Atriplex Canescens ir jauns Cistanche Deserticola saimnieks

Kontaktpersona: emily.li@wecistanche.com

Fangmings Vangs u.c

Abstrakts

Cistanche deserticolaTradicionālajā ķīniešu medicīnā ir vēsturiski izmantots nieru (jaņ) funkcijas papildināšanai, asins un esences uzlabošanai, kā arī zarnu mitrināšanai, lai izvadītu izkārnījumus. Tās saimnieks Haloksilons ammodendrons ir svarīgs pionieris, ko izmanto vējlauzēm un smilšu kāpu nostiprināšanai, kas ir stratēģijas, ko izmanto pārtuksnešošanās kontrolei. Ilgu laiku tika uzskatīts, ka C. deserticola var parazitēt tikai H. ammodendron. Šajā pētījumā tika veikti morfoloģiskās identifikācijas, gēnu svītrkodu identifikācijas un inokulācijas eksperimenti, un mēs beidzot atklājām, ka C. deserticola var arī parazitēt Atriplex canescens. A. canescens ir Chenopodiaceae suga ar plašu pielāgošanās spēju. Salīdzinot ar H. ammodendron, tam ir lielāka biomasa un plašāks ekoloģiskās pielāgošanās spēju diapazons, kas padara to piemērotāku C. deserticola rūpnieciskai ražošanai. Turklāt mēs arī atklājām, ka C. deserticola, kas parazitē uz A. canescens, aktīvo komponentu koncentrācija bija augstāka nekā tiem, kas parazitēja uz H. ammodendron; šis atklājums vēl vairāk liecina, ka C. deserticola izmantošana plašākā mērogā prasa turpmāku izpēti.

Atslēgvārdi:Cistanche deserticola, Parazītisms, DNS svītrkoda identifikācija, Tradicionālā ķīniešu medicīna, Cistanche salsa

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par cistanche

1. Ievads

Cistanche lietošana tradicionālajā ķīniešu medicīnā pirmo reizi tika reģistrēta Shennong Herbal Scriptures, jo tā ietekmetonēšananieresjaņ, veicinotuzbūtībanoasinis, unmitrināšanauzzarnaslai atvieglotu izkārnījumu izvadīšanu. Tas ir ierakstīts arī senās augu medicīnas darbos kā "tuksnesisžeņšeņs'. Cistanche deserticola YC Ma un Cistanche tubulosa (Schenk) Wight sausie gaļīgie stublāji un zvīņainās lapas ir pirmās Ķīnas farmakopejā aprakstītās locītavas 2005. gadā. Cistanche galvenokārt audzē Sjiņdzjanā, Iekšējā Mongolijā un Ķīnas Gansu, un visā pasaulē tā ir sastopama pussausos un sausos apgabalos visā Eiropas Ibērijas pussalā, Ziemeļāfrikā, Arābijā, Irānā, Afganistānā, Pakistānā, Ziemeļindijā, Mongolijā u.c. al. [1]. Tas ir izturīgs pret skarbiem vides apstākļiem, piemēram, ārkārtīgi sausu klimatu, lielām temperatūras svārstībām un noplicinātām augsnēm [2]. Saskaņā ar Ķīnas augstāko augu taksonomisko indeksu Ķīnā ir sešas Cistanche sugas. Tomēr turpmāks pētījums apstiprināja tikai četru Cistanche sugu un viena varianta esamību, proti, C. deserticola YC Ma, C. tubulosa (Schenk) R. Wight, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, C. sinensis G. Beck un C. salsa var. albiflflora PF Tu et al., [3].

C. deserticola tiek uzskatīta par vienīgo tradicionālo Cistanche avotu, un tai ir ilga izmantošanas vēsture medicīnā, kopš Austrumu Haņu dinastijas (25. m.ē.–220. g.) [4]. Materia Medica apkopojumā (ko sarakstījis Li Šidžens, Ming dinastija) tika dokumentēts, ka tas vienmērīgi tonizē jaņ (atšķirībā no citiem augiem, kuriem ir enerģiskāka iedarbība). Ar modernām fitoķīmiskām metodēm no C. deserticola ir izdalīta virkne efektīvu ķīmisko sastāvdaļu, tostarp feniletanoīdu glikozīdi, iridoīdi, lignāni, alditoli, oligosaharīdi, polisaharīdi un alkaloīdi [5]. Farmakoloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka fenetilglikozīds ir galvenā aktīvā sastāvdaļa, un ir ziņots, kauzlabotseksuālafunkciju, pieliktneiroprotektīvsefekti, uzlabotmācīšanāsunatmiņa, unaizsargātuzaknas. Tam ir arī terapeitiska iedarbība pret demenci,Alcheimera slimībaslimība, Parkinsona slimība slimība, nogurums, unaudzējikopā ar eksponātiemanti-iekaisīgsunimūnmodulējošaīpašības [6, 7].

C. deserticola ir obligāts parazītaugs, kas dzīvo tikai uz Haloxylon ammodendron [8] saknēm. Pētījumā tika ziņots, ka C. deserticola nav sastopama pat Haloxylon persicum [9]. Pēdējos gados arvien lielāka uzmanība tiek pievērsta C. deserticola, jo tā ir ne tikai ārstniecisku sastāvdaļu avots, bet arī sniedz lielu ieguldījumu pārtuksnešošanās kontrolē [10]. H. ammodendron ir vienīgais saimnieks, kas izmantots pētījumos ar C. deserticola. 2017. gada aprīlī Vans Šuai, Zhejiang Quheng sabiedriskās labklājības fonda darbinieks, uzsēja C. deserticola sēklas uz Atriplex canescens Minqin tuksneša botāniskajā dārzā, Gansu provincē, un tika konstatēts, ka C. deserticola zied 2018. gada maijā un turpināja. ziedēt līdz 2019. gada maijam. Tomēr sēklas tika iegādātas tirgū, un ir šaubas, vai tās patiešām bija C. deserticola sēklas. Turklāt šī parādība sagrauj tradicionālās zināšanas un ir jāpēta tālāk

A. canescens ir C4 daudzgadīgs krūms, kura dzimtene ir Dienvidrietumu Amerikas tuksneši un ātri pielāgojas sāļuma, smago metālu, sausuma un augstas temperatūras apstākļiem [11]. Tā kā tas ir ļoti garšīgs un bagāts ar barības vielām, to izmanto kā lopbarību lielākajai daļai mājlopu un lielu dzīvnieku [12]. Turklāt tas ir īpaši noderīgs erozijas kontrolei un nomaļu zemju meliorācijai, pateicoties izcilai pielāgošanās spējai un plašajai sakņu sistēmai. Tas pirmo reizi tika ieviests Ķīnā no Amerikas Savienotajām Valstīm 1989. gadā un ir plaši izmantots augsnes un ūdens saglabāšanai, smilšu nostiprināšanai un sāļu zemes atjaunošanai [13]. Lai gan pētījums par C. deserticola augšanu uz A. canescens apgāž ekskluzīvo izpratni par C. deserticola, tas varētu izrādīties revolucionārs atklājums, jo A. canescens ir piemērotāks C. deserticola augšanai, jo tas ir lielāka biomasa un plašāks ekoloģiskās pielāgošanās spēju diapazons salīdzinājumā ar H. ammodendron.

Lai nodrošinātu nejaušā atklājuma precizitāti, tika veikti augu identifikācijas un mākslīgās inokulācijas eksperimenti. Tradicionālā augu identifikācija ietver organoleptisko novērtēšanu (piemēram, pieskārienu, smaržu, redzi un garšu), morfoloģisko īpašību analīzi (piemēram, mikroskopisko un makroskopisko) un ķīmisko profilēšanu (piemēram, augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju, plānslāņa hromatogrāfiju un gāzi). hromatogrāfija) [14]. C. tubulosa un C. Sinensis ir salīdzinoši vienkārši izslēgt, jo stumbra asinsvadu kūlīši atšķiras pēc izmēra, krāsas un izvietojuma. Patiesais izaicinājums ir atšķirt C. deserticola no C. salsa. Saskaņā ar Ķīnas floru, C. salsa seglapas garums ir aptuveni 1/3 no vainaga, savukārt C. deserticola tas ir vienāds. Mīksto stublāju šķērsgriezums ir līdzīgs starp C. deserticola un C. salsa un sastāv no epidermas, garozas, asinsvadu kūlīšiem un serdes. Galvenā atšķirība ir asinsvadu kūlīša apvalkā, jo C. deserticola tā ir astes forma, bet C. salsa – trīsstūrveida vai pusapaļa.

Pēdējos gados DNS svītrkodēšanas tehnoloģija ir bieži izmantota sugu identificēšanai. Tas ir process, kurā tiek izmantota īsa DNS secība no standarta genoma, kas parasti ir konservēta un ko neietekmē ārējie faktori, piemēram, vecums un augu audu veids. Populārākās augu DNS svītrkodu kandidātu sekvences ir rbcL, matK, psbA-trnH, ITS un ITS2 [15]. Vairāki pētījumi liecina, ka ITS/ITS2 ir visefektīvākais augu identifikācijas rīks. Ir arī ierosināts, ka ITS2 reģions būtu jāiekļauj pamata svītrkodos, jo tam ir augstāka diskriminācijas spēja nekā plastida svītrkodiem. Ir pieņemts, ka ITS2 varētu izmantot kā jaunu universālu svītrkodu, lai identificētu plašu augu taksonu klāstu [16, 17, 18, 19, 20, 21]. Lai gan daudzos pētījumos ir mēģināts identificēt universālu augu svītrkodu, neviens no pieejamajiem lokusiem nedarbojas visās sugās, tāpēc ir nepieciešama vairāku lokusu metode, lai atšķirtu augu sugas [22, 23, 24, 25, 26, 27, 28] . Šajā pētījumā kā svītrkodi tika izmantoti ITS2, rbcL, psbA-trnL.

Papildus morfoloģiskajām un molekulārajām identifikācijas metodēm tieši pierādījumi nāk no inokulācijas eksperimentiem. Jāveic inokulācijas eksperimenti, lai pierādītu, ka C. deserticola var parazitēt A. canescens. Papildus identifikācijai kvalitātes kontrole kļūst par galveno apsvērumu. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noskaidrotu atšķirību starp C. deserticola kvalitāti, kas parazitē uz H. ammodendron saknes, un kvalitāti, kas parazitē uz A. canescens.

2. Materiāli un metodes

2.1. Augu materiāli

Cistanche aug mīkstās smilšainās augsnēs ar vieglu sāļošanos, parasti parazitējot uz 30–100 cm dziļām saimnieka sānsaknēm. Piemērotajā audzēšanas apgabalā klimats ir sauss, mazāk lietains, ar lielu iztvaikošanu, ilgu saules staru stundu un lielu temperatūru starpību starp dienu un nakti. Mincjinas apgabals un Baijinas pilsēta ir šo paraugu savākšanas vietas, tās atrodas ģeogrāfiski tuvu, un tām ir mērens kontinentāls sausais klimats ar gada vidējo nokrišņu daudzumu 113,2 mm un vidējo gada relatīvo mitrumu 44 procenti. Konkrēta un detalizēta informācija par paraugu ņemšanu ir parādīta 1. tabulā. Visi paraugi tika sasaldēti un uzglabāti -20 C temperatūrā State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs Lab, Pekina, Ķīna.

2.2. Audu krāsošana un novērošana

Svaigi paraugi tika iegūti un uzglabāti šķīdumā, kas sastāvēja no 70 procentiem etanola, ledus etiķskābes un formaldehīda proporcijā 90:5:5, un tika dehidrēti, izmantojot etanola gradientu (75 procenti, 95 procenti, 100 procenti, 100 procenti). uz 1h. Dehidrētās sekcijas tika pakļautas ksilola gradientam (25 procenti, 50 procenti, 75 procenti, 100 procenti, 100 procenti) 1 stundu, lai iegūtu caurspīdīgas sekcijas. Caurspīdīgās sekcijas tika pakļautas parafīna infiltrācijai, kur paraugu saturošajam ksilolam tika pievienots parafīna tilpums, kas vienāds ar ksilola tilpumu, pēc tam tika izsūkta puse no iegūtā šķīduma un atkal tika pievienots vienāds tilpums parafīna. Šis process tika atkārtots 10 reizes, un visbeidzot, visi šķīdumi tika izsūkti un aizstāti ar vienādu daudzumu parafīna; šo pēdējo soli atkārtoja divas reizes, un pēc katras darbības iegūto šķīdumu inkubēja 1 stundu 75 C temperatūrā. Pēc parafīna infiltrācijas sekcijas tika pakļautas iegulšanai, kurā paraugi tika ievietoti dzelzs tvertnē, kurā bija šķidrais parafīns, un tika pievienots papildu šķidrais parafīns. ātri pievieno, lai piepildītu visu tvertni, un atstāj, lai sacietē. Iegūtais vaska bloks tika apgriezts un sadalīts. Iegultās sekcijas tika ievietotas siltā ūdenī, pabeigtas, novietotas uz priekšmetstikliņa un inkubētas 45 ° C temperatūrā 30 minūtes. Priekšmetstikliņa sekcijas tika atvaskots, sērijveidā mērcējot 100% ksilolā, 100% ksilolā, 50% ksilola, 50% ksilola, 100% etanola, 100% etanola, 100% etanola, 95% etanola un 75% etanola, un pēc tam iemērc 40% safranīnā. min. Tam sekoja vēl viena sērijas kārta, ātra mērcēšana 75% etanolā un 95% etanola, un pēc tam priekšmetstikliņus uz 1 minūti iegremdē ātri zaļā krāsā. Visbeidzot, sekcijas tika pakļautas pēdējai sērijveida mērcēšanai 95% etanola, 95% etanola, 100% etanola, 100% etanola, 50% ksilola, 50% ksilola un 100% ksilola. Pēc sekciju nokrāsošanas uz priekšmetstikliņa tika uzlikts piliens sveķu līmes, un virs tā tika uzlikts vāka stikls. Priekšmetstikliņi tika atstāti netraucēti nedēļu, un audu sekcijas tika novērotas, izmantojot Olympus optisko mikroskopu, un attēlotas.

2.3. DNS ekstrakcija un PCR amplifikācija

Kopējā genoma DNS tika iegūta no ziedu paraugiem, izmantojot augu genoma DNS ekstrakcijas komplektu (Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pekina, Ķīna) saskaņā ar ražotāja protokoliem. Gēnu amplifikācijas un sekvencēšanas praimeri un reakcijas apstākļi ir parādīti 2. tabulā. Katra gēna amplifikācija tika atkārtota trīs reizes katram paraugam.

2.4. Sekvences analīze

Lai iegūtu precīzas sekvences, fifinal PCR produkti pēc attīrīšanas, izmantojot Transgene Quick Gel Extraction Kits, tika klonēti atsevišķi pEASY®-Blunt Cloning Vectors saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc klonēšanas tie tika pārveidoti ķīmiski kompetentās Trans5ɑ šūnās. Trīs katra parauga kolonijas tika nejauši atlasītas un sekvencētas, izmantojot M13 praimerus. Šīs kolonijas tika sekvencētas divos virzienos, izmantojot Sangera sekvencēšanu, izmantojot BigDye Terminator V3.1 cikla sekvencēšanas komplektus ABI Prism 3700 DNS analizatoros. Iegūtās sekvences tika izlīdzinātas, izmantojot Clustal X (v1.8.7) [29], un manuāli sinhronizētas programmā BioEdit (v7.1.3.0) [30]. Izmantojot saskaņotās secības datus, mēs rekonstruējām filoģenēzi, izmantojot MEGA 7 programmatūru, izmantojot kaimiņu savienošanas (NJ) metodi, tika izmantots Kimura 2-parametra (K2P) modelis, un sāknēšanas straume bija 1000 atkārtojumu [31].

2.5. C. deserticola inokulācija

Trīs gramus C. deserticola sēklu pievienoja podiņos (diametrs, augstums apakšējā diametrā ¼ 20 cm- 20 cm-12 cm), kas satur smilšainu augsni, un samaisīja, lai nodrošinātu vienmērīgu izplatīšanos. Kontroles grupa sastāvēja no 3 g C. salsa sēklu, kas tika pievienotas līdzīgiem podiem ar smilšainu augsni. Visbeidzot katrā podā tika iestādīts A. canescens, un podi tika novietoti ārā. Kad augsnes mitruma saturs ir mazāks par 13 procentiem (g/g), podi tika laistīti. Eksperiments tika veikts Zhongguancun Life Science Park, Pekinā, Ķīnā (platums 39-560 N, garums 116 200 E; 20 m virs jūras līmeņa) no maija līdz jūlijam. Temperatūra dienā svārstījās no 16 līdz 35 C, naktī no 12 līdz 16 -C. Gaisa relatīvais mitrums ir lielāks par 50 procentiem. Saules gaisma ir bagātīga. Apmēram pēc 80 dienām no podiem tika izņemta augsne un noteikts inokulācijas ātrums.

2.6. Zāļu sastāvdaļu koncentrācijas noteikšana

Zāļu komponentu koncentrācijas noteikšana ietver divas daļas, no kurām viena ir šķidruma hromatogrāfijas procedūra, bet otra ir standartvielas un testa vielas sagatavošana, sīkāka informācija ir šāda:

i). Ehinakozīda un verbaskozīda-ehinakozīda un verbaskozīda noteikšana tika nosvērta un pievienota 50 procentu metanolā, lai iegūtu 0,2 mg/ml šķīdumu, ko izmantoja kā atsauces šķīdumu. Pirmā ir sausas C. deserticola samalšana pulverī, pulveris tika sajaukts 50 ml 50 procentu metanola 100 ml brūnā mērkolbā, un testa šķidrumu ieguva pēc maisījuma kratīšanas, mērcēšanas. , apstrāde ar ultraskaņu, stāvēšana un filtrēšana. Hromatogrāfiskā kolonna bija Agilent ZORBAX SB-C18 kolonna (4,6 mm 150 mm, 5 μm), ar metanolu (A) - 0,1 procenta skudrskābes šķīdumu (B) kā kustīgo fāzi, gradienta eluēšana (0–17 min, 26,5 procenti A; 17–20 min, 26,5 procenti → 29,5 procenti A; 20–27 min, 29,5 procenti A), plūsmas ātrums bija 1,0 ml/min, kolonnas temperatūra bija 35 C, noteikšanas viļņa garums bija 330 nm, injekcijas tilpums bija 10ul.

ii). Betaīna, mannīta, fruktozes, glikozes un saharozes noteikšana Betaīns, mannīts, fruktoze, glikoze un saharoze tika precīzi nosvērti un pievienoti ūdenim, lai iegūtu {{0}},25 mg/ml šķīdumu, kas bija izmanto kā atsauces šķīdumu. Piecus mililitrus iepriekš minētā Cistanche testa šķīduma sajauca ar 50 procentiem metanola 25 ml mērkolbā, labi sakrata un filtrēja ar 0,2 μm mikroporainu membrānu. Hromatogrāfiskā kolonna bija SHODEXASHAIPAK NH2P-50 4E polimerizētā gēla kolonna (250 mm 4,6 mm, 5 μm), kustīgā fāze bija acetonitrila-ūdens (77:23), plūsmas ātrums 0,7 ml/min, kolonnas temperatūra bija 25 C, Izmantojot iztvaikošanas gaismas izkliedes detektoru (ELSD), dreifējošās caurules temperatūra bija 100 C, nesējgāzes plūsmas ātrums bija 3 L/min, standartvielas un parauga injekcijas tilpums bija 5 ul.

3. Rezultāti

3.1. Ziedu morfoloģiskā identifikācija

Lai apstiprinātu Cistanche sugu, kas parazitē A. canescens, tika veikta ziedu īpatņu morfoloģiskā analīze (1. attēls un S1 attēls). Parazītiskā auga ziedu kopējā morfoloģija bija līdzīga C. deserticola ziedu morfoloģijai. Turklāt vainags bija biezāks nekā C. salsa uz dažādiem saimniekiem. Saskaņā ar Flora of China, C. deserticola un C. salsa ir acīmredzamas atšķirības ziedu seglapās. C. deserticola seglapas ir mazākas par vainagu, savukārt C. salsa seglapa ir 1/3 no vainaga garuma. Pamatojoties uz mūsu statistisko analīzi, Cistanche seglapas, kas parazitēja uz A. canescens un C. deserticola, bija zemākas par vainagu (S2 attēls). Cistanche uz A. canescens uzrādīja C. deserticola morfoloģiskas pazīmes, kas liecina, ka C. deserticola varētu būt A. canescens parazīts.

1. attēls. Cistanche ziedu morfoloģiskās pazīmes. (A) Cistanche deserticola (saimnieks: Haloxylon ammodendron); (B) Cistanche (saimnieks: Atriplex canescens); (C) Cistanche salsa (saimnieks: Sympegma regelii); (D) Cistanche salsa (saimnieks: Salsola passerina).

3.2. Krāsotu audu paraugu mikroskopiskā identifikācija

C. deserticola gaļīgā stumbra šķērsgriezums ir ļoti līdzīgs C. salsa, un tos abus veido epiderma, garoza, asinsvadu kūlis un serde. Abu augu asinsvadu kūlīši ir izkārtoti viļņainos vai dziļos viļņotos gredzenos, un iekšā ir skaidri redzamas. Galvenā atšķirība ir asinsvadu saišķa apvalka sānu formā; C. deserticola tā ir astes forma, bet C. salsa - trīsstūrveida vai pusapaļa. Veicot mikrostruktūras analīzi Cistanche, kas parazitēja uz A. canescens, mēs atklājām, ka tai ir astes formas asinsvadu kūļa apvalks, kas atgādina C. deserticola (2. attēls).

2. attēls. Gaļīgā stublāja mikroskopiskās īpašības dažādām Cistanche sugām. (A) Cistanche deserticola gaļīgā stumbra mikroskopiskās īpašības: 1. epiderma, 2. garoza, 3. lapu saišķis, 4. asinsvadu kūlis, 5. medulārais stars, 6. asinsvadu kūlīša apvalks, 7. floēma, 8. ksilēma. , 9. iekšpuse. (B) Palielināts Cistanche deserticola asinsvadu kūļa skats: 1. asinsvadu saišķa apvalks, 2. šķiedra, 3. prolīna šūnas, 4. lūksnes šķiedra, 5. floēma, 6. ksilēma, 7. trauks, 8. neilons. (C) Cistanche salsa gaļīgā stumbra mikroskopiskās īpašības: 1. epiderma, 2. lapu saišķis, 3. garoza, 4. asinsvadu saišķis, 5. medulārais stars, 6. serde. (D) Cistanche salsa asinsvadu saišķa palielināts skats: 1. asinsvadu saišķa apvalks, 2. prolīna šūnas, 3. šķiedra, 4. floēma, 5. trauks, 6. ksilēma. (E) Cistanche gaļīgā stublāja mikroskopiskās īpašības, kas parazitē uz Atriplex canescens 1. epidermas, 2. cortex, 3. asinsvadu kūlīša, 4. medulārā stara, 5. serdes. (F) Palielināts skats uz Cistanche asinsvadu kūlīti, kas parazitē uz Atriplex canescens 1. trauka, 2. ksilēma, 3. kambija, 4. floēma, 5. asinsvadu saišķa apvalks.

3.3. Molekulārā identifikācija

Papildus morfoloģiskajai identifikācijai mēs veicām arī molekulāro identifikāciju un izvēlējāmies trīs gēnu fragmentus, proti, ITS2, rbcL un psbA-trnL. Evolūcijas koks tika izveidots, izmantojot katra fragmenta secības informāciju (3. attēls), un visi trīs filoģenētiskie koki parādīja, ka Cistanche, kas parazitēja uz A. canescens, ir cieši saistīta ar C. deserticola. Šie rezultāti liecina, ka C. deserticola var būt A. canescens parazīts. Sīki izstrādātas gēnu atšķirības starp dažādām Cistanche sugām tika novērotas pēc vairāku secību izlīdzināšanas (4. attēls). Mēs atklājām trīs viena nukleotīda polimorfismus (SNP) ITS2 gēna ķermenī starp C. deserticola un C. salsa, 139., 295. un 472. bāzēs. RbcL gēna ķermenī bija četras gēnu atšķirības starp C. deserticola un C. salsa, kas satur divus SNP un divas ievietošanas un dzēšanas (indel) mutācijas. Salīdzinot ar ITS2 un rbcL, atšķirības psbA-trnL gēna ķermenī starp C. deserticola un C. salsa bija acīmredzamākas ar septiņām secību atšķirībām, kur četras bija SNP un trīs bija InDel mutācijas. Konkrēti, virkni timīna atkārtojumu, sākot no saskaņotās secības 414. bāzes, varētu izmantot, lai izstrādātu vienkāršus secības atkārtojumu (SSR) marķierus, lai atšķirtu C. deserticola un C. salsa.

3.4. C. deserticola inokulācija

Lai pārbaudītu, vai C. deserticola vai C. salsa var parazitēt ar A. canescens, tika veikts inokulācijas eksperiments, un mēs atklājām parazītisma pierādījumus visos ar C. deserticola inokulētajos podos ar gandrīz 100 procentu inokulācijas līmeni (5. attēls). Kontroles grupās parazītisms netika novērots. Šis rezultāts tieši pierāda, ka C. deserticola viegli parazitēja A. canescens, bet C. salsa nevarēja.

3.5. Nozīmīgu zāļu sastāvdaļu koncentrācijas noteikšana

Mēs novērtējām svarīgu zāļu komponentu koncentrāciju C. deserticola, kas parazitē uz A. canescens. Konkrētā hromatogramma ir parādīta papildu materiālā. Lai iegūtu precīzus rezultātus, tika izveidoti četri neatkarīgi eksperimenti. Pamatojoties uz mūsu mērījumiem (3. tabula), mēs atklājām, ka verbaskozīda un ehinakozīda koncentrācija bija 20 reizes augstāka nekā Ķīnas farmakopejā (saskaņā ar Ķīnas farmakopeju, ehinakozīda koncentrāciju summas procentuālā daļa). un verbaskosīdam C. deserticola jābūt mazākam par 0.30 procentiem). Koncentrācijas bija arī ievērojami augstākas nekā C. deserticola, kas parazitē uz H. ammodendron (parasti 0,2–1,5 procenti) [32]. Arī mannīta, betaīna, fruktozes un citu ogļhidrātu komponentu koncentrācija bija ļoti augsta, un kopējā kvalitāte bija labāka nekā C. deserticola, kas parazitēja uz H. ammodendron. Tādējādi šie rezultāti liecina, ka A. canescens var izmantot C. deserticola audzēšanai rūpnieciskā līmenī un apdraudēto savvaļas resursu aizsardzībai.

4. Diskusija

Iepriekš tika uzskatīts, ka C. deserticola parazitē tikai H. ammodendron. Tomēr šajā pētījumā, izmantojot morfoloģiskās un molekulārās identifikācijas metodes, mēs parādījām, ka C. deserticola var arī parazitēt A. canescens. Lai gan H. ammodendron, A. canescens un H. persicum pieder pie Chenopodiaceae dzimtas, ir interesanti un savdabīgi, ka C. deserticola ir sugu selektivitāte, ko, iespējams, regulē saimnieka izdalītās signalizācijas molekulas. A. canescens, kura izcelsme ir Amerikas Savienotajās Valstīs, uzrāda spēcīgu izturību pret vides traucējumiem, un tai ir salīdzinoši liela biomasa. A. canescens ir dzīvotspējīgs C. deserticola saimnieks dažādu iemeslu dēļ. Pirmkārt, tas var izdzīvot dažādos vides apstākļos. Otrkārt, C. deserticola biomasa un augšanas ātrums var būt attiecīgi lielāks un straujāks uz A. canescens nekā uz H. ammodendron. Treškārt, ņemot vērā A. canescens plašo pielāgošanās spēju, stādīšanas platību var vēl vairāk paplašināt. Tādējādi A. canescens ir īpašas priekšrocības salīdzinājumā ar H. ammodendron kā saimniekorganismu, un tas palīdzēs C. deserticola rūpnieciskai ražošanai.

C. deserticola un C. salsa ir grūti atšķirt, un morfoloģiskā identifikācija pagātnē ir radījusi mulsinošus rezultātus. Līdz ar progresu molekulārās bioloģijas jomā uz molekulām balstītas identifikācijas metodes ir plaši izmantotas Ķīnas augu izcelsmes medicīnā. Tā kā lielākā daļa ķīniešu augu izcelsmes zāļu piedāvā maz genoma informācijas, DNS svītrkodēšanas tehnoloģija ir kļuvusi par revolucionāru identifikācijas metodi. Šajā pētījumā morfoloģiskās un DNS svītrkodēšanas tehnoloģija tika vispusīgi izmantota, lai identificētu nezināmās Cistanches sugas; tas iepriekš nav mēģināts, un mūsu rezultāti liecina, ka šī pieeja ir iespējama.

Tā kā C. deserticola parazitē A. canescens, ir svarīgi noteikt atšķirības C. deserticola kvalitātē uz A. canescent saknēm un uz H. ammodendron saknēm. Saskaņā ar mūsu rezultātiem aktīvo komponentu koncentrācija bija augstāka C. deserticola, kas parazitēja uz A. canescens, nekā tajā, kas parazitēja uz H. ammodendron. Tādējādi mūsu rezultāti veido stabilu teorētisku pamatu C. deserticola liela mēroga ražošanai, kas parazitē uz A. canescens.

5. Secinājumi

Ilgu laiku tika uzskatīts, ka C. deserticola parazitē tikai H. ammodendron. Iepriekš tika konstatēts, ka tirgū iegādātās C. deserticola sēklas var parazitēt A. canescens, cita

Chenopodiaceae augs. Izmantojot morfoloģiskās un molekulārās identifikācijas metodes, mēs apstiprinājām, ka Cistanche suga, kas parazitē A. canescens, ir C. deserticola. Šo rezultātu vēl vairāk apstiprināja inokulācijas eksperiments. Mēs noteicām nozīmīgu zāļu komponentu koncentrāciju, un mūsu rezultāti liecina, ka C. deserticola, kas parazitē uz A. canescens, komponentu koncentrācija un kvalitāte bija lielāka nekā H. ammodendron. Jaunu saimnieku atklāšana var veicināt C. deserticola rūpniecisko ražošanu, kā arī var efektīvi aizsargāt savvaļas resursus un ekoloģisko vidi.

Atsauces
[1] DY Tan, QS Guo, CL Wang, Pētījums par Cistanche deserticola status quo un tā izmantošanu un izmantošanu Ķīnā, For. Resurss. Manag. 33 (2004) 29.–32.
[2] XY Qiao, HL Wang, YH Guo, pētījums par Cistanche sēklu dīgtspēju, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32 (2007) 1848–1850.
[3] PF Tu, YP He, ZC Lou, Aptauja par Cistanche, Chin izcelsmi un resursu aizsardzību. Tradīcija. Garšaugs. Narkotikas 25 (1994) 205–208.
[4] LD Karalliedde, CT Kappagoda, Tradicionālo ķīniešu medikamentu izaicinājums alopātiskiem ārstiem, Am. J. Physiol. Sirds Circ. Fiziol. 297 (2009) 1967.–1969.
[5] Y. Jiang, PF Tu, Cistanche sugu ķīmisko sastāvdaļu analīze, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 1970.–1979.
[6] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "tuksneša žeņšeņs": pārskats, Am. J. Čins. Med. 40 (2012) 1123–1141.
[7] Farmakopeja NCOC, Ķīnas Tautas Republikas farmakopeja, The Chemical Industry Press, Pekina, 2020. gads.
[8] GX Meng, XS Cui, Y. Wu, YH Guo, Leveillula saxaouli ietekme uz Haloxylon ammodendron, North, augšanu, hlorofilu un ogļhidrātiem. Hortic. 14 (2012) 141–143.
[9] YC Chen, M. Li, MZ Wu, YX Song, Sakņu struktūra un sastāvs divās Haloxylon Bunge sugās, Plant Physiol. J. 49 (2013) 1273–1276.
[10] PF Tu, Y. Jiang, YH Guo, YZ Tian u.c., Developing ecological industry of Cistanches herba, lai veicinātu rietumu tuksneša reģiona ekoloģisko civilizāciju, Mod. Zods. Med. 4 (2015) 297–301.
[11] SC Sanderson, HC Stutz, Augsts hromosomu skaits Mojavean un Sonoran tuksnesī Atriplex canescens (Chenopodiaceae), Am. Dž. Bots. 81 (1994) 1045–1053.
[12] JL Peterson, DN Ueckert, RL Potter, JE Huston, Ekotipiskās variācijas izvēlētās četrspārnu sālskrūmu populācijās Teksasas rietumos, J. Range Manag. 40 (1987) 361–366.
[13] DS Kong, Atriplex canescens morfoloģiskās īpašības un ekofizioloģiskā pielāgošanās spēja: pārskats, Chin. J. Ecol. 32 (2013) 210–216.
[14] MA Bashir, MS Faezah, SSO Mohd, W. Alina, Review: DNS svītrkodēšanas un hromatogrāfijas pirkstu nospiedumi augu izcelsmes zāļu augu izcelsmes zāļu autentifikācijai. Evid. Pamatots papildinājums, alternatīva. Med. 2017 (2017) 1.–28.
[15] XW Li, Y. Yang et al., Augu DNS svītrkodi: no gēna līdz genomam, Biol. Rev. 90 (2015) 157–166.
[16] SL Chen, H. Yao, JP Han et al., ITS2 reģiona validācija kā jauna DNS svītrkoda ārstniecības augu sugu identificēšanai, PloS One 5 (2010), e8613.
[17] K. Luo, SL Chen, KL Chen u.c., Kandidātu augu DNS svītrkodu novērtējums, izmantojot Rutaceae ģimeni, Sci. Ķīna Life Sci. 53 (2010) 701–708.
[18] T. Gao, H. Yao, JY Song u.c., Fabaceae dzimtas ārstniecības augu identificēšana, izmantojot iespējamo DNS svītrkodu ITS2, J. Ethnopharmacol. 130 (2010) 116.–121.
[19] T. Gao, H. Yao, JY Song u.c., Kandidātu DNS svītrkodu izmantošanas iespējamības novērtējums lielās Asteraceae dzimtas diskriminējošās sugās, BMC Evol. Biol. 10 (2010) 324.
[20] XH Pang, JY Song, YJ Zhu u.c., Izmantojot DNS svītrkodus sugu identificēšanai Euphorbiaceae, Planta Med. 76 (2010) 1784–1786.
[21] XH Pang, JY Song, YJ Zhu u.c., Augu DNS svītrkodu izmantošana Rosaceae sugu identificēšanai, Cladistics 27 (2011) 165–170.
[22] PD Hebert, EH Penton, JM Burns, DH Janzen, W. Hallwachs, Desmit sugas vienā: DNS svītrkods atklāj noslēpumainas sugas neotropiskajā kapteiņa taurenī Astraptes fulguration, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 101 (2004) 14812–14817.
[23] MW Chase, RS Cowan u.c., Priekšlikums standartizētam protokolam visu sauszemes augu svītrkodēšanai, Taxon 56 (2007) 295–299.
[24] WJ Kress, DL Erickson, Divu lokusu globālais DNS svītrkods sauszemes augiem: kodējošais rbcL gēns papildina nekodējošu trnH-psbA starplikas reģionu PloS One 2 (2007) e508.
[25] DL Erickson, J. Spouge, A. Resch et al., DNS svītrkodēšana sauszemes augos: standartu izstrāde, lai kvantitatīvi noteiktu panākumus, Taxon 57 (2008) 1304–1316.
[26] NC Kane, Q. Cronk, Botānika bez robežām: svītrkodi fokusā, Mol. Ecol. 17 (2008) 5175–5176.
[27] R. Lahaye, M. van der Bank, D. Bogarin u.c., DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots, Proc. Natl. Akad. Sci. USA 105 (2008) 2923–2928.
[28] N. Kane, S. Sveinsson, H. Dempewolf, et al., Ultra-barcoding in cacao (Theobroma spp.; Malvaceae), izmantojot veselus hloroplastu genomus un kodola ribosomu DNS, Am. Dž. Bots. 99 (2012) 320–329.
[29] JD Thompson, TJ Gibson, F. Plewniak, F. Jeanmougin, DG Higgins, CLUSTAL_X windows interfeiss: elastīgas stratēģijas vairāku secību saskaņošanai, ko palīdz kvalitātes analīzes rīki, Nucleic Acids Res. 25 (1997) 4876–4882.
[30] TA Hall, BioEdit: lietotājam draudzīgs bioloģisko secību izlīdzināšanas redaktors un analīzes programma Windows 95/98/NT, Nucl. Skābes Symp. Ser. 41 (1999) 95–98.
[31] S. Kumar, M. Nei, J. Dudley, K. Tamura, MEGA: uz biologiem orientēta programmatūra DNS un olbaltumvielu sekvenču evolūcijas analīzei, īss. Bioinform. 9 (2008) 299.–306.
[32] PF Tu, B. Wang, T. Deyama, ZG Zhang, ZC Lou, Herba cistanchis feniletanoīdu glikozīdu analīze, izmantojot RP-HPLC, Acta Pharm. Sinica. 32 (1997) 294–300.