līknes analīzi, un -aktīns kalpoja kā iekšējā kontrole. Relatīvie gēnu ekspresijas līmeņi tika analizēti, izmantojot 2-ΔΔCq metodi (18). Izmantoto praimeru secības bija šādas: ar runtu saistīts transkripcijas faktors 2 (RUNX2), priekšējais 5'-CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3', reversais 5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG-3'; kolagēna I tipa 1 ķēde (COL1A1), uz priekšu 5'-GCCTCCCAGAACATC ACCTA-3', reversā 5'-GCAGGGACTTCTTGAGGTTG-3';kaulu -karboksiglutamāta proteīns (BGLAP), priekšējais 5'-CGCTACCTTGGAGCCTCAGT-3', reverss 5'-AGGCGGTCTTCAAGCCATAC-3”; Sp7 transkripcijas faktors (SP7), uz priekšu5'-AAGGTGTACGGCAAGGCTTC-3', reverss 5'-CGTCAGAGCGAGTGAACCTC-3”; -katenīns, uz priekšu 5'-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3', reverss 5'-CTTGCCACTCAGGGAAGGA-3'; -aktīns, uz priekšu 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', reverss 5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
Western blot analīze. MC3T3-E1 šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2x105 šūnas/iedobē. Šūnas 3 dienas apstrādāja ar arbutīnu dažādās koncentrācijās un trīs reizes skaloja ar ledus aukstu PBS. Kopējais šūnu proteīns tika ekstrahēts no MC3T3-E1 šūnām, izmantojot radioimūnprecipitācijas testa līzes buferi (Beyotime Institute of Biotechnology), kas satur 1 mM fenilmetilsulfonilfluorīdu. Olbaltumvielas tika izolētas pēc centrifugēšanas ar ātrumu 13 800 xg 15 minūtes 4 °C temperatūrā. Olbaltumvielu koncentrācija tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot bicinhonīnskābes proteīna testa komplektu (Beyotime Biotehnoloģijas institūts). Vienāds daudzums olbaltumvielu (20-30 µg) katrā paraugā tika atdalīts ar 10% SDS-PAGE 2 stundas ar nemainīgu spriegumu (110 V) un pārnests uz polivinilidēnfluorīda (PVDF) membrānu (EMD Millipore, Billerica, MA, ASV). Membrānas tika bloķētas TBS plus Tween-20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5 un 0,1% Tween-20), kas satur 5 procentus beztauku piena istabas temperatūrā 2 stundas, un pēc tam inkubēja nakti plkst. 4˚C ar atbilstošām primārajām antivielām. Izmantotās antivielas bija šādas: truša monoklonālais anti- -katenīns (1:5,000; kat. nr. ab32572; Abcam, Kembridža, MA, ASV), truša poliklonālais anti-RUNX2 (1: 1,000; kat. nr. ab23981; Abcam) un peles poliklonālais anti- -aktīns (1:1,000; kat. nr. AF0003; Beyotime Biotehnoloģijas institūts). Pēc tam membrānas trīs reizes nomazgāja ar TBST un PVDF membrānas inkubēja ar mārrutku peroksidāzi (HRP) konjugētu kazas anti-trušu imūnglobulīnu G (IgG; 1:10, 000; kat. nr. ZB{{). 52}}; OriGene Technologies, Inc., Pekina, Ķīna) vai ar HRP konjugētu kazu anti-peles IgG (1:10 000; kat. nr. ZB-2305; OriGene Technologies, Inc.) RT 2 h . Olbaltumvielas tika vizualizētas, izmantojot Enhanced Chemiluminescence reaģentus (Thermo Fisher Scientific, Inc.), un tika konstatētas ar hemiluminiscences noteikšanas sistēmu (Amersham Imager 600; GE Healthcare Life). Olbaltumvielu daudzums tika noteikts, izmantojot ImageJ programmatūru (versija 1.52; Nacionālie veselības institūti, Bethesda, MD, ASV). Pēc normalizācijas relatīvie proteīna ekspresijas līmeņi tika aprēķināti ar -aktīnu kā iekšējo kontroli.
Statistiskā analīze. Visi eksperimenti tika atkārtoti neatkarīgi vismaz trīs reizes. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., Lajolla, CA, ASV). Dati tiek parādīti kā vidējā ± standartnovirze, un būtiskas atšķirības tika analizētas ar vienvirziena dispersijas analīzi, kas apvienota ar Daneta post hoc testu. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
Rezultāti
Arbutīns veicina MC3T3-E1 šūnu proliferāciju. Arbutīna ietekme uz MC3T3-E1 šūnu proliferāciju tika pārbaudīta, izmantojot CCK-8 testu. Arbutīns tika ievadīts dažādās koncentrācijās (0, 10, 50 un 100 µM) 24, 48 un 72 stundas, un tika veikts CCK-8 tests (2.A att.). Pēc 24 stundām statistiskas atšķirības osteoblastu proliferācijā netika konstatētas, salīdzinot ar neapstrādātajām kontroles šūnām. Tomēr MC3T3-E1 šūnu proliferācija ievērojami palielinājās pēc apstrādes ar arbutīnu 100 µM pēc 48 un 72 stundām. EdU marķēšanas tests tika veikts pēc 72 stundām, un rezultāti parādīja, ka EdU pozitīvo MC3T3-E1 šūnu procentuālais daudzums, kas apstrādāts ar arbutīnu koncentrācijā 50 un 100 µM, ir ievērojami palielināts, salīdzinot ar neapstrādātu kontroli (2.B un C attēls). .
Arbutīns paātrina šūnu cikla progresēšanu. Arbutīna ietekme uz šūnu cikla progresēšanu tika novērtēta, izmantojot šūnu cikla analīzi (3. att.). Apstrāde ar arbutīnu 50 un 100 µM izraisīja šūnu procentuālā daudzuma palielināšanos S fāzē (3.A un C att.), un 100 µM arbutīna rezultātā samazinājās šūnu procentuālais daudzums G1- fāzē ( 3D att.). Netika konstatētas statistiski nozīmīgas atšķirības 10 µM grupā, salīdzinot ar kontroles grupu. Arbutīna ietekme uz MC3T3-E1 apoptozi tika novērtēta arī, izmantojot plūsmas citometriju (3.B un E att.). Apoptozes ātrums pēc apstrādes ar arbutīnu 10, 50 un 100 µM, salīdzinot ar kontroli, būtiski nemainījās.
Arbutīna ietekme uz ALP aktivitāti. Arbutīna ietekme uz osteoblastu diferenciāciju tika analizēta ar ALP krāsošanu. Pēc 9 dienām apstrāde ar dažādām arbutīna koncentrācijām (0, 10, 50 vai 100 µM) ievērojami palielināja ALP aktivitāti salīdzinājumā ar kontroles grupu (4.A att.). Šie atklājumi liecina, ka arbutīns var palielināt ALP aktivitāti MC3T3-E1 šūnās.
Arbutīna ietekme uz COL1A1, katenīna, RUNX2, BGLAP un SP7 mRNS ekspresijas līmeņiem. COL1A1, -katenīna, RUNX2, BGLAP un SP7 mRNS ekspresijas līmeņi tika novērtēti MC3T3-E1 šūnās, izmantojot RT-qPCR pēc apstrādes ar arbutīnu dažādās koncentrācijās (0, 10, 50 vai 100 µM). 3 dienas. COL1A1 un -katenīna ekspresijas līmenis palielinājās osteoblastos, kas tika ārstēti ar 10, 50 un 100 µM arbutīna, salīdzinot ar neapstrādātām šūnām (4.B un C att.). RUNX2, BGLAP un SP7 ekspresijas līmeņi ievērojami palielinājās pēc apstrādes ar arbutīnu pie 50 un 100 µM (att. 4D-F).
Arbutīna ietekme uz katenīna un RUNX2 olbaltumvielu ekspresijas līmeni. Lai izpētītu arbutīna izraisītās osteoblastu diferenciācijas pamatā esošos mehānismus, RUNX2 un katenīna proteīna ekspresijas līmeņi tika pārbaudīti MC3T3-E1 šūnās ar Western blot metodi (5.A un B att.). Ārstēšana ar arbutīnu pie 100 µM ievērojami palielināja -katenīna un RUNX2 proteīna ekspresijas līmeņus osteoblastos, salīdzinot ar kontroli (attiecīgi 5.C un D attēls). Šie rezultāti liecināja, ka arbutīns var ietekmēt osteoblastu diferenciāciju, regulējot -katenīna un RUNX2 proteīna ekspresijas līmeni. Lai noskaidrotu, vai arbutīns stimulē osteoblastisko diferenciāciju, izmantojot Wnt/-catenin signalizācijas ceļu, MC3T3-E1 šūnas tika apstrādātas ar 0,5 µg/ml DKK1 6 stundas pirms apstrādes ar 100 µM arbutīnu.
DKK1 ievērojami inhibēja arbutīna izraisīto RUNX2 proteīna ekspresiju (5. E att.). Pašreizējie rezultāti liecināja, ka arbutīns var ietekmēt osteoblastu diferenciāciju, izmantojot Wnt / -catenin signalizācijas ceļu.
Diskusija
Osteoporoze var izraisīt nopietnus lūzumus un invaliditāti, un tā ir ar vecumu saistīta problēma visā pasaulē (19). Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka nelīdzsvarotība starp osteoklastiem un osteoblastiem kaulu veidošanā un rezorbcijā var izraisīt osteoporozi (20). Jo īpaši kaulu veidošanās ir atkarīga no osteoblastu proliferācijas un diferenciācijas (21, 22).
Vairākas pieejamās zāles, ko izmanto osteoporozes ārstēšanai, ir pretresorbcijas zāles (23); tomēr šīs ārstēšanas metodes nespēj novērst kaulu zudumu (24). Anaboliskie līdzekļi, kas stimulē kaulu veidošanos, var atjaunot stipri bojātu skeleta mikrostruktūru un kaulu masas zudumu (24). Teriparatīds ir viens no anaboliskajiem līdzekļiem, kas stimulē kaulu veidošanos, un klīniskie pētījumi parādīja, ka ārstēšana ar teriparatīdu samazināja jaunu skriemeļu lūzumu risku un palielināja kaulu minerālo blīvumu gūžas, mugurkaula jostas daļā un augšstilba kaklā (25). Jo īpaši teriparatīds ir dārga ārstēšana. Tāpēc ir svarīgi izstrādāt jaunas zāles, kas var efektīvi veicināt kaulu veidošanos.
Arbutīns ir citoprotektīvs līdzeklis, un augstās koncentrācijās tam nav būtiskas citotoksiskas iedarbības (26). Lai gan arbutīna koncentrācija asinīs nav skaidra (13), arbutīnu lieto kā urīna pretmikrobu līdzekli un uzskata par drošu perorālu līdzekli (27, 28). Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka arbutīnam var būt vairākas aktivitātes, tostarp ādas balināšana (10, 11), pretiekaisuma (29), pretvēža (30) un osteoklastu diferenciācijas nomākšana (13). Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai izpētītu arbutīna ietekmi uz osteoblastiem un tā potenciālu izmantot kā jaunu savienojumu osteoporozes ārstēšanai. Tāpēc šajā pētījumā tika pētīta arbutīna ietekme uz MCET3-E1 šūnu proliferāciju un diferenciāciju un mehānismi, kas ir pamatā arbutīna funkcijai in vitro.
Kaulu veidošanās ir saistīta ar osteoblastu skaitu un atsevišķu osteoblastu aktivitāti (31). Osteoblastu skaitu var palielināt, veicinot pre-osteoblastu replikāciju vai diferenciāciju vai samazinot nobriedušu osteoblastu šūnu nāvi (32). Šajā pētījumā arbutīns palielināja MC3T3-E1 šūnu proliferāciju, neietekmējot apoptozes ātrumu. Turklāt arbutīns palielināja šūnu cikla progresēšanu, pārvietojot šūnas no G1-fāzes uz S fāzi. Šie rezultāti liecināja, ka arbutīns var izraisīt osteoblastu proliferāciju.
ALP ir agrīns osteogēnas diferenciācijas marķieris (33). ALP ir saistīta ar skeleta pārkaļķošanos kaulu veidošanās laikā (34). Šajā pētījumā ALP krāsošanas rezultāti liecināja, ka osteoblastiem, kas tika ārstēti ar arbutīnu 10, 50 un 100 µM un ar osteogēnu piedevu 9 dienas, bija paaugstināta ALP aktivitāte, kas liecina, ka arbutīns var veicināt osteoblastu agrīnu diferenciāciju.
Ir pierādīts, ka osteoģenēzi regulē dažādi transkripcijas faktori, tostarp RUNX2 un SP7, un vairāki kauliem specifiski matricas proteīni, tostarp ALP,BGLAP un COL1A1 (35). RUNX2 un SP7 ir svarīgitranskripcijas faktori, kas saistīti ar osteoblastu diferenciācijukaulu veidošanās laikā (36). COL1A1 ir ārpusšūnumatricas proteīns, kas veicina kaulu atjaunošanos un osteosprādziena diferenciācija (37). BGLAP nav kolagēnskaulu matricas proteīns, kas regulē kaulu apriti un kaulumineralizācija (38). Šajā pētījumā tika konstatēts, ka arbutīnsvar izraisīt svarīgu mRNS ekspresijas līmeniosteogēnie regulatori, tostarp RUNX2, BGLAP, SP7 unCOL1A1. Turklāt izteiksmes līmenis -katenīns bijapalielinājies. Šie rezultāti liecināja, ka arbutīns var veicinātosteoblastiskā diferenciācija, izmantojot mehānismu, kas ietverWnt/ - katenīna signalizācija.
Wnt signalizācijas ceļš ietekmē kaulu veidošanos attīstības laikā un kaulu remodelāciju audu atjaunošanas laikā (39). Kanoniskais Wnt signalizācijas ceļš bijaidentificēts, ka to ierosina Wnt ligandu signalizācija šūnāvirsmas caur zema blīvuma lipoproteīnu receptoriemproteīns 5 vai 6 (Lrp5/6) un septiņu caurlaidību transmembrānasSaburzīts receptors (40). Mijiedarbība starp Wnt ligandiemun to receptori var inhibēt GSK3- citoplazmā,kas noved pie atbrīvošanas -katenīns, transkripcijas medikanoniskās Wnt signalizācijas ators. Pēc atbrīvošanas, - katenīnsvar iekļūt kodolā, tādējādi kontrolējot izteiksmitā mērķa gēnu līmeni (41). RUNX2 pieder Runtdomēna gēnu saime un ir iesaistīts transkripcijas faktorsosteoblastiskā diferenciācija (42). RUNX2 kalpo svarīgamloma vairāku signalizācijas ceļu koordinēšanā laikāosteoblastu diferenciācija (43). Iepriekšējais studiju dēmonsuzskata, ka kanoniskā Wnt signalizācija var tieši regulētRUNX2. Konkrēti, -catenin/HNF1 homeobox Akomplekss var aktivizēt RUNX2 ekspresijas līmeni,tādējādi veicinot kaulu veidošanos (44). DKK1 ir spēcīgsWnt inhibitors/ -katenīna kanoniskais ceļš, saistotiesuz Lrp5/6 (45,46). Šī pētījuma rezultāti liecinaka ārstēšana ar arbutīnu ievērojami palielināja proteīnuizteiksmes līmeņi RUNX2 un -katenīns MC3T3-E1šūnas, un DKK1 ievērojami samazināja proteīna ekspresijulīmeņa RUNX2. Pašreizējie rezultāti liecināja par toarbutīns var veicināt MC3T3-E1 šūnu diferenciāciju, izmantojot kanonisko Wnt/- katenīna ceļš.
Kopumā, cik autoriem ir zināms, šis pētījums ir pirmais, kas norāda, ka arbutīns var stimulēt MC3T3-E1 šūnu proliferāciju un diferenciāciju, izmantojot Wnt / -catenin signalizācijas ceļu. Tāpēc arbutīns var būt jauns potenciāls kandidāts osteoporozes ārstēšanai. Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noteiktu Wnt/-catenin signalizācijas ceļa īpašo lomu arbutīna izraisītā osteoģenēzē, tostarp katenīna fosforilācijā pie Ser675 (47); papildu informāciju par Wnt/-catenin signalizācijas lomu var iegūt, izmantojot Wnt agonistus. Nākotnē turpmākos pētījumos var izpētīt arbutīna spēju veicināt kaulu veidošanos in vivo.
Pateicības
Nav piemērojams.
Finansējums
Šo darbu atbalstīja Ķīnas Nacionālā dabas zinātnes fonda galvenā programma (granta Nr. 81370981) un Shengjing slimnīcas izcilais zinātniskais fonds.
Datu un materiālu pieejamība
Pašreizējā pētījuma laikā izmantotās un/vai analizētās datu kopas pēc pamatota pieprasījuma ir pieejamas no attiecīgā autora.
Autoru ieguldījums
QF, XM un LiY izstrādāja un izstrādāja eksperimentus. XM veica eksperimentus un uzrakstīja manuskriptu. SL, LiY, LeY un ML analizēja datus un kritiski pārskatīja manuskriptu. QF uzraudzīja visus pētījumus un pārskatīja manuskriptu. Visi autori izlasīja un apstiprināja galīgo manuskriptu.
Ētikas apstiprinājums un piekrišana dalībai
Nav piemērojams.
Pacienta piekrišana publicēšanai
Nav piemērojams.
Konkurējošas intereses
Autori paziņo, ka viņiem nav konkurējošu interešu.
Atsauces
1. Das S un Crockett JC: Osteoporoze — pašreizējais skatījums uz farmakoloģisko profilaksi un ārstēšanu. Drug Des Devel Ther 7435-448.2013.
2.Rachner TD, Khosla S un Hofbauer LC: Osteoporoze: tagad un nākotnē.Lancet 377: 1276-1287. 2011. gads.
3. Hernlund E, Svedbom A, Ivergard M, Compston J, Cooper CStenmark JMcCloskey EVJOnsson B unKanis JA: Osteoporosis the European Union: Medical management, epidemiology andeconomic burden. Sadarbībā ar starptautisko osteoporozes fondu (IOF) un Eiropas Farmācijas industrijas asociāciju federāciju (EFPIA) sagatavots ziņojums.Arch Osteoporos 8: 136.2013.
4. Cauley JA: Osteoporozes ietekme uz sabiedrības veselību. J Gerontol ABiol Sci Med Sci 68: 1243-1251.2013.
5. Manolagas SC un Jilka RL: kaulu smadzenes, citokīni un kaulu remodelācija. Jaunākie ieskati osteoporozes patofizioloģijā. N Engl J Med 332: 305-311. 1995. gads.
6. Baron R un Hesse E: Atjauninājums par kaulu anaboliku osteoporozes ārstēšanā: pamatojums, pašreizējais stāvoklis un perspektīvas. J ClinEndocrinol Metab 97: 311-325.2012.
7. TangDZ, Hou WZhou Q, ZhangM, HolzJ, SheuTJ, LiTF ChengSDShi O. Harris SE.et al: Osthole stimulē osteoblastu diferenciāciju un kaulu veidošanos, aktivizējot beta-katenīna-BMP signālu Bone Miner Res 25: 1234-1245 . 2010. gads.
8. Canalis E: atjauninājums jaunās osteoporozes anaboliskās terapijās. J Clin Endocrinol Metab 95: 1496-1504.2010.
9. Lamien-Meda A, Lukas B, Schmiderer C, Franz C un Novak J: Arbutīna kvantitatīvās pārbaudes validācija, izmantojot gāzu hromatogrāfiju Origanum majorana un Arctostaphylos uva-ursiextracts. Phytochem Anal 20: 416-420.200 .
10.Lim YJ, Lee EH, Kang TH, Ha SK, Oh MS, Kim SM, Yoon TJ.Kang C, Park JH un Kim SY: arbutīna inhibējošā iedarbība uz alfa melanocītu stimulējošā hormona izraisītas hiperpigmentācijas melanīna biosintēzi kultivētos brūnganos jūrascūciņu ādas audos. Arch Pharm Res 32: 367-373.2009.
11. Maeda K un Fukuda M: Arbutin: tā depigmentācijas darbības mehānisms cilvēka melanocītu kultūrā. J Pharmacol ExpTher 276: 765-769.1996.
12. Wu LH Li P Zhao OL. Piao JL Jiao YF Kadowaki M un Kondo T: Arbutin. intracelulārs hidroksila radikāļu uztvērējs aizsargā starojuma izraisītu apoptozi cilvēka limfomas U937 šūnās. Apoptoze 19: 1654-1663.2014
13. Omori A Yoshimura Y. Deyama Y un Suzuki K: rosmarīnskābe un arbutīns nomāc osteoklastu diferenciāciju, inhibējot superoksīda un NFATel pazeminātu regulēšanu RAW 264.7 šūnās Biomed Rep 3: 483-490.2015
14. Barons R un Kneissel M: WNT signalizācija kaulu homeostāzē un slimībās: no cilvēka mutācijām līdz ārstēšanai. Nat Med l9.{2}}.2013
15. Baron R un Rawadi G: Targetting the Wnt/beta-catenin pathway to regulaed bone form in the adult skeleton.Endocrinology 148: 2635-2643.2007.
16. Hoeppner LH Secreto FJ un Westendorf JJ: Wnt signalizācija kā terapeitisks mērķis kaulu slimībām. Ekspertu atzinums TherTargets 13: 485-496.2009.
17. Williams BO un Insogna KL: Kur devās Wnts: Lrp5 un Lrp6 signālu sprādzienbīstams lauks kaulos. J Bone Miner Res 24:171-178.2009
18. Livak KJ un Schmittgen TD: relatīvo gēnu ekspresijas datu analīze, izmantojot reāllaika kvantitatīvo PCR un 2(-Delta DeltaC(T) metodi Methods 25:402-408.2001.
19.Lin X. Xiong D. Peng YO. Šens ZF. Wu XY Wu XP Wu FYuan LO un Liao EY: Osteo slimību epidemioloģija un pārvaldība. poroze Ķīnas Tautas Republikā: pašreizējās perspektīvas.Clin Interv Aging 10: 1017-1033.2015.
20. Manolagas SC: Kaulu šūnu dzimšana un nāve: pamata regulēšanas mehānismi un ietekme uz osteoporozes patoģenēzi un ārstēšanu. Endocr Rev 21: 115-137.2000.
21.Liu S. Fang T. Yang L. Chen Z. Mu S un Fu O: Gastrodin aizsargā MC3T3-El osteoblastus no deksametazona izraisītas šūnu disfunkcijas un veicina kaulu veidošanos, inducējot NRF2 signālu ceļu. Int J Mol Med 41: 2059-2069.2018.
22. Yun HM Park KR. Quang TH Oh H. Hong JT. Kim YC un Kim EC: 2,4.5-Trimetoksildalbergihinols veicina osteoblastu diferenciāciju un mineralizāciju, izmantojot BMP un Wnt/B-katenīna ceļu. Cell Death Dis 6: el819. 2015. gads.
23. Cosman F Nieves JW and Dempster DW: Treatment sequence1718.22.matters: Anabolic and antiresorbtive therapy for osteoporosis Bone Miner Res 32: 198-202.2017
24.Uihlein AV and Leder BZ: Anabolic therapies for osteoporosis.Endocrinol Metab Clin North Am 41: 507-525.2012.
25. Nakamura T. Sugimoto T. Nakano T. Kishimoto H. Ito MFukunaga MHaginoH Sone T. Yoshikawa Nishizawa Y.eralRandomizēts teriparatīds (cilvēka parathormons (PTH1-341 Reizi nedēļā efektivitātes izpētes (TOWER)) samazināšanas izmēģinājums in examining jauni skriemeļu lūzumi subjektiem ar primāru osteoporozi un augstu lūzumu risku.J Clin Endocrinoetab 97: 3097-3106.2012
26. Jurica K BrCic Karabonji l, Mikolic A, Milcjkowic-Opsenica DBenkovic V un Kopjar N: Zemeņu koka (Arbrrfus redo L) ūdenslapu ekstrakta un arbutīna cilvēka perifēro asiņu limfocītu drošības novērtējums in vitro. Citotehnoloģija 70: 1261-1278.2018
27. Schindler G. Patzak U Brinkhaus B. uzvarēja Niecieck A. Wittig JKrihmer N Glockl land Veit M: Urinary excretion and Metabo. arbutīna saraksts pēc perorālas Arctosfaphylos reversi ekstrakta kā apvalkotās tabletes un ūdens šķīduma lietošanas veseliem cilvēkiem. J Clin Pharmacol 42: 920-927.2002.
28. Genowese C Davinelli S. Mangano K, Tempera G, Nicolosi D. Corsello S. Vergalito F Tartaglia E. Scapagnini G andDi Marco R: Ietekme uz jaunu augu ekstraktu un d-mannozes kombināciju nekomplicētu atkārtotu urīnceļu ārstēšanai infekcijas. J Chemother 30: 107-114. 2018. gads
29. Lee HJ un Kim KW: arbutīna pretiekaisuma iedarbība lipopolisaharīdu stimulētās BV2 mikroglia šūnās. InfiammRes 61: 817-825.2012.
30. Jiang L. Wang D Zhang Y. Li J. Wu Z. Wang Z un Wang D. Arbutīna un tā acetilētā atvasinājuma proapoptotiskās iedarbības izpēte uz peles melanomas šūnām. Int J Mol Med 41:1048-1054.2018
31. Marie PJ un Kassem M: Osteoblasti osteoporozes gadījumā: pastemerging un nākotnes anaboliskie mērķi. Eur J Endocrinol 165:1-10.2017
32. Canalis E: Endokrīno slimību pārvaldība: jauni anaboliskie osteoporozes ārstēšanas veidi. Eur J Endocrinol 178: R33-R44. 2018. gads
33. Weinreb M Shinar D un Rodan GA: dažāda modeļa sārmainās fosfatāzes, osteopontīna un osteokalcīna ekspresija žurku kaula attīstībā, kas vizualizēta ar in situ hibridizāciju. J BoneMiner Res 5: 831-842.1990.
34. Kima JJ. Lee MH Wozney JM Cho JY un Ryoo HM: kaulu morfoģenētisko proteīnu -2-inducēto sārmainās fosfatāzes ekspresiju stimulē Dlxs un nomāc Msx2. J BioChemm 279: 50773-50780.2004
35. An JYang H Zhang O. Liu C. Zhao J. Zhang L un Chen BDabiski produkti osteoporozes ārstēšanai: ietekme un mehānismi osteoblastu mediētās kaulu veidošanās dzīves veicināšanā Sci 147: 46-58.2016.
36.Kobavashi T un K ronenbere H: Minireview: Transkripcijas regulēšana kaulu attīstībā.Endocrinoloey 146: 1012-1017.2005.
37. Cathev un Reddy ABaltordal.oiczThrombospondin-2 atvieglo I tipa kolagēnu bagātas matricas salikšanu smadzeņu stromas šūnās, kurās tiek veikta osteoblastiska atšķirīga stacija. Connect Tissue Res 54: 275-782.2013
38. Neve A. Corrado A un Cantatore FP: Osteocalcin: Skeletal and extra-skeletal effects J Cell Physiol 228: 1149-1153.2013
39. Wang Y.Li YP Paulson C, Shao Jz, Zhang X Wu M un Chen devās un Wnt signalizācijas ceļu kaulu attīstībā un slimībās. Front Biosci (Landmark Edit) 19: 379-407.2014
40.MacDonald BT. Tamai K un He X: Wnt/beta-katenīna signalizācijas komponenti. mehānismi. un slimības. Dev Cel1 17: 9-26. 2009. gads
41. Kramer l.Halleux C, Keller H, Pegurri M, Gooi JHWeber PB. Fengs JO. Bonewald LF un Kneissel M: normālai kaulu homeostāzei ir nepieciešama OsteocytWnt / beta-katenīna signalizācija. Mo Cel1 Biol 30: 3071-3085.2010
42. Ducy P Schinke T un Karsenty G: Osteoblasts: sarežģīts fibroblasts centrālā uzraudzībā. Science 289:1501-1504.2000
43. Franceschi RI un Xiao G: Osteoblastiem specifiskā transkripcijas faktora regulēšana. RUNX2: reaģētspēja uz vairākiem si gnaltransdukcijas ceļiem. J Cell Biochem 88: 446-454.2003
44. Gaur T, Lengner Cl, Howhannisyan H, Bhat RA, Bodine PVKomm BS. Javed A. van Wijnen AJ. Šteins JL. Stein GS Lian JB: Kanoniskā WNT signalizācija veicina osteoģenēzi, tieši stimulējot Runx2 gēna ekspresiju. J Biol Chem 280:33132-33140.2005
45. Kawano Y un Kypta R: izdalītie Wnt signalizācijas ceļa antagonisti. J Cel1 Sci 116: 2627-2634.2003
46.Daoussis D un Andonopoulos AP: otDickkopf-l jaunā loma kaulu bioloģijā: vai tas ir galvenais slēdzis, kas kontrolē kaulu un locītavu remodelēšanu? Semin Arthritis Rheum 41: 170-177.2011
47. Taurin S.Sandbo N. Qin Y. Browning D un Dulin NO: beta-katenīna fosforilēšana ar ciklisku AMP atkarīgu proteīnkināzi. J Biol Chem 281: 9971-9976.2006
Plašāka informācija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
