Beta-glikāna pastiprināta imūnreakcija pret Ņūkāslas slimības vakcīnu un izmainīta MRNS liesas ekspresija cāļiem

KOPSAVILKUMS

Šis pētījums tika veikts, lai izpētītu b-glikāna (G70), produkta, kas iegūts no rauga šūnu sieniņas, perorālas ievadīšanas ietekmi uz Ņūkāslas slimības vīrusa (NDV) specifisko hemaglutinācijas inhibīcijas (HI) titriem, limfocītu proliferāciju un T limfocītu apakšpopulāciju loma cāļiem, kas ārstēti ar dzīvu NDV vakcīnu. Turklāt b-glikāna ietekme uz liesas gēnu ekspresiju tika pētīta ar transkripta sekvencēšanu. Rezultāti atklāja, ka b-glikāna papildināšana paaugstināja seruma NDV HI titru, palielināja limfocītu NDV stimulācijas indeksu perifērajās asinīs un zarnu traktā un veicināja T limfocītu diferenciāciju CD 4+ T šūnās. RNS sekvencēšanas (RNS-seq) analīze parādīja, ka G70 pārregulēja mRNS ekspresijas, kas saistītas ar G-proteīnu saistītu receptoru un MHC I klases polipeptīdu, un pazemināja mRNS ekspresijas, kas saistītas ar katelicidīnu un betadefensīnu. G70 imūnmodulējošā iedarbība var darboties, izmantojot mitogēnu aktivētu proteīnkināzes signālu ceļu. Rezumējot, G70 varētu palielināt dzīvas NDV vakcīnas imunoloģisko efektivitāti cāļiem un varētu tikt izmantots kā potenciāls palīgvielas kandidāts mājputnu nozarē.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Atslēgvārdi: Ņūkāslas slimības vakcīna, beta-glikāns, adjuvants, melnkaula vistas, RNS-seq

IEVADS

Rauga šūnu sienas polisaharīdi tiek tieši iegūti no Saccharomyces cerevisiae šūnu sienas un tiek plaši izmantoti kā augšanas veicinātāji, pretmikrobu līdzekļi vai imūnmodulatori mājputniem, lai uzlabotu ražošanu un veselību (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Iepriekš tika pierādīts, ka produkts ar nosaukumu PW220, kas satur rauga šūnu sieniņu polisaharīdus, pastiprina Ņūkāslas slimības vīrusa (NDV) izraisīto imūnreakciju un maina mikrobu kopienu cāļu aklajā zarnā, to lietojot perorāli (Bi et al., 2020). ). Rauga šūnu sienas polisaharīdi galvenokārt sastāv no b-glikāna un mannāna-oligosaharīdiem (Wang et al., 2018). Šajā pētījumā tika pētīta b-glikāna ietekme uz imūnreakciju pret NDV vakcīnu cāļiem. Liesa ir galvenais orgāns imūnās atbildes ierosināšanai. Nesen veikts pētījums norādīja, ka PW220, kas ir rauga šūnu sienas produkts, pārregulēja TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 un T-bet mRNS ekspresiju cāļu liesā ( Bi et al., 2022). Tomēr ir jānoskaidro konkrētais mehānisms. RNS sekvencēšana (RNA-seq) ir viena no augstas caurlaidspējas tehnoloģijām, ko var izmantot, lai noteiktu kvantitatīvu gēnu ekspresiju un nodrošinātu dažādu ekspresijas profilu analīzi visa transkripta līmenī (Zhao et al., 2018). Pateicoties augstās jutības un zemo izmaksu priekšrocībām, RNS-seq ir plaši izmantots mājlopu un mājputnu pētījumos (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Tādējādi šajā pētījumā tika novērtēta b-glikāna ievadīšanas ietekme uz NDV specifisko hemaglutinācijas inhibīcijas (HI) titriem, limfocītu proliferāciju un T-limfocītu subpopulācijām cāļiem, kas perorāli vakcinēti ar NDV vakcīnu. Turklāt tika izmantota transkripta analīze, lai novērtētu b-glikāna ietekmi uz gēnu ekspresiju un pamatā esošajiem signāla transdukcijas ceļiem cāļu liesā.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Dzīvnieki

Vienu dienu veci komerciāli melnkaulu cāļi (vīrieši) tika iegādāti no Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Anšuna, Ķīna). Cāļi tika sadalīti stiepļu būros, kas ļāva brīvi piekļūt barībai un ūdenim. Pirmajās 7 dienās istabas temperatūra tika uzturēta no 33°C līdz 35°C, pēc tam pakāpeniski pazeminājās par 1°C ik pēc 2 d līdz 27°C. Visas cāļus apstrādāja saskaņā ar Dienvidrietumu universitātes dzīvnieku kopšanas un lopkopības universitātes noteiktajiem standartiem. Izmantošanas komiteja (ētikas sertifikāta numurs: IAC-2021-0057). Visi eksperimentālie putni pētījuma beigās tika eitanizēti ar CO2.

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Vakcīna

Dzīvu NDV (La Sota celma) vakcīnu nodrošināja Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Qingdao, Ķīna).

Reaģenti 

Rauga šūnu sienas produkts (YP) G70 tika iegūts no rauga šūnu (Saccharomyces cerevisiae) sienas, kas satur b-glikānu (lielāks vai vienāds ar 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Yichang, Ķīna). Gan antigēni, gan pozitīvās kontroles serumi NDV specifisko HI titru mērīšanai tika iegādāti no Qingdao Regen Diagnostics Development Center (Qingdao, Ķīna). Anti-vistas CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) un CD8- PE (L{{14) }}TH49T) žurkām piedāvāja Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Nanjing, Ķīna).

Eksperimentālais dizains

Četrdesmit astoņi cāļi ar melnkauliem 5 dienu vecumā nejauši tika iedalīti 3 grupās (1. tabula), un tiem tika piešķirta vai nu pamata diēta (2. tabula), vai arī pamata diēta ar 0.1% G7{{10} } (b-glikāns, 0,7 g/kg) papildinājumu šī pētījuma laikā. H grupa (G70 + vakcīna) un C (vakcīna) tika perorāli imunizēta ar NDV vakcīnu attiecīgi 14. un 28. dienā. S grupa (Sailne) tika apstrādāta ar vienādu tilpumu fizioloģiskā šķīduma. Lai pārbaudītu HI titru, asins paraugi tika savākti ar spārnu venipunktūru 5, 7, 14, 21, 28, 35 un 42 dienu vecumā. Septiņas dienas pēc revakcinācijas, 8 cāļi katrā kolonnā tika nejauši atlasīti un nonāvēti ar nosmakšanu, izmantojot CO2. Limfocīti tika atdalīti gan no perifērajām asinīm, gan tukšās zarnas, lai veiktu limfocītu proliferācijas un plūsmas citometrijas analīzi. Jejunālas paraugu ņemšanas gadījumā divpadsmitpirkstu zarnas suspensīvā saite bija tukšās zarnas sākuma punkts, un no tukšās zarnas sākuma punkta tika savākta 5 cm gara daļa. Liesa tika ātri sasaldēta šķidrā slāpeklī un pēc tam uzglabāta -80 grādos RT-qPCR un secību profilēšanai.

1. tabula. Eksperimentālais dizains

2. tabula. 1 Eksperimentālo broileru pamatbarību sastāvs un uzturvielu saturs.

HI Pētījums

NDV specifisko HI titru pārbaude serumā tika veikta saskaņā ar iepriekšējo aprakstu (Ball et al., 2019). Īsāk sakot, serums tika atšķaidīts ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) no 1:2 līdz 1:1 024 V-dibena 96-iedobes mikrotitrēšanas plāksnē. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 25 ml NDV atšķaidījuma un inkubēja 37 grādu temperatūrā 30 minūtes. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 25 ml 1% gaiļa eritrocītu suspensijas un inkubēja 37 grādu temperatūrā 30 minūtes. Visi paraugi tika pārbaudīti divas reizes, un katrā plāksnē tika iekļautas gan pozitīvas, gan negatīvas kontroles. HI titri tika balstīti uz lielāko atšķaidījumu, kas izraisīja pilnīgu hemaglutinācijas inhibīciju. Katrai grupai tika mērīts vidējais HI titrs un standarta kļūda (SE).

Limfocītu izolēšana no perifērajām asinīm

Limfocīti tika izolēti un savākti no perifēro asiņu limfocītiem, izmantojot limfocītu atdalīšanas barotnes komplektu (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Tianjin, Ķīna). Pēc tam limfocīti tika uzglabāti suspensijā ar RPMI 164 0 barotni (Solarbio, Pekina, Ķīna), ieskaitot 5% teļa augļa serumu un 25 mM HEPES (pH 7,0).

Limfocītu izolēšana no tukšās zarnas

Piešķiršanas process tika veikts saskaņā ar iepriekšējo aprakstu un ar nelielām izmaiņām (Yuan et al., 2020). Īsāk sakot, izmantojiet 70 mm šūnu filtru, lai sadalītu zarnas 4 ml auksta PBS. Pēc tam parauga šūnu suspensija tika centrifugēta ar ātrumu 4500 apgr./min 12 minūtes, noņemot supernatantu. Pēc tam atkārtoti suspendējiet zarnu šūnas pilnā barotnē (Solarbio Co., Pekina, Ķīna), kas sastāv no 5% liellopu augļa seruma (FBS) RPMI 1640 (Sijiqing Co., Hangzhou, Ķīna). Galu galā vistas limfocītu izolācijas komplekts (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.), lai atdalītu limfocītus. zarnu audi tika sadalīti 4 ml auksta PBS, izmantojot 70 mm šūnu filtru. Pēc tam parauga šūnu suspensija tika centrifugēta ar ātrumu 4500 apgr./min 12 minūtes un supernatants tika izmests. Pēc tam zarnu šūnas tika atkārtoti suspendētas RPMI 1640 (Solarbio Co.), kas satur 5% FBS (Sijiqing Co.). Visbeidzot, limfocīti tika atdalīti, izmantojot vistas limfocītu izolācijas komplektu (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Limfocītu proliferācija 

Šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs (5 £105 katrā iedobē), stimulējot ar inaktivētā NDV antigēnu 4 hemaglutinācijas vienībām vai vienādam tilpumam fizioloģiskā šķīduma. Katrs paraugs tika pārbaudīts 3 atkārtojumos. Šūnas un antigēnu inkubēja 44 stundas 37 grādu temperatūrā 5% CO2, un pēc tam katrai iedobei pievienoja 50 ml metiltiazoliltetrazolija (MTT) (2 mg / ml) un inkubēja vēl 4 stundas. Paraugus centrifugēja ar ātrumu 1200 £ g 8 minūtes iekštelpu temperatūrā. Pēc tam supernatants tika uzmanīgi noņemts un katrā iedobē tika pievienots 100 ml DMSO. Plāksnes krata 8 minūtes, lai pilnībā izšķīdinātu kristālus. Visbeidzot, vidējais optiskais blīvums (OD) tika reģistrēts pie 570 nm. Stimulācijas indekss (SI) tika iegūts, izmantojot vienādojumu: stimulēto aku OD vērtības/ nestimulēto aku OD vērtības (Cui et al., 2020).

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

T-limfocītu apakšpopulāciju plūsmas citometrijas analīze

Limfoīdu šūnu suspensijas tika izolētas un divas reizes mazgātas ar PBS. Šūnu koncentrācija tika mainīta līdz 106 / ml un pēc tam tika turēta uz ledus. Katrs paraugs tika iekrāsots ar 2 ml žurku pretvistas CD3-APC, CD4- FITC un žurku pretvistas CD8-PE gaismas necaurlaidīgos apstākļos 30 minūtes, pēc tam sekoja. 2 mazgāšanas reizes ar PBS. Šūnas tika pārbaudītas, izmantojot plūsmas citometrijas analīzi ar plūsmas citometru (BD Bioscience, Sanhosē, CA).

RT-qPCR analīze

Kopējā RNS tika iegūta no liesas, izmantojot TRIzol reaģentu (Takara, Shiga, Japāna) saskaņā ar ražotāja vadlīnijām, un pēc tam pārveidota par cDNS, izmantojot PrimeScript RT Master Mix (Takara, Dalian, Ķīna) uz T100 termiskā ciklera (Bio-Rad, Hercules, CA). Vistas beta-aktīns tika izmantots kā iekšējās kontroles gēns. Atlasīto gēnu RT-qPCR tika veikta vairāku reāllaika PCR sistēmā (AB, Karlsbāda, Kalifornija) ar SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Lai novērtētu kvantitatīvo variāciju, tika izmantota relatīvā kvantitatīvā metode (244CT) (Bi et al., 2022). Praimeru secības ir norādītas 3. tabulā.

RNS ekstrakcija

Katrs no 3 H grupas (G70 +vakcīna) un C grupas (vakcīna) liesas paraugiem tika izmantots RNS-seq ar TRIzol reaģentu (Takara). Pēc tam RNS tika pārbaudīts attiecībā uz piesārņojumu un sadalīšanos ar 1% agarozes gelu, un RNS tīrība tika analizēta, izmantojot nanofotometra spektrofotometru (IMPLEN, Westlake Village, CA). RNS koncentrācija tika noteikta, izmantojot Qubit RNA Assay Kit Qubit 2.0 Fluorometrs (Life Technologies, Carlsbad, CA). RNS integritāte tika mērīta, izmantojot Bioanalyzer 2100 sistēmas RNA Nano 6000 testa komplektu (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Rezultāti parādīja, ka RNS bija pilnīga un bez DNS piesārņojuma.

Transkripta analīze

Transkripta sekvencēšanu, secību montāžu un datu analīzi nodrošināja Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Pekina, Ķīna). Galvenās transkripta procedūras tika uzskaitītas šādi: 1) mRNS attīrīšana no kopējās RNS tika veikta, izmantojot poli-T oligo pievienotās magnētiskās lodītes. Fragmentēšana tika veikta ar divvērtīgiem katjoniem NEB Next First Strand sintēzes reakcijas buferšķīdumā (5X) augstā temperatūrā. 2) Pirmās virknes cDNS tika sintezēta, izmantojot nejaušu heksamēra praimeru un Moloney peles leikēmijas vīrusa (M-MuLV) reverso. Pēc tam otrās ķēdes cDNS sintēze tika sintezēta, izmantojot DNS polimerāzi I un RNāzi H. 3) Atlikušās pārkares tika pārveidotas par neasiem galiem, izmantojot eksonukleāzes/polimerāzes aktivitātes. Pēc tam tika ligēts matadata cilpas struktūra NEB Next Adapter, lai sagatavotos hibridizācijai pēc DNS fragmentu 3' gala adenilēšanas. 4) Tika iegūti aptuveni 250 līdz 300 bp cDNS fragmenti, un bibliotēka tika attīrīta, izmantojot Beckman Coulter's AMPure XP sistēmu (Beckman Coulter, Beverly, MA). Pēc tam 37 ° C temperatūrā 15 minūtes uzklāja 3 ml NEBU SER enzīma (Thermo Fisher, Hillsboro, OR) ar atlasītu izmēru, ar adapteri ligētu cDNS 37 ° C temperatūrā 15 minūtes un pēc tam 5 minūtes 95 ° C temperatūrā. PCR amplifikācija tika veikta ar Phusion High-Fidelity DNS polimerāzi. Galu galā PCR produkti tika attīrīti (AMPure XP sistēma) un bibliotēkas kvalitāte tika novērtēta, izmantojot Agilent Bioanalyzer 2100 sistēmu. Ar indeksu kodēto paraugu grupēšana tika veikta ar TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, Sandjego, CA). Pēc tam sekvencēšana tika veikta Illumina Novaseq platformā un tika ģenerēti 150 bp pāra gala nolasījumi. Atsauces genoma un gēnu modeļa anotācijas faili tika lejupielādēti no genoma vietnes (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ un ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Atsauces genoma indekss tika izveidots, izmantojot HISAT2 (v2.0.5), un pāra gala tīrie nolasījumi tika saskaņoti ar atsauces genomu. Katram gēnam kartēto nolasījumu skaits un fragmenti uz kilogramu bāzi uz miljonu (FPKM) katram gēnam, pamatojoties uz gēna garumu, un nolasījumu skaits, kas kartēts ar gēnu, tika aprēķināts, izmantojot funkciju Feature Counts v1.5.{38} }p3. Diferenciālā izteiksme starp H grupu (G70 + Vakcīna) un C grupu (Vakcīna) tika iegūta, izmantojot DESeq2 R pakotni (1.16.1.). Gēni ar P < 0,05 un |log2 (izmaiņas reizes)| > 1 tika definēti kā diferenciālās ekspresijas gēni (DEG).

3. tabula. Praimeru secības RT-qPCR.

Reāllaika kvantitatīvā PCR validācija 

Lai apstiprinātu transkripta sekvencēšanas rezultātus ar RT-qPCR, H grupas (G70 + Vakcīna) un C grupas (vakcīna) salīdzinājumam tika izvēlēti divi augstāk regulēti DEG un 4 pazemināti DEG. RNS tika pārveidota par cDNS, izmantojot PrimeScript RT Master Mix (Takara) uz T100 termociklera (Bio-Rad). Praimeru sekvences ir norādītas 3. tabulā. Vistas b-aktīns tika izmantots kā iekšējās kontroles gēns. Atlasīto gēnu RT-qPCR tika veikts ar vairāku reāllaika PCR sistēmu (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ar SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Lai novērtētu kvantitatīvās noteikšanas atšķirības, tika izmantota relatīvā kvantitatīvā metode (244CT). Visi paraugi analīzei tika veikti trīs eksemplāros.

Statistiskā analīze

Vairākkārtējai grupu salīdzināšanai, izmantojot SPSS programmatūru (versija 21.0, SPSS Inc., Čikāga, IL), tika izmantota vienvirziena ANOVA ar Duncan post hoc testu. Dati ir izteikti kā vidējais § SE. Vērtība P < 0,05 tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.

REZULTĀTI b-glikāna ietekme uz seruma antivielu titriem

Kā parādīts 1. attēlā, NDV specifiskie HI titri samazinājās visās grupās pirms vakcinācijas un palielinājās H (G70+vakcīna) un C (vakcīna) grupās pēc imunizācijas. Interesanti, ka augstāki HI titri tika novēroti H grupā (G70+Vakcīna) 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (P > 0,05) un 42 (P > 0,05) d vecumā nekā C grupā (Vakcīna).

b-glikāna ietekme uz limfocītu proliferāciju

G70 ietekme uz perifēro asiņu limfocītu proliferāciju ir attēlota 2.A attēlā. SI asins limfocītos palielinājās putniem, kuri tika papildināti ar G70 (G70 + Vakcīnu) 7 dienās (P < 0,05) revakcinācijas laikā, salīdzinot ar Vakcīnas grupu. Turklāt SI tukšās zarnas limfocītos ievērojami palielinājās 7 dienas (P < 0,05) pēc revakcinācijas, salīdzinot ar vakcīnas grupu (2.B attēls).

b-glikāna ietekme uz CD4 +/CD8 + T šūnu attiecību perifērajās asinīs 

Attēlā 3A un 3B ir parādīts limfocītu un CD3 + šūnu stingums, savukārt 3C līdz 3E attēlā parādīta CD4 + /CD8 + T šūnu attiecība G70, vakcīnu un fizioloģisko šķīdumu grupām. Kā parādīts 3.F attēlā, pēc revakcinācijas nebija ievērojamas atšķirības starp vakcīnu grupu un fizioloģiskā šķīduma grupu (P > 0.05), savukārt CD4 +/CD{{12} } T šūnu skaits acīmredzami bija augstāks G70 (G70 + Vakcīna) grupā nekā vakcīnas grupā (P < 0,05).

1. attēls. B-glikāna perorālas ievadīšanas ietekme uz NDV vakcīnas antivielu titriem serumā. Dati ir izteikti kā vidējais § SE.

Saistītā gēnu ekspresija

Kā parādīts 4. attēlā, ievērojami palielinājās TGF-b mRNS ekspresija (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{13} }5), un TLR5 (P < 0.05) tika konstatēts ar G70 (G70 + Vaccine) ārstēto cāļu liesā, salīdzinot ar vakcīnu grupu. IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) un TLR3 (P > 0,05) mRNS ekspresijā starp G70 (G70 + Vaccine) un vakcīnu liesā netika konstatēta būtiska atšķirība. grupas.

RNS sekvencēšanas datu analīze 

RNS sekvencēšana no 8 liesas bibliotēkām deva 24,1 G neapstrādātu datu, kā parādīts papildu materiāla S1 tabulā. CN nozīmē grupas vakcīnu, un HN nozīmē G70 + grupas vakcīnu. Bibliotēka C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 un H4 attiecīgi sastāv no 45 591 492, 47 424 782, 46 193 492, 54 403 376, 47 118 476, 47 118 476, 47 118 476, 47 118 476, 47 118 476, 45, 81, 4, 5, 4, 5, 8 438 oriģināllasījumi. Pēc aptamera tika noņemtas neskaidras un zemas kvalitātes sekvences, atstājot 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 44, 40, 290 un 44, 40, 29. Vairāk nekā 96% tīro nolasījumu bija starp sākotnējiem lasījumiem, un 8 bibliotēkas tika saskaņotas, izmantojot HISAT2, lai secinātu nolasījumus ar atsauces datu bāzi, kas sastāv no Gallus genoma. Turklāt vairāk nekā 95% gadījumu tīrie nolasījumi tika kartēti šajā datubāzē. Speciāli bibliotēkām no C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 un H4 bija 40 921 384 (92,9%), 41 302 100 (90,87%), 40 771 075 (92,11%), 46,4,4 (92,11%), 46,4, 4, 4, 4, 4, 4, 0, 4, 4, 0, 4, 0 2 %), atsauces datubāzei unikāli tika piešķirti attiecīgi 40 213 444 (90,23%), 40 922 895 (92,77%) un 40 971 972 (93,06%) lasījumi.

Atšķirīgi izteikti gēni

Kā norādīts 5.A attēlā, kopumā tika identificēti 198 atšķirīgi ekspresēti gēni, tostarp 47 augšregulēti gēni un 151 pazemināti regulēti gēni. DEG tika sīki aprakstīti papildu materiāla S2 tabulā. 5.B attēlā redzams, ka DEG ir laba apstrādes reproducējamība.

Gēnu ontoloģijas klasifikācijas un Kioto enciklopēdijas gēnu un genomu bagātināšanas analīze

Gēni, kas ir atšķirīgi izteikti gēni, tika klasificēti 3 galvenajās funkcionālajās kategorijās, pamatojoties uz gēnu ontoloģijas (GO) klasifikācijas sistēmu: bioloģiskais process, šūnu komponents un molekulārā funkcija. 10 populārākie GO termini 3 kategorijās ir parādīti 6. attēlā. Pārsvarā bija gēni, kas iesaistīti "reakcijā uz humorālo imūnsistēmu", "ķīmokīna reakcijā", "reakcijā uz pretmikrobu humorālo", "aizsardzības reakcijā pret baktēriju, " "imūnā atbilde pret antimikrobiālo humoru, ko mediē pretmikrobu peptīdi", "aizsardzības reakcija pret gramnegatīvām baktērijām" un "aizsardzības reakcija pret grampozitīvām baktērijām" bioloģisko procesu kategorijā. Turklāt molekulāro funkciju kategorijā ievērojama gēnu attiecība bija saistīta ar "CC motīva ķīmokīna receptoru (CCR) saistīšanos ar ķemokīna receptoriem", "ķīmokīna receptoru saistīšanu" un "lipopolisaharīdu saistīšanos". Turklāt "mitohondriju elpošanas ķēdes komplekss I", "NADH dehidrogenāzes komplekss" un "elpošanas ķēde" bija visvairāk dominējošie bagātinātie termini šūnu komponentu kategorijā. Kioto enciklopēdijas gēnu un genomu ceļu analīze tika veikta arī atšķirīgi ekspresētajiem gēniem. Rezultāti liecināja, ka gēni galvenokārt tika sagrupēti 7 ceļos, tostarp "neiroaktīvo ligandu-receptoru mijiedarbība", "plaisas savienojums", "mitogēna aktivētās proteīnkināzes (MAPK) signalizācijas ceļš", "ABC transporteri", "aminoskābju biosintēze". "Zāļu metabolisms" un "olbaltumvielu eksports".

2. attēls. B-glikāna perorālas ievadīšanas ietekme uz limfocītu stimulēšanas indeksu (SI). (A) perifēro asiņu limfocīti; (B) zarnu limfocīti. Dati ir izteikti kā vidējais § SE.

3. attēls. B-glikāna perorālas ievadīšanas ietekme uz perifēro asiņu CD4+/CD8+ šūnu attiecību. (A) Vārti uz limfocītiem; (B) vārti uz CD3+ T šūnām; (C) CD3+ CD4 + CD8 + T šūnu biežums G70+ vakcīnu grupā; (D) CD3+ CD4 + CD8 + T šūnu biežums vakcīnu grupā; (E) CD3+ CD4 + CD8 + T šūnu biežums sālsūdens grupā; (F) svītru diagramma, kas attēlo CD4+/CD8+ attiecību. Dati ir izteikti kā vidējais § SE.

4. attēls. B-glikāna perorālas ievadīšanas ietekme uz mRNS ekspresiju vistas liesā. Dati ir izteikti kā vidējais § SE.

5. attēls. RNA-Seq datu kopsavilkums. (A) Atšķirīgi izteiktu gēnu saraksts, (B) DEG klasterizācijas karte.

Atšķirīgi izteikto gēnu pārbaude ar RT-qPCR

6 DEG, kas tika regulēti uz augšu vai uz leju, tika apstiprināti ar reāllaika kvantitatīvo PCR. Rezultāts liecināja, ka RT-qPCR dati kopumā atbilda RNS-seq datiem kopumā, norādot uz ticamu sekvencēšanas rezultātu (7. attēls). MAPK ceļu saistīto gēnu mRNS ekspresija Kā parādīts 8. attēlā, tika ievērojami samazināta FAS (P < 0.05) un CACNA2 (P < 0.05) mRNS ekspresija. konstatēts cāļu liesā G70 grupā (G70 + vakcīna), salīdzinot ar vakcīnu grupu. Turklāt G70 grupā (G70 + Vaccine) tika konstatēta skaitliski palielināta DUSP5 un DUSP4 mRNS ekspresija un skaitliski samazināta p38, JNK un ERK mRNS ekspresija, salīdzinot ar vakcīnu grupu (P > 0,05). .

DISKUSIJA

Dzīva ND vakcīna tiek plaši inokulēta vistu fermās, tomēr joprojām pastāv sporādiski Ņūkāslas slimības uzliesmojumi imunizētajos mājputnu saimēs (Zhang et al., 2022). Optimālās vakcīnas ir noteiktas, lai stimulētu šūnu un gļotādu imunitāti, kā arī efektīvu humorālo imunitāti (Shan et al., 2019). Tāpēc arvien lielāka uzmanība tika pievērsta adjuvantiem, kas varētu radīt gļotādas, kā arī šūnu imūnās atbildes (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). Salīdzinot ar injekcijas veidu, perorāla ievadīšana ir vienkāršāka pieeja, kas samazina izmaksas un izraisa mazāku stresu broilercāļiem (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Šī pētījuma rezultāti parādīja, ka diēta, kas papildināta ar b-glikānu, ievērojami paaugstināja NDV specifisko HI titru līmeni cāļu serumā, kas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem (Horst et al., 2019). NDV specifiskās antivielas ir būtiskas humorālās imūnreakcijas attīstībai, lai aizsargātu cāļus no NDV infekcijas (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). B limfocīti ražo antivielas, un T limfocīti paplašinās, reaģējot uz mitogēnu (Bohacova et al., 2021). Šajā pētījumā vistas perifēro asiņu limfocītu stimulācijas indekss uz G70 grupas NDV bija acīmredzami augstāks nekā vakcīnas grupā, norādot, ka tika aktivizēts vairāk T limfocītu. Dominējošās T limfocītu apakšpopulācijas ir CD4 + un CD8 + T šūnas (Cui et al., 2020). CD4 + T šūnas galvenokārt ražo citokīnus un veicina B šūnu nobriešanu, savukārt CD8 + T šūnas ir saistītas ar mērķa šūnu nogalināšanu (Zhang et al., 2021b). Šajā pētījumā G70 grupā konstatēto CD4 +/CD8 + T šūnu attiecība nepārprotami pieauga, kas liecina, ka G70 varētu aktivizēt vairāk CD4 + T šūnu no perifērajām asinīm. Turklāt mēs novērojām ievērojami augstāku zarnu limfocītu stimulācijas indeksu G70 grupā nekā vakcīnas grupā, kas apstiprināja, ka b-glikāns var stimulēt arī zarnu limfocītus. Mūsu iepriekšējie eksperimenti apstiprināja, ka rauga šūnu sienas ekstrakts PW220 ievērojami palielināja zarnu specifiskās sIgA un IgA + šūnas (Bi et al., 2020). Tas nozīmē, ka gan b-glikāns G70, gan PW220 efektīvi veicina zarnu gļotādas imunitāti.

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Iepriekš ziņots par dzīvnieku imunitātes uzlabošanos, ievadot b-glikānu. Guo et al. (2003) apstiprināja, ka b-glikāna ievadīšana uzlaboja bursa un NDV specifisko antivielu indeksu cāļiem. Levine et al. (2018) ierosināja, ka b-glikāna papildināšana var regulēt zarnu MHC Ⅱ un palielināt CD45 + šūnu skaitu, lai mazinātu zarnu bojājumus.

Li et al. (2005) atklāja, ka uztura b-glikāns var paaugstināt IL-8 un TGF-b mRNS ekspresijas līmeni cūku zarnu traktā. B-glikāna imūnmodulējošās iedarbības mehānisms nav skaidrs. Kims u.c. (2010) parādīja, ka b-glikāns veicināja dendritisko šūnu nobriešanu, regulējot CD40, CD80 un CD ekspresiju86. Turklāt Lī un Kims (2014) un Su et al. (2020) ziņoja, ka b-glikāna aktivētie modeļa atpazīšanas receptori, piemēram, dektīna-1 receptori, toll līdzīgi receptori un CR3 (Baert et al., 2015). Liesa ir būtisks orgāns imūnās atbildes ierosināšanai, un tai ir būtiska loma gan iedzimtajā, gan iegūtajā imunitātē (Bronte un Pittet, 2013). Tomēr ir tikai neliels pētījums, kas balstīts uz mRNS ekspresijas RNS-seq analīzi liesā pēc rauga polisaharīdu ievadīšanas. Šajā pētījumā Kioto enciklopēdijas gēnu un genomu ceļu analīze liecina, ka šie gēni galvenokārt tika sagrupēti 2 ceļos, tostarp "neiroaktīvo ligandu-receptoru mijiedarbība" un "MAPK signalizācijas ceļš". Rakstu atpazīšanas receptori, kas vērsti uz b-glikānu, tika bagātināti uz imūno šūnu virsmas (Goodridge et al., 2009). Pēc b-glikāna atpazīšanas šie receptori stimulēja tirozīna kināzi un kodolfaktoru kappaB (NF-kappaB), kā rezultātā tika ierosināta pro-iekaisuma citokīnu sekrēcija un aktivizētas imūnās atbildes (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Xu et al., 2016; Bode et al., 2019). MAPK kā serīna-treonīna proteīnkināžu saimei ir izšķiroša loma cāļu iekaisumos un citokīnu ražošanā. Byun et al. (2016) pierādīja, ka b-glikāns paaugstināja interferona-g un interleikīna-2 veidošanos un izraisīja ievērojami lielāku MAPK p38 fosforilācijas līmeni peritoneālās makrofāgos. Wang et al. (2014) ziņoja, ka b-glikāns mazina iekaisuma reakcijas THP-1 šūnās, inhibējot p38 MAPK aktivāciju. Šajā pētījumā MAPK signalizācijas ceļā tika identificēti 13 DEG, tostarp DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB un EGFR, kas varētu liecināt par to, ka b-glucan. liesa, izmantojot MAPK cāļiem. MAPK ir konservēta Ser/Thr kināžu klase šūnās, kuras galvenokārt ir iesaistītas šūnu reakcijās, piemēram, imūnreakcijā, apoptozē un proliferācijā. MAPK saime ietver vismaz 3 apakšgrupas: c-Jun N-termināla kināze (JNK), p38 MAPK un ārpusšūnu signālu regulētā kināze (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a). DUSP4 un DUSP5 ir divspecifiskas fosfatāzes, kas īpaši inhibē MAPK ģimenes locekļu, piemēram, p38, JNK un ERK, aktivitāti, spēlējot svarīgu regulējošu lomu iekaisuma pārmērīgas reakcijas novēršanā un iekaisuma regresijas veicināšanā organismā (Imasato et al. ., 2002; Talreja et al., 2021). Turklāt ir ziņots, ka neliela nekodējoša RNS ar nosaukumu gga-miR-200a-3p nomāc pro-iekaisuma faktoru ekspresiju un tādējādi regulē saimniekorganisma autoimūno reakciju, negatīvi regulējot MAPK ceļu. un tās pakārtotās signalizācijas molekulas (Pham et al., 2017). Šajā pētījumā RT-qPCR analīze parādīja, ka cāļiem, kas baroti ar b-glikānu (G70), samazinājās P38, JNK un ERK mRNS ekspresija un palielinājās DUSP4 un DUSP5 mRNS ekspresija. Šie rezultāti liecina, ka b-glikāna (G70) imūnsistēmu uzlabojošā iedarbība uz Ņūkāslas slimības vakcīnu var būt saistīta ar MAPK izraisīto pro-iekaisuma faktoru negatīvo atgriezenisko saiti. Turklāt FAS ir būtiska viela, kas mediē apoptozi un ir ļoti svarīga imūnsistēmas homeostāzei (Krueger et al., 2003; Guegan and Legembre, 2018). Tikmēr CACNA2 ir no sprieguma atkarīga kalcija kanāla apakšvienība, kurai ir veicinoša ietekme uz šūnu proliferāciju, migrāciju un invāziju (Sun et al., 2020). Šajā pētījumā FAS un CACNA2 tika ievērojami samazināti cāļiem, kas papildināti ar b-glikānu (G70), norādot, ka b-glikāns (G70) iedarbojas uz imūnsistēmu uzlabojošu iedarbību, galvenokārt inhibējot imūno šūnu apoptozi un līdzsvarojot autoimunitāti. Šie atklājumi sniedz teorētisku atsauci uz b-glikāna (G70) izmantošanu kā imūnsistēmas pastiprinātāju klīniskos apstākļos. Tomēr b-glikāna mehānismam, kas uzlabo imūnreakciju, izmantojot MAPK ceļa negatīvo atgriezenisko saiti, ir vajadzīgi papildu pierādījumi. Interesanti atzīmēt, ka gēni, kas kodē katelicidīnu, kas satur CATH3, CATH1, CATH2, un gēni, kas kodē b-defensīnu, tostarp AvBD6, AvBD7, AvBD1 un AvBD4, tika ievērojami samazināti H salīdzinājumā (G70 + vakcīna). pret kontroli (grupas vakcīna). Saimnieka aizsardzības peptīdi (HDP) ir efektormolekulas, kurām ir izšķiroša nozīme iedzimtajā imūnsistēmā (Cuperus et al., 2013). Šie peptīdi ir atklāti dažādās dzīvnieku sugās no zīdītājiem līdz putniem. Cāļos ir 4 katelicidīni, kas sastāv no CATH1, CATH2, CATH3 un CATHB1, kas efektīvi nogalina dažādas baktērijas (Hamad et al., 2017). Putnu beta-defensīni (AvBD), alternatīvi saukti par gallinacean, ir mazi katjonu peptīdi ar 3 cisteīna disulfīda saitēm starp cisteīna atlikumiem un tiem ir svarīga loma iedzimtajā imūnsistēmā (Yoshimura, 2015). Katelicidīnu un beta-defensīna ekspresijas samazināšanās, iespējams, tika izskaidrota ar atgriezeniskās saites regulēšanu, kur baktēriju un parabaktēriju populācijas samazināja rauga šūnu sienas polisaharīdi (Bi et al., 2020). Līdzīgi rezultāti tika atklāti citos pētījumos. Šao et al. (2016) parādīja, ka rauga b-glikāna papildināšana broileru cāļiem nomāca Salmonella infekciju un samazināja HDP ekspresiju, izmantojot kvantitatīvu reāllaika PCR analīzi. Šajā pētījumā produkts G70, kas galvenokārt sastāvēja no b-glikāna, paaugstināja NDV specifisko antivielu līmeni serumā, palielināja perifēro asiņu limfocītu un zarnu limfocītu NDV stimulācijas indeksu un veicināja perifēro asiņu T limfocītu diferenciāciju par CD{{ 123}} T šūnas. Turklāt RNS-seq analīze parādīja, ka G70 pārregulēja mRNS ekspresijas, kas saistītas ar G-proteīnu saistīto serotonīna receptoru un MHC I klases polipeptīdu, un pazemināja mRNS ekspresijas, kas saistītas ar katelicidīnu un beta-defensīnu. Ņemot vērā G70 pastiprināto ietekmi uz ND vakcīnu cāļiem, var turpināt pētīt G70 ietekmi uz citām mājputnu vakcīnām, piemēram, putnu gripas vakcīnu.

6. attēls. KEGG ceļa analīze.

7. attēls. Atlasīto DEG kandidātu RT-qPCR apstiprinājums. Dati ir izteikti kā vidējais § SE.

8. attēls. Relatīvā mRNS ekspresija liesā. Kopējā RNS tika ekstrahēta no liesas. Vistas b-aktīns tika pasniegts kā iekšējās kontroles gēns. Dati ir izteikti kā vidējais § SE.

ATSAUCES

Baert, K., E. Sonck, BM Goddeeris, B. Devriendt un E. Cox. 2015. Šūnu tipam raksturīgās atšķirības b-glikāna atpazīšanā un signalizācijā cūku iedzimtajās imūnās šūnās. Izstrādātājs Comp. Immunol. 48:192–203.

Bols, C., A. Forresters, A. Hermans, S. Lemjē un K. Ganapatija. 2019. gads. Salīdzinošā aizsargājošā imunitāte, ko nodrošina dzīvas Ņūkāslas slimības vīrusa vai putnu metapneumovīrusa vakcīnas, vienlaikus lietojot kopā ar klasiskajiem un infekciozā bronhīta vīrusa variantiem diennakti veciem broileru cāļiem. Vakcīna. 37:7566–7575.

Bi, S., J. Džans, Y. Qu, B. Zhou, X. He un J. Ni. 2020. gads. Rauga šūnu sienas produkts pastiprināja zarnu IgA reakciju un mainīja aklās zarnas mikrofloras sugas pēc perorālās vakcinācijas cāļiem. Poults. Sci. 99:6576–6585.

Bi, S., J. Džans, L. Džans, K. Huangs, J. Li un L. Cao. 2022. gads. Rauga šūnu sienas pārregulētas šūnu mediētas imūnās atbildes pret Ņūkāslas slimības vīrusa vakcīnu. Poults. Sci. 101:101712–101721.

Bode, K., F. Bujupi, C. Link, T. Hein, S. Cimmermann, D. Peiris, V. Jaquet, B. Lepenies, H. Weyd un PH Krammer. 2019. Dektīna-1 saistīšanās ar aneksīniem uz apoptotiskām šūnām izraisa perifēro imūno toleranci, izmantojot NADPH oksidāzi-2. Šūna. Rep. 29:4435–4446.

Bohacova, P., J. Kossl, M. Hajkova, B. Hermankova, V. Holan un E. Javorkova. 2021. Atšķirība starp mitogēnu stimulētām B un T šūnām R-fikoeritrīna konjugēto antivielu nespecifiskajā saistīšanā. J. Immunol. Metodes. 493:113013–113023.

Bojaka, PN, A. Tafaro, R. Fišers, K. Fudžihaši, E. Jirillo un Dž. R. Makgī. 2003. Imūnsistēmas terapeitiskās manipulācijas: iedzimtas un adaptīvās gļotādas imunitātes uzlabošana. Curr. Pharm. Dizains. 9:1965–1972.

Bronte, V. un MJ Pitets. 2013. Liesa vietējā un sistēmiskā imunitātes regulēšanā. Imunitāte. 39:806–818.

Byun, E., S. Park, B. Jang, N. Sung un E. Byun. 2016. Gamma apstarots b-glikāns inducē imūnmodulāciju un pretvēža aktivitāti, izmantojot MAPK un NF-kB ceļus. J. Sci. Ēdiens. Agr. 96:695–702.

Čens, X., Ks. Čens, S. Cju, J. Hu, K. Dzjans, D. Vans, K. Fans, K. Džans, J. Huans, J. Ju, H. Jaņs, K. Liu, Z. Gao, R. Hou un X. Li. 2014. Epimedija polisaharīda-propolisa flavona perorālā šķidruma ietekme uz gļotādas imunitāti cāļiem. Int. J. Biol. Macromol. 64:6–10.

Cui, X., Y. Wang, R. Guan, M. Lu, L. Yuan, W. Xu un S. Hu. 2020. gads. Uzlabotas imūnās atbildes ar hu aitu seruma proteomisko analīzi pret mutes un nagu sērgas vakcīnu, kas emulģēta augu eļļas adjuvantā. Vakcīnas. 8:180–197

Cuperus, T., M. Coorens, A. van Dijk un HP Haagsman. 2013. Putnu saimnieka aizsardzības peptīdi. Izstrādātājs Comp. Immunol. 41:352–369.

Goodridge, HS, AJ Wolf un DM Underhill. 2009. Beta-glikāna atpazīšana no iedzimtas imūnsistēmas. Immunol. Atkl.230:38–50.

Guegan, J. un P. Legembre. 2018. Fas/CD95 neapoptotiskās funkcijas imūnreakcijā. FEBS J 285:809–827.

Guo, Y., RA Ali un MA Qureshi. 2003. Beta-glikāna ietekme uz imūnreakcijām broileru cāļiem. Immunopharm. Immunol. 25:461–472.

Hamad, SK, S. Kim, SW El-Kadi, EA Wong un RA Dalloul. 2017. Saimnieka aizsardzības peptīdu salīdzinošā izpausme tītaru mājputniem. Poults. Sci. 96:2083–2090.

Hasted, T., S. Sharif, P. Boerlin un MS Diarra. 2021. Augļu un to ekstraktu imūnstimulējošais potenciāls mājputnu gaļā. Priekšpuse. Immunol. 12:641696.

Hong, Y., J. Lee, TH Vu, S. Lee, HS Lillehoj un YH Hong. 2020. gads. Vistas putnu b-defensīns 8 modulē imūnreakciju, izmantojot mitogēnu aktivētu proteīnkināzes signalizācijas ceļus vistas makrofāgu šūnu līnijā. Poults. Sci. 99:4174–4182.

Horst, G., R. Levine, R. Chick un C. Hofacre. 2019. gads. Beta- 1,3-glikāna (AletaTM) ietekme uz broilercāļu vakcinācijas reakciju. Poults. Sci. 98:1643–1647.

Imasato, A., C. Desbois-Mouthon, J. Han, H. Kai, ACB Cato, S. Akira un J. Li. 2002. P38 MAPK inhibēšana ar glikokortikoīdiem, indukējot MAPK fosfatāzi-1, uzlabo netipizējamu Haemophilus ietekmes izraisītu nodevu līdzīgu receptoru ekspresiju 2. J. Biol. Chem. 277:47444–47450.

Kankkunens, P., L. Teirila, J. Rintahaka, H. Aleniuss, H. Volfs un S. Matikainens. 2010. (1,3)-beta-glikāni cilvēka makrofāgos aktivizē gan dektīnu-1, gan NLRP3 iekaisumu. J. Immunol. 184:6335–6342.

Kima, HS, Dž. Kima, HK Lī, MS Kima, SR Lī, J. S. Kanga, HM Kima, K. Lī, Dž. T. Honna, J. Kima un S. Han. 2010. Dendritisko šūnu aktivācija ar glikānu, kas izolēts no umbilicaria esculenta. Imūns. Tīkls 10:188–197.

Krueger, A., SC Fas, S. Baumann un PH Krammer. 2003. CD95 loma perifēro T-šūnu apoptozes regulēšanā. Immunol. Atkl. 193:58–69.