BCAT2 veido neiekaisīgu audzēja mikrovidi un izraisa rezistenci pret anti-PD-1/PD-L1 imūnterapiju, negatīvi regulējot proinflammatoriskus ķīmokīnus un pretvēža imunitāti
Oct 25, 2023
Lai uzlabotu imūnās kontrolpunkta blokādes (ICB) monoterapijas atbildes reakciju, ir nepieciešams atrast jaunu mērķi kombinētajā terapijā. Analizējot ar audzēja mikrovidi (TME) saistītos rādītājus, ir apstiprināts, ka BCAT2 veido neiekaisīgu TME urīnpūšļa vēža gadījumā. Multiomikas rezultāti liecina, ka BCAT2 inhibē citotoksisko limfocītu piesaisti, ierobežojot proinflammatorisko citokīnu / ķemokīnu saistīto ceļu un T-šūnu-ķīmotakses ceļu aktivitātes. Imūntesti atklāj, ka ar CD8+T-šūnām saistīto ķīmokīnu sekrēcija saglabā spēcīgu negatīvu korelāciju ar BCAT2, radot CD8+T šūnu samazināšanās tendenci ap BCAT2+ audzēja šūnām no tālu līdz tuvumā. Vienlaicīgai BCAT2 deficīta un anti-PD-1 antivielu ārstēšanai ir sinerģiska iedarbība in vivo, kas norāda uz BCAT2 potenciālu kombinētajā terapijā. Turklāt BCAT2 vērtība imūnterapijas efektivitātes prognozēšanā ir apstiprināta vairākās imūnterapijas grupās. Kopā kā galvenā TME molekula BCAT2 ir jauns mērķis kombinācijā ar ICB un vadošās precīzās terapijas biomarķieri.
Cistanche tubulosa-Antitumor priekšrocības
1. Ievads
Urīnpūšļa vēzis (BLCA) ir viens no visbiežāk sastopamajiem ļaundabīgajiem audzējiem urīnceļu sistēmā.[1] Tiek lēsts, ka katru gadu visā pasaulē tiek diagnosticēti vairāk nekā 430,{2}} pacienti.[2] Neskatoties uz radikālu ķirurģisku ārstēšanu, gandrīz pusei pacientu ar muskuļu invazīvu urīnpūšļa vēzi rodas metastāzes.[3] Tādējādi sistēmiskai terapijai ir svarīga loma progresējoša urīnpūšļa vēža gadījumā. Attīstoties imūnterapijai, jo īpaši imūnsistēmas kontrolpunktu blokādei (ICB), uzkrātie pierādījumi liecina, ka ICB ir lielisks sniegums audzēju slodzes likvidēšanā.[4] Tomēr joprojām ir liels skaits pacientu, kuri nereaģē uz ICB monoterapiju primārās vai iegūtās rezistences dēļ.[5] Lai atrisinātu neapmierinātās klīniskās vajadzības, citu racionālu terapiju kombinācija ar ICB sniedz pavisam jaunu ieskatu monoterapijas rezistencē. Audzēja mikrovide (TME) ir sarežģīta sistēma, un tai ir liela ietekme uz imūnterapijas efektivitāti.[6] Ar nepietiekamu citotoksisko T limfocītu (CTL) infiltrācijas līmeni neiekaisušais TME tika uzskatīts par kritisku faktoru, kas nespēj radīt spēcīgu pretvēža imūnreakciju imūnterapijas laikā.[7] Tāpēc ir ļoti svarīgi atrast galveno molekulu, kas var pārveidot neiekaisušo TME par iekaisušo TME un kas varētu būt kombinētas terapijas mērķis. Sazarotās ķēdes aminotransferāze 2 (BCAT2) ir sēra aminoskābju metabolisma procesa galvenais enzīms.[8] Li et al. atklāja, ka BCAT2 ir būtiska aizkuņģa dziedzera vēža attīstībai, veicinot sazarotās ķēdes aminoskābju (BCAA) katabolismu.[9] Lī et al. parādīja, ka BCAT2 deficīts kavē aizkuņģa dziedzera ductal adenokarcinomas (PDAC) audzēja augšanu, regulējot lipīdu metabolismu.[10] Lai gan bija vairāki pētījumi, kas dokumentēja, ka BCAT2 tieši ietekmēja audzēju bioloģisko procesu, regulējot ar vielmaiņu saistītos ceļus, tā loma TME imūnsistēmas regulēšanā nekad nav pētīta. Mūsu pētījumā, veicot visaptverošu ar TME saistīto rādītāju analīzi Xiangya BLCA kohortā un vairākās publiskajās BLCA grupās, mēs pārbaudījām, ka BCAT2, iespējams, veido imūnsupresīvu TME BLCA. Lai izpētītu molekulāros mehānismus, mēs turpinājām veikt vienšūnu RNS sekvencēšanu (siRNA seq) un lielapjoma RNS sekvenci, atklājot, ka BCAT2 ir represīva loma CTL piesaistīšanā TME, inhibējot citokīnu / ķemokīnu saistīto signālu ceļu aktivitātes un Tšūnu-ķīmotakses signālu ceļi. In vitro vairāku imūntesti parādīja, ka ar CTL saistīto ķīmokīnu sekrēcijai ir stabila negatīva korelācija ar BCAT2 ekspresiju. Saskaņā ar audu mikromasīva (TMA) panorāmas analīzi mēs atklājām savstarpēji izslēdzošu saistību starp CTL un BCAT2+ audzēja šūnām telpiskajā sadalījumā. In vivo BCAT2 zuduma un ICB kombinētajā terapijā tika atklāts sadarbības efekts. Vēl svarīgāk ir tas, ka tā loma imūnterapijas ārstnieciskās iedarbības prognozēšanā tika apstiprināta Xiangya BLCA imūnterapijas grupā.
cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu
2. Rezultāti
2.1. BCAT2 negatīvi korelē ar TME pretvēža imunitāti BLCA
Vairumā vēža veidu BCAT2 ekspresija vēža audos ir augstāka nekā normālos audos (S1A attēls, papildinformācija), un tā ekspresijas modelis BLCA tika apstiprināts Xiangya BLCA kohortā (S1B attēls, atbalsta informācija). Turklāt BCAT2 ir plaši izteikts dažādās vēža šūnu līnijās (S1C attēls, atbalsta informācija). Turklāt visaptverošas vēža analīzes rezultāti par ķīmokīnu sistēmu, MHC, imūnstimulatoriem un TIIC liecināja, ka BCAT2 ir nozīmīga imūnsupresīva iedarbība dažos vēža veidos, tostarp urīnpūšļa vēzis (BLCA), krūts vēzis (BRCA), nieru nieru papilārā šūna. karcinoma (KIRP), aizkuņģa dziedzera adenokarcinoma (PAAD), sarkoma (SARC) un vairogdziedzera karcinoma (THCA) (S2A, B attēls, papildinformācija). Turklāt tika konstatētas arī negatīvas korelācijas starp BCAT2 un parastajiem inhibējošajiem imūnsistēmas kontrolpunktiem (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 un LAG-3) (S2C–F attēls, papildinformācija ). Veicot visaptverošu vēža analīzi, mēs atklājām, ka BCAT2 ir visdziļākā imūnsupresīvā iedarbība BLCA. Tādējādi mēs tālāk pētījām tā imunoloģisko lomu BLCA. Pamatojoties uz BCAT2 vidējo izteiksmes vērtību, mēs sadalījām indivīdus grupā ar augstu BCAT2 un zemu BCAT2 grupā TCGA-BLCA grupā. Acīmredzot virkne ķīmokīnu, ķīmokīnu receptoru, ar MHC saistītu molekulu un imūnstimulatoru tika samazināti ekspresijas grupā ar augstu BCAT2 līmeni un pārmērīgi izteikti grupā ar zemu BCAT2 līmeni (1.A attēls). Līdzīgs rezultāts tika konstatēts vēža imunitātes ciklā, kas aptver vairākus būtiskus imūno šūnu vervēšanas un infiltrācijas posmus (1.B attēls). Turklāt mēs parādījām spēcīgas negatīvas saiknes starp imūno šūnu (CD8+T šūnu, CD4+T šūnu, dabas killer (NK) šūnu un dendritisko (DC) šūnu) un BCAT2 infiltrācijas līmeņiem dažādos veidos. algoritmi (1.C attēls). Tāpat zemāka imūnšūnu efektorgēnu (CD8+T šūnu, NK šūnu, makrofāgu, T helper 1 (Th1) šūnu un DC šūnu) ekspresija tika konstatēta grupā ar augstu BCAT2 līmeni, salīdzinot ar zemu BCAT2. grupa (1.D attēls). Vēl svarīgāk ir tas, ka, korelējot BCAT2 ar TIS punktu skaitu (S3 attēls, papildinformācija) un inhibējošiem imūnsistēmas kontrolpunktiem (1. E attēls), starp tiem tika atklātas acīmredzamas negatīvas attiecības. Tādējādi mēs spekulējām, ka BCAT2 var negatīvi regulēt TME imūnreakciju un būtiski ietekmēt imūnterapijas efektivitāti. Turklāt iepriekš minētie rezultāti tika labi apstiprināti deviņās neatkarīgās BLCA grupās (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 un GSE128702)4. atbalsta informācija (SFigur22). Beidzot mēs vēlreiz pārbaudījām saistību starp BCAT2 un TME Xiangya BLCA kohortā. Konsekventi BCAT2 ekspresijai ir negatīva saistība ar vēža imunitātes cikla aktivitāti, TIIC infiltrācijas līmeņiem, TIS punktu skaitu un imūnās kontrolpunktu ekspresijas līmeņiem (2.A–C attēls). Kopā mēs atklājām, ka augsta BCAT2 ekspresija veido neiekaisīgu TME BLCA un zema BCAT2 ekspresija veido iekaisušu TME BLCA.
2.2. BCAT2 mehānisma izpēte TME veidošanā, izmantojot Bulk RNA-seq un siRNA-seq
TCGA-BLCA kohortā tika identificēti un krustojušies DEG starp augsta/zema BCAT2 grupām, augsta/zema imūnsistēmas līmeņa grupām un augsta/zema stromas punktu skaita grupām (S13A attēls, papildinformācija). Interesanti, ka ar BCAT2 pozitīviem DEG nebija krustošanās ar imūnsistēmas un stromas rezultāta pozitīvajiem DEG (attēls 2D). Tikmēr tā pati parādība notika ar negatīviem saistītajiem EG starp tiem (S13B attēls, papildinformācija). Šie atklājumi norādīja, ka BCAT2, iespējams, negatīvi regulē ar imūnsistēmu saistītos ceļus. Nejauši GO un KEGG analīžu rezultāti atklāja, ka ar BCAT{11}}saistītie DEG ir visnozīmīgākie leikocītu migrācijas, T šūnu aktivācijas un citokīnu-citokīnu receptoru mijiedarbības ceļos (2.E un F attēls). Tādējādi mēs spekulējām, ka BCAT2 veido neiekaisīgu TME BLCA, inhibējot ar citokīnu / ķemokīnu saistīto ceļu aktivitātes. Tomēr lielapjoma NA sekvencēšanas īpašība nosaka tās ierobežojumu, kura gēna ekspresijas līmeni aprēķina pēc visu audu šūnu vidējās vērtības. Lai pārvarētu ierobežojumu, siRNS tika veikta trim BLCA paraugiem. Vairāk nekā 19 000 šūnas tika analizētas un klasificētas sešās kategorijās: epitēlija šūnas, fibroblastu šūnas, T/NK šūnas, endotēlija šūnas, B šūnas un mieloīdās šūnas (3.A attēls), attiecas uz atpazītajiem biomarķieriem (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 un VWF).[11] Pārsteidzoši, ka BCAT2 galvenokārt tika ekspresēts epitēlija šūnās (EPCAM +), nevis endotēlija šūnās un imūnās šūnās. Pamatojoties uz CNV uzkrāšanos, EPCAM + epitēlija šūnas tika uzskatītas par ļaundabīgām urotēlija šūnām. Lai apstiprinātu BCAT2 ekspresijas modeli, pētījumā tika iekļautas divas ārējās siRNS kohortas. GSE135337 scRNS kohortā tika apstrādātas vairāk nekā 36,{31}} šūnas un sadalītas piecās kopās. BCAT2 primāri izteiktais šūnu apakštips joprojām bija ļaundabīga urīnpūšļa urotēlija šūna (3.B attēls). Līdzīgs ekspresijas modelis atkal parādījās GSE145137 siRNS kohortā (3.C attēls). Tāpēc vairākuma ekspresijas modelis uz ļaundabīgām šūnām secināja, ka BCAT2 darbojas kā imūnregulatora daļa TME, galvenokārt izmantojot dažādas vēža šūnu īpašības. Pamatojoties uz BCAT2 ekspresijas līmeni, ļaundabīgās urotēlija šūnas tika sadalītas grupā ar augstu BCAT2 un zemu BCAT2 grupā. GO terminu GSEA analīze GSE135337 un GSE145137 siRNS kohortās atklāja, ka grupā ar augstu BCAT2 līmeni tika ievērojami pazemināti vairāki ar citokīniem/ķīmokīniem saistīti ceļi, tostarp ķemokīnu ražošana, ķemokīna sekrēcija, ķīmokīnu mediētā signalizācijas ceļa regulēšana, reakcija uz ķīmokīnu. ķīmokīnu receptoru saistīšanās, citokīnu aktivitāte, citokīnu saistīšanās un citokīnu receptoru saistīšanās (attēls 3D–G; attēls S14B, papildinformācija). Tikmēr leikocītu ķemotaksei, limfocītu ķemotaksei, T šūnu ķīmijaksei un to regulēšanas ceļiem bija ievērojami negatīva korelācija ar BCAT2 (3.E–I attēls; S14A attēls, papildinformācija). KEGG terminu GSEA analīze liecināja, ka citokīnu un citokīnu receptoru mijiedarbības ceļi un antigēnu apstrāde un prezentācija acīmredzami bija pazemināti grupā ar augstu BCAT2 līmeni (3.F attēls). Kopā augstā BCAT2 ekspresija nomāc proinflammatorisko citokīnu un ar ķemokīniem saistīto ceļu aktivitātes, kā rezultātā samazinās TIIC infiltrācijas līmenis, kas galu galā veido neiekaisīgu TME.
1. attēls. BCAT2 negatīvi korelē ar pretvēža imunitāti BLCA TME gadījumā. A) Ķīmokīnu, ķīmokīnu receptoru, MHC molekulu un imūnstimulatoru ekspresijas modelis augstās un zemās BCAT2 grupās. B) Vēža imunitātes cikla aktivitāte augsta un zema BCAT2 grupās. Septiņas krāsas apzīmē septiņus cikla posmus. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0,001. C) Korelācijas starp BCAT2 un vairākiem imūnšūnu veidiem (CD8+T šūnām, CD4+T šūnām, DC šūnām un NK šūnām) sešos neatkarīgos algoritmos. D) Vairāku imūnšūnu apakštipu (CD8+T šūnu, NK šūnu, makrofāgu, Th1 šūnu un DC šūnu) saistītu efektorgēnu ekspresijas modeļi augsta un zema BCAT2 grupās. E) Korelācijas starp BCAT2 un ICB saistītajiem efektorgēniem. Skaitlis aplī nozīmē korelācijas koeficientu.
2. attēls. BCAT2 funkcijas apstiprināšana Xiangya BLCA kohortā. A) Korelācijas starp BCAT2/vēža imunitātes ciklu (pa kreisi) un BCAT2/TIIC (pa labi). Nepārtrauktas un punktētas līnijas nozīmē pozitīvas un negatīvas attiecības, līniju biezums ir korelāciju koeficients, līnijas ar dažādām krāsām apzīmē korelāciju p-vērtību. B) Korelācijas starp BCAT2 un ICB saistītajiem efektorgēniem. C) Korelācijas starp BCAT2 un TIS rezultātiem saistītajiem efektorgēniem. Skaitlis aplī apzīmē korelācijas koeficientu. D) BCAT2, imūnsistēmas un stromas rezultāta pozitīvo gēnu krustpunkts. E, F) 20 populārākie GO un KEGG analīžu bagātināšanas signalizācijas ceļi BCAT{10}}saistītajos gēnos.
3. attēls. BCAT2 mehānisma izpēte TME veidošanā, izmantojot masveida RNS-seq un scRNA-seq. A, B) BCAT2 vienas šūnas ekspresijas modeļa tSNE diagrammas Xiangya siRNA kohortā un GSE135337 grupā. C) BCAT2 vienas šūnas ekspresijas modeļa vijoles grafiks GSE145137 kohortā. D, E) GO termina GSEA analīze norāda uz citokīniem / ķemokīniem saistītu ceļu un imūno šūnu ķīmijakses ceļu aktivitātes starp dažādām BCAT2 grupām GSE135337 kohortā. F) KEGG termina GSEA analīze norāda uz antigēna prezentācijas aktivitātēm un citokīnu un citokīnu receptoru ceļa mijiedarbību starp dažādām BCAT2 grupām GSE145137 kohortā. G – I) GO termina GSEA analīze norāda uz citokīnu / ķemokīnu saistīto ceļu, ar imūno šūnu ķīmijaksi saistīto ceļu un ar imūno šūnu migrāciju saistītu ceļu aktivitātēm starp dažādām BCAT2 grupām GSE145137 kohortā. J, K) GO un KEGG analīze DEG starp BCAT2 OE un BCAT2 KD šūnu līnijām.
2.3. BCAT2 maina CD8+T-šūnu saistīto ķīmokīnu ekspresijas modeļus un inhibē CTL citotoksisko spēju
Lai apstiprinātu iepriekš minētos bagātināšanas ceļus, tika veiksmīgi izveidotas BCAT2 pārmērīgas ekspresijas (BCAT2 OE) un BCAT2 notriekšanas (BCAT2 KD) cilvēka (T24)/peles (MB49) urīnpūšļa vēža šūnu līnijas (S15A–D attēls, papildinformācija) un tika pārbaudītas ar augstas caurlaidības RNS sekvencēšana. Sagaidāmā T24 šūnu līniju GO analīze atklāja, ka DEG bija ievērojami bagātināti ar ķemokīnu mediētās signalizācijas ceļiem, reakciju uz ķemokīnu, leikocītu migrāciju un leikocītu migrāciju (3J attēls). T24 šūnu līniju KEGG ceļa analīze parādīja, ka ķīmokīnu signalizācijas ceļš, citokīnu-citokīnu receptoru mijiedarbības ceļš un urīnpūšļa vēža ceļš bija ievērojami bagātināti (3K attēls). Tāpat MB49 šūnu līniju GO un KEGG analīzēs tika atrasti vairāki ar citokīniem / ķemokīniem saistīti kritiski ceļi (attēls S16A, B, papildinformācija). Pašsaprotami, dažādiem citokīniem un kemokīniem ir izšķiroša loma TME regulēšanā. Tāpēc ir nepieciešams pārbaudīt citokīnus/ķīmokīnus, kurus īpaši regulē BCAT2. Tādējādi tika izmantoti ProcartaPlex vairāki imūntesti, lai identificētu citokīnu/kemokīnu sekrēcijas variācijas cilvēka un peles urīnpūšļa vēža šūnu līnijās. Pārsteidzoši ir tas, ka CCL3, CCL4, CCL5 un CXCL10 sekrēcijas līmenis ir paaugstināts cilvēka un peles BCAT{23}}KD šūnu līnijās un pazemināts cilvēka un peles BCAT2-OE šūnu līnijās (4.A, B attēls; S16C attēls. , D, papildinformācija). Iepriekšējos pētījumos CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 un CXCL10 tika uzskatīti par būtiskiem ķīmokīniem CD8+T šūnu piesaistīšanai TME.[12] Līdz ar to, lai labāk veiktu visaptverošu ar CD8+T-šūnu saistīto ķīmokīnu analīzi, tie visi tika iekļauti turpmākai apstiprināšanai. Pārsteidzoši, ka CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 un CXCL10 RNS ekspresijas līmeņi bija ievērojami pazemināti BCAT2 OE šūnās un ievērojami paaugstināti BCAT2 KD šūnās (4.C attēls). Tāpat ELISA rezultāti parādīja, ka izdalītajiem proteīnu līmeņiem bija arī negatīva korelācija ar BCAT2 ekspresiju (4D attēls). Šie atklājumi liecināja, ka pārmērīga BCAT2 ekspresija kavē ar CD8+T-šūnām saistīto ķīmokīnu, tostarp CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 un CXCL10, transkripta un proteīna līmeni. Vēl svarīgāk ir tas, ka ķīmijakses tests atklāja, ka BCAT2 OE šūnu līnija būtiski inhibēja CD8+T šūnu ķīmijakses spēju (4.E attēls, pa kreisi). Un otrādi, BCAT2 KD šūnu līnijas šūnu supernatanti spēja piesaistīt vairāk CD8+T šūnu nekā tās negatīvā kontrole (4. E attēls pa labi). Šie atklājumi liecināja, ka BCAT2 var ietekmēt CD8+T šūnu ķīmijakses spēju, regulējot saistīto ķīmokīnu mRNS un olbaltumvielu līmeni. Turklāt, lai izpētītu T šūnu citotoksicitātes izmaiņas pēc tieša kontakta ar audzēja šūnām, kas ekspresē atšķirīgu BCAT2 līmeni, tika izmantots T-šūnu mediētais vēža šūnu iznīcināšanas tests. Kā parādīts 4F un S17A, B attēlā (atbalsta informācija), BCAT2 pārmērīga ekspresija uz audzēja šūnām tieši nomāca T šūnu citotoksisko funkciju un BCAT2 iznīcināšana audzēja šūnās ievērojami mainīja tendenci. Savākto T šūnu plūsmas citometrijas analīze atklāja, ka CD8+TNF-𝛼+ T šūnu un CD8+IFN-𝛾+ T šūnu proporcijām bija būtiskas atšķirības dažādās kopkultūras sistēmās, kas nozīmēja milzīgas izmaiņas CD8+T šūnu aktivitāte (4G attēls; S17C, D attēls, papildinformācija). Kopumā BCAT2 spēj kavēt CD8+T šūnu piesaistes spēju, regulējot saistīto ķemokīnu līmeni, kā arī nomācot CTL aktivitātes tiešā kontaktā. Turklāt T-šūnu mediētā vēža šūnu nogalināšanas testa rezultāts (bez T šūnu grupas) var secināt, ka BCAT2 ir onkogēna loma urīnpūšļa vēža gadījumā. Tāpēc, lai apstiprinātu šo hipotēzi, tika izmantots plākšņu koloniju tests un transwell migrācijas/invāzijas tests. Kā paredzēts, BCAT2 pārmērīga ekspresija ievērojami uzlaboja audzēja šūnu proliferācijas, migrācijas un invāzijas spēju, un BCAT2 iznīcināšana ievērojami nomāca šo uzvedību (S18A–F attēls, papildinformācija).
2.4. Ekskluzīvās telpiskās attiecības starp BCAT2+ audzēja šūnu un CD8+T šūnu apstiprinājusi Xiangya BLCA kohortas TMA
Saskaņā ar lielapjoma RNS-seq, scRNA-seq un vitro eksperimentu rezultātiem mēs parādījām, ka BCAT2 spēlē imūnsupresīvu lomu BLCA, nomācot CD8+T šūnu rekrutāciju un citotoksicitāti. Tomēr BCAT2+ audzēja šūnu un CD8+T šūnu mijiedarbība cilvēka audu līmenī joprojām nav zināma. Xiangya BLCA kohortā reprezentatīvi attēli un kopējais IHC rādītājs atklāja negatīvu korelāciju starp BCAT2 un CD8 (R=−0.38, p=0).{36}} 038) (5.A, B attēls). BCAT2+ audzēja šūnu (BCAT2+CK19+) un BCAT2+CD8+T šūnu daudzkrāsainā IF krāsošana tika veikta TMA un pusautomātiski analizēta, izmantojot TissueFAXS panorāmas kvantifikācijas platforma. Kā parādīts 5C attēlā, BCAT2 un CK19 izteiksmes joma lielā mērā pārklājās. Un otrādi, BCAT2 un CD8 izteiksmes joma bija atšķirīga un atsevišķa. Detalizētas BCAT2+CK{19+ šūnu un BCAT2+CD8+T šūnu koekspresijas proporcijas bija 87,29% un 5,09% (5D, E attēls), kas atbilst BCAT2 ekspresijas modelis scRNA-seq. Kopumā TMA starp tām joprojām bija būtiska atšķirība koekspresijas proporcijā (S19A attēls, papildinformācija). Vēl svarīgāk ir tas, ka daudzdimensiju attāluma gradienta analīzē (0–25, 25–50, 50–100 un 100–150 μm) ap BCAT2+ audzēja šūnām CD8+T šūnu skaits pakāpeniski palielinājās. no tuvuma uz tālu (5.F attēls; S19B attēls, papildinformācija). Kopā mēs parādījām, ka cilvēka audu līmenī BCAT2 galvenokārt tiek ekspresēts arī audzēja šūnās, un BCAT2+ audzēja šūnai ir ekskluzīva telpiskā saistība ar CD8+T šūnu.
Cistanche tubulosa-Antitumor priekšrocības
2.5. BCAT2 zudums uzlabo anti-PD-1 terapijas efektivitāti
Ņemot vērā izteikti negatīvo ietekmi uz TME un negatīvu ciešu korelāciju ar inhibējošo kontrolpunktu blokādi, tas izraisa lielu interesi izpētīt BCAT2 zuduma un anti-PD- 1 terapijas sinerģisko efektu. Pirms imūnterapijas BCAT2 KD un kontroles peles šūnu līnijas izveidoja zemādas urīnpūšļa vēža modeli. Pēc tam pelēm ar audzējiem tika piemērota anti-PD-1 terapija un kontroles terapija (6.A attēls). Atbilstoši BCAT2 deficīta onkogēnajai lomai un regulēšanas mehānismam attiecībā uz ķīmokīniem in vitro, BCAT2 deficīts inhibēja audzēja augšanu un pagarināja dzīvildzi in vivo, pārregulējot ar CD8+T saistītos ķīmokīnus (6.B–E attēls; S20A attēls, papildinformācija). Imunoterapijas efektivitātes aspektā, lai gan anti-PD-1 monoterapija varēja daļēji samazināt audzēja slodzi, BCAT2 KD un anti-PD-1 monoklonālo antivielu (mab) vienlaicīga ārstēšana norādīja uz labāku audzēju nomācošo efektu un ieguva vairāk. izdzīvošanas pabalsts. Paredzētajā dienā audzēji tika novākti un sagatavoti turpmākai analīzei. Daļa no tiem tika sagremota vienas šūnas suspensijā un veikta plūsmas citometrijas analīze. Ar līdzīgu leikocītu un T šūnu populāciju (S20B–E attēls, papildinformācija) audzējā BCAT2 deficīta grupā tika parādīts lielāks CD8+T šūnu īpatsvars nekā negatīvās kontroles grupā. Līdzīgi kombinētās terapijas grupā bija masīvāka CTL infiltrācija nekā monoterapijas grupā (6.F–H attēls). Vēl svarīgāk ir tas, ka CTL citotoksicitātes indikatori (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 un perforīns) tika pastiprināti arī peļu audzējos ar BCAT2 zudumu un kombinētu ārstēšanu, salīdzinot ar atbilstošo kontroli (6.G attēls, I – L). Pārējās audzēju daļas tika izgatavotas saldētās sekcijās un veikta IF krāsošana. Kā gaidīts, CD8+T šūnu blīvums interesējošajā reģionā (ROI) uzrādīja tādu pašu tendenci ar plūsmas citometrijas analīzi (6M, N attēls). Šie atklājumi norādīja, ka BCAT2 deficīts uz audzēja šūnām var veidot iekaisušu TME un tam ir liela efektivitāte imūnterapijas ārstēšanā. Lai noskaidrotu CD8+T šūnu lomu kopterapijas sinerģiskajā iedarbībā, CD8𝛼 mab tika izmantots, lai tās antagonizētu imūnkompetentām pelēm (attēls S21A, papildinformācija), un apstiprināja tās izsīkuma efektu ar plūsmas citometriju un IF. (Attēls S21B, C, papildinformācija). Acīmredzot pēc izsīkuma audzēja slodze un izdzīvošanas laiks tika ievērojami mainīti (attēls S21D – G, atbalsta informācija). Šie atklājumi norādīja, ka CD8+T šūnām ir būtiska nozīme kombinētās terapijas sinerģiskajā efektā.
4. attēls. BCAT2 maina CD8+T-šūnu ķīmokīnu ekspresijas modeļus un inhibē CTL citotoksisko spēju. A, B) ProcartaPlex vairāku imūntestu siltuma kartes parāda parasto citokīnu un ķemokīnu sekrēcijas izmaiņas BCAT2 OE, BCAT2 KD un negatīvās kontroles grupās (n=3 katrā grupā). C, D) Histogrammas parāda normalizētus mRNS ekspresijas līmeņus un CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 un CXCL10 proteīnu sekrēcijas koncentrāciju BCAT2 OE (pa kreisi), BCAT2 KD (pa labi) un negatīvās kontroles grupās (n {{). 15}} vienai grupai). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p < 0,001. E) Ķīmijtakses tests norāda uz atšķirīgu CTL ķīmotaksijas spēju BCAT2 OE, BCAT2 KD un negatīvās kontroles grupās (n=3 katrā grupā). *p < 0,05; **p < 0,01. F) T-šūnu mediētais vēža šūnu iznīcināšanas tests norāda uz atšķirīgām nogalināšanas spējām T šūnām, kas kultivētas ar BCAT2 OE, BCAT2 KD un negatīvās kontroles šūnu līnijām (n=3 katrā grupā). G) Plūsmas citometrijas analīze norāda uz dažādām CD8+T šūnu aktivitātēm dažādās kopkultūras grupās (n=3 katrā grupā).
5. attēls. BCAT2+ audzēja šūnu un CD8+T šūnu ekskluzīvo telpisko attiecību validācija, izmantojot Xiangya BLCA kohortas TMA. A) BCAT2 un CD8 IHC attēls iekaisušos un neiekaisušos TME veidos. Mēroga josla: 50 μm. B) Korelācija starp BCAT2 un CD8, pamatojoties uz to IHC rādītājiem kopējā TMA. C) BCAT2, CK19, CD8 daudzkrāsains IF attēls un kombinētais indekss iekaisušos un neiekaisušos TME veidos. BCAT2+ šūna (rozā), CK19+ šūna (ciāna), CD8+T šūna (oranža) un šūnas kodols (zils). Mēroga josla: 50 μm. D,E) Detalizēti BCAT2+CK19+ un BCAT2+CD8+ šūnu koekspresijas rādītāji tipiskajā paraugā. F) CD8+T šūnu attāluma gradienta analīze (0–25, 25–50, 50–100 un 100–150 μm) ap BCAT2+CK19+ šūnām tipiskajās paraugs.
6. attēls. BCAT2 zudums uzlabo anti-PD-1 terapijas efektivitāti. A) Ārstēšanas plāna plūsmas diagramma. B) dažādu terapijas shēmu savāktie audzēji (n=5 katrā grupā). C–E) Audzēja tilpuma, ķermeņa svara un izdzīvošanas laika kvantitatīva noteikšana dažādās terapijas shēmās (n=5 katrā grupā). ns: nav nozīmes; *lpp< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
Turklāt līdzās audzēja šūnām neliela BCAT2 daļa tiek ekspresēta arī CD8+T šūnās. Tāpēc mēs tālāk pētījām, vai atšķirīgais BCAT2 ekspresijas līmenis CD8+T šūnās var ietekmēt to darbību. Pēc peles liesas vienas šūnas suspensijas iekrāsošanas ar BCAT2 un ar T šūnām saistītām fluorescējošām antivielām mēs salīdzinājām CD8+ TNF-𝛼+T un CD8+ IFN-𝛾+T šūnu proporcijas starp BCAT. 2+CD8+ un BCAT2−CD8+ grupas. Interesanti, ka mēs atklājām, ka proporcijas starp abām grupām bija līdzīgas, atklājot, ka CD8+T šūnas aktivitāte nav atkarīga no tās BCAT2 ekspresijas līmeņa (S22A–C attēls, papildinformācija).
2.6. BCAT2 prognozē reakciju uz imūnterapiju vairākās reālās pasaules imūnterapijas grupās
Iepriekš minētie atklājumi ir pierādījuši BCAT2 imūnsupresīvo lomu TME un sinerģisko efektu, apvienojot BCAT2 zudumu ar anti-PD-1 terapiju. Tomēr tā paredzamais imūnterapijas efektivitātes potenciāls nav skaidrs. Tāpēc TCGA-BLCA grupā tika salīdzināti ar imūnterapiju saistīto ceļu bagātināšanas rādītāji starp augstu un zemu BCAT2 grupām. Kā parādīts attēlā S23A (atbalsta informācija), zema BCAT2 grupai bija aktīvāki gēni ar imūnterapiju saistītos ceļos, kas var secināt, ka zema BCAT2 ekspresija ir jutīgāks stāvoklis pret imūnterapiju. Turpmākai apstiprināšanai Xiangya BLCA imūnterapijas grupā tika iekļauti 58 muskuļu invazīva urīnpūšļa vēža (MIBC) pacienti, kuri mūsu slimnīcā pieņēma neoadjuvantu anti-PD-1 terapiju. Reprezentatīvie IHC, IF un CT attēli, kas uzņemti ar atbildēju un nereaģējošo personu, liecina, ka BCAT2 ekspresijas līmenim ir cieša saistība ar imūnterapijas efektivitāti — indivīdam ar zemu BCAT2 ekspresijas līmeni ir lielāka iespēja reaģēt uz imūnterapiju nekā indivīdam ar augsts BCAT2 ekspresijas līmenis (7.A–C attēls). Turklāt Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas IHC rezultāts un IMvigor210 kohortas mRNS ekspresijas matrica norādīja uz spēcīgu negatīvu korelāciju starp BCAT2 un PD-L1 (R=−{{3{{32}). }}}.4, p=0.002; R=−0,41, p < 0,001) (S23B, C attēls, papildinformācija). Tādējādi mēs tieši salīdzinājām imūnterapijas efektivitāti starp augsta un zema BCAT2 grupām Xiangya BLCA imūnterapijas grupā un atklājām, ka grupā ar zemu BCAT2 bija ievērojami lielāks atbildes reakciju īpatsvars nekā augsta BCAT2 grupā (p=0,001). (7.D attēls). Turklāt mēs novērtējām BCAT2, PD-L1 un kombinācijas indeksa (BCAT2+PD-L1) prognozētās vērtības attiecībā uz patoloģisku reakciju uz imūnterapiju un atklājām kombinētās indeksa (BCAT2+PD-) lielisko veiktspēju. L1) par prognozēšanas precizitāti (7. E attēls). Iedvesmojoši izdzīvošanas iznākuma aspektā zema BCAT2 grupai bija ilgāka dzīvildze bez slimībām (DFS) nekā augsta BCAT2 grupai (p=0.032) (7.F attēls), kas parāda BCAT2 prognozes vērtību BLCA imūnterapija. Klīniski indivīdiem ar tuksneša TME ir ierobežota imūnterapijas efektivitāte nekā indivīdiem ar iekaisušu TME, vēl vairāk uzsverot indikatoru prognozēšanas nozīmi. Līdz ar to mēs atlasījām visas personas ar tuksneša TME no IMvigor210 kohortas un veicām visaptverošu novērtējumu. Tiešā BCAT2 ekspresijas līmeņa salīdzināšanā dažādās atbildes grupās CR grupai (reaģētājam) bija ievērojami zemāks BCAT2 ekspresijas līmenis nekā SD un PD grupām (neatbildētājiem) (7.G attēls). Vēl svarīgāk ir tas, ka kombinācijas indeksam (BCAT2+PD-L1) bija arī lielisks prognozēšanas precizitātes rādītājs (7. H attēls). Lai gan IMvigor210 kohortas tuksneša tipa grupā nebija būtiskas atšķirības kopējā dzīvildze (OS) starp augstu un zemu BCAT2 grupām, prognozes tendence joprojām bija līdzīga Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas iznākumam (7. attēls). Papildus PD-L1 mikrosatelītu nestabilitāte (MSI) ir vēl viens būtisks imūnterapijas efektivitātes prognozētājs. Neatbilstības novēršanas (MMR) statuss — prasmīgs MMR (pMMR) un deficīts MMR (dMMR) nodrošina augstu atbilstību zemas frekvences MSI (MSI-L) un augstfrekvences MSI (MSI-H).[13] Tādējādi mēs veicām visaptverošu visu Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas indivīdu novērtējumu, pamatojoties uz četru MMR marķieru gēnu (MLH1, MSH2, MSH6 un PMS2) krāsošanas rezultātiem. Rezultāts atklāja ievērojami lielāku dMMR (MSI-H) īpatsvaru grupā ar zemu BCAT2 līmeni, salīdzinot ar augstu BCAT2 grupu (p=0.02) (S23D, E attēls, atbalsta informācija). Turklāt mēs novērtējām MMR, BCAT2 un kombinācijas indeksa (MMR + BCAT2) paredzamās vērtības attiecībā uz imūnterapijas efektivitāti un konstatējām, ka kombinācijas indeksam (MMR + BCAT2) bija atbilstošs prognozēšanas precizitātes rādītājs (S23F attēls, papildinformācija). Kopā šie atklājumi parādīja, ka BCAT2 ir kvalificēts, lai darbotos kā papildu BLCA imūnterapijas efektivitātes prognozētājs. Visbeidzot, BCAT2 paredzamā vērtība, reaģējot uz imūnterapiju, tika pētīta dažādos vēža veidos. Mēs atklājām, ka indivīdiem ar augstu BCAT2 ekspresiju GSE35640 grupā (melanoma) bija ievērojami sliktāks atbildes reakcijas līmenis (p=0,04) (7.J attēls). Lai gan nebija būtisku atšķirību atbildes biežumā starp augstu un zemu BCAT2 grupām GSE173839 (krūts vēzis), GSE135222 (NSCLC) un Gide 2019 kohortā (melanoma), pacientiem ar zemu BCAT2 ekspresiju joprojām bija lielāka iespēja saņemt pozitīvu atbildi. uz imūnterapiju (7K-M attēls).
cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu
Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus
【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.7. BCAT2 vērtība molekulārā apakštipa prognozēšanā un precīzās terapijas vadīšanā
Tā kā tradicionālajā histoloģijas klasifikācijā pastāv liela neviendabība, arvien vairāk pierādījumu liecina, ka molekulārais apakštips spēj nodrošināt precīzāku klasifikāciju, pamatojoties uz transkripta profilu BLCA.[14] Turklāt ar līdzīgām imunoloģiskajām īpašībām vienā un tajā pašā apakštipā molekulārajai klasifikācijai ir liels potenciāls prognozēt TME un vadīt precīzu terapiju klīniskajā jomā[15]. Veicot visaptverošu dažādu molekulāro apakštipu sistēmu analīzi TCGA-BLCA kohortā, mēs noskaidrojām, ka indivīdi ar zemu BCAT2 ekspresiju, visticamāk, tiek klasificēti bazālajā apakštipā, ko papildina aktivizēti bazālās diferenciācijas, EMT diferenciācijas, imūnās diferenciācijas, interferona atbildes ceļi, un tā tālāk. Personas ar augstu BCAT2 ekspresiju galvenokārt tiek klasificētas luminālajos apakštipos, ko pavada aktīvi luminālās diferenciācijas, urotēlija diferenciācijas un Ta ceļi (S24A attēls, papildinformācija). Saskaņā ar vienprātību par molekulāro apakštipu bazālajam apakštipam ir lielāks efektorlimfocītu infiltrācijas līmenis un aktīvāks IFN-𝛾 signālu ceļš nekā luminālajam apakštipam [16], kas nozīmē labāku imūnterapijas efektivitāti. Pēc tam AUC tika izmantots, lai novērtētu prognozēšanas precizitāti. Pārsteidzoši, izņemot Baylor apakštipa sistēmu (AUC=0.76), lielākā daļa AUC citās sistēmās pārsniedza 0.90 (attēls S24B, papildinformācija), kas nozīmē stabilu BCAT2 prognozēšanas precizitāti molekulārais apakštips. Lai turpinātu izpētīt tās lomu citu terapiju efektivitātes prognozēšanā, mēs salīdzinājām epidermas augšanas faktora receptoru (EGFR) mērķa terapijas aktivitāti un ar staru terapiju saistītos ceļus starp augstu un zemu BCAT2 grupām. Ar acīmredzamām augšupregulētām aktivitātēm pacientiem ar zemu BCAT2 līmeni, visticamāk, būs pozitīva reakcija uz EGFR mērķa terapiju un staru terapiju (S24C attēls, papildinformācija). Lai palielinātu prognozēšanas ticamību attiecībā uz molekulāro apakštipu un ārstēšanas jutīgumu, astoņas BLCA kohortas (Xiangya BLCA kohorta, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 un E-BLCA) (kooperatīvā imūnterapija) (GSE52329 un E-28}MTCA2) pieteikts ārējai apstiprināšanai. Līdztekus izcilai prognozēšanas precizitātei šajās grupās tika atrasti līdzīgi atklājumi (S25–S27 attēli, papildinformācija). Hiperprogresējoša slimība (HPS) ir ārkārtīgi nejutīgs stāvoklis pret imūnterapiju. Lai izpētītu BCAT2 ietekmi uz HPD, ar HPD saistītie biomarķieri tika savākti no iepriekšējiem pētījumiem[17], un biomarķieru CNV tika salīdzināts starp zemu un augstu BCAT2 grupām. Izņemot EGFR, citu ar HPD pozitīvu saistīto biomarķieru (sarkanais simbols) CNV amplifikācijas rādītāji bija augstāki grupā ar augstu BCAT2 līmeni, īpaši MDM2 (p=0.0116). HPD negatīvo saistīto biomarķieru (zaļais simbols) CNV dzēšanas rādītāji bija zemāki grupā ar augstu BCAT2 līmeni (S24D attēls, papildinformācija). Rezultāts norādīja, ka pacientiem ar augstu BCAT2 ekspresiju imūnterapijas laikā ir iespējams HPD risks. Neoadjuvanta ķīmijterapija (NAC) ir izšķiroša BLCA terapija. Marķieri, kas prognozē reakciju uz NAC BLCA, tika savākti no Buttigliero et al pārskata.[18] un to mutāciju rādītāji tika salīdzināti starp abām grupām. Pamatojoties uz augstāku kopējo biomarķieru mutāciju līmeni un biežāku RB1 mutāciju grupā ar zemu BCAT2 līmeni, mēs spekulējām, ka indivīdam ar zemu BCAT2 ekspresiju ir labāka NAC efektivitāte klīniskajā praksē (S24E attēls, papildinformācija). Tādējādi Drugbank datubāze tika izmantota, lai salīdzinātu vairāku izplatītu ķīmijterapijas shēmu efektivitāti starp divām grupām un konstatēts, ka indivīdiem ar zemu BCAT2 ekspresiju ir lielāka iespēja reaģēt uz ķīmijterapiju. Turklāt grupai ar zemu BCAT2 līmeni bija arī labāka efektivitāte parastās imūnterapijas un ERBB terapijas shēmās. Negaidīti pacienti ar augstu BCAT2 ekspresiju, iespējams, iegūst labāku ārstniecisko efektu antiangiogēnajā terapijā (S24F attēls, papildinformācija). Kopumā indivīdi ar zemu BCAT2 ekspresiju pieder iekaisušam molekulāram apakštipam, bazālajam apakštipam, kas nozīmē pozitīvāku reakciju uz imūnterapiju, ķīmijterapiju, staru terapiju, EGFR mērķa terapiju un ERBB terapiju. Diemžēl pacientiem ar augstu BCAT2 ekspresiju ir slikta reakcija uz šo ārstēšanu. Tomēr antiangiogēnā terapija viņiem var būt gaismas mirdzums.
7. attēls. BCAT2 prognozē reakciju uz imūnterapiju vairākās reālās pasaules imūnterapijas grupās. A) BCAT2 un PD-L1 IHC attēls starp reaģētāju un nereaģējošo Xiangya BLCA imūnterapijas kohortā. Mēroga josla: 50 μm. B) BCAT2 un PD-L1 daudzkrāsains IF attēls starp reaģētāju un nereaģējošo Xiangya BLCA imūnterapijas kohortā. Mēroga josla: 50 μm. BCAT{11}}šūna (zaļa), PD-L1+šūna (dzeltena) un šūnas kodols (zila). C) CT attēls par imūnterapijas efektivitātes atšķirībām starp indivīdiem ar augstu un zemu BCAT2 ekspresijas līmeni. Sarkanā bultiņa norāda uz audzēja zonu. D) kopējā atbildes reakcijas ātruma atšķirība starp augstu un zemu BCAT2 grupām Xiangya BLCA imūnterapijas grupā. E) BCAT2, PD-L1 un kombinācijas indeksa (BCAT2+PD-L1) prognozēšanas precizitāte reakcijai uz imūnterapiju Xiangya BLCA imūnterapijas grupā. F) Izdzīvošanas bez slimībām (DFS) atšķirība starp augstu un zemu BCAT2 grupām Xiangya BLCA imūnterapijas grupā. G) BCAT2 ekspresijas līmeņa atšķirības starp CR, PR, SD un PD grupām IMvigor210 kohortas tuksneša tipa. *p < 0,05; ns: nav nozīmes. H) BCAT2, PD-L1 un kombinācijas indeksa (BCAT2+PD-L1) prognozēšanas precizitāte reakcijai uz imūnterapiju IMvigor210 kohortas tuksneša tipa gadījumā. I) Vispārējās izdzīvošanas (OS) atšķirības starp augstu un zemu BCAT2 grupām IMvigor210 kohortas tuksneša tipa. J – M) Atšķirības atbildē uz imūnterapiju starp augstu un zemu BCAT2 grupām GSE35640, GSE173839, GSE135222 un Gide2019 grupās.
3. Diskusija
Kā galvenais enzīms BCAA katabolisma procesā, iepriekšējie pētījumi galvenokārt bija vērsti uz BCAT2 ar vielmaiņu saistīto lomu tādās slimībās kā aptaukošanās, diabēts un aritmija. Ma et al. pierādīja, ka BCAT2 izslēgšana taukaudos var paātrināt tauku brūnināšanu un termoģenēzi, kas samazina aptaukošanās līmeni pelēm.[19] Nosakot vairāk nekā 2000 cilvēku asins paraugus, Gerszten et al. attēloja ar diabētu saistītu metabolītu profilu un atklāja, ka BCAT2-transformētajiem BCAA ir izšķiroša nozīme slimības attīstībā.[20] Portero et al. atklāja, ka BCAT2p.Q300*/p.Q300* muļķīgās mutācijas izraisa paaugstinātu BCAA līmeni un izraisa aritmijas pelēm.[21] Nesen daži pētījumi atklāja, ka BCAT2 ir cieša saistība ar vēzi. Lei et al. atklāja, ka BCAT2 degradācija ar acetilēšanu var aizkavēt aizkuņģa dziedzera ductal adenokarcinomas (PDAC) attīstību, samazinot BCAA metabolisma līmeni.[22] Wang et al. uzskatīja, ka ierobežots BCAT2 transkripcijas līmenis noved pie intracelulārā glutamāta līmeņa pazemināšanās, kas stimulē hepatomas šūnu ferroptozi.[23] Tomēr visos esošajos pētījumos tika uzsvērta BCAT{18}}mediētā BCAA katabolisma ietekme uz vēža bioloģisko procesu, nevis tika pētīts pavisam jauns mehānisms. Šajā pētījumā mēs pirmo reizi atklājām BCAT2 imūnsupresīvo lomu TME. Imūnterapijas pielietošana uzlabo vēža ārstēšanu ar lielisku dzīves kvalitāti un ilgāku izdzīvošanas laiku. Tomēr, ņemot vērā audzēja imūnās ekoloģiskās sistēmas neviendabīgumu, tikai daļa indivīdu iegūst apmierinošu efektivitāti. TME ir sarežģīta sistēma, ko veido audzēja šūnas, imūnās šūnas, stromas šūnas un kapilāri.[24] Saskaņā ar CTL infiltrācijas līmeni TME var iedalīt iekaisušajos un neiekaisušajos veidos.[25] Pieaugošie pierādījumi liecina, ka iekaisušajam TME ir pozitīva loma efektīvas pretvēža imūnās atbildes izraisīšanā terapijas laikā.[26] Tādējādi mēs vispusīgi analizējām vairākus ar TME saistītus rādītājus un atklājām, ka augsta BCAT2 ekspresija veido neiekaisīgu TME ar kavētu vēža imunitātes ciklu, ķīmokīna profila represīvu ekspresijas modeli, MHC molekulām un nepietiekamu TIIC infiltrācijas līmeni. Turklāt BCAT2 ir negatīvi saistīts ar TIS un ICB efektorgēniem, kas nozīmē, ka indivīdi ar augstu BCAT2 ekspresiju, visticamāk, nereaģēs uz imūnterapiju. Lai apstiprinātu savu hipotēzi, mēs salīdzinājām atbildes reakciju starp augsto un zemo BCAT2 grupām Xiangya BLCA imūnterapijas grupā un citās imūnterapijas grupās. Pārsteidzoši, vairākās grupās bija ievērojamas atšķirības, kas norādīja, ka BCAT2 spēj arī prognozēt imūnterapijas efektivitāti, īpaši BLCA. Turklāt scRNA-seq tika izmantots BCAT2 regulēšanas mehānisma izpētei TME un norādīja, ka ar citokīnu / ķemokīnu saistīto signalizācijas ceļu, T šūnu ķīmijakses signālu ceļa un T šūnu migrācijas signālu ceļa aktivitātei ir būtiska negatīva korelācija ar BCAT2. Kā kritisks regulēšanas tīkls citokīni un kemokīni ir neaizstājami dažādu imūno šūnu pārvietošanai TME. Ķīmokīnu sistēmai ir četras superģimenes: C, CC, CXC un CX3C, ar ievērojamu dublēšanos ligandu un receptoru savienošanā.[27] Citokīnus var iedalīt Th1, Th2 un Th17 apakšgrupās, pamatojoties uz to bioloģisko funkciju.[28] Pateicoties dažāda līmeņa to sekrēcijai, pietiek ar cīņu starp audzēja šūnām un imūnšūnām, lai pārprogrammētu TME īpašības.[29] Neskatoties uz to, starp lielāko daļu citokīnu un kemokīnu ir nepieciešams izsijāt visvērtīgāko kopu. Izmantojot 34-citokīnu un ķemokīnu imūntesta paneli, mēs atklājām, ka ķīmokīni, tostarp CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 un CXCL10, ir stingri negatīvi korelēti ar BCAT2 ekspresiju cilvēka un peles urīnpūšļa vēža šūnā. Ir labi zināms, ka CXCL9 un CXCL10 ir atbildīgi par CD{50}T šūnu piesaistīšanu TME[30]. Lai noskaidrotu CCL3, CCL4 un CCL5 funkciju, mēs meklējām iepriekšējos pētījumus. Harlins u.c. izmantoja proteīnu blokus un qPCR, lai atklātu, ka CCL3, CCL4 un CCL5 regulēšana spēj veicināt CD8+T šūnu migrāciju melanomā.[31] Noman et al. atklāja, ka palielināta CCL5 sekrēcijas populācija palīdz izveidot proinflammatorisku TME, ievedot CTL kolorektālā vēža audos.[32] Izmantojot chemokīna profila IHC un RNS-seq vairākās grupās, Romero et al. parādīja, ka CCL4 un CCL5 ir cieša saistība ar CD8+T šūnu infiltrācijas līmeni aizkuņģa dziedzera vēža gadījumā.[33] Tāpēc mēs uzskatījām, ka ar CD8+T-šūnām saistītie ķīmokīni ir galvenie ķemokīni, kurus urīnpūšļa vēža gadījumā regulē BCAT2. Lai gan mēs parādījām spēcīgas negatīvas korelācijas starp BCAT2 un CD8+T šūnām saistītajiem ķīmokīniem, joprojām ir jāturpina izpētīt to regulējošais mehānisms. Pētersona u.c. pētījums. parādīja, ka MAP kināzes (MAPK) signalizācijas ceļa aktivizēšana var izraisīt CX3CL1 veidošanos.[34] Xu et al. atklāja, ka JAK-STAT signalizācijas ceļš regulē Th1-saistīto ķīmokīnu sekrēciju, izraisot TIL infiltrācijas līmeņa pazemināšanos.[35] Nesen Peng et al. atklāja, ka demetilāze JMJD3 var kavēt ar CD4+T-šūnām saistīto ķīmokīnu ekspresiju un samazināt citotoksicitātes T šūnu infiltrācijas līmeni TME, kas atspoguļo epiģenētiskās modifikācijas izšķirošo lomu ķemokīnu ekspresijas regulēšanā.[36] Mayo et al. arī atklāja, ka epiģenētiskajam inhibitoram, histona dezacetilāzei 1, ir liela spēja nomākt CXCL8 ekspresiju, aktivizējot kodolfaktora-𝜅B (NF-𝜅B) signalizācijas ceļu.[37] Turklāt kā audzēja šūnu metabolisma, aerobās glikolīzes un reaktīvo skābekļa sugu (ROS) simboli, kas liecina par lieliskām CXCL8 un CXCL14 ekspresijas ierosināšanas iespējām, paaugstinot NF-𝜅B un transkripcijas faktora aktivatora proteīna 1 (AP{93) signalizācijas ceļu aktivitātes. }}).[38] Interesanti, ka mūsu pētījumā NF-𝜅B, STAT un MAPK signalizācijas ceļi tika ievērojami bagātināti starp augstu un zemu BCAT2 šūnu līnijām (3K attēls; S16A, B attēls, papildinformācija). Tādējādi, apvienojot ar iepriekšminētajiem pētījumiem, mēs tālāk pētīsim galveno molekulu ar BCAT2 un CD{100}}T saistīto ķīmokīnu regulēšanas mehānismā. Ierobežotais objektīvās atbildes reakcijas rādītājs monoterapijai ar ICB veicina kombinētas terapijas stratēģijas parādīšanos. Lai neimunoloģisku TME pārveidotu par imunoloģisku TME, Wolchok et al. pielietoja nivolumabu (anti-PD-1 terapiju) un ipilimumabu (anti-CTLA-4 terapiju) pacientiem ar melanomu un atklāja iedrošinošu ārstniecisku efektu, kas saistīts ar sinhronu pastiprinātu CTL sākšanu, aktivāciju un iznīcināšanu. [39] Ķīmijterapija un imūnterapija ir vairāk nekā kombinācija ar cita veida ICB, bet arī alternatīva terapijas iespēja. Kā pirmās līnijas ārstēšanas shēma progresējošas urotēlija karcinomas gadījumā vairākos pētījumos tika atklāts, ka uz cisplatīnu balstīta ķīmijterapija spēj veidot proinflammatorisku TME, palielinot MHC I klases ekspresijas līmeni uz dendrītiskajām šūnām un bojājot MDSC un Tregs.[40] Nejauši Homma et al. atklāja, ka citas izplatītas ķīmijterapijas zāles urīnpūšļa vēža ārstēšanai — gemcitabīns — var uzlabot CD{110}}T šūnu infiltrācijas daudzumu un pasliktināt imūnsupresīvās imūnās šūnas TME.[41] Mūsu preklīniskajā eksperimentā ar dzīvniekiem BCAT2 zuduma un anti-PD{114}} mab kopterapija uzrādīja izteiktāku pretaudzēju efektivitāti, salīdzinot ar monoterapiju ar anti-PD-1 mab imūnkompetentām pelēm, kas nodrošina novatorisku ārstēšanu. stratēģija ICB rezistences pacientiem. Tikmēr, izmantojot plūsmas citometrijas analīzi un IF, mēs parādījām, ka BCAT2 notriekšana ne tikai piesaista TME vairāk CTL, bet arī uzlabo CTL nogalināšanas aktivitāti. Līdzīgi Peng et al. atklāja, ka pārmērīga LGALS2 ekspresija samazina infiltrējošo CTL, kā arī citotoksisko biomarķieru daudzumu pelēm, kurām ir krūts vēzis.[42] Yang et al. ilustrēja, ka CXCL13 spēj pastiprināt atbildes reakciju uz imūnterapiju olnīcu vēža peļu modeļos, palielinot CD{123}}T šūnu infiltrācijas līmeni un GZMB, IFN-𝛾 un IL sekrēcijas līmeni-2.[43] Līdz ar spēcīgāku pretvēža reakciju kombinētā terapija vēl vairāk izjauc esošo imūnās atgriezeniskās saites cilpu, kas, iespējams, izraisa nopietnas blakusparādības. Saskaņā ar BCAT2 ekspresijas modeli siRNS līmenī, kas īpaši izteikts audzēja šūnās, nevis imūnās šūnās un endotēlija šūnās, mēs varam provizoriski secināt, ka BCAT2 zudums vai BCAT2 inhibitors, visticamāk, neizraisīs briesmīgas nelabvēlīgas sekas. Tomēr vēl ir jāizpēta optimālā BCAT2 inhibitora un anti-PD-1 mab deva un intervāla laiks kombinētajā terapijā.
Lai vadītu precīzu terapiju indivīdiem, mēs korelējām BCAT2 ar BLCA molekulāro apakštipu un dažādu terapiju kritiskajiem biomarķieriem. Pamatojoties uz ticamām prognozēm vairākās grupās, mēs noskaidrojām, ka imūnterapija, ķīmijterapija, staru terapija un EFGR mērķa terapija ir piemērota pacientiem ar zemu BCAT2 ekspresiju. Antiangiogēno terapiju ieteicams lietot pacientiem ar augstu BCAT2 ekspresiju. Atšķirībā no sarežģītā molekulāro apakštipu noteikšanas procesa, BCAT2 ir pārnēsājams precīzas terapijas prognozētājs. Neizbēgami mūsu pētījumos ir daži ierobežojumi. Pirmkārt, Xiangya BLCA kohortas un Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas izlases lielums un novērošanas laiks bija ierobežoti. Mums ir vēl vairāk jāpalielina izlases apjoms un jāturpina standartizēta uzraudzība. Otrkārt, kā reālās pasaules kohorta, Xiangya BLCA imūnterapijas grupā bija dažādas operācijas iespējas, kas, iespējams, izraisīja iespējamu novirzi. Mēs vēl vairāk paplašināsim savu kohortu un veiksim apakšgrupu analīzi, pamatojoties uz to pašu operācijas iespēju. Treškārt, kombinētās terapijas sadarbības efekts in vivo ir jāturpina apstiprināt, izmantojot BCAT2 inhibitora sistēmas pielietojumu. Rezumējot, BCAT2 kā imūnsupresīva loma BLCA TME ir jauns mērķis ICB kombinētajā terapijā un precīzs precīzas terapijas biomarķieris.
Citanche tubulosa priekšrocības- stiprināt imūnsistēmu
4. Eksperimentālā sadaļa
cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1.5 un koriģētā p vērtība < 0.{148}}5. Gēnu ontoloģijas (GO) un Kioto gēnu un genomu enciklopēdijas (KEGG) analīzes tika veiktas identificētajiem DEG, izmantojot ClusterProfiler R pakotni.[51] Seurat R pakotne ar Findmarker algoritmu tika izmantota, lai aprēķinātu BCAT2 ekspresijas līmeni epitēlija šūnās scRNA-seq. Pamatojoties uz dažādu gēnu ekspresijas rangu pēc reizes izmaiņu (FC) vērtības, tika ieviesta gēnu kopas bagātināšanas analīze (GSEA), lai novērtētu pozitīvas un negatīvas korelācijas. Ar imūnsistēmu saistītu DEG identificēšana: ESTIMATE R pakotne tika izmantota, lai aprēķinātu imūnsistēmas un stromas rādītājus TCGA-BLCA kohortā. Saskaņā ar divu punktu vidējo vērtību un BCAT2 ekspresijas līmeni, Limma R pakotne tika izmantota, lai identificētu pozitīvus/negatīvus ar imūnsistēmu saistītus un ar stromu saistītus DEG. Venn diagrammas R pakotne tika izmantota, lai ņemtu dažādu grupu krustojumu un noteiktu kopīgos DEG. Personu klasifikācija, izmantojot BLCA molekulāros apakštipus: Septiņi BLCA molekulārie apakštipi (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lunda, CIT un Consensus) tika plaši izmantoti klīniskajā praksē, lai novērtētu TME īpašības un dažādu terapiju efektivitāti.[52] Ņemot vērā dažādu apakštipu sarežģīto mijiedarbību, mēs tos kopīgi sadalījām divās galvenajās kategorijās – bazālos un luminālos apakštipos.[16] Lai klasificētu personas konkrētos apakštipos, tika izmantotas Consensus MIBC un BLCAsubtyping R paketes. Pēc normalizācijas laukums zem ROC līknes (AUC) tika izmantots, lai novērtētu BCAT2 uzticamību klasifikācijas prognozēšanā. Pacientu precīzas terapijas novērtējums: kā parādīts mūsu iepriekšējā pētījumā[53], no dažādiem pētījumiem un datubāzēm tika apkopota virkne kritisku gēnu parakstu, kas var paredzēt ķīmijterapijas, staru terapijas, mērķterapijas un imūnterapijas efektivitāti.[16] 54] ssGSEA algoritms tika izmantots, lai aprēķinātu gēnu parakstu bagātināšanas rādītājus.[55] Šūnu līnijas: Cilvēka urīnpūšļa vēža šūnas (T24) un peles urīnpūšļa vēža šūnas (MB49) tika iegādātas attiecīgi no Procell Life Science & Technology (Uhaņa, Ķīna) un Meisen CTCC (Jinhua, Ķīna). Tie tika turēti DMEM barotnē (BasalMedia, Ķīna) ar 10% liellopu augļa serumu (FBS) (BI, Izraēla), 1% penicilīna un streptomicīna (NCM Biotech, Ķīna) un kultivēti inkubatorā 37 ° C temperatūrā. grādu temperatūra, kas satur 5% CO2. Stabilas transfekcijas šūnu uzbūve un RNS-seq: Lentivīrusu vektoru plenti-BCAT2-karogs-puromicīns (GV341) izstrādāja un konstruēja GeneChem (Šanhaja, Ķīna) stabilai BCAT2-pārekspresijai (BCAT2 OE) šūnu līnija un tās negatīvā kontrole (oe-vektors). Turklāt GeneChem (Šanhaja, Ķīna) BCAT2- īsu matadata RNS (shRNA) klonēja GV112-lentivīrusu vektorā, lai izveidotu stabilu BCAT2-notriekšanas (BCAT2 KD) šūnu līniju. . ShRNS mērķa sekvences tika uzskaitītas S3 tabulā (atbalsta informācija). Pēc tam rekombinantie BCAT2 lentivīrusi tika transficēti objektīvās šūnās saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Lai trīs dienas filtrētu stabilas transfekcijas šūnas, tika izmantots 2 ug mL-1 puromicīns (Amersco, ASV). Lai apstiprinātu transfekcijas efektivitāti, tika izmantota Western blot un kvantitatīvā reversās transkripcijas PCR (qRT-PCR). Galu galā RNS-seq un turpmākajiem eksperimentiem tika izvēlēta stabila transfekcijas šūna ar vislabāko efektivitāti. Trīs katras šūnu līnijas paraugi tika nosūtīti uz BGI RNA-seq platformu (Shenzhen, Ķīna). Kritēriji DEG atlasei un bagātināšanas ceļu analīzei bija tādi paši kā 2.3. punktā (bagātināšanas ceļu analīzes). ProcartaPlex vairāki imūntesti vēža šūnu līniju ķemokīnu un citokīnu sekrēcijas līmeņa noteikšanai: cilvēka ProcartaPlex imūnanalīzes panelis (Kat.: EPX340-12167-901) un peles ProcartaPlex imūnanalīzes panelis (Kat: EPX{{50}}) tika iegādāti no ThermoFisher Scientific (Masačūsetsa, ASV), lai noteiktu proteīnu ekspresijas līmeņus vairāk nekā 30 svarīgos ķemokīnus un citokīnus stabilās transfekcijas vēža šūnās. Īsāk sakot, šūnu kultūras supernatanti tika savākti no 24-iedobes plāksnes un centrifugēti, lai noņemtu šūnas un šūnu atliekas. Pēc tam dzidrinātie supernatanti tika inkubēti ar lodītēm panelī, ievērojot ražotāja norādījumus. Lai veiktu katra parauga kvantitatīvo analīzi, tika izmantota Luminex noteikšanas platforma (ThermoFisher Scientific, ASV). Neatklātie rādītāji tika izslēgti no analīzes. qRT-PCR: Kopējā RNS tika izolēta no šūnām ar šūnu kopējās RNS izolācijas komplektu un dzīvnieku kopējās RNS izolācijas komplektu (Foregene, Ķīna) saskaņā ar ražotāja protokolu. cDNS tika sintezēta, izmantojot UeIris II RTPCR sistēmu pirmās kārtas cDNS sintēzei (ASV Everbraita, Ķīna). qRTPCR tika veikts, izmantojot SYBR Green qPCR Master Mix (ASV Everbraita, Ķīna) CFX Connect sistēmā (Bio-Rad, ASV). GAPDH tika izmantots kā iekšējā standarta kontrole. Praimerus izstrādāja un sintezēja Sangon Biotech (Šanhaja, Ķīna), un detalizētas primeru sekvences tika uzskaitītas S4 tabulā (atbalsta informācija). ELISA: CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) un CXCL10 (IP10) koncentrācija cilvēka urīnpūšļa vēža šūnu kultūras supernatantos tika noteikta ar cilvēka ELISA komplektiem, ievērojot ražotāja protokolu (Proteintech, ASV). Lai izmērītu optiskā blīvuma (OD) vērtības, tika izmantots biotehnoloģiju mikroplašu lasītājs (ThermoFisher Scientific, ASV). Ņemot vērā lielo dažādu citokīnu un ķīmokīnu sekrēcijas līmeņu dažādību, pirms analīzes veicām datu standartizāciju (log 2 transformāciju). Western Blot: šūnu lizēšanai tika izmantots RIPA buferšķīdums (NCM biotech, Ķīna), kas pievienots 1% proteāzes inhibitoru kokteilim (NCM biotech, Ķīna). Proteīna koncentrācijas noteikšanai tika izmantots BCA proteīna testa komplekts (NCM biotech, Ķīna). Pēc pārnešanas uz PVDF membrānām šūnu proteīni tika secīgi inkubēti ar primārajām antivielām un specifiskām HRP konjugētām sekundārajām antivielām. Signālus uztvēra XRS attēlveidošanas sistēma (Bio-Rad, ASV). Primārās antivielas ietver anti-BCAT2 antivielu (Kat: ab95976, Abcam, ASV) un anti-GAPDH antivielu (Kat: ab8245, Abcam, ASV). Sekundārās antivielas ietver HRP kazu anti-trušu IgG (Kat: 7074, Cell Signaling Technology, ASV) un HRP kazu anti-peles IgG (Kat: 7076, Cell Signaling Technology, ASV). T limfocītu izraisīts vēža šūnu iznīcināšanas tests un kulturas tests: mūsu slimnīcā tika savākti asins paraugi no 10 veseliem donoriem. Saskaņā ar ražotāja norādījumiem tika izmantota gradienta centrifugēšana, lai ar Lymphoprep (Kat.: 07851, StemCell Technologies, ASV) ekstrahētu perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC). Turklāt sarkano asins šūnu līzes buferis (Solarbio, Ķīna) tika izmantots, lai likvidētu sarkanās šūnas, kas sajauktas ar PBMC. Lai aktivizētu T šūnas, PBMC tika kultivēti DMEM barotnē (Gibco, ASV), papildinot cilvēka rekombinanto IL- 2 (10 ng mL−1, Cat: 202-1L-050, R&D , ASV) un ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 T šūnu aktivatoru (25 μL ml-1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, ASV) 1 nedēļu. Attiecībā 1:5 cilvēka urīnpūšļa vēža šūnas (BCAT2-OE, BCAT2-KD un to negatīvās kontroles) tika kultivētas ar aktivētām T šūnām DMEM barotnē ar anti-CD3 antivielu (100 ng ml–1, Thermo Scientific, ASV) un IL-2 (10 ng ml–1) no viena donora 12- iedobes plāksnē 72 stundas. Pēc tam T šūnas tika savāktas plūsmas citometrijas analīzei. Detalizēta plūsmas analīzes vārtu stratēģija ir parādīta S28 attēlā (atbalsta informācija). Atlikušās vēža šūnas tika iekrāsotas ar kristālvioletu un ar mikroplašu lasītāju izmērīja OD vērtību pie 570 nm. Antivielas plūsmas citometrijas analīzei ietver Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Kat: 423101, Biolegend, ASV), APC/Cy7 pret cilvēka CD45 (Kat: 368516, Biolegend, ASV), Pacific Blue anti-human CD3 antivielu (Kat: 300329, Biolegend, ASV), PerCP/Cy5.5 anti-human CD4 Antibody (Cat: 317427, Biolegend, USA), FITC anti-human CD8a Antibody (Cat: 301006, Biolegend, USA), PE/Dazzle 594 pret cilvēka TNF- 𝛼 Antiviela (Kat.: 502946, Biolegend, ASV) un Brilliant Violet 711 pret cilvēka IFN- 𝛾 Antiviela (Kat.: 502540, Biolegend, ASV). Ķīmijtakses tests: Ķīmijtakses tests tika ieviests 24-iedobes transwell plāksnē ar 3 μm serdes diametru (Korninga, ASV). Cilvēka CD{133}}T šūnu izolācijas komplekts (Cat: 480012, Biolegend, USA) tika izmantots, lai no PBMC iegūtu CD{135}}T šūnas. Augšējā kamerā tika pievienotas 1 × 105 izolētas šūnas 200 μL tilpumā, un apakšējā kamerā tika pievienoti 600 μL dažādu stabilu transfekcijas šūnu līniju supernatanti. Pēc 6 stundu inkubācijas 37 grādu temperatūrā šūnas migrēja apakšējā kamerā un tika novāktas un skaitītas ar plūsmas citometriju. Šūnu proliferācijas, migrācijas un invāzijas testi: lai novērtētu šūnu proliferācijas spēju, tika izmantots plākšņu koloniju veidošanās tests. BCAT2-OE, BCAT2-KD un negatīvās kontroles cilvēka urīnpūšļa vēža šūnas tika kultivētas 6-iedobju plāksnēs katrā iedobē. Pēc 2 nedēļu inkubācijas 37 grādu mitrā atmosfērā kolonijas tika fiksētas un krāsotas attiecīgi ar paraformaldehīdu un kristālvioletu. Lai novērtētu šūnu migrācijas un invāzijas spēju in vitro, tika izmantotas Transwell kameras ar 8, 0 μm poru polikarbonāta membrānas ieliktņiem (Corning, ASV). 1 × 105 stabilas transfektētas šūnas tika suspendētas barotnē, kas nesatur serumu, un iesēja augšējā kamerā ar vai bez Matrigel (Corning, ASV), lai veiktu invāzijas un migrācijas testu atsevišķi. Pēc 24 h (migrācijas tests) un 48 h (invāzijas tests) inkubācijas šūnas, kas pielipušas membrānas apakšējai virsmai, tika fiksētas un iekrāsotas. Šūnas, kas palika augšējā kamerā, tika noņemtas ar tamponiem. Lai aprēķinātu šūnu skaitu, mikroskopā tika atlasīti pieci nejauši lauki. Imunofluorescence (IF) un imūnhistoķīmija (IHC): daudzkrāsains IF uz Xiangya BLCA kohortas un Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas TMA. Īsi sakot, pēc devaska noņemšanas, rehidratācijas un antigēna atjaunošanas TMA tika inkubēts ar primārajām antivielām un sekundārajām antivielām, kas veicina dažādu luciferīnu saistīšanos ar tiramīda signāla pastiprināšanu (TSA). Pēc nesaistīto antivielu noslaukšanas ar citrāta buferšķīdumu inkubācijas process tika atkārtots divas reizes. DAPI tika izmantots, lai neitralizētu šūnu kodolus, un attēlus skenēja Pannoramic MIDI platforma (3DHISTECH, Ungārija). Primārās antivielas uz Xiangya BLCA kohortas TMA ietver anti-BCAT2 (Kat: ab95976, Abcam, ASV), anti-Cytokeratin 19 (CK19) (Kat: ab52625, Abcam, ASV), anti-CD8 (Kat: ab237709, Abcam, ASV). ) un DAPI (Invitrogen, ASV). Sekundārās antivielas un fluorohroms uz Xiangya BLCA kohortas TMA ietver HRP kazu anti-trušu/peles IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Primārās antivielas uz Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas TMA ir anti-BCAT2 (kat.: ab95976, Abcam, ASV), anti-PD-L1 (kat.: ab213524, Abcam, ASV) un DAPI (Invitrogen, ASV). Sekundārās antivielas un fluorohroms uz Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas TMA ietver HRP kazu anti-trušu/peles IgG, Absin 520 TSA Plus un Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). IF uz peles audzēja audiem secīgi tika inkubēts ar primāro antivielu — anti-CD8 (kat.: 372902, BioLegend, ASV) — un sekundāro antivielu — pretpeles Alexa Fluor 488 krāsvielu konjugātu (Invitrogen, ASV). DAPI tika piemērots vizualizētajam šūnu kodolam. Mikroskopā tika atlasīti pieci nejauši lauki, lai aprēķinātu pozitīvo krāsojošo šūnu skaitu. IHC par Xiangya BLCA kohortas un Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas TMA veica SP-9000 komplekts (ZSGB-BIO, Ķīna). Pēc antigēna iegūšanas un bloķēšanas primārās antivielas un sekundārās antivielas pēc kārtas tika inkubētas ar audzēja audiem. Pēc tam diaminobenzidīns (DAB) tika uzklāts, lai krāsotu mērķa antigēnus. Brūnais signāls tika uzskatīts par pozitīvu krāsojumu. Krāsošanas intensitātes rādītājs (nav=0, vājš=1, mērens=2 un spēcīgs=3), reizinot pozitīvo procentuālo punktu skaitu (bez iekrāsošanās=0, krāsojas šūnas mazāk nekā 25%=1, 25%–50% krāsojošo šūnu=2, 50%–75% krāsojošo šūnu=3 un krāsojošo šūnu skaits vairāk nekā 75%=4). galīgais paraugu IHC rādītājs. BCAT2/CD8/PD-L1 rādītāji, kas ir mazāki par sešiem punktiem, tika klasificēti kā zema izteiksme, to rādītāji, kas ir lielāki vai vienādi ar sešiem punktiem, tika klasificēti kā augsta izteiksme. Lai novērtētu indivīda statusu MMR, visi Xiangya BLCA imūnterapijas kohortas paraugi tika novērtēti, pamatojoties uz četru MMR marķieru gēnu (MLH1, MSH2, MSH6 un PMS2) krāsošanas rezultātiem. Kā parādīts iepriekšējos pētījumos [56], kad visi četri marķieru gēni bija pozitīvi iekrāsojušies, indivīds tika atzīmēts kā MMR. Ja kādam no četriem marķiera gēniem bija negatīva iekrāsošanās, indivīds tika atzīmēts kā dMMR. Novērtējuma veikšanai tika uzaicināti divi neatkarīgi patologi. Antivielas ietver: anti-BCAT2 (Kat: ab95976, Abcam, ASV), anti-CD8 (Kat: ab4055, Abcam, ASV), anti-PD-L1 (Kat: ab213524, Abcam, ASV), anti-MLH1 (Kat: A4858, Abcolonal, Ķīna), anti-MSH2 (Kat: A22177, Abcolonal, Ķīna), anti-MSH6 (Kat: A16381, Abcolonal, Ķīna), anti-PMS2 (Kat: A4577, Abcolonal, Ķīna) un HRP Goat Anti. -Rabbit/Mouse IgG (ZSGB-BIO, Ķīna). TissueFAXS Panorāmas telpiskās mijiedarbības analīzes TME: lai novērtētu BCAT2+ ļaundabīgo šūnu un efektoru T šūnu telpisko mijiedarbību, TissueFAXS panorāmas platforma (Tissue Gnostics, Austrija) tika izmantota, lai skenētu un pusautomātiski analizētu daudzkrāsu objektīvu šūnu IF st on. Xiangya BLCA kohortas TMA. TMA sastāvēja no 1, 5 mm kodola biopsijām no parafīnā iestrādātiem audzēja audu paraugiem. Sīkāk, BCAT2+ šūnas, ļaundabīgās šūnas un CD8+T šūnas tika iekrāsotas ar specifiskām primārajām antivielām un sekundārajām antivielām. DAPI (Invitrogen, ASV) tika izmantots, lai krāsotu šūnas kodolu. Detalizēti soļi ir aprakstīti Makarevic et al pētījumā.[57] Īsāk sakot, saskaņā ar dažādu indikatoru fluorescences intensitāti un šūnu fizikālajām īpašībām pozitīvās šūnas tika atzīmētas un kvantificētas. Vēl svarīgāk ir tas, ka CD8+T šūnu telpiskais sadalījums ap BCAT2+CK{19+ šūnām tika attēlots ar izkliedes diagrammām, pamatojoties uz attālumu telpā (0–25, 25–50, 50– 100 un 100–150 μm). Tika uzaicināti divi pieredzējuši patologi, lai pārbaudītu TissueFAXS panorāmas platformas lēmuma iznākumu. Eksperimenti ar dzīvniekiem: C57BL/6 peļu mātītes (6–7 nedēļas) tika iegūtas no Centrālās Dienvidu universitātes Laboratorijas dzīvnieku nodaļas. Visas operācijas ar pelēm pārbaudīja un apstiprināja Centrālās Dienvidu universitātes Sjangyas slimnīcas Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (preces numurs: 2021101175). Pirmkārt, lai izpētītu BCAT2 lomu audzēja augšanā in vivo, BCAT2 KD MB49 šūnas (5 × 105) un tās kontroles šūnas 100 μL barotnes tilpumā tika subkutāni injicētas peles labajā pusē. Turklāt pēc veiksmīgas zemādas audzēja modeļa izveidošanas (audzēja tilpums līdz 100 mm3) 100 ug InVivomAb pretpeles PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, ASV) un IgG2a izotipa kontrole (Cat: BE0089, Bioxcell, ASV) tika intraperitoneāli injicētas katrai pelei, lai novērtētu BCAT2 zuduma un anti-PD{275}} terapijas sinerģisko efektu. Anti-PD-1 terapija tika veikta pelēm ik pēc 3 dienām, un tā ilga līdz pieciem kursiem. Turklāt, lai spriestu, vai kopterapijas kooperatīvā iedarbība bija atkarīga no CD8+T šūnām. Kopā ar kombinēto terapiju tika izmantoti 100 ug InVivoPlus pretpeles CD8 (Kat.: BP0117, Bioxcell, ASV) un IgG2b izotipa kontrole (Kat.: BP0090, Bioxcell, ASV), lai noplicinātu CD8+T šūnas pelēm. Peļu ķermeņa svars tika reģistrēts ik pēc trim dienām. Paredzētajā datumā audzēji tika novākti, izmērīti un sagatavoti plūsmas citometrijas analīzei, IF krāsošanai un qRT-PCR. Lai izpētītu mijiedarbību starp BCAT2 ekspresijas līmeni uz CD8+T šūnām un CD8+T šūnu aktivitāti, tika pētītas mātīšu C57BL/6 peļu liesas (6–7 nedēļas) bez audzēja. disociēts un sagatavots vienas šūnas suspensijai turpmākai analīzei. Plūsmas citometrijas analīze: Peļu audzēji tika sasmalcināti un sagremoti vienas šūnas suspensijā ar kolagenāzi IV (kat.: C5138, Sigma, ASV), hialuronidāzi (kat.: H3506, Sigma, ASV) un DNāzi I (kat.: DN25, Sigma, ASV). ). Piemaisījumu filtrēšanai tika izmantoti 70 μm šūnu sietiņi (BIOFIL, Ķīna), un tika izmantots šūnu skaitītājs (Countstar, Ķīna), lai katrā paraugā iegūtu (3–5) × 106 šūnas. Pēc dzīvu šūnu identificēšanas, izmantojot Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Kat.: 423101, Biolegend, ASV) un bloķējot Fc receptoru ar anti-peles CD16/32 antivielu (Kat: 156603, Biolegend, ASV), šūnu membrānas antigēni tika iekrāsoti ar APC-Cy7. pretpeles CD45 (Kat.: 103116, Biolegend, ASV), BV421 pretpeles CD3 (Kat.: 100341, Biolegend, ASV), BV605 pretpeļu CD8a (Kat: 100744, Biolegend, ASV) un PerCPCy5.5 pretpeles CD4 (Kat.: 100540, Biolegend, ASV). Pēc tam šūnu un kodola membrānas fiksēšanai un caurlaidībai tika izmantots biozinātnes Foxp3/Transcription Factor krāsošanas bufera komplekts (Cat: 2400632, Invitrogen, ASV). Ar citotoksisku iedarbību saistītie antigēni tika krāsoti ar PE anti-cilvēka/peles Granzyme B (kat.: 372208, Biolegend, ASV), PE-Cy7 anti-peles TNF-𝛼 (Kat.: 506324, Biolegend, ASV), PE-Dazzle 594 anti- peles IFN-𝛾 (Kat: 505846, Biolegend, ASV), APC pretpeles Perforin (Kat: 154304, Biolegend, ASV). Plūsmas citometrijas analīzes vārtu noteikšanas stratēģija ir parādīta S29 attēlā (atbalsta informācija). Pret cilvēka/peles BCAT2 (Kat.: A7426, Abclonal, Ķīna) tika inkubēts ar Flexible 488 antivielu marķēšanas komplektu (Cat: KFA001, Proteintech, ASV), lai sintezētu personalizētu BCAT2 fluorescējošu antivielu plūsmas citometrijas analīzei. Pēc tam BCAT2 antivielas un ar T-šūnām saistītās antivielas tika sajauktas un pievienotas peles liesas vienas šūnas suspensijai, lai izpētītu mijiedarbību starp BCAT2 ekspresijas līmeni CD8+T-šūnā un CD{357}aktivitāti. }T šūna. Plūsmas citometrijas analīzes vārtu noteikšanas stratēģija ir parādīta S30 attēlā (atbalsta informācija). Krāsotie paraugi tika atklāti ar Cytek DxpAthena Flow citometriju (Cytek Biosciences, ASV), un dati tika analizēti ar Flowjo versijas programmatūru (BD Biosciences, ASV). Statistiskā analīze: dati tika parādīti kā vidējais ± SD. t-tests ar vai bez Welch korekcijas tika izmantots, lai salīdzinātu nepārtrauktus mainīgos starp divām grupām. Vienvirziena ANOVA analīze ar vai bez Brown-Forsythe un Welch testiem tika izmantota, lai salīdzinātu nepārtrauktus mainīgos lielumus starp vairākām grupām. Dihotomu mainīgo salīdzināšanai tika izmantots Chi kvadrāta tests vai Fišera precīzais tests. Lai novērtētu korelācijas intensitāti starp dažādiem mainīgajiem, tika izmantots Pīrsona vai Spīrmena korelācijas koeficientu tests. Kaplan-Meier izdzīvošanas līkne tika izmantota, lai parādītu dihotomu mainīgo prognostisko analīzi, un log-rank tests tika izmantots, lai novērtētu statistiskās atšķirības. Divpusējs p < 0,05 tika definēts kā nozīmīguma slieksnis. Datu apstrādei pētījumā tika izmantota programmatūra R (versija 4.0) un GraphPad Prism8.
Atsauce
[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Cancer J. Clin. 2021, 71, 7.
[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Cancer J. Clin. 2020, 70, 404.
[3] R. Nadals, J. Bellmunts, Cancer Treat. Rev. 2019, 76, 10.
[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüroglu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galskis, A. Mortazavi, MI Milovskis, S. Džordžs, S. Gupta, MT Flemings, LH Dangs, DM Geinismans, R. Volings, RS Alters, M. Kasārs, Dž. Vans, S. Gupta, N. Deiviss, Dž. Pikass, G. Filipss, DI Kvins, GK Hainss 3., N. M. Hāns, K. Žao, M. Ju, SK. Pals, Dž. Klins. Oncol. 2020, 38, 1797; c) T. Poulss, SH Parks, E. Vūgs, K. Kaserta, BP Valderrama, H. Gērnijs, H. Kalofonoss, S. Radulovičs, V. Demejs, A. Ulēns, J. Loriots, SS Sridhars, N. Cučija, E. Kopiļcovs, CN Sternbergs, J. Belmunts, Dž. B. Aragons-Čings, DP Petrilaks, R. Laliberte, Dž. Vans, B. Huans, K. Deiviss, K. Fosts, N. Kosta, JA Bleiks-Haskinss , A. di Pietro, P. Grīvas, N. Engl. J. Med. 2020, 383, 1218.
[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Br. J. Cancer 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Cancer Cell 2020, 37, 443.
[6] a) DS Chen, I. Mellman, Nature 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Exp. Med. Biol. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Cancer Res. 2019, 79, 4557.
[7] a) SM Vareki, J. Immunother. Vēzis 2018, 6, 157; b) B. Džans, K. Vu, B. Li, D. Vans, L. Vans, Y. Džou, Mol. Vēzis 2020, 19, 53.
[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Volpins, D. Vitkups, MG Vanders Heidens, Zinātne 2016, 353, 1161.
[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D. Su, QY Lei, Nat. Cell Biol. 2020, 22, 167.
[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. Mol. Med. 2019, 51, 146.
[11] a) H. Lai, X. Čens, K. Liu, V. Luo, M. Liu, M. Džans, J. Miao, Z. Dži, GN Lins, V. Songs, L. Džans, Dž. Bo, G. Yang, J. Wang, WQ Gao, Int. J. Cancer 2021, 149, 2099; b) D. Lambrehts, E. Voters, B. Boks, S. Aibars, D. Nitners, O. Bērtons, A. Basess, H. Dekaluvē, A. Pirčers, K. Van den Einds, B. Vainands, E. Verbekens, P. De Leins, A. Listons, J. Vanstīnkiste, P. Karmeljē, S. Aerts, B. Tīnponts, Nats. Med. 2018, 24, 1277.
[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Immunol. 2017, 17, 559.
[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Oncol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mols, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Vischers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Oncol. 2021, 160, 771.
