lvValoda
Mājas / Zināšanas / Saturs

Zināšanas

Autofluorescence kā neinvazīvs novecošanās un uzlabotas glikācijas galaproduktu biomarķieris Cistanche Tubulosa

Apr 11, 2023

DISKUSIJA

Iepriekš autofluorescence tika izmantota, lai uzraudzītu lipofuscīnu, vecuma pigmentu, kā novecošanās biomarķieri.4,13. Lai gan mēs novērojām sarkanoFluorescence, kas liecina par lipofuscīnu, kā redzams iepriekšējos pētījumos9, zilsFluorescence tika konstatēta agrākā dzīves posmā, kad tārpi tika pārbaudīti, izmantojot M165 FCfluorescences stereomikroskops (Leica Microsystems, Tokija, Japāna) (dati nav parādīti). Šī pētījuma mērķis bija pārbaudīt, vai zilā autofluorescence varētu kalpot kā jutīgāks marķieris atsevišķu tārpu novecošanās izsekošanai.

anti- senescence cistanche function

Cistanche ParAnti-novecošanās

Buy Cistanche

Pretnovecošanās Cistanche produkts ir gatavs nosūtīšanai


TheFluorescence, ko mēra atsevišķiem tārpiem, palielinājās līdz ar vecumu; jo mazāk tārpuFluorescēts, jo ilgāks viņu dzīves ilgums. Tādējādi zilsfluorescence var nodrošināt alternatīvu biomarķieri novecošanās izsekošanai. Tomēr Pincus et al. ziņoja, ka tārpi, kas pēc tam nomira (24 stundu laikā)Fluorescēts kinurenīna biosintēzes dēļ; šie pētnieki nosauca šo zilo gaismu"nāviFluorescence". Tiek ziņots, ka nāveFluorescence reflekts emisija ar antranilskābes glikozilētu formu, ko ražo kinurenīna ceļš; autoFluorescējošais materiāls tiek konstatēts lizosomām līdzīgās zarnu granulās31. Šī zilā gaisma varētu būt tas pats nāves marķieris, ko Coburn et al. gadā novērotsC. elegansvairākas stundas pirms un pēc nāves, un tiek ziņots, ka tas tika novērots gan jauniem tārpiem, kas tika pakļauti nāvējošiem ievainojumiem, gan tārpiem, kas dabiski mirst no vecuma. Patiešām, mēs novērojām, kalaipns-1mutants, kuram trūkst kinurenināzes aktivitātes, bija mazāk autofluorescējošs nekā savvaļas tipam. Tomēr mūsu rezultāti liecināja, ka daļa zilāsFluorescence ir saistīta ar novecošanu, nevis ar nāvi. Jo īpaši, kā parādīts attēlā.3b, novecojošiem tārpiem bija palielināta zilā krāsaFluorescence pat tad, ja neietver datus, kas iegūti 2 dienu laikā pirms nāves. Turklāt tārpi joprojāmFluoresced vairāk līdz ar novecošanos, neatkarīgi no stāvokļakynu-1gēns. SamazinātsFluorescence inkynu-1Tādējādi mutantam vajadzētu būt zaudējuma dēļAGE sintēzes paātrināšana ar kinurenīnu palīdzību, nevis nāves trūkumsFluorescence32.


Daži AGE savienojumi irFluorescējošs27. Mēs secinājām, ka zilāFluorescence var ietvert emisiju no šiem AGE, atsevišķi no tās, kas attiecināma uz nāviFluorescence. Kad ekstrahētie tārpu proteīni tika inkubēti ar cukuriem in vitro,Fluorescences intensitāte un AGE līmenis laika gaitā palielinājās. Tārpi, kas kultivēti uz barotnes, kas satur riboziFluorescēja vairāk nekā kontroles dzīvnieki tiek audzēti bez papildu ribozes, pat jakynu-1tika mutēts. Turpretim tārpiem, kas kultivēti rifampicīna, kas ir zināms AGE ražošanas inhibitors, klātbūtnē, bija pazemināts zilās krāsas līmenis.fluorescence. Patiešām, fluorescences mikroskopija liecināja, ka 13-dienu veci tārpi izstaro vairāk zilās gaismas nekā 3-dienu veci jauni pieaugušie. Imūnkrāsošana ar anti-CML vai anti-pentosidīna antivielām neuzrādīja difūzi izplatošu AGE klātbūtni, kas līdzinās zilajai krāsai.Fluorescence. TheFluorescence varētu rasties no citiem bagātīgiemfluorescējoši AGE, piemēram, vespertīns A, LM-1 un argpirimidīns33,34.


Lai nodrošinātu oocistām dzeltenumu,C. eleganshermafrodīti patērē paši savu zarnu biomasu, kā rezultātā vēlākā dzīvē rodas zarnu atrofija un ārpusdzemdes dzeltenuma nogulsnēšanās. Kā ziņots iepriekš, vitellogenīni (dzeltenuma proteīni) veciem tārpiem bija divas reizes augstāki (salīdzinājumā ar jaunākiem dzīvniekiem).35, un uzrādīts sešas reizes lielāksFluorescence pēc glikācijas in vitro. Šie dati liecināja, ka paši vitellogenīni radītu 12-kāršu pieaugumuFluorescence gados vecākiem tārpiem, salīdzinot ar jauniem pieaugušajiem teorētiski. Western blotēšana parādīja, ka galvenās joslas, kas reaģē ar anti-CML antivielu, bija dzeltenuma proteīni. Šis atklājums atbilst iepriekšējiem Nakamura et al. ziņojumiem, kuri atklāja smagu vitellogenīna glikāciju36un Golegaonkar et al., kuri konstatēja samazinātu glikāciju vitellogenīnā-2, vitellogenīnā-6 un pagarinājuma faktora 1 alfa ar rifampicīnu ārstētām nematodēm30. Tiek ziņots, ka vitellogenīni darbojas kā antioksidanti un veicina medus bišu māšu ilgmūžību37. InC. elegans, vitellogenīniem ir izšķiroša nozīme stresa rezistencē. 38. Tā kā antioksidanti var viegli oksidēties paši, glikozētā vitellogenīna uzkrāšanās var pasliktināt aizsardzību pret oksidatīviem bojājumiem, kā rezultātā veidojas apgriezta sakarība starp paredzamo dzīves ilgumu un zilās krāsas intensitāti.Fluorescence, kas novērota šajā pētījumā. Tomēr Sornda et al. nesen ziņoja, ka dzīves ilgums nav saistīts ar oksidatīvā stresa rezistenci, ko izraisa YP115/YP88 (vitellogenīns-6)39. Šie pētnieki ierosināja, ka vitellogenīna YP170 uzkrāšanās, kas iegūta no vitellogenīniem 1–5, izraisa zarnu atrofiju un saīsinātu dzīves ilgumu, savukārt YP115/YP88 uzkrāšanās var aizkavēt zarnu atrofiju un pagarināt dzīves ilgumu. Tāpēc vitellogenīna-6 glikācija un no tā izrietošā disfunkcija var veicināt novecošanos. Lai gan pagarinājuma faktoriFluorescēja trīs reizes intensīvāk pēc in vitro glikācijas, šo proteīnu daudzums jauniem un veciem tārpiem bija līdzīgs. Tāpēc šī faktora ieguldījums pastiprinātā autofluorescencē var būt mazāks nekā tas, kas attiecināms uz vitellogenīniem.

anti- senescence cistanche function


Cistancheparasti tika izmantots kā paraugspētījumsnovecošanās un pretnovecošanās iejaukšanās. Mēs ierosinājām izmantot tārpu kā modeli, lai izpētītu ilgmūžības ietekmipienskābes baktērijas8. Ņemot vērā demonstrāciju (šajā pētījumā), ka zilsFluorescence nematodēs ir iespējams AGE uzkrāšanās rādītājs, mēs to ierosināmCistanche hermafrodīti var kalpot par paraugu, lai izpētītu anti-novecošanās iejaukšanās lietderību, kas darbojas, nomācot AGE veidošanos. Turpretim autofluorescence, visticamāk, nebūs tārpu tēviņu novecošanās biomarķieris, jo vitellogenīnu ir jābūt maz.

anti- senescence cistanche function

5. att. Zilā fluorescence no kynu-1 mutantiem, kuriem nevajadzētu izstarot nāves fluorescenci. a7-dienu veca un 13-dienu veca fluorescences intensitāte (ex 340/em 430)kynu-1mutanti (n = 37 katrs); vecāki tārpi joprojām emitēja vairākFluorescence nekā jaunākiem tārpiem, neskatoties uzkynu-1mutācija. Tomēr nekādas zīmesFifiMann atklāja nenozīmīgu atšķirību autofluorescences vērtībās–VitnijaU pārbaude.b Ar ribozi uzturēts 7-dienu vecs tārps izdalīja vairāk zilās krāsasFluorescence, neskatoties uzlaipns-1mutācija. ZilsFluorescence noC. elegansaudzē ar ribozi (n = 24) vai sorbīts (n = 18) tika salīdzināts ar kontroles tārpiem bez cukuriem (n = 20). Autofluorescences vērtības tika salīdzinātas, izmantojot neparametrisko tēraudu–Dwass metode (**p < 0.01). c Izdzīvošanas līknesC. elegansaudzē ar ribozi (n = 62) vai sorbīts (n = 84) tika salīdzināti ar kontroles tārpiem bez cukuriem (n = 64). Tārpi bija 3 dienas veci dienā 0. Nematodes izdzīvošanu aprēķināja Kaplan–Meiera metodes un izdzīvošanas atšķirību nozīmīgums tika pārbaudīts, izmantojot log-rank testu (**p < 0.01).


METODES

NematodesCistanche Bristoles celmu N2 un tā atvasinātos mutantu celmus laipni nodrošināja Minesotas Universitātes Caenorhabditis ģenētikas centrs. Šajā pētījumā izmantotās mutācijas bija CB1370daf-2 (e1370)un CB1003kynu-1 (e1003). Nematodes tika uzturētas un pavairotas ar NGM saskaņā ar standarta metodi 40. Tārpu oliņas tika iegūtas no pieaugušiem tārpiem pēc pakļaušanas nātrija hipohlorīta/nātrija hidroksīda šķīdumam, kā aprakstīts iepriekš 41. Olu suspensijas inkubēja nakti 25 grādu temperatūrā, lai varētu izšķilties, un suspensija L1- stadijas tārpi tika centrifugēti ar ātrumu 156 ×g uz 1 min. Supernatants tika noņemts, un atlikušie kāpuri tika pārnesti uz svaigām, bezpeptonu modificētām NGM (mNGM) plāksnēm, kas pārklātas arE. colicelms OP50 (OP50). Celmus audzēja uz mNGM agara plāksnēm 25 grādu temperatūrā, izņemotdaf-2celms, kas tika audzēts 20 grādu temperatūrā līdz L4 stadijai. Visas pārbaudes tika sāktas ar jauniem pieaugušiem tārpiem, kas sāka dēt olas 25 grādu temperatūrā. Nematodēm nebija vajadzīgs ētisks apstiprinājums.Baktēriju celmiOP50 tika izmantota kā starptautiski atzīta nematožu barība. OP50 kultivēšanai tika izmantots triptona sojas agars (Nissui Pharmaceutical, Tokija, Japāna). Baktērijas (100 mg mitrā svara) tika suspendētas 0,5 ml M9 buferšķīduma; 50-µL baktēriju suspensijas alikvota daļa tika izplatīta uz mNGM 55- cm diametra plāksnēs, ja vien nav norādīts citādi.


anti- senescence cistanche function

Autofluorescences daudzfaktoru analīze

100 pieaugušo populācijas tika atjaunotas 3 un 17 dienu vecumā,mazgāti trīs reizes, koncentrēti 3 µL M9 buferšķīduma un uzglabāti sasaldētiplkst–80 grādi līdz lietošanai. Pirms ekstrakcijas 3 µL līzes buferšķīduma (kas sastāv no50 mM Tris-HCl buferšķīdums (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1 procents nātrija dodecilsulfāta(SDS), 1 procents Triton X-100, 1 mM fenilmetilsulfonilsFluorīds (PMSF) un
Katrā mēģenē tika sadalīti 2 procenti 2-merkaptoetanola) un 4 µL 15 procentu SDS. Pēc tam paraugi tika pakļautifive sasaldēšanas-atkausēšanas ciklus, lai atbrīvotu proteīnu. Fotoluminiscējošie spektri tika savākti ar aFluorescencespektrofotometrs (Hitachi FL{{0}}) ar datu interpretācijas programmatūru (FL Solutions versija 2.0). Nematožu suspensiju fluorescences īpašības bija

analizēts, izmantojot ierosmes-emisijas matricu (EEM)Fluorescences spektroskopija. Daudzfaktoru analīze (viena viļņa garuma ierosme ar vairākiemviļņa garuma emisija un sinhronā skenēšanaFluorometrija) radīja EEM diagrammas, kas sastāv no vienas skenēšanas ierosmes un sinhronāsFluorescencestika uzzīmēti katras sērijas spektri.



Novecojošu tārpu fluorescences spektri

Tārpi (3–13 dienas veci) tika iegūti no augšanas barotnes, kas satur 2'-deoksi-5-Fluorouridīns (Tokijas ķīmiskā rūpniecība, Tokija, Japāna). Šissavienojums bloķē pēcnācēju embrionālo attīstību, tādējādi novēršot inficēšanos ar pēcnācējiem. Tika savākti atsevišķi novecojoši tārpicaurules, mazgātaspiecireizes, koncentrēts 3 µL M9 buferšķīduma un uzglabāts sasaldēts plkst–80 grādi līdz lietošanai. Pirms ekstrakcijas 100 µL līzes buferšķīduma(kas sastāv no 50 mM Tris-HCl buferšķīduma (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM ditiotreitola (DTT), 1 mM PMSF un 1 µL proteāzes inhibitoru kokteili (Sigma, Sentluisa, MO, ASV)) katra caurule. Pēc tam paraugi tika samalti, izmantojot mini bezvadu dzirnaviņas (Funakoshi, Tokija, Japāna), lai atbrīvotu
olbaltumvielas. Olbaltumvielu saturs tika kvantitatīvi mērīts, izmantojot Pierce™ 660 nm proteīna testa reaģents (Thermo Fisher Scientific Meridian,Waltham, MA, ASV) un NanoDrop OneC instrumentu (Thermo Fisher Scientific). TheFluorescencesspektrs tika noteikts katram 30-µL paraugam (kas satur 1,5μg kopējā proteīna), izmantojot daudzmodu režģi

mikroplašu lasītāja modelis SH-9000Lab ar SF6 datu apstrādes programmatūru(Corona Electric, Ibaraki, Japāna). Katrs mērījums tika veikts trīs reizes.


image

Atsevišķu dzīvo tārpu autofluorescences mērīšana (iesaiņojuma-drop metode)

Nejauši atlasīti tārpi tika mazgāti ar M9 buferšķīdumu un pēc tamatsevišķi tārpi tika ievietoti 1.0 µL M9 buferšķīduma uz Saran Wrap pieķeršanās.film (Asahi Kasei, Tokija, Japāna) izstiepts virs 384-akas melnas plāksnes(STEM, Tokija, Japāna). Uz katras iedobes tika izveidoti nelieli iedobumi, izmantojot areplikators (Watson, Kobe, Japāna). Šīs modifikācijas mērķis bija droši atgūt tārpus pēc mērījuma, lai varētu izsekot katra tārpa vecuma atkarīgās autofluorescences izmaiņām. Pieķeršanāsfilm tika izvēlēts, jo tas automātiski fluorescēja mazāk nekā citi komerciāli pieejamiefilms.

Tomēr tukšie (tikai M9 buferis) dati tika pārbaudīti trīs reizeskatru aku, ņemot vērāsvārstībasno akas uz aku. Minimālās noteikšanas robežas un kvantitatīvi nosakāmās robežas tika noteiktas, pamatojoties uz tukšiem datiem par katru dienu kāμ (tukšā laukuma vidējais rādītājs)plus3.29σ (standarta novirze) unμplus√2 × 10σ, attiecīgi. Autofluorescence katra tārpa ķermenī

tika uzņemts ar daudzmodu režģa mikroplašu lasītāju. Pēcmērījumu, katrs tārps tika atsevišķi uzturēts 4.{1}}cmdiametra plāksne, kas pārklāta ar OP50 (2 mg/10μL M9 buferis) pie 25 grādiem. Katrstests tika veikts ar vismaz 20 tārpiem un atkārtots divas reizes.


Dzīves ilguma mērīšana

Tārpi tika turēti uz mNGM plāksnēm, kas pārklātas ar OP50, 25 grādu temperatūrā līdz 13 dienu vecumam. Pēc izvērtēšanas līdzFluorescencestestā, katrs bija 30 tārpipārvietots uz atsevišķām jaunām mNGM plāksnēm, kas pārklātas ar OP50. Plāksnes inkubēja 25 grādu temperatūrā, un dzīvi un miruši tārpi tika novērtēti ik pēc 24 stundām. Tārps tika uzskatīts par mirušu, ja tas nereaģēja uz maigu pieskārienu ar tārpu savācēju.

anti- senescence cistanche function


AGE pēc in vitro glikācijas

Olbaltumvielu ekstrakcija tika veikta, kā aprakstīts iepriekš. Mākslīgai glikācijai tika izmantoti trīs dienas veci tārpi. Olbaltumvielu paraugi (2 mg/ml)tika inkubēti ar 500 mM glikozes, 100 mM ribozes vai 500 mM fruktozes(figalīgā koncentrācija). Visi paraugi tika inkubēti 37 grādu temperatūrā 0–4 nedēļas. Alikvotas (50μL) tika izdalīti polistirola plāksnes iedobēs
(Sumitomo Bakelite, Tokija, Japāna) un inkubēja 2 stundas 37 grādu temperatūrā. Pēcnoņemot parauga šķīdumu, plāksne tika mazgāta ar PBS-T(fosfātu buferšķīdums (PBS), 0,05 procenti Tween 20); 250μL 3 procentu vājpienatika pievienota katrai iedobei, un plāksni inkubēja 2 stundas 37 grādu temperatūrā. Katrslabi pēc tam nomazgāja ar PBS-T un 100μL no anti-AGE (anti-CML)
monoklonālā antiviela (Klons Nr. 6D12, Trans Genic, Fukuoka, Japāna; 75 ng/ml) tika izdalīts katrā iedobē; pēc tam plāksne tika inkubēta telpātemperatūra 1 h. Pēc mazgāšanas ar PBS-T, 100μL ar peroksidāzi konjugētakazas anti-peles IgG antiviela (Rockland Immunochemicals, Inc., Limerick, PA, ASV; 1:150, 000) tika dota katrā iedobē, un
plāksni inkubēja istabas temperatūrā 1 stundu. Pēc mazgāšanas ar PBS-T, 100μL darba šķīduma (tetrametilbenzidīna (TMB) krāsošanas šķīdums: peroksīda šķīdums).= 1:1; ELISA POD substrāta TMB komplekts, populārs,Nacalai Tesque, Kioto, Japāna) tika dota katrā iedobē, un plāksne tika turēta istabas temperatūrā tumsā, līdz tā tika atdzesēta.

papildinājums 100μL 1 mol/l sērskābes katrā iedobē. Katra absorbcijaiedobē pie 450 nm (sub: 650 nm), tad nekavējoties tika mērīts ar mikroplašu lasītāju. ELISA tika veikta trīs reizes katram testa apstākļiem.


Western blotēšana novecojošiem tārpiem

Paraugi tika apstrādāti ar 4 × Bolt™ LDS parauga buferis (Thermo Fisher ScientiFific) un 10 × skrūve™ Parauga reducētājs (Thermo Fisher ScientiFific), un katrs paraugs, kas satur 1.5μg kopējā proteīna tika palaists ar Bolt™ 4–12% Bis-Tris Plus želeja (Thermo Fisher ScientiFific). Pēc tam olbaltumvielas tika pārnestas no gēla uz polivinilidēnufluorīda membrāna (ATTO, Tokija, Japāna) un bloķēta ar 5% vājpiena PBS- 0.1% Tween 20 1 stundu. Membrānu inkubēja nakti 4 grādos ar anti-AGE (anti-CML) monoklonālo antivielu (klons Nr. 6D12 1:1 000), mazgā ar PBS-T un pēc tam inkubēja istabas temperatūrā 1 h ar peroksidāzi konjugētu kazu anti-peles IgG antivielu (1:25,000). Pēc mazgāšanas ar PBS-T membrānu inkubēja ar ECL primāro Western blot noteikšanas reaģentu (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Anglija) un skenēja, izmantojot ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV) vai ImageQuant. LAS 500 (GE Healthcare UK). Pēc tam membrānas mazgā ar PBS-T, inkubēja ar Western BLoT atdalīšanas buferi (Takara, Shiga, Japāna) 30 minūtes istabas temperatūrā un vēlreiz mazgāja ar PBS-T. Membrāna tika atkārtoti pārbaudīta ar anti-vitellogenīna antivielām YP115 un YP170 (katra 1:10 000) 4 grādos nakti.42, mazgā ar PBS-T un inkubē ar kazas anti-žurku IgG antivielu, kas konjugēta ar peroksidāzi (1:2000) (Proteintech, Rosemont, IL, ASV) istabas temperatūrā 2 stundas. Iekraušanas kontrolēm membrānas tika atkārtoti pārbaudītas, izmantojot anti-aktīna antivielu (Klons Nr. C4; Merck KGaA, Darmštate, Vācija) un ar peroksidāzi konjugētu anti-peles antivielu (GE Healthcare UK). Vitellogenīna (YP170 un YP115) un CML joslu blīvums katrā joslā tika normalizēts attiecībā pret aktīna joslu blīvumu attiecīgajā joslā. Joslu blīvumi tika analizēti, izmantojot ImageQuant TL programmatūru (GE Healthcare). Katrs tests tika veikts divas reizes.


Ribozes un rifampicīna ietekme uz AGE in vivo

Trīs dienas veci tārpi tika kultivēti uz mNGM, kas satur 400 mM ribozivai 400 mM sorbīts, lai atbilstu augstas ribozes osmolaritātei; Tārpu barība tika nodrošināta ar karstumu (100 grādi, 10 min) nogalinātu OP50, lai baktērijas nevarētu raudzēt cukuru. Lai novērstu inficēšanos ar pēcnācējiem, tārpi tika pārvietoti uz svaigām plāksnēm katru dienu 4 dienas, līdz tie bija pilnībā.

pabeigtsolu dēšana (7 dienu vecumā). Lai novērtētu ribozes ietekmi, mēs veicām izdzīvošanas testus un izmērījām autofluorescenci. Tārps bijauzskatīts par mirušu, kad tas nereaģēja uz maigu pieskārienu ar tārpu savācēju. Tārpi, kas nomira, pielipuši pie plāksnes sienas, netika iekļauti analīzē un tika cenzēti. Atsevišķā eksperimentāMGM, kas satur 50 µM (galīgaiskoncentrācija) rifampicīns (izšķīdinātsDMSO) tika izmantots. Katrs tests tika atkārtots divas reizes.


anti- senescence cistanche function

6. att. Vitellogenīna (Vit) un pagarinājuma faktora (EF) autofluorescence. aSpektrofotometrija (ex 325/em 350–600) vitellogenīna unpagarinājuma faktors pirms un pēc glikācijas in vitro ar ribozi 14 dienas: gly-Vit un gly-EF ir glikozēts vitellogenīns un glikāta pagarinājumsfaktors, attiecīgi. RiboFLFLavin (Rib) ir parādīts kā pārstāvisLFLuorescējošs savienojums. Salīdzinājumam ir parādīts ekstrakts no 17-dienu veciem tārpiem (savvaļas tipa N2) (C. elegans). b Vitellogenīna glikācija un pagarinājuma faktors ar ribozi in vitro izraisīja autofluorescences palielināšanos
laika gaitā.c AGE un vitellogenīnu Western blot analīze paraugos, kas iegūti no dažāda vecuma tārpu (savvaļas tipa N2) populācijām. Bloti tika iegūti no tā paša gēla un tika apstrādāti ar katru antivielu secībā.d Kvantifikācijavitellogenīnu un AGE no rietumiemblotēšana, izmantojot densitometriju. Eksperimenti tika atkārtoti divreiz, un ir parādīti reprezentatīvā eksperimenta dati. Gan līnija, gan punktēta līnija sarkanā krāsā parāda AGE locījuma izmaiņas, savukārt melnā krāsa norāda vitellogenīnu daudzumu. Slēgtie apļi un krusti ir paredzēti datiem par joslām, kas atbilst attiecīgi YP170 un YP115


Veco tārpu specifisko proteīnu identificēšana

3- un 17-dienu vecu nematožu ekstraktu masas spektrometrijas analīzetika veikta ar AB SCIEX 5800 LC-MALDI-TOF masas spektrometru (Ņuarka, NJ, ASV) ar Protein Pilot versiju 4.0. Abas matricas bijasagremo ar tripsīnu un sajauc ar matricas šķīdumu (7 mg/l - ciān-4-hidroksikanēļskābe 0,1% (v/v) trifluoretiķskābē (TFA), 70%
(v/v) acetonitrils (ACN)). Thebiedrsatdalīšanai izmantotais ātrums bija 300 ml/min,un atdalīšana tika panākta, izmantojot divu kustīgu fāžu lineāro gradientu ({{0}},1% (v/v) TFA 2% ACN (šķīdinātājs A) un 0,1% (v/v) TFA 80 procenti ACN(šķīdinātājs B)) šādās proporcijās: A/B= 100/0–50/50 (60 min), A/B= 50/50–0/100 (20 min), A/B= 0/100 (10 min). Lai iegūtu peptīdu masu, tika izmantota MALDI-TOF masas sistēmapirkstu nospiedums. Peptīdu saskaņošana unproteīnu meklēšana tika veikta, izmantojot Swiss-Prot versiju 57.0 datubāzi.


Ekstrahētie proteīni tika izšķīdināti 50 mM amonija bikarbonātā(AmBic), lai iegūtu olbaltumvielu koncentrāciju no 0,1 līdz 1 µg/µL. Lai palielinātu olbaltumvielu šķīdību, aprēķinātais ūdens tilpumsRapigest (Waters Corporation, Milford, MA, ASV) tika pievienots, lai iegūtu ražufinālās koncentrācijas 0.1–0.2 procenti Rapigest paraugos pirms sagremošanas. Paraugi
tika karsēti 40 grādos ar kratīšanu 10 minūtes; saturs toreiz bijacentrifugēja, un iegūtā granula tika suspendēta AmBic, kas satur 10 mM DTT. Paraugus karsēja 80 grādu temperatūrā 15 minūtes un granulēja istabas temperatūrā. 200 mM jodacetamīda (IAM) alikvota daļa 50 mMAmBic tika pievienots katram paraugam, lai iegūtu agalīgaisIAM koncentrācija

20 mM (ja ir 2x molārais DTT pārpalikums); maisījums tad bijainkubē tumsā istabas temperatūrā 30 minūtes, lai ļautu turpināties alkilēšanas reakcijai. Tripsīns 50 mM AmBic tika sajaukts ar katru šķīdumu 1:50 (tripsīns: olbaltumvielu koncentrācija). Paraugi tika sagremoti vismaz 4 stundas vai nakti 37 grādu temperatūrā, kratot. Sekojošscentrifugējot, pievienoja TFA un ACN, lai iegūtugalīgaiskoncentrācijas 0.5–1.0 % TFA un 2 % ACN pēc tilpuma. Paraugus krata 2 stundas 60 grādu temperatūrā. Pēc centrifugēšanas pie 22 200 ×g 5 min, supernatants bijapipeti automātiskā parauga ņemšanas flakonā. Iepriekš olbaltumvielas tika sagremotas ar tripsīnuanalizēt ar apgrieztās fāzes šķidruma hromatogrāfiju, izmantojot Ultimate3000RSnanoLC sistēmu (Thermo Fisher Scientific), kas savienota ar ESI-Q-TOF sistēmu (Impact II Bruker Daltonics). Rauga spirta dehidrogenāze(ADH1_YEAST) proteīns tika pievienots paraugos kā iekšējais standarts;tika veikta pievienošana, lai nodrošinātu daudzumu aptuveni 50 fmolstandarts uz kolonnas.


Autofluorescence pēc in vitro glikācijas

Vitellogenīns PBS šķīdumā ({{0}},053 µM) tika iegādāts no Biosense Laboratories AS (Bergena, NORVĒĢIJA). Pagarinājuma faktora šķīdums (1,17 µM) tika iegādāts no Abnova Corporation (Taipei City, Taivāna). Šie šķīdumi tika glikēti ar 0,1 mM ribozi 23 dienas 37 grādu temperatūrā. RiboFLFLavin tika iegādāts no Sigma (Tokija, Japāna) un izšķīdināts PBS pie 0,1 mM. Katrs šķīdums tika mērīts ar fluorescences spektrofotometriju tādos pašos apstākļos.

Imunofluorescencear jauniem un veciem tārpiemAr vecumu sinhronizēti CB1003, kas baroti ar OP50, tika inkubēti 25 grādu temperatūrā. Trīs dienas veci un 13-dienu veci pieaugušie tika caurlaidīgi, izmantojot Bouin's caurules fiksācijas protokols43.


anti- senescence cistanche function

7. att. 3-dienu veco un 13-dienu veco kynu-1 mutantu fluorescences attēli. a–cTrīs dienas veci tārpi und–f 13-dienu veci tārpi, ar neapstrādātiem attēliem 1. slejā. Lai izslēgtu iespējamās nāves sekasFluorescence, kas sākas 2 dienas pirms tārpiem' nāve, mutantskynu-1tika lietots. Autofluorescence ir redzama attēlos 2. un 3. ailē. Fotoattēli 3. ailē tika palielināti no norādītajiem (ar taisnstūriem) 2. kolonnas attēlu apgabaliem. Novecojuši tārpi (13-dienu veci) autofluorescējasigniFifiievērojami augstāks par jauniem tārpiem (3-dienu veciem). Katra mēroga josla norāda 50μm. g Kvantitatīvā noteikšanano zilaFluorescencesizmantojot ImageJ un ImageQuant TL programmatūru. Katra josla apzīmē vidējās vērtībasFluorescences intensitāte uz 1 mm2 no deviņiem tārpiem. ** norāda statistiski zīmiFifinevar atšķirties starp 3-dienu veciem un 13-dienas tārpiem pie ap vērtība < 0.01. Kļūdu joslas apzīmē SE.

Paraugi bijafiksētsin Bouin's fiksatorsar metanolu/ - merkaptoetanolsistabas temperatūrā 30 min. Lai saplaisātu kutikulu, tajā tika ievietoti tārpiizopropanolu un uzglabā plkst–80 grādu temperatūrā 10 minūtes, pēc tam inkubē istabas temperatūrā vēl 30 minūtes. Thefiksatorsšķīdums tika noņemts unaizstāts ar BTB šķīdumu (25 mM borāta buferšķīdums, 0,5 procenti Triton X-100, 2 procenti
-merkaptoetanols) istabas temperatūrā 1 stundu; inkubācija BTB bijaatkārto kopā trīs reizes. Pēc tam tārpi tika pārvietoti no BTB uz BT (25 mM borāta buferis, 0,5 procenti Triton X-100), inkubēti antivielu buferšķīdumā (1 × PBS, 0,5 procenti). Triton X-100, 0,1 mM EDTA, {{10}},1 procenti liellopu seruma albumīna (BSA), 0,05 procenti nātrija azīda, pH 7,2) istabas temperatūrā

1 h, un bloķēts ar antivielu buferšķīdumu, kas satur 10 procentus kazas seruma(Cosmo Bio, Tokija, Japāna) 4 grādos naktī. Primārās antivielas sastāvēja no peles monoklonālās anti-AGE (anti-CML) antivielas (klons Nr. 6D12; 1:125) un anti-pentosidīna antivielas (klona Nr. PEN-12, Trans Genic; 1:5 0). Sekundārā antiviela sastāvēja no Alexa Fluor 555- konjugētas kazas antivielas pret peles (Abcam, Kembridža, Anglija; 1:100). Visi antivielu atšķaidījumi tika veikti, izmantojot antivielu buferšķīdumu, kas satur 0,5 procentus BSA. Paraugi tika uzstādīti uz stikla priekšmetstikliņiem, izmantojot VECTASHIELD pretizbalēšanas montāžas līdzekli (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ASV).



Fluorescences mikroskopija

3- vai 13-dienu vecu pieaugušu tārpu fluorescences attēli, kas uzstādīti uz stikla priekšmetstikliņiem, kā aprakstīts iepriekš, tika ierakstīti, izmantojot apgrieztuFluorescencemikroskops (BZ-X700; Keyence) ar 10× objektīvu (CFI Plan Fluor DL10×/0,30). AutoFLFLtārpu uorescence un sarkanafluorescenceno AlexaFluor 555 tika skatīts ar BZ-X DAPI (ierosmes viļņa garums (Ex), 360 ± 20 nm; emisijas viļņa garums (Em), 460 ± 25 nm) un TRITC (Ex, 545 ± 20 nm)12,5 nm; Em, 605 ± 35 nm)filtriem, attiecīgi. Sadaļu attēli bijatverts sagriešanas režīmā ar viendimensijas spraugas tipu ar aplatums 32, un Z veida kaudzes solis 0.7μm par 40-μm biezi paraugi. Lai noteiktu ziloFluorescences,Fluorescencesintensitātes, ko mēra ar attēlu
Quant TL programmatūra (GE Healthcare) tika normalizēta līdz blīvuma vērtībām uz 1 mm2 no tārpa's projekcijas laukums. Ķermeņa izmērs tika noteikts ar Adobe Photoshop Elements un ImageJ programmatūru, ko izstrādājuši Nacionālie veselības institūti. Šajā sistēmā tārpa laukums's projekcijatika novērtēts automātiski un izmantots kā ķermeņa izmēra indekss.



Statistiskā analīze

Dzīves ilguma korelācija tika aprēķināta, izmantojot Spīrmenu's ranga korelācijas koeficients. Autofluorescences līmeņi pēc in vitro glikācijas tika salīdzināti, izmantojot divu faktoru faktoriālo ANOVA un Scheffe's F pārbaude. TheELISA vērtības pēc in vitro glikācijas tika salīdzinātas, izmantojot viena faktora ANOVA un Dunnett testu vairākiem salīdzinājumiem. Nematodes izdzīvošanatika aprēķināts pēc Kaplan–Meiera metodes un izdzīvošanas atšķirību nozīmīgums tika pārbaudīts, izmantojot log-rank testu. Autofluorescences vērtības pēc rifampicīna terapijas un novecošanasdaf-2unkynu-1mutanti tika salīdzināti katram, izmantojot Studentu's t tests, atkārtota mērījuma divu faktoru ANOVA un Mann–VitnijaU pārbaude. Autofluorescences vērtības pēc ribozes apstrādes ar N2 vaikynu-1mutants tika salīdzināts, izmantojot neparametrisko tēraudu–Dwass metode. Autofluorescences mikroskopijas blīvumi tika salīdzināti, izmantojot Studentu's t-tests. Ja tika novērota nozīme, dati tika klasificētiFified kā *p < 0.05 and **p < 0.01. All statistiskās analīzes tika veiktas ar Microsoft Excel, kas papildināta arpievienojumprogrammatūraplusStatcel 3 (OMS, Tokija, Japāna) un JSTAT operētājsistēmai Windows(Nankodo, Tokija, Japāna).


Pārskatu kopsavilkums

Sīkāka informācija par pētījumu plānošanu pieejama Dabas pētījumosPārskatu kopsavilkums, kas saistīts ar šo rakstu.


DATU PIEEJAMĪBA

Pašreizējā pētījuma laikā ģenerētās datu kopas ir pieejamas korespondencēautoru pēc pamatota pieprasījuma.



ATSAUCES

1. Brenner, S. The genetics ofCaenorhabditis elegans. Ģenētika 77, 71–94 (1974).
2. Riddle, DL, Blumenthal, T., Meyer, BJ, Priess, JR (eds.).C. elegans II. (AukstsPavasaris osta Laboratorija Prese, Auksts Pavasaris Osta, 1997).
3. Herndon, LA et al. Stohastiskie un ģenētiskie faktori ietekmē audu specifisko novecošanās samazināšanosC. elegans. Daba 419, 808–814 (2002).
4. Klass, MR Aging in the nematodeCaenorhabditis elegans: galvenie bioloģiskie un vides faktori, kas ietekmē dzīves ilgumu.Meh. Aging Dev. 6, 413–429 (1977).
5. Son, HG, Altintas, O., Kim, EJE, Kwon, S. & Lee, SV Age-dependent changes and biomarkers of aging inCaenorhabditis elegans. Novecojoša šūna 18, e12853 (2019).
6. Yoshino, J., Mills, KF, Yoon, MJ & Imai, S. Nikotīnamīda mononukleotīds, galvenais NAD (plus) vidējais, ārstē uztura un vecuma izraisīta diabēta patofizioloģiju pelēm.Šūnu Metab. 14, 528–536 (2011).
7. Denzel, MS, Lapierre, LR & Mack, HID Jaunās tēmasC. elegansnovecošanās pētījumi: transkripcijas regulēšana, stresa reakcija un epigenētika.Meh. Age ing Dev. 177, 4–21 (2019).
8. Ikeda, T., Yasui, C., Hoshino, K., Arikawa, K. & Nishikawa, Y. InFLFLpienskābes baktēriju ietekme uz ilgmūžībuCaenorhabditis elegansun saimnieka aizsardzība pret salmonelluzarnās šķīstošsserovars Enteritidis.Appl. Vide. Microbiol. 73, 6404–6409 (2007).
9. Komura, T., Ikeda, T., Yasui, C., Saeki, S. & Nishikawa, Y. Mechanism underlying pro-longevity induced by bifidobacteria inCaenorhabditis elegans. Biogerontoloģija 14, 73–87 (2013).
10. Clark, LC & Hodgkin, J. Commensals, probiotikas un patogēniCae Caenorhabditis elegansmodelis.Šūnu mikrobiols. 16, 27–38 (2013).
11. Cabreiro, F. & Gems, D. Tārpiem ir nepieciešami arī mikrobi: mikrobiota, veselība un novecošanāsCaenorhabditis elegans. EMBO Mol. Med. 5, 1300–1310 (2013).
12. Kim, Y. & Mylonakis, E.Caenorhabditis elegansImūnsistēmas kondicionēšana ar probiotisko baktērijuLactobacillus acidophiluscelms NCFM uzlabo grampozitīvas imūnās atbildes.Inficēt. Immun. 80, 2500–2508 (2012).
13. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N. & Driscoll, M. In vivo spektrofluorimetryatklāj endogēnos biomarķierus, kas ziņo par veselības ilgumu un uztura ierobežojumiemCaenorhabditis elegans. Novecojoša šūna 4, 127–137 (2005).
14. Coburn, C. et al. Antranilātsfluorescenceiezīmē kalcija izplatītu nekrotisku vilni, kas veicina organisma nāviC. elegans. PLoS Biol. 11, e1001613 (2013).
15. Pincus, Z., Mazer, TC & Slack, FJ AutoFLFLuorescence kā novecošanās mērsC. elegans: skatieties uz sarkanu, nevis zilu vai zaļu.Novecošana (Albani, Ņujorka) 8, 889–898 (2016).
16. Sebekova, K. & Sebekova, KB Glikētie proteīni uzturā: draugs vai ienaidnieks?Exp. Gerontols. 117, 76–90 (2019).
17. Giacco, F. & Brownlee, M. Oksidatīvais stress un diabēta komplikācijas.Circulation Res. 107, 1058–1070 (2010).
18. Srikanth, V. et al. Uzlaboti glikācijas galaprodukti un to receptors RAGE Alcheimera gadījumā's slimība.Neirobiol. Novecošana 32, 763–777 (2011).
19. Zhuo, Q., Yang, W., Chen, JY & Wang, Y. Metaboliskais sindroms satiekas ar osteoartrītu.Nat. Rev. 8, 729–737 (2012).
20. Gkogkolou, P. & Bohm, M. Uzlaboti glikācijas gala produkti: galvenie ādas novecošanas dalībnieki?Dermatoendokrinols 4, 259–270 (2012).
21. Liu, J. et al. Uzlabotas glikācijas galaproduktu receptors veicina priekšlaicīguproksimālo cauruļveida epitēlija šūnu novecošanās, aktivizējot endoplazmuno tīkla stresa atkarīga p21 signalizācija.Šūnas signāls 26, 110–121 (2014).

22. Mendler, M., Schlotterer, A., Morcos, M. & Nawroth, PP. Izpratne par diabētisko polineiropātiju un ilgmūžību: ko mēs varam mācīties no nematodesCae norhabditis elegans? Exp. Clin. Endokrinols. Diabēts 120, 182–183 (2012).


Jautājiet vairāk:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950


























Jums varētu patikt arī