Pamatojoties uz tīkla farmakoloģiju un eksperimentiem ar dzīvniekiem, lai izpētītu Cistanche Tubulosa feniletanoīda glikozīda ietekmi uz diabētiskās nefropātijas ietekmi

Abstract: Mērķis Izpētīt ietekmiCistanchefeniletanola glikozīdi(CPhGs) ieslēgtsdiabētiskā nieru slimība(DKD), pamatojoties uz tīkla farmakoloģiju un eksperimentiem ar dzīvniekiem. Metodes UHPLC-QE-MS metode tika izmantota, lai analizētuCPhG ķīmiskās sastāvdaļas. TCMSP un Swiss Target Prediction datu bāzes tika izmantotas, lai pārbaudītu galvenos komponentus. OMIM un GeneCards datu bāzes tika izmantotas, lai iegūtu ar DKD saistītus mērķus. Pēc kopīgu mērķu iegūšanas vietne STRING tika izmantota, lai izveidotu proteīnu mijiedarbības tīklu. DAVID datu bāze tika izmantota GO, KEGG ceļa analīzei un Cytoscape programmatūra tika izmantota, lai izveidotu "CPhGs galvenā komponenta-mērķa ceļa" tīklu. Desmit žurkas tika nejauši izvēlētas kā parastā grupa, un pārējās žurkas tika barotas ar barību ar augstu cukura un tauku saturu un tika veikta viena STZ intraperitoneāla injekcija, lai izveidotu DKD modeli. Tie tika sadalīti modeļu grupā, dapagliflozīna (1 mg/kg) grupā un CPhG ar augstu un vidēju un zemu devu (500, 25{{40}}, 125 mg/kg) grupās, 10 dzīvnieks katrā grupā, zāļu iejaukšanās 6 nedēļas, tika novēroti vispārējie stāvokļi, noteikta ķermeņa masa un katru nedēļu pārbaudīts glikozes līmenis asinīs; 24 stundu urīns tika savākts pēc pēdējās devas. Noteikt 24-stundu kopējo urīna proteīnu (24-UTP); savākt asinis no vēdera aortas un upurēt tās, atdalīt serumu un noteikt urīnvielas slāpekli (BUN), urīnskābi (UA), kopējo holesterīnu (TC), triglicerīdus (TG) un augstu asinsspiedienu. Lai novērotu patoloģiskas izmaiņas nieru audos, tika izmantots augsta blīvuma lipoproteīnu (ABL) un zema blīvuma lipoproteīnu (ZBL) līmenis, HE krāsošana un Masona krāsošana, ELISA tika izmantota, lai noteiktu seruma IL-1, IL{{17} } un TNF- līmeni, un Western blot tika izmantots, lai noteiktu nieru audus. JAK2, p-JAK2, STAT3, p STAT3, SOCS3 proteīna ekspresija. Rezultāti Kopā ar UHPLC-QE-MS tehnoloģiju tika atklāti 699 komponenti. Pēc skrīninga tika iegūti 16 CPhG galvenie komponenti un 323 saistītie mērķi. CPhG un DKD kopīgi bija 99 mērķi. Galvenie mērķi bija STAT3, SRC, EGFR uc DKD ārstēšana ar CPhG. CPhG var palielināt DKD žurku ķermeņa svaru (P＜0,01), samazināt ūdens patēriņu (P＜0,01), regulēt glikozes un lipīdu metabolismu, samazināt 24-UTP un BUN līmeni (P＜0,01) un uzlabot nieru audus. . Patoloģiskie bojājumi samazināja p-JAK2/JAK2 un p-STAT3/STAT3 proteīnu ekspresiju nieru audos (P＜0,01) un palielināja SOCS3 proteīna ekspresiju (P＜0,01). Secinājums CPhG iejaucas DKD, izmantojot vairākus komponentus, vairākus mērķus un vairākus ceļus, iespējams, inhibējot JAK2/

STAT3 signalizācijas ceļš.

Atslēgvārdi: Cistanche feniletanola glikozīds; diabētiskā nefropātija; UHPLC-QE-MS; tīkla farmakoloģija; eksperiments ar dzīvniekiem; JAK2 / STAT3 signalizācijas ceļš

CIK ILGS IR VAJADZĪGS, LAI CISTANČE STRĀDĀS NIERU PACIENTIEM?

Diabēta nieru slimība (DKD), kā viena no svarīgākajām diabēta mikrovaskulārajām komplikācijām, ir ne tikai primārais faktors, kas izraisahroniska nieru slimībabet arī galvenais beigu stadijas nieru slimības (ESRD) cēlonis visā pasaulē. Iemesls [1-2]. DKD klīniskā ārstēšana galvenokārt ietver, pirmkārt, cukura līmeni asinīs, asinsspiedienu un lipīdu līmeni asinīs un, otrkārt, nieru funkcijas aizsardzību, izvairīšanos no nefrotoksisku zāļu lietošanas un dzīvesveida uzlabošanu [3-4]. Tomēr, ņemot vērā DKD sarežģīto patoģenēzi un konkrētu intervences mērķu trūkumu, pašreizējām ārstēšanas iespējām ir ierobežojumi un tās nav efektīvas. Saslimstība ar beigu stadijas DKD joprojām pieaug. Tāpēc ir ļoti svarīgi atrast efektīvas dabīgas zāles.

Cistanche Deserticola Y. C. Ma vaiCistanče C.Žāvēti gaļīgie kātiCistanche tubulosa (Schenk) Wightar zvīņainām lapām [5] pirmo reizi tika ierakstītas "Shen Nong's Materia Medica" un tika uzskaitītas kā augstākās klases. Tie ir pazīstami kā "tuksneša žeņšeņs" [6]. Tie ir saldi, sāļi un silti. , atgriežas nierēs un resnās zarnas meridiānos, un tam ir nieres yang barojoša, esences un asiņu papildināšana, zarnu mitrināšana un caureju veicinoša iedarbība. Pētījumi liecina, ka feniletanoīdu glikozīdi (CPhG) ir viena no galvenajām aktīvajām sastāvdaļām un ir atbildīgi par tās attīstību.

Materiāls pamats farmakoloģiskās iedarbības veikšanai; Cistanche ekstraktam piemīt pretdiabēta [7-8], pret aknu vēzi [9], nieres aizsargājoša [10-11], neiroprotektīva [12-13] un cita farmakoloģiska iedarbība, bet šobrīd CPhG nav efektīvas DKD ārstēšanā. Tās ietekme un mehānismi ir neskaidri.

Šajā pētījumā tika izmantotas tīkla farmakoloģijas un molekulārās dokstacijas metodes [14], par pētījuma objektu ņemot CPhG, prognozējot un analizējot tā galvenās aktīvās sastāvdaļas un iespējamos mērķus DKD ārstēšanā, un pēc tam izveidojot streptozocīna (STZ) izraisītu augstu DKD žurku modelis, kas barots ar lipīdu barību, tika izmantots kā in vivo izpētes priekšmets, lai sniegtu atsauci saistītu ārstēšanas metožu klīniskai paplašināšanai un pielietošanai un turpmākiem darbības mehānisma pētījumiem.

1 materiāls

1.1 Dzīvnieki

70-nedēļu veci SD žurku tēviņi ar SPF līmeni, ķermeņa svars (240±20) g, tika iegādāti no Sjiņdzjanas Medicīnas universitātes Dzīvnieku eksperimentu centra [Licences izmantošana izmēģinājumos ar dzīvniekiem Nr. SYXK (jauna) {{4} }], pie Dzīvnieki tika adaptīvi audzēti 1 nedēļu temperatūrā (22 ± 2) grādi, relatīvajā mitrumā no 50% līdz 70%, un 12 h/12 ​​h mainīgā gaismas un tumsas ciklā. Eksperimentu apstiprināja Sjiņdzjanas Medicīnas universitātes Medicīnas eksperimentālo dzīvnieku centra (ētikas numurs IACUC-20220127-19) Dzīvnieku ētikas komiteja.

1.2. Reaģenti un zāles

CPhGs (batch number 201610, purity >80%) nodrošināja Xinjiang Hotan Dichen Co., Ltd. Dapagliflozīns (partijas numurs NB2248) tika iegādāts no AstraZeneca, Apvienotās Karalistes. Barība ar augstu cukura un tauku saturu (kat. Nr. Boaigang-B1135DM) un STZ (partijas Nr. 2021110307) tika iegādāta no Beijing Boai Port Biotechnology Co., Ltd.; urīna mikroalbumīns (sērijas Nr. 20220611), urīnvielas slāpeklis (partijas Nr. 20220626), urīnskābe (partijas Nr. 20220613), kopējais holesterīns (partijas numurs 20220615), triglicerīdi (partijas numurs 20220615), triglicerīdi (partijas numurs 20220616), augsts 2-proteīnu skaits 2 (20220616), augsts 0-proteīnu skaits 20. ), un zema blīvuma lipoproteīns (partijas numurs 20220615) tika iegādāts no Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūta; interleikīns-6 (IL-6, partijas numurs JL20896), interleikīns-1 (IL-1, partijas numurs JL20884) un audzēja nekrozes faktors- (TNF-, partijas numurs 13202 ) tika iegādāti no Shanghai Jianglai Biotechnology Co., Ltd.; JAK2 truša poliklonālā antiviela (partijas numurs 22v9316), p-JAK2 truša poliklonālā antiviela (partijas numurs 78g9360), STAT3 truša poliklonālā antiviela (partijas numurs 15x8824), p-STAT3 truša poliklonālā antiviela (partijas numurs 74mlont3 truša antiviela) numurs 31d4841) visi tika iegādāti no Jiangsu Qianke Biotechnology Research Center Co., Ltd.; Ar HRP iezīmēta kazas anti-trušu IgG poliklonālā antiviela (partijas numurs 20000758) tika iegādāta no Wuhan Mitaka Biotechnology Co., Ltd.; -aktīna truša monoklonālā antiviela (sērijas numurs AC230205001), RIPA līzes buferis (sērijas numurs 20220416), BCA proteīna koncentrācijas noteikšanas komplekti (partijas numurs 20230401) tika iegādāti no Beijing Solebao Technology Co., Ltd.

1. 3 Instrumenti

Vanquish īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfija, Q Exactive Focus augstas izšķirtspējas masas spektrometrs, Heraeus Fresco17 centrifūga, FC automātiskais mikroplašu lasītājs (Thermo Fisher Scientific, ASV); JXFSTPRP-24 dzirnaviņas (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd.); Mingche D24 UV tīra ūdens skaitītājs (Vācija Merck Millipore Company); ACQUITY UPLC BEH C18 kolonna (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm) (American Waters Company); Accu Chek Performa asins glikozes mērītājs (Swiss Roche Company); CM1850UV kriostats, DM300 vertikālais fluorescences mikroskops (Leica Company, Vācija); GL-88B virpuļmetrs (Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., Ltd.); elektroniskie analītiskie svari (Bio-Rad Company, ASV).

2 metodes

2. 1 UHPLC-QE-MS analīze

2.1.1. Testa šķīduma sagatavošana

Nosveriet 100 mg CPhG, pievienojiet 500 μL 80% metanola, 30 s virpuļojiet, 1 stundu apstrādājiet ar ultraskaņu ledus ūdens vannā, ļaujiet nostāvēties -40 grādu temperatūrā 1 stundu, centrifugējiet 4 grādos. , 12 000 apgr./min 15 minūtes, aspirējiet supernatantu, 0. Filtrējiet caur 22 μm mikroporainu membrānu un uzglabājiet -80 grādu ledusskapī.

2.1.2. Hromatogrāfiskie apstākļi

ACQUITY UPLC BEH C18 kolonna (1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm); kustīgās fāzes acetonitrils (A) -1% skudrskābe (B), gradienta eluēšana (0 ~ 11 min, 15% ~ 75% A; 11 līdz 12 min, 75% līdz 98% A; 12 līdz 14 min, 98% A; 14 līdz 14,1 min, 98% līdz 15% A; 14,1 līdz 15%; Tilpuma plūsmas ātrums 0 . 5 ml/min; kolonnas temperatūra 35 grādi ; injekcijas tilpums 5 μL.

2.1.3. Masu spektrometrijas apstākļi

pilnas skenēšanas ddMS2 pilnas skenēšanas režīms; apvalka gāzes tilpuma plūsmas ātrums 45 arb; palīggāzes tilpuma plūsmas ātrums 15 arb; kapilārā temperatūra 400 grādi ; sadursmes enerģija NCE režīmā 15% ~ 30% ~ 45% cikls; smidzināšanas spriegums ± 4,0 kV.

2.2. Tīkla farmakoloģijas pētījumi

2. 2. 1 CPhG

Komponentu mērķa skrīnings: kārtojiet UHPLC-QE-MS analizētos ķīmiskos komponentus pēc relatīvā satura un izdzēsiet tos, kuru ķīmiskā struktūra vēl nav noteikta. Ievadiet pārbaudīto sastāvdaļu InChIKey sērijas numuru TCMSP datu bāzē, lai iegūtu katras sastāvdaļas farmakokinētiskos parametrus. Pamatojoties uz nosacījumiem, ka perorālā biopieejamība (OB) > 30% un līdzība zālēm (DL) > 0,18, tiks pārbaudīti kandidāti, kuri atbilst prasībām. Ievadiet katra komponenta SMILES numuru Swiss Target Prediction datubāzē, lai paredzētu mērķi un iegūtu CPhG ķīmiskās sastāvdaļas mērķi.

2. 2. 2 DKD

Slimības mērķa skrīnings Izmantojiet "diabētiskā nefropātija" kā meklēšanas vienumu, lai meklētu slimības mērķus OMIM, GeneCards un NCBI datubāzēs.

2. 2. 3 Komponentu-mērķa-slimību tīkla izveide

CPhG komponentu un slimību savstarpējie mērķi tika iegūti, izmantojot R programmatūras kartēšanu, un programmatūra Cytoscape 3.7.2 tika izmantota, lai izveidotu komponentu mērķa tīkla sistēmu, kurā analīzes spraudnis atklāja galvenos mērķus.

2. 2. 4 Proteīna-olbaltumvielu mijiedarbības tīkla (PPI) izveide

Importējiet komponentu un slimību krustpunktu mērķa proteīnus STRING datu bāzē, izveidojiet proteīnu-olbaltumvielu mijiedarbības tīklu (PPI), dzēsiet proteīnus bez savienotiem mezgliem tīklā un iestatiet zemākā proteīnu mijiedarbības rezultāta ticamības līmeni uz {{1} }.700. Izveidojiet PPI tīklu, lejupielādējiet tā TSV formāta rezultātus, importējiet tos Cytoscape 3.7.2 programmatūrā un izmantojiet analīzes spraudni, lai turpinātu ekrāna galvenos mērķus.

2. 2. 5 GO, KEGG analīze

Izmantojiet DAVID datubāzes sadaļu Funkcionālā anotācija, lai veiktu komponentu slimību krustošanās mērķu bagātināšanas analīzi. Vispirms iestatiet analīzes parametrus, lodziņā Gēnu saraksts ievadiet krustojuma mērķi, kā mērķa identifikatoru atlasiet oficiālo gēna simbolu, kā datu tipu (saraksta veids) atlasiet Gēnu saraksts un kā mērķa avots (Suga). Race)", sāciet analīzi pēc analīzes parametru apstiprināšanas, iegūstiet GO un KEGG analīzes rezultātus un pēc tam izmantojiet ImageGP tiešsaistes zīmēšanas platformu, lai uzzīmētu KEGG un GO analīzes rezultātu burbuļu diagrammu. Programmatūra Cytoscape 3.7.2 konstruē komponentu -mērķa ceļa tīkla attēls.

2. 2. 6 Molekulārā doka

Vispirms lejupielādējiet aktīvās sastāvdaļas 3D struktūras diagrammu SDF formātā no PubChem datu bāzes, pēc tam lejupielādējiet krustojuma mērķa 3D struktūras diagrammu PBP formātā no ASV globālās olbaltumvielu datu bāzes (PDB) un visbeidzot augšupielādējiet to CB-Dock. vietne molekulārajai dokstacijai. Pārlūkojiet dominējošās dokstacijas un vizualizējiet tās ar Pymol.

2.3. Eksperimenti ar dzīvniekiem

2.3.1. Modelēšana, grupēšana un zāļu ievadīšana

10 žurkas tika nejauši izvēlētas kā parastā grupa un barotas ar parasto barību, bet pārējās žurkas tika barotas ar barību ar augstu cukura un tauku saturu. Pēc 6 nedēļām viņiem tika ievadīta vienreizēja intraperitoneāla injekcija 30 mg/kg STZ (0,1 mmol/L STZ, kas izšķīdināts pH 4,5 nātrija citrāta buferšķīdumā), un pēc 72 stundām tika paņemtas asinis no astes vēnas. lai noteiktu glikozes līmeni asinīs tukšā dūšā (FBG). Ja FBG ir lielāks vai vienāds ar 16,7 mmol/L, diabēta modelis tika veiksmīgi izveidots [15]; turpināt Viņi 2 nedēļas tika baroti ar barību ar augstu cukura un tauku saturu. Tika noteikts, ka DKD modelēšana ir veiksmīga, pamatojoties uz urīna glikozes pozitivitāti un 24-stundu kopējo urīna proteīnu (24-UTP), kas ir lielāks vai vienāds ar 20 mg. No tiem 3 gāja bojā modelēšanas procesā un 7 bija neveiksmīgi. , kopā 50 bija veiksmīgi. Žurkas, kuras tika veiksmīgi modelētas, tika nejauši sadalītas modeļu grupā, dapagliflozīna grupā (1 mg/kg) un CPhG lielas, vidējas un mazas devas (500, 250, 125 mg/kg) grupās. Katra ievadīšanas grupa tika ievadīta intragastrāli. Žurkām parastajā grupā un modeļa grupā tika ievadītas atbilstošas ​​zāles, un žurkām normālajā grupā un modeļa grupā vienu reizi dienā ar zondi tika ievadīts vienāds daudzums parastā fizioloģiskā šķīduma, kopā 6 nedēļas. Ievadīšanas periodā žurkām katrā grupā, izņemot parasto grupu, turpināja dot barību ar augstu tauku saturu.

2.3.2. Bioķīmisko indikatoru noteikšana

Pēc 6 nedēļām ilgas CPhG iejaukšanās no žurkām tika savākts 24-stundu urīns un tika izmērīts 24-stundu kopējais urīna proteīns (24-UTP); asinis tika savāktas no tukšā dūšā astes vēnas, lai noteiktu FBG līmeni; asinis tika savāktas no vēdera aortas, 4 grādi, 1500 apgr./min. Centrifugējiet 10 minūtes, lai atdalītu serumu un noteiktu seruma urīnvielas slāpekli.

BUN), urīnskābes (UA), kopējā holesterīna (TC), triglicerīdu (TG), augsta blīvuma lipoproteīnu (ABL), zema blīvuma lipoproteīnu (zema blīvuma lipoproteīnu ZBL) līmenis.

2.3.3. Nieru audu patoloģiskās morfoloģijas novērošana

Žurkas tika anestēzētas ar nātrija pentobarbitālu un nonāvētas. Nieres tika nolobītas, nosvērtas, fiksētas ar 4% paraformaldehīdu, dehidrētas, caurspīdīgas, iemērc vaskā, iestrādātas un sadalītas hematoksilīna-eozīna (HE) krāsošanai.

Pēc Masona krāsošanas audu morfoloģija tika novērota mikroskopā, un programmatūra Image-Pro Plus 6.{2}} tika izmantota, lai analizētu integrēto optisko blīvumu un kvantitatīvi noteiktu relatīvo kolagēna šķiedras laukumu.

2. 3. 4 ELISA

Metode tika izmantota, lai noteiktu seruma iekaisuma faktoru līmeni žurkām. IL-6, IL-1 un TNF- līmenis tika noteikts saskaņā ar komplekta norādījumiem.

2. 3. 5 Western blot metode saistīto proteīnu ekspresijas noteikšanai

Tika ņemti žurku nieru audi, pievienots RIPA lizāts, lai ekstrahētu kopējo proteīnu, un koncentrācija tika noteikta ar BCA metodi.

Pēc nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzes pārnes uz PVDF membrānu un pēc bloķēšanas JAK2 (1: 2000), p-JAK2 (1: 1000), STAT3 (1: 2000), p -STAT3 (1: 2000), SOCS3 (1:2000), -aktīna (1:2000) antivielas, inkubējiet 4 grādu temperatūrā nakti, pievienojiet ar HRP iezīmētu IgG sekundāro antivielu (1:5000) un inkubējiet istabas temperatūrā 1 stundu, izstrādātas ar elektroluminiscences komplektu, eksponētas ar proteīna gēla attēlu, izmantojot Image J programmatūru

Gabalu kvantitatīvā analīze. Izmantojot -aktīnu kā iekšējo atsauci, mērķa joslas un iekšējās atsauces joslas pelēkās vērtības attiecība ir relatīvā proteīna ekspresija.

2.4. Statistiskā analīze

Dati tika apstrādāti ar SPSS 25.{1}} programmatūru, un dati tika izteikti kā (x±s). Grupu salīdzināšanai tika izmantota vienvirziena dispersijas analīze. P<0.05 indicates that the difference is statistically significant.