Echinacoside labvēlīgā ietekme uz diabētisko kardiomiopātiju diabētiskās Db/Db pelēm

Kontakti: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 e-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Xiang Zhang & Yarong Hao

Ievads

Diabētiskā kardiomiopātija (DHM) ir liela diabēta komplikācija ar augstu saslimstību un augstu sirds un asinsvadu slimību un mirstības risku diabēta slimniekiem.1 DHM sastopamība pacientiem ar diabēta ≥ 5 gadiem anamnēzē pārsniedz 44,4%, kas pēc 8 gadiem palielinās līdz 56%.2,3 DHM ir sava veida primārā kardiomiopātija, kas izpaužas kā sirds strukturālas un funkcionālas novirzes, ko izraisa miokarda fibrozes šūnu apoptoze un mikrovaskulāri bojājumi diabēta slimniekiem bez išēmiskas vai hipertensīvas sirds slimības, un var izraisīt sirds aritmiju ar sirds izcelsmes šoku un pēkšņu nāvi sirds mazspējas gadījumā.4 Sakarā ar DHM sarežģīto patoģenēzi un tā diagnozi progresīvās stadijās efektīvas ārstēšanas nav.5 Hiperglikēmija ir sākuma faktors DCM patoģenēzes laikā. Ilgstoša hiperglikēmija izraisa glikozes un lipīdu metabolisma traucējumus diabēta pacientu kardiomiocītos, kā rezultātā tiek ievainotas asinsvadu endotēlija šūnas un citi audi, veicinot patoloģiskas izmaiņas, tostarp hipertrofiju, nekrozi, apoptozi un miokarda intersticiālu fibrozi.6,7 Glikozes un lipīdu metabolisma traucējumi ir galvenie DHM patoloģiskajos mehānismos. Tāpēc efektīva enerģijas metabolisma kontrole kardiomiocītos ir svarīga DHM terapeitiskā stratēģija.

cistanche tubulosa ārstētDiabētiskā kardiomiopātija

Miokarda lipīdu uzkrāšanās DHM saasina sirds mazspējas progresēšanu. PPAR-α ir galvenais dažādu saistīto gēnu regulators šūnu peroksidāžu, mitohondriju un mikrosomu taukskābju oksidācijas sistēmā, un tam ir galvenā loma lipīdu metabolisma un iekaisuma un imunitātes regulēšanas laikā.8 PPAR-α uzlabo lipīdu metabolismu, izmantojot mitohondriju un peroksidāzes taukskābju beta-oksidāciju, mediējot caur karnitīna palmitoiltransferāzi-I (CPT-I).9 Garu un sazarotu taukskābju oksidācija10 samazina lipoproteīnu un VLDL sintēzi un montāžu. 11 Netiešā žultsskābes sintēzes regulēšana veicina holesterīna izdalīšanos12 un kavē ar iekaisumu saistītu gēnu ekspresiju. PPAR-α ekspresija aknās ir ievērojami zemāka pacientiem ar bezalkoholisko taukaino aknu slimību vai dzīvnieku modeļos ar ilgstošu augstu tauku saturu.13,14 Everett et al parādīja, ka ar aknām saistīto brīvo taukskābju līmenis ievērojami palielinājās PPAR-α nokauta peļu modeļos novājināta lipīdu metabolisma dēļ, veicinot aknu steatozi.15 Šie atklājumi liecina, ka PPAR-α ir svarīga loma lipīdu metabolisma patoģenēzē.

Ehinozīds (ECH) ir dabisks savienojums, kas izolēts nocistanche tubulosa.ECH aktīvā ķīmiskā viela ir feniletanoīds, kas parāda antioksidantu, pret nogurumu, pretvēža un pretiekaisuma iedarbību, kā arī var uzlabot atmiņu, nervu un aknu aizsardzību un uzlabot imūno regulēšanu.16,17 Pētījumā par db/db diabētiskām pelēm tika konstatēts, ka ECH var uzlabot insulīna rezistenci, palielināt ABL līmeni un samazināt TG, TC un ZBL līmeni, norādot, ka ECH varētu efektīvi uzlabot diabētiskā lipīdu metabolismu.18 Turklāt Shimoda et al pierādīja, ka Echinacoside var ietekmēt lipīdu metabolismu, regulējot mRNS, kas saistīta ar hepatobiliāro sterīnu transportu

un metabolisms.19 Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka ECH regulē TGF-β un tā pakārtoto gēnu ekspresiju, lai uzlabotu nieru fibrozi db/db pelēm.20 Šajā pētījumā, lai vēl vairāk izprastu ECH aizsargājošo ietekmi uz miokarda šūnu traumu DHM un izpētītu tā iespējamos molekulāros mehānismus, mēs izmantojām db/db peles kā DHM slimības modeli un izpētījām ECH regulējošo(-os) mehānismu(-us) attiecībā uz proteīniem, kas kontrolē glikozes un lipīdu vielmaiņas traucējumus, oksidatīvais stress un apoptoze kardiomiocītos. Mūsu mērķis bija nodrošināt teorētisku pamatu efektīvai DHM ārstēšanai.

cistanche tubulosa

Materiāli un metodes

Ķimikālijas un reaģenti

ECH pulveris (94% tīrība, ko atklāja HPLC, partijas Nr.190906) (papildinājums 1. attēls) tika iegūts no Shanghai Medical Science Company, Ltd. (Šanhaja, Ķīna). ECH izšķīdināja ūdenī līdz 2 mg/ml un tumsā uzglabāja 4°C temperatūrā. ECH tika ievadīts devā 100–500 mg/kg·d un ievērojami pazemināts

glikozes līmenis asinīs un lipīdu līmeņa uzlabošanās asinīs.18 ECH uzrādīja no devas atkarīgu hipoglikēmisku un anti-hiperlipidēmisku iedarbību.

Izmēģinājumu dzīvnieki un ārstēšana

Eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu vadlīnijām (NIH Pub. Nr. 85-23, pārstrādāts 1996. gadā). Protokolus apstiprināja eksperimentālā dzīvnieku ētikas komiteja un Uhaņas universitātes Renminas slimnīcas Dzīvnieku barošanas centrs (Uhaņa, Ķīna, Nr. 20190517). Pieaugušie vīrieši C57BLKS/J db/db peles un db/m peles (SPF pakāpe) tika iegādāti no Nanjingas universitātes-Nanjingas Biomedicīnas pētījumu institūta (Nanjing, Ķīnas Tautas Republika, numurs: SCXK (Sjū) 2018-0001). Dzīvnieki tika ievietoti sprostos Renminas slimnīcas dzīvnieku centrā (Uhaņa, Ķīnas Tautas Republika) istabas temperatūrā (20 ° C), relatīvajā mitrumā 50%-60% un pakļauts 12 stundu gaismas / tumsas ciklam. Adaptīvā barošana tika veikta 1 stundu, un hipoglikēmiskas zāles netika ievadītas.

Pēc karantīnas db/db peles pēc nejaušības principa tika iedalītas diabēta parauggrupā (db/db grupa, n= 10), ECH terapijas grupā (db/db+ECH grupa, n=11) vai db/m kontroles grupā (db/m, n=9). Pēc 8 nedēļām pelēm db/db un db/m grupās 10 nedēļas tika ievadīts perorāls 0,05 ml/ 10 g ķermeņa masas sāls šķīdums, bet pelēm db/db+ECH grupā tika ievadīti 300 mg/(kg/d) perorāli

ECH atkarībā no ķermeņa masas 10 nedēļas. Trīs peļu grupu ķermeņa masa tika uzraudzīta katru nedēļu, un tika novērtēta barošana, dzeršana un aktivitāte. Kad peles bija badojušās 8 stundas, asins paraugi (~50ul) tika ņemti no astes gala ik pēc 2 nedēļām ar glikozes mērītāju asinīs un testa papīru (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, ASV), lai noteiktu glikozes līmeni asinīs. Pēc 10 nedēļu ilgas iejaukšanās pelēm tika veikta anestēzija intraperitoneāla injekcija ar 2% pentobarbitālo nātriju (Šanhajas ražas uzņēmums, Šanhaja, Ķīnas Tautas Republika) (100mg/kg). Pēc kapilārās adatas ievietošanas tika savāktas asinis, un serums tika ātri atdalīts un uzglabāts −80°C temperatūrā analīzei. Pēc sirds perfūzijas ar aukstu- PBS, lai noņemtu asinis, brīvais PBS tika noņemts ar filtrpapīru. Sirds audi tika atdalīti un nosvērti, un tika mērīts sirds sausais svars. Peles vēders tika noskūts, vēders tika atvērts pēc alkohola (70%) dezinfekcijas, un vēdera zemādas taukaudi tika ātri noņemti un nosvērti mitri. Peļu stilba kauls tika izolēts un mērīts. Sirds hipertrofija tika novērtēta, ņemot vērā sirds ķermeņa masas un stilba kaula garuma (HW/TL) (mg/mm) attiecību. Sirds audi tika fiksēti ar 4% paraformaldehīdu (Google biotehnoloģija, Uhaņa, Ķīnas Tautas Republika), un biopsijas tika veiktas, lai uzraudzītu miokarda audu morfoloģiju. Atlikušie sirds audi tika ievietoti šķidrā slāpeklī 1 stundu un uzglabāti −80 ° C temperatūrā pirms RT-PCR un Western blot analīzes.

Ehokardiogrāfija

Ultraskaņa (VisualSonics, Toronto, ON, Kanāda) tika veikta ehokardiogrāfiskiem mērījumiem eksperimenta beigās. Peles tika anestezētas, intraperitoneāli injicējot 4% hlora hidrātu ar 30 mg/kg pusstundu,21 noskūts, lai atklātu krūšu kurvja zonu, un piestiprināts pie plakanas plāksnes. Tika noteikts kreisā kambara sistoliskais diametrs (DVD), LV diastoliskais diametrs (LVD), LV izmešanas frakcija (EF) un LV frakcionētā saīsināšana (FS).

Vielmaiņas un bioķīmiskie parametri

18 nedēļu vecumā asins paraugi tika centrifugēti 4 °C temperatūrā 20 minūtes seruma savākšanai. Kopējais automatizētais bioķīmiskais analizators (ADVID2400, Tokija, Japāna) tika izmantots, lai noteiktu kopējo holesterīnu (TC), triglicerīdus (TG), brīvās taukskābes (FFAs), augsta blīvuma lipoproteīna holesterīnu (ABL- c) un zema blīvuma lipoproteīnu holesterīnu (ZBL-c) serumā.

Antioksidācija: cistanche tubulosa

Oksidācijas indekss un antioksidantu līmenis

Tika iegūti svaigi kreisā kambara miokarda audi (50 mg) no katras grupas. SOD, GSH-px un MDA līmenis miokarda šūnās tika noteikts, izmantojot komerciālus komplektus (Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, Ķīna).

Trihroms, Tunels un Sudāna II Krāsošana Katras peļu grupas miokarda audu kreisais kambara reģions tika fiksēts 4% paraformaldehīda 24h, parafīns iestrādāts, sadalīts un HE iekrāsots. Katras peļu grupas miokarda šķiedru patoloģiskās un morfoloģiskās izmaiņas tika novērotas vieglā mikroskopijā (JEOL, Tokija, Japāna). Sirds miocītu apoptozi atklāja Tunel testi (numurs11684817910, Roche, ASV). Sirds audi tika iepriekš apstrādāti ar paraformaldehīdu, iestrādāti un sagriezti šķēlēs. Sekcijas tika mazgātas ar ksilolu I (Šanhaja, Činas Tautas Republika) (20 min) -ksilolu II (20 min)-bezūdens etanolu I (10 min) -bezūdens etanolu II (10 min) −95% alkohola (5 min)-90% alkohola (5 min)-80% alkohola (5 min) −70% alkohola (5 min) un destilēta ūdens. Sekcijas tika žāvētas, kratot, un, lai novērstu šķidruma zudumus, tika izmantoti histoķīmiskie suku gredzeni. Gredzeniem tika pievienota proteāze K, lai pārklātu audus. Pēc 15 min inkubācijas 37°C temperatūrā priekšmetstikliņus ievietoja PBS (pH 7,4) un mazgāja atkrāsojošā kratītājā (trīs reizes 5 min). Reaģenti 1 (TdT) un 2 (dUTP) tika sajaukti ar attiecību 1:9 un pievienoti audu iekšējam pārklājumam. Maisījumi tika inkubēti ūdens vannā 37 °C temperatūrā 60 minūtes. Lai uzturētu mitrumu, tika pievienots neliels ūdens daudzums. Slaidi tika izskaloti PBS un DAPI iekrāsoti (Aspen biological, Wuhan, People's Republic of China) tumsā 5 min. Slaidi tika izskaloti PBS un uzstādīti, izmantojot anti-fluorescences dzesēšanas līdzekli. Sekcijas tika vizualizētas ar fluorescējošu mikroskopiju un attēlotas. Sudānas II krāsošana tika izmantota, lai novērotu lipīdu uzkrāšanos sirds miocītos. Kreisā kambara audi tika fiksēti 10% paraformaldehīdā 30 min, iekrāsoti ar Sudānas sarkano II (Gefen, Šanhaja, Ķīnas Tautas Republika) istabas temperatūrā 10 min, dekrāsoti ar 75% alkoholu un atkārtoti iekrāsoti PBS 15 min. Miokarda fibrozes attiecība pret kopējo laukumu Masson iekrāsotajās trihromās sekcijās tika noteikta, izmantojot Image-Pro Plus kvantitatīvo programmatūru. Slaidi tika uzstādīti, izmantojot glicerīna želatīnu, un attēloti mikroskopijā.

Rezultātus

ECH ietekme uz Db/Db pelēm

Pelēm db/db grupās bija acīmredzama polifāgija un poliūrija. Arī ķermeņa izmēri bija ievērojami lielāki nekā db/m pelēm. Ķermeņa masa db/db grupā ievērojami palielinājās attiecībā pret db/m grupu (1.A attēls; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

Glikozes līmenis asinīs tukšā dūšā tika novērtēts katru nedēļu. Kā parādīts 1.B attēlā, salīdzinot ar db/m pelēm, db/db pelēm glikozes līmenis asinīs tukšā dūšā līdz ar vecumu ievērojami palielinājās un uzrādīja acīmredzamu hiperglikēmiju (1.B attēls; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

Diskusija

Diabētiskā kardiomiopātija parasti ir sadalīta četros posmos. Pirmajā posmā palielinājās kreisā kambara masa, diastoliskā disfunkcija un izmešanas frakcija (EF) normāla. Pat klīniski asimptomātiska, palielinājās miokarda fibroze, samazinājās agrīna diastoliskā piepildījums un palielinājās kreisā kambara gala diastoliskais spiediens.22 Otrajam posmam raksturīga palielināta kreisā kambara masa, sabiezinātas kambara sienas, sistoliskā un diastoliskā disfunkcija (EF<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson’s="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP ir sirds enerģijas pamatavots. Sirds enerģiju nodrošina FA oksidēšanās un sadalīšanās, kas veido ~70% no sirds enerģijas piegādes.29 Atlikušo daļu nodrošina ogļhidrāti, piemēram, glikoze un pienskābe.30 Diabētiskās sirdis ir pakļautas paaugstinātam enerģijas patēriņam un miokarda spēju nelīdzsvarotībai, kas ir galvenais miokarda vielmaiņas traucējumu cēlonis, tostarp samazināts glikozes metabolisms un paaugstināts FA metabolisms. Tas noved pie palielinātas FA uzņemšanas un oksidēšanās, kas izraisa taukaudu uzkrāšanos un toksisku tauku vielu veidošanos, kas tieši izraisa DHM bojājumus.31

Secinājumi

DB/db pelēm ar diabētisko miokardu glikozes un lipīdu metabolisms tiek disregulēts, izraisot paaugstinātu oksidatīvā stresa un apoptozes līmeni. Šis pētījums apstiprināja, ka ECH var ievērojami samazināt ilgtermiņa hiperglikēmiju db/db pelēm, izmantojot PPAR/M-CPT-1/GLUT-4 signalizāciju. Tikmēr ECH uzlaboja oksidatīvo stresu un inhibēja miokarda apoptozi db/db DHM pelēm, kas var būt saistīta ar uzlabotu enerģijas metabolismu. Lai gan pamatmehānismi, kas regulē šo ietekmi, netika atklāti, šie atklājumi sniedz jaunu virzienu DHM ārstēšanai un ECH aizsargājošajai lomai miokarda traumu uzlabošanā.

Atsauces

1. Bauters C, Lamblin N, Mc Fadden EP, Van Belle E, Millaire A, de

Groote P. Cukura diabēta ietekme uz sirds mazspējas risku un iznākumu. Kardiovasc Diabetol. 2003;1(8):1–2. doi:10.1186/1475- 2840-2-1

2. Tate M, Grieve DJ, Ritchie RH. Vai pie apvāršņa ir mērķtiecīgas terapijas diabētiskai kardiomiopātijai? Clin Sci. 2017;131(10):897–915. doi:10.1042/CS20160491

3. Khan H, Anker SD, Januzzi JJ u.c. Sirds mazspējas epidemioloģija pacientiem ar cukura diabētu bez koronārās sirds slimības. J karte neizdodas. 2019;25(2):78–86. doi:10.1016/j.cardfail.2018.10.015

4. Šeila K, Patels B. CTGF gēns −945 G/C polimorfisms nav saistīts ar sirds vai nieru komplikācijām personām ar 2. tipa cukura diabētu. Kardiovasc Diabetol. 2012;1(11):42.