Beta Vulgaris Rubra L. (biešu) mizas metanola ekstrakts samazina oksidatīvo stresu un stimulē šūnu proliferāciju, palielinot VEGF ekspresiju H2O2 izraisītās oksidatīvā stresa izraisītās cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnās

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai uzzinātu vairāk

Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subaš-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 un Amna Abdullah Alotiby 2

Abstract:Polifenolu antioksidanta spēja unflavonoīdiTas, kas atrodas uztura līdzekļos, palīdz apturēt reaktīvo skābekļa sugu (ROS) attīstību un aizsargāt endotēlija gludās muskulatūras šūnas no oksidatīvā stresa / izraisītas nekrozes. Bietes (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) ir bieži patērēts dārzenis, kas ir bagātīgsantioksidanti. Biešu mizas bioaktīvie savienojumi un to loma cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnās (HUVEC) joprojām ir nepietiekami izpētīti. Šajā pētījumā tika sagatavots biešu mizas metanola ekstrakts (BPME) un tā ietekme uz bioefektivitāti, kodola integritāti, mitohondriju membrānas potenciālu, asinsvadu šūnu augšanu un ar imūnregulāciju saistīto gēnu ekspresijas līmeni HUVEC ar inducētu.oksidatīvstika analizēts stress. Gāzu hromatogrāfijas-masu spektroskopijas (GC-MS) rezultāti apstiprināja, ka BPME satur 5-hidroksimetilfurfurolu (32,6 procenti), metilpiruvātu (15,13 procenti), furfurolu (9,98 procenti) un 2,3-dihidro{{11}. },5-dihidroksi-6-metil-4H-pirān-4-ons (12,4 procenti). BPM ekstrakts efektīvi uzlaboja šūnu proliferāciju un tika apstiprināts ar MTT testu; kodola integritāte tika apstiprināta ar propīdija jodīda (PI) krāsošanas testu; mitohondriju membrānas potenciāls (∆ψm) tika apstiprināts ar JC-1krāsošanas testu. Aneksīna V tests apstiprināja, ka ar BPME apstrādātajiem HUVEC tika uzrādīti 99 procenti dzīvotspējīgu šūnu, bet tikai 39,8 procenti dzīvotspēja tika parādīta HUVEC, kas tika apstrādāti tikai ar H2O2. Turklāt HUVEC apstrāde ar BPME 48 stundas samazināja lipīdu peroksīda (LPO) mRNS ekspresiju un palielināja NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotēlija slāpekļa oksīda sintāzi (eNOS). ) un asinsvadu šūnu augšanas faktora (VEGF) mRNS ekspresijas līmeni. Mēs noskaidrojām, ka BPME terapija samazināja proinflammatoriskus procesus (kodolfaktors-κ (F-κ), audu nekrozes faktors (TNF-), nodevām līdzīgs receptors-4 (TLR-4), interleikīns{{37}. } (IL-1 )) un asinsvaduiekaisums(intracelulārās adhēzijas molekulas (ICAM), asinsvadu šūnu adhēzijas molekulas (VCAM), EDN1, IL-1 ) saistītas mRNS ekspresijas. Noslēgumā jāsaka, ka biešu mizas apstrāde efektīvi palielināja asinsvadu gludo šūnu augšanas faktorus un mikrotubulu attīstību, bet samazināja asinsvadu iekaisuma regulatorus. BPM var būt labvēlīgs asinsvadu gludo šūnu reģenerācijai, audu atjaunošanai un pretnovecošanās potenciālam.

Atslēgvārdi:bietes; oksidatīvais stress; mitohondriji; angioģenēze; iekaisums

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

1. Ievads

Angioģenēze ir fizioloģisks vaskuloģenēzes process no organisma esošās asinsvadu sistēmas [1]. Tas ir būtiski ne tikai embriju attīstībai un reprodukcijai, bet arī šūnu ciklam un audu atjaunošanai [2,3]. Tomēr tas ir saistīts ar dažādu slimību patoģenēzi, piemēram, audzēju augšanu, reimatoīdo artrītu un dažādām išēmiskām un iekaisuma slimībām [3–5]. Asinsvadu endotēlijam ir svarīga loma asinsvadu hemostāzes uzturēšanā, regulējot asinsvadu tonusu un imūnās un iekaisuma reakcijas [6,7]. Endotēlija šūnas (EC) ir plāni vienšūnu slāņi, kas izklāj visas asinsvadu iekšējās virsmas un ražo dažādas molekulas, kas darbojas lokāli vai attālās vietās [7]. Endotēlijs ir būtisks ķermeņa homeostāzei, un jebkuras izmaiņas endotēlija šūnu reakcijā izraisa primāros iekaisuma un asinsvadu slimību procesus, piemēram, aterosklerozi un hipertensiju [6, 8, 9]. Šīs slimības izraisa oksidatīvo stresu, kas maina EK struktūru un funkciju integritāti un izraisa endotēlija disfunkciju [9]. Cilvēka nabas vēnu EC (HUVEC) ir plaši izmantoti kā paraugs ar cilvēka asinsvadu endotēliju saistītiem pētījumiem. Turklāt tie ir noderīgs modelis galveno endotēlija funkcijā iesaistīto bioloģisko ceļu izpētei [10]. Bioaktīvie savienojumi un fitoķīmiskās vielas ir bagātīgi atrodamas augļos, dārzeņos, zaļajos augos un daudzos augos, kam piemīt daudzas veselības priekšrocības, piemēram, pretiekaisuma, antioksidanta, pretkancerogēna un angiogēnas īpašības [11–13]. Šajā sakarā sarkanā biete (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) pieder pie Amaranthaceae dzimtas un tiek klasificēta kā viens no labākajiem augsta līmeņa antioksidantu avotiem [14,15]. Konkrēti, tas satur vairākas fitoķīmiskas vielas, kas ir bioloģiski aktīvas, tostarpbetalains, flavonoīdi,polifenoli, terapeitiskie fermenti, askorbīnskābe, dehidroaskorbīnskābe (DHAA) un neorganiskais nitrāts (NO3) [16–18]. Turklāt tas nodrošina vērtīgas būtiskas uzturvielas, piemēram, kāliju, kalciju, magniju, nātriju, dzelzi, cinku, fosforu, varu un mangānu [19]. Vairākos pētījumos ir ziņots, ka sarkano biešu ekstraktam (saknei) ir daudz labvēlīgu efektu, jo tam piemīt hipoglikemizējošas, lipīdu līmeni pazeminošas, pretiekaisuma, antihipertensīvas un antiproliferatīvas īpašības [20–22]. Visas šīs labvēlīgās īpašības var būt saistītas ar bioaktīvo savienojumu brīvo radikāļu attīrīšanas spējām. Tādējādi sarkano biešu patēriņš ir saistīts ar daudziem uztura un veselības ieguvumiem. Tā uzturvērtības dēļ to var izmantot kā funkcionālu pārtikas avotu pret oksidatīvo stresu, kas izraisa hroniskas vielmaiņas slimības, piemēram, 2. tipa diabētu un sirds un asinsvadu slimības [23]. Pamatojoties uz literatūras apskatu, Beta vulgaris piemīt spēcīgas antioksidanta, imūnregulējošas un angiogēnas īpašības. Apigenīns ir atrasts biešu lapās; tam ir antiproliferatīva iedarbība aknu un zarnu šūnās, un tas var uzlabot augsta tauku satura diētas izraisītu aptaukošanos, izmantojot AMPK aktivāciju [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] atklāja, ka Beta vulgaris aizsargā asinsvadu EC no ārēji izraisīta oksidatīvā stresa, kas var būt saistīts ar vairāku šajā augā esošo bioaktīvo savienojumu kopējo iedarbību. Līdz šim Beta vulgaris sakņu mizas mehāniskā darbība EK proliferācijas un angiogēzes iedarbībai ir bijusi nepietiekami izpētīta. Līdz ar to mūsu mērķis bija veikt šo pētījumu, lai pārbaudītu asinsvadu šūnu proliferāciju, mikrotubulu attīstību, oksidatīvo stresu un angiogēzes spēju saistībā ar Beta vulgaris sakņu mizu, izmantojot šūnu morfoloģiju un gēnu ekspresijas analīzi HUVEC. Tiek pētīta sarkano biešu mizas metanola ekstrakta angiogēnā iedarbība, kas saistīta ar kodola integritāti, mikrotubulu attīstību, mitohondriju efektivitāti un šūnu cikla stimulāciju cilvēka asinsvadu EC.

2. Materiāli un metodes

2.1. Biešu sagatavošana(Beta vulgaris rubra L.) Metanola ekstrakts Svaigu biešu (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) paraugi sākotnēji tika iegūti dārzeņu veikalos Rijādā, Saūda Arābijas Karalistē (KSA). Svaigas bietes tika mazgātas ar destilētu ūdeni, lai noņemtu stublājus un piesārņotājus. Ārējo ādu nomizo, lai to noņemtu un sagrieztu mazos gabaliņos. Paraugi tika žāvēti karstā gaisa krāsnī 40 ◦ un pēc tam sasmalcināti pulverī, izmantojot elektronisko blenderi. Pēc tam 5{{10}}0 g pulvera tika ekstrahēti sterilā pudelē, kurā bija 1 l metanola (Sigma, Sentluisa, MO, ASV) 24 stundas istabas temperatūrā. kratītājā un atkārto trīs reizes. Pēc tam ekstrakta filtrēšanai tika izmantots Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, ASV). Visbeidzot, samazinot spiedienu, šķīdinātājs tika atdalīts no ekstrakta, un pēc metanola iztvaicēšanas ekstrakts tika savākts kā cieta sausa viela. Ekstrahēto paraugu līdz turpmākai lietošanai uzglabāja ledusskapī 4 ◦C temperatūrā. 2.2. Gāzu hromatogrāfijas un masas spektroskopijas analīze Biešu mizas metanola ekstrakts (BPME) tika ievadīts silīcija dioksīda kapilārā kolonnā (30 m × {{60}},25 mm ID × 0). 0,25 µm plēves biezums) ar GC-MS instrumentu (Agilent 6890N/5973I, Kalifornija, CA, ASV) ar masas selektīvo detektoru ķīmisko sastāvu noteikšanai. Instrumenta temperatūra tika iestatīta kā sākotnējā 7{{90}} ◦C, turot 2 minūtes, līdz 305 ◦C pie 20 ◦C/min, kam sekoja turēšana 1 minūti. Kopējais GC darbības laiks tika iestatīts uz 45 minūtēm ar hēlija gāzi (99,999 procenti) kā nesējgāzi (konstants līdzsvara ātrums 1,2 ml/min), 250 ◦C kā inžektora temperatūru un 230 ◦C kā jonu avotu. temperatūra. Pamatojoties uz GC-MS spektru, tika aprēķināta atbilstošā komponenta relatīvā procentuālā daļa un nezināmā komponenta masas spektri tika identificēti, salīdzinot ar zināmajiem 62,000 modeļiem, kas pieejami Nacionālajā standartu un tehnoloģiju institūtā. datoru bibliotēka (NIST08). 2.3. Šūnu kultūras materiāli un ķīmiskās vielas HUVEC tika iegādāti no Amerikas tipa kultūras kolekcijas (ATCC, Manassas, VA, ASV). Šūnu kultūras materiāli, piemēram, Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, tripsīns un citi, tika iegūti no Gibco (Paislija, Apvienotā Karaliste). Penicilīna-streptomicīns (PS) un liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāti no Hyclone Laboratories, ASV. Molekulārās bioloģijas eksperimentā izmantotās ķīmiskās vielas tika iegūtas no Sigma-Aldrich, īpaši MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolija bromīds], PI un JC-1 traipu. SYBR Green PCR Master Mix un cDNS sintēzes komplekts tika iegūti no Qiagen (Hilden, Vācija). 2.4. HUVECs HUVEC tika kultivēti DMEM un papildināti ar 1% PS un 10% FBS kompleksu. Šūnas inkubēja mitrinātā atmosfērā 37 ◦C, 5% CO2, un subkultivēja aptuveni ik pēc 3 dienām. 2.5. Šūnu dzīvotspēja un šūnu proliferācija ar MTT testu HUVEC (1 × 104 šūnas/iedobē) tika kultivētas ar uzturošo barotni un ļāva tām pieķerties nakti 96-iedobes kultūras plāksnē. Pēc tam barotne tika aizstāta ar jaunu barotni, kas satur pieaugošas BPME koncentrācijas (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 un 3,2 µg/ml), kā norādīts MTT testa plates kartē, un inkubēja 24 un 48 h; neapstrādātas šūnas tika izmantotas kā kontroles. Pēc inkubācijas perioda eksperimentālās šūnas tika apstrādātas ar 20 µL/iedobē 5 mg/ml MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2, 5-difeniltetrazolija bromīds, kas tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO)) un papildus inkubēts 4 stundas 37 ◦C temperatūrā. Pēc tam barotne tika izmesta, un iegūtais purpursarkanais formazāns tika izšķīdināts 100 µl 100 procentu DMSO. Šķīduma absorbcija tika mērīta, izmantojot mikroplašu lasītāju (Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV) pie viļņa garuma 570 nm. Šūnu proliferācijas procentuālā daļa (procenti) tika aprēķināta, izmantojot šādu vienādojumu: (parauga absorbcija/kontroles vidējā absorbcija) × 100. 2.6. Eksperimentālais plāns Saskaņā ar pašreizējo šūnu proliferācijas testu, pārbaudītā zemākā BPME koncentrācija (0,1 un 0,2 µg/ml) uzrādīja proliferējošu HUVEC un mikrotubulu morfoloģiju bez toksicitātes. Tika atlasīti 0,1 un 0,2 µg/ml BPME devas tilpumi un apstrādāti ar normāliem HUVEC un 10 mM H2O2-inducētiem oksidatīvā stresa izraisītiem HUVEC 48 stundas, lai noteiktu šūnu proliferācijas, pretiekaisuma, angiogēno un apoptotisko potenciālu. (1. attēls). Transportlīdzekļa kontrole arī tika saglabāta 48 stundas abās grupās. Kvercetīns (10 µM) tika izmantots kā atsauces kontrole abās eksperimentālajās grupās. Pēc inkubācijas neapstrādātās un eksperimentālās šūnas tika analizētas, lai noteiktu šūnu un kodola morfoloģiju un mitohondriju membrānas potenciālu, izmantojot BDTM MitoScreen (JC{105}}) komplektu; apoptoze tika noteikta ar aneksīna V / apoptozes bāzes šūnu šķirošanas metodi kolēģu citometrijā. Tika pētīti oksidatīvā stresa, proinflammatoriskie un ar angiogēzi saistītie gēnu ekspresijas līmeņi.

2.7. Propīdija jodīda krāsošanas tests kodolbojājumu noteikšanai Šūnu morfoloģijas attiecībā uz raksturīgiem kodola bojājumiem, piknozi vai apoptotiskām morfoloģiskām izmaiņām pēc apstrādes ar 0,1 un 0,2 µg/mL BPME (ar vai bez H2O2) HUVEC. tika noteikts, izmantojot PI krāsošanas analīzi apgrieztās fluorescences mikroskopijā, kā aprakstījis Leite et al. [27].

2.8. Mitohondriju membrānas potenciāla (∆ψm) pārbaude ar JC-1 krāsvielu krāsošanu Mitohondriju membrānas potenciāls (∆ψm) tika noteikts ar JC-1 testu, lai novērtētu mitohondriju efektivitāti transportlīdzekļa kontrolē un {{4} },1 un 0,2 µg/mL ar BPME apstrādātu HUVEC (ar un bez H2O2). Īsumā, JC-1 krāsošanas šķīdums tika sajaukts ar līdzīgu tilpumu barotnes un pēc tam pievienots eksperimentālajiem HUVEC un inkubēts tumsā 20 minūtes 37 ◦C temperatūrā. Pēc tam nesaistītā JC-1 krāsviela tika maigi mazgāta divas reizes, izmantojot 200 µL JC-1 krāsošanas mazgāšanas buferšķīduma 4 ◦C temperatūrā. Pēc tam fluorescences mikroskopijā, izmantojot fluorescences mikroskopu, tika novērota j-agregāta uzkrāšanās pret JC-1 krāsošanu, un tika uzņemti attēli. Turklāt mitohondriju membrānas potenciāls tika mērīts plūsmas citometrijā, izmantojot BDTM MitoScreen (JC-1) komplektu.

2.9. Aneksīna V/apoptozes analīze, izmantojot plūsmas citometriju. Lai kvantitatīvi noteiktu dzīvotspējīgas, proapoptotiskas, agrīnas apoptotiskas un nekrotiskas šūnas, tika izmantota cita uz citometriju balstīta aneksīna V/PI noteikšanas komplekta metode (Sigma Chemicals, ASV). Oksidatīvā stresa izraisīti HUVEC (1 × 105/iedobē) tika ievietoti 24-iedobju plāksnēs un inkubēti ar BPME (0.1 un 0,2 µg/mL) vai nesēja kontroli, lai. 48 h. Pēc inkubācijas šūnas tika inkubētas 400 µl 5 µL aneksīna V-fluoresceīna izotiocianāta (FITC) un 5 µl PI, kas satur saistīšanas buferšķīdumu; pēc tam šūnas tika turētas 15 minūtes istabas temperatūrā (RT) tumsā. Šūnas tika analizētas ar citu citometriju (BD Biosciences, Sanhosē, Kalifornija, ASV), lai identificētu apoptotiskās (PI negatīvās un aneksīna V pozitīvas) un vēlīnās apoptotiskās (PI pozitīvas un aneksīna V pozitīvas) šūnas [28].

2.10. Kvantitatīvā reāllaika PCR analīze Fastlane® Cell to cDNS komplekts (Qiagen, Hilden, Vācija) tika izmantots, lai ekstrahētu kopējo RNS un sintēzes cDNS no transportlīdzekļa kontroles, ar BPME apstrādātiem HUVEC (ar un bez H2O2), izmantojot daļēji automatizētu kvantitatīvu PCR (qPCR). instruments (Applied Biosystems, Foster City, CA, ASV). Oksidatīvā stresa izpausmes līmeņi, tostarp (lipīdu peroksīds, NOS-3), antioksidants (Nrf-2, GSK-3 un GPx), proinflammatīvs (kodolfaktors-κ (NF-κ), audzēja nekrozes faktors (TNF-), interleikīns-1 (IL-1), asinsvadu šūnu augšanas faktors (VEGF), nodevām līdzīgs receptors-4 (TLR-4)) , un asinsvadu iekaisums (intracelulārā adhēzijas molekula (ICAM), asinsvadu šūnu adhēzijas molekula (VCAM), EDN1 un endotēlija slāpekļa oksīda sintāzes (eNOS)) saistīti gēni un atsauces gēns -aktīns tika analizēti HUVEC un kvantitatīvi noteikti ar metodi. Yuan et al. [29]. Pastiprinājuma vērtības (∆Ct) tika aprēķinātas pēc starpības starp Ct (apstrādātais) un Ct (kontrole). Gēnu ekspresija tika attēlota, izmantojot 2−∆∆Ct vērtības izteiksmi.

2.11. Statistiskā analīze Visi eksperimenti tika veikti trīs reizes, un iegūtie dati tika izteikti kā vidējās vērtības ± standartnovirze (SD). Atšķirību statistiskā analīze starp grupām tika veikta ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot SPSS programmatūru (versija 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, ASV). Pēc tam, ja tika konstatētas būtiskas atšķirības, tika veikts Tukey vairāku salīdzināšanas tests. Visi rezultāti tika parādīti kā vidējais ± SD sešām replikācijām katrā grupā. Tika uzskatīts, ka p-vērtība < 0,05="" apzīmē="">

Cistanche imunitātes uzlabošanai

3. Rezultāti

3.1. Bioaktīvās molekulas BPME BPME ķīmiskās sastāvdaļas tika apstiprinātas, izmantojot GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Biešu mizas ekstrakta ķīmiskais sastāvs tika noteikts, salīdzinot pieejamos masas spektrus ar Nacionālā standartu un tehnoloģiju institūta (NIST) spektrālo datu bāzi. GC-MS rezultāti apstiprināja, ka BPME satur hidroksiacetonu (8,18 procenti), 5-hidroksimetilfurfurolu (32,6 procenti), metilpiruvātu (15,13 procenti), beta-d-alopiranozi (1,48 procenti), furfurolu (9,98 procenti), 2-hidroksi-gamma-butirolaktons (1,32 procenti) un 2,3-dihidro-3,5-dihidroksi- 6-metil-4H-pirāns -4-viens (12,4 procenti; 2.a attēls, 1. tabula). 3.2. Šūnu proliferācija BPME in vitro šūnu proliferācijas potenciāls pret HUVEC ir parādīts 2.b attēlā. Salīdzinot ar nesēja kontroli, eksperimentālajās grupās netika novērota nozīmīga šūnu augšanas inhibīcija. Šis pētījums apstiprināja, ka ar HUVEC ārstētā BPME koncentrācijas palielināšana izraisīja palielinātu šūnu proliferāciju un dzīvotspēju pēc 48 stundām (112 procenti), salīdzinot ar 24 stundām (103 procenti) pēc ārstēšanas. Turklāt ar BPME apstrādāto HUVEC gaismas mikroskopiskie attēli pēc 48 stundām apstiprināja normālas šūnas ar vienādu pielipušo šūnu morfoloģijas formu, bija redzams palielināts proliferējošo (replikācijas) šūnu skaits bez bojājumiem (2.c attēls). 3.3. Šūnu un kodola morfoloģijas, mikrotubulu veidošanās un JC-1 iekrāsošanās analīze HUVEC 3. attēlā parādīta mikrotubulu attīstības morfoloģija FL fluorescences mikroskopiskajos attēlos. H2O2-inducētie oksidatīvā stresa izraisītie HUVEC uzrādīja vāju pielipušo šūnu proliferāciju un neregulāru morfoloģiju, salīdzinot ar kontroles HUVEC. Parastajiem HUVEC, kas apstrādāti ar 0,2 µg/mL BPME, tika novērotas šūnu proliferācijas, izmantojot replikāciju vai neoģenēzi ar mikrotubulu morfoloģiju. Tikmēr 0,1 µg/mL BPME apstrādāto šūnu deva uzrādīja 100 procentus pielipušo šūnu ar agrīnām mikrotubulu stadijām. Oksidatīvā stresa pakļautie HUVEC, kas apstrādāti ar 0, 2 µg / ml BPME, identificēja jaunas šūnas ar mikrotubulu morfoloģiju un samazinātu oksidatīvo šūnu bojājumu. Turklāt 0, 1 µg / ml BPME arī palielināja normālu asinsvadu šūnu morfoloģiju ar proliferējošām šūnām.

4.a attēlā parādīta kodola struktūras normālā morfoloģija ar sfērisku formu kontroles un BPME (0,1 vai 0,2 µg/mL) apstrādātajos HUVEC. 4.b attēlā parādīti attēli PI krāsošanai normāliem un HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisa H2O2. Ar H2O{{10}}apstrādātajiem HUVEC ir neregulāras formas kodoli, pēc 30 min kondensācija un piknoze. Tomēr 0,2 µg/mL BPME apstrādes HUVEC oksidatīvā stresa apstākļos parādīja apļveida kodolus ar normālu morfoloģiju. Salīdzinot ar 0,2 µg/mL BPME ekstrakta, 0,1 µg/mL BPME bija mazāka aizsargājoša iedarbība pret H2O2- izraisītu oksidatīvo stresu HUVEC.

2. attēls. Biešu mizas metanola ekstrakta (a) GC-MS hromatogrammas, šūnu proliferācijas (b) un gaismas mikroskopijas attēlu šūnu morfoloģijas (c) rezultāti HUVEC, kas apstrādāti ar pieaugošu biešu mizas metanola ekstrakta (BPME) koncentrāciju. ) (viendabīga pielipušo un proliferējošo šūnu forma, kas minēta ar sarkano bultiņas galvu). Visas vērtības ir vidēji ± SD (n=6). * p Mazāks vai vienāds ar 0,05, salīdzinot ar transportlīdzekļa kontroli.

3. attēls. Mikrocaurules veidošanās analīze, pamatojoties uz fluorescences mikroskopisko transportlīdzekļa kontroli, 0,1 un 0,2 µg/mL devu biešu mizas metanola ekstrakta (BPME) apstrādāta normāla un H2O{{6} }izraisīti oksidatīvā stresa izraisīti HUVEC pēc 48 h. Pēc 48 stundām H2O2-inducētie oksidatīvā stresa izraisītie HUVEC uzrādīja mainītu morfoloģiju, salīdzinot ar nesēja kontroli. Ar biešu mizas metanola ekstraktu (BPME) apstrādātu HUVEC tilpumiem 0.1 un 0.2 µg/ml bija normāla morfoloģija ar asinsvadu mikrotubulām ar proliferējošām šūnām, kas atgādina gludo muskuļu šūnu uzvedības parasto morfoloģiju.

4. attēls. Propīdija jodīda (PI) krāsošanas analīze kodola morfoloģijai transportlīdzekļa kontrolē, 0,1 un 0,2 µg/mL biešu mizas metanola ekstrakta (BPME) apstrādāta normāla (3a) un H2O2-inducēti oksidatīvā stresa izraisīti (3b) HUVEC pēc 48 h. PI krāsošanā transportlīdzekļa kontrole parādīja, ka kodols ir normāls, bez saraušanās, piknozes vai apoptotiskā kodola pazīmēm. Tikai H2O2 apstrādātajās šūnās pēc 48 stundām bija polarizēta kodola membrāna. Ārstēšana ar 0,2 µg/mL BPME normalizēja H2O2- izraisīto kodola membrānas polarizāciju, salīdzinot ar 0,1 µg/mL BPME vai kvercetīnu 10 µM.

5.a attēlā parādīti JC-1 krāsošanas rezultāti HUVEC, ieskaitot kontroles un BPME apstrādātās šūnas; attēlā parādītas veselas šūnas ar aktīviem mitohondrijiem, ko apstiprina negatīvi lādētā mitohondriju uzņemšana ekstramitohondriju lipofīlā katjona JC-1 (zaļā krāsā) un J-agregātos, kas pārveidoti ar sarkanu krāsu intramitohondiski. 5.b attēlā parādīti JC-1 krāsošanas rezultāti 0,2 µg/mL BPME, kas ievadīts HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisa H2O2; rezultāti apstiprināja, ka gandrīz 94 procenti negatīvi lādētu mitohondriju pārveidoja lipofīlo katjonu JC-1 (zaļā krāsa) sarkanās krāsas J-agregātos, salīdzinot ar 0.1 µg/mL BPME (61,4 procenti) ārstēšanu. vai H2O{{20}}izraisīts oksidatīvais stress HUVEC (2 procenti). Tika novērots, ka mitohondriju membrānas potenciāls (MMP) ir augstāks ar BPME apstrādātajām šūnām, salīdzinot ar atsauces zāļu kvercetīnu. 3.4. FACS atbalstītā mitohondriju membrānas potenciāla (∆ψm; BD MitoScan) un aneksīna V/apoptozes analīze HUVEC 6. attēlā parādīta mitohondriju membrānas potenciāla kapacitāte BD MitoScan analīzē pēc 0,2 µg/mL BPME apstrādes normāliem HUVEC. un HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisa H2O2. Mēs atklājām, ka 0,2 µg/ml BPME apstrādes palielināja MMP (∆ψm) līdz 92,7 procentiem ± 3,7 procentiem, salīdzinot ar HUVEC, kas tika ārstēti tikai ar H2O2 (27,9 procenti ± 7,2 procenti). Turpretim ar kvercetīnu apstrādātās šūnas uzrādīja palielinātu MMP (∆ψm) procentuālo daudzumu par 41,4 procentiem ± 1,6 procentiem, salīdzinot ar HUVEC, kas apstrādātas tikai ar BPME un H2O2 vai H2O2.

5. attēls. Mitohondriju membrānas potenciāla analīze, izmantojot JC-1 krāsošanu nesēja kontrolei, 0,1 un 0,2 µg/mL biešu mizas metanola ekstrakta (BPME) apstrādāta normāla (a) ) un H2O2-inducēta oksidatīvā stresa izraisīta (b) HUVEC pēc 48 stundām. JC{{10}}fluorescences attēli, kuros redzami krāsvielas sarkano un zaļo signālu sapludināti attēli, kas atbilst JC-1 J-agregātos pret monomēru. Mēs atradām mazāk J-agregātu ar H2O2 atsevišķi apstrādātu HUVEC. 0.2 µg/mL ar BPME apstrādātiem HUVEC, kas uzrāda augstus j-agregātus, kas tieši atspoguļo (augsts MMP, ∆ψm) augstu mitohondriju membrānas potenciālu, salīdzinot ar 0,1 µg/mL BPME vai 10 µM kvercetīna.

4. Diskusija

Ekstracelulārā vai intracelulārā stresa gadījumā reaktīvo skābekļa sugu (ROS) biopieejamība pārspēj antioksidantu aizsardzību, un oksidatīvais stress izjauc redokssignalizāciju un kontroli [31]. Oksidatīvā stresa attīstība ir saistīta ar hronisku traucējumu patoģenēzēm, piemēram, neirodeģeneratīvām slimībām, diabētu un aterosklerozi. Piemēram, oksidatīvais stress izraisa endotēlija disfunkciju un veicina sistēmisku iekaisumu un makrofāgu piesaisti [32]. Aktivētās imūnās šūnas migrē uz asinsvadu sistēmu un atbrīvo citokīnus un ķemokīnus, kas saistīti ar vazokonstrikciju un gludo muskuļu šūnu asinsvadu remodelāciju un iekaisumu, kas ietekmē asinsvadu gludās muskulatūras šūnas un asinsvadu sieniņu [33]. Paaugstināts asinsvadu oksidatīvais stress beidzas ar asinsvadu bojājumiem, gludo muskuļu šūnu stīvumu un strukturālām elastīna anomālijām. Turklāt asinsvadu oksidatīvais stress ir stimulēts citos patoloģiskos apstākļos, piemēram, viscerālā aptaukošanās vai aterosklerozes gadījumā, jo palielinās NADPH oksidāzes (NOX-2) aktivitāte perivaskulārajos taukaudos [34]. Asinsvadu oksidatīvais stress izraisa galvenās epiģenētiskās izmaiņas, kas notiek novecošanas laikā, un tas beidzas ar agrīnu novecošanas procesu [35]. ROS veidošanās un oksidatīvā stresa attīstība bioloģiskajā sistēmā lielā mērā ir atkarīga no mitohondriju disfunkcijas, papildus NOX-2, endotēlija ksantīna oksidāzei, nesaistītajai eNOS un lipoksigenāzei [36]. Diētisko līdzekļu antioksidanta īpašības var neitralizēt ROS veidošanos, palielinot antioksidantu spēju [26]. Ginkgo Biloba ekstrakts aizsargā pret aterosklerozes attīstību, samazinot ROS veidošanos un lipoksigenāzes aktivitāti OxiLDL izraisītas endotēlija disfunkcijas gadījumā [37]. Turklāt dažādi fenola savienojumi unflavonoīdi noēdamiem augiem un graudiem ir īpašība novērst ROS un lipīdu peroksidāciju [38]. Biešu mizas (Beta vulgaris) metanola ekstraktam piemīt antioksidanta potenciāls, jo tajā ir daudz šķiedrvielu, antocianīnu un flavonoīdu, piemēram, viteksīna un betanīna [39]. Šajā pētījumā BPME tika izvēlēts, lai identificētu no mitohondriju atkarīgo mehānisko pieeju, lai atklātu tās ietekmi uz mitohondriju membrānas potenciālu, LPO slāpēšanu un ar asinsvadu iekaisumu saistīto mRNS ekspresijas līmeņu inhibīciju. MTT tests apstiprināja, ka BPME ievērojami palielināja šūnu proliferāciju, ko apstiprina palielināta kodola integritāte PI krāsošanā ar efektīvo devu 0,2 µg/mL BPME, salīdzinot ar pārbaudīto 0,1 µg/mL no BPME. Efektīvas devas noteikšanu ar zemu koncentrāciju un augstāko aktivitāti var uzskatīt par fizioloģiski drošu. Mēs atklājām JC-1 FL fluorescences mikroskopisku krāsojumu, un mitohondriju membrānas potenciāls tika atjaunots gan normālos, gan H2O{{10}}inducētos ārēji stimulētos oksidatīvā stresa izraisītos HUVEC pēc 0,2 µg/mL BPME. ārstēšana. Mitohondriju disfunkcija izmaina oksidatīvo fosforilāciju, kas nespēj pārveidot skābekļa (O2·−) radikāļus par H2O2 un H2O ar glutationa peroksidāzes palīdzību. Nepietiekamas ROS detoksikācijas vai nekontrolētas ROS ražošanas dēļ palielināts mitohondriju oksidatīvais stress ir saistīts ar aterosklerozi [40]. Biešu mizas ekstrakti efektīvi atjaunoja mitohondriju membrānas potenciālu, kas veiksmīgi palielināja ROS detoksikāciju un H2O2 veidošanos. Aneksīna V / PI krāsošanas analīze apstiprināja, ka BPME ārstēšana saglabāja dzīvotspējīgo šūnu procentuālo daudzumu un uzlaboja šūnu proliferācijas stadiju gan normālos HUVEC, gan HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisīja H2O2. Šajā kontekstā Choo et al. [41] apstiprināja, ka pēc pārmērīga ROS vai eksogēna H2O2 ģenerēšanas išēmiskajā vietā transplantētās mezenhimālās cilmes šūnas (MSC) var pasliktināt pašproliferāciju un vairāku līniju spēju. Reģeneratīvajā medicīnā asinsvadu gludās muskulatūras šūnas ir galvenie saraušanās tonusa artēriju regulatori, uzturot artēriju perifēro pretestību, asinsspiediena regulatorus, asins līdziniekus un artēriju labošanu [42]. Turklāt vecuma izraisīta EC fenotipa modulācija ir saistīta ar samazinātu šūnu kontraktilitāti un palielinātu šūnu novecošanos. Pastāvīga stresa vai samazinātas mehāniskās jutības dēļ novecojušās gludās muskulatūras šūnās tiek konstatēta samazināta mikrovides signālu adaptācija [43]. Šie rezultāti apstiprināja, ka BPME ārstēšana saglabāja dzīvotspējīgu šūnu populāciju, par ko liecina angiogēzes spēja. Identificētā BPME proliferācijas spēja uz HUVEC ir atbalstīta ar LPO ekspresijas samazināšanos un palielinātu antioksidantu gēnu ekspresiju. Sākotnēji ROS un LPO tiek ģenerēti no mitohondriju kompleksa (I un III) un NOX-4 šūnu proliferācijas vai diferenciācijas laikā [44]. Pārmērīga ROS reaģē un bojā biomolekulas, īpaši mainot genoma DNS integritāti, kas ir būtiska šūnu proliferācijai un funkcijām [45]. Tomēr ir apstiprināts, ka antioksidantu polifenolu, piemēram, epigallokatehīna un tokoferola, uzņemšana ar uzturu aizsargā šūnas no oksidatīvā stresa un palielina proliferācijas spēju [46]. Mūsu pētījumā LPO mRNS ekspresijas līmenis samazinājās, un tika konstatēts, ka NOS-3, Nrf-2 un eNOS palielinājās divas reizes HUVEC ar oksidatīvo stresu, ko izraisa H2O2. eNOS ir dominējošā NOS izoforma, kas ir atbildīga par lielāko daļu NO produktu gludo muskuļu šūnās un asinsvadu audos. NO · paplašina visu veidu asinsvadus un aizsargā trombocītu agregāciju un leikocītu adhēziju EK [47]. Līdz šim ir bijuši daudzi pretrunīgi ziņojumi par sirds un asinsvadu riska faktoriem, un endotēlija disfunkcija ir saistīta ar samazinātu vai palielinātu eNOS ekspresiju [48]. Paaugstināta eNOS ekspresija novērota pēc asinsvadu slimībām, kas, iespējams, ir pārmērīgas H2O2 ražošanas sekas. O2·−, dismutācijas produkts, var palielināt eNOS ekspresiju, izmantojot transkripcijas un pēctranskripcijas mehānismus [49]. Asinsvadu slimības patoģenēzi pavada paātrināta NO · sadalīšanās pēc reakcijas ar O2 ·− un, visbeidzot, ONOO− forma, kas izraisa eNOS atsaisti un NOX enzīmu disfunkciju [50]. Oksidatīvo stresu nomāc antioksidantu enzīmi, un pēc ārstēšanas ar BPME ir paaugstināts GSK-3 un GPX mRNS līmenis. BPME satur vairākas bioloģiski aktīvas fitoķīmiskas vielas, tostarp betalaīnus, flavonoīdus, polifenolus, terapeitiskos enzīmus, askorbīnskābi, dehidroaskorbīnskābi (DHAA) un neorganisko nitrātu (NO3), un tie var būt iesaistīti HUVEC antioksidantu kapacitātes regulēšanā. Šajā kontekstā Cha et al. (2014) [51] ziņoja, ka hlorogēnskābe efektīvi aizsargā pret oksidatīvā stresa izraisītiem DNS bojājumiem cilvēka keratinocītos. Endotelīns -1 (Edn-1), no endotēlija iegūts vazokonstriktors, veic gludo muskuļu šūnu migrāciju un darbojas kā antiapoptotisks faktors šūnās ar slāpekļa oksīda izraisītu stresu [52,53]. Asinsvadu remodelācijas, migrācijas, proliferācijas un ekstracelulārās matricas uzkrāšanās procesus stimulēja gan Edn-1, gan NO [54,55]. Mēs novērojām palielinātu Edn-1 ekspresiju pēc BPME ārstēšanas HUVEC ar oksidatīvo stresu. Pēc oksidatīvā stresa vai LPO uzkrāšanās asinsvadu iekaisuma agrīnā stadija ir leikocītu saķere ar endotēlija gludo muskuļu šūnām, kas ir pamanāma išēmijas un aterosklerozes kritiskajiem notikumiem [56]. To nodrošina VCAM un ICAM izteiksmes; to ir stimulējuši daudzi ķīmokīni un ķīmotaksiskie līdzekļi, piemēram, NF-κB, IL-1 un TNF- ekspresijas [57]. IL-1 aktivācijas inhibēšana, kam seko adhēzijas molekulu ekspresija, ir panākta ar uztura fenola savienojumu ellagīnskābi [58]. Ārstēšana ar BPME ārēji stimulētiem HUVEC ar oksidatīvo stresu ievērojami samazināja asinsvadu šūnām raksturīgos proinflammatoriskos faktorus, piemēram, VCAM, ICAM, NF-κB, IL-1 un TNF ekspresijas līmeni. Šajā kontekstā Crespo et al. [59] ziņoja, ka kaempferols un kvercetīns inhibēja pro-iekaisuma gēnus, piemēram, VCAM, ICAM, NF-κB un IL-1 ekspresijas, attiecīgi. Kopumā BPME oksidatīvā stresa un ar asinsvadu iekaisumu saistītā gēnu ekspresijas potenciāla kavēšana veicināja asinsvadu šūnu augšanas faktoru ekspresiju un potenciāli veicināja asinsvadu šūnu proliferāciju un augšanu.

5. Secinājumi

Šie atklājumi apstiprina, ka palielināta antioksidantu gēnu ekspresija bija saistīta ar oksidatīvā stresa remdēšanu, palīdzot pārvarēt HUVEC proliferācijas un angiogēzes traucējumus. Melnie ķiploki, kas satur hidroksimetilfurfurolu, nomāc TNF izraisīto monocītu šūnu adhēzijas pie HUVEC iekaisuma efektu un vēl vairāk nomāc ROS veidošanos, VCAM-1 ekspresiju un NF-κB aktivāciju [60]. Turklāt He et al. [61] apstiprināja, ka hidroksimetilfurfurāls spēj aizsargāt EC no hipoksijas. Ir konstatēts, ka biešu miza satur arī flavonoīdus, furānu un antioksidantus, piemēram, 5-hidroksimetilfurfurolu, metilpiruvātu, furfurolu un 2,3-dihidro-3,5- dihidroksi-6-metil-4H-pirān-4-ons; šīs sastāvdaļas ir atbildīgas par paaugstinātu antioksidantu spēju un proinflammatorisko asinsvadu gludo muskuļu šūnu adhēzijas molekulu nomākšanu. Biešu miza ir izmantota kā stimulants antioksidantu baseiniem, lai remdētu peroksidatīvā šūnu stresa ārējo stimulu vai iekšējo patoloģisko stimulu. Mūsu atklājumi liecināja, ka biešu komponenti palīdz samazināt vielmaiņas stresu un iekaisumu HUVEC, kas var būt labvēlīgi asinsvadu šūnu proliferācijai un angioģenēzei.

Autora ieguldījums:

Konceptualizācija, LNA-H. un S.-BP; metodika, LNA-H. un S.-BP; programmatūra, GS; validācija, LNA-H. un S.-BP; formālā analīze, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) un GS; izmeklēšana, LNA-H., S.-BP un ​​AMA-D.; resursi, LNA-H.; datu apkopošana, S.-BP un ​​LNA-H.; rakstīšana — oriģinālā projekta sagatavošana, LNA-H. un S.-BP; rakstīšana — pārskatīšana un rediģēšana, LNA-H., AMS, GS un AAA (Amna Abdullah Alotiby); vizualizācija, S.-BPand AAA (Ali A Alshatwi); uzraudzība, LNA-H. un S.-BP; projektu administrācija, LNA-H.; finansējuma iegūšana, LNA-H. Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai. Finansējums: autori izsaka pateicību King Saud Universitātes Zinātniskās pētniecības dekanātei par šī darba finansēšanu, izmantojot pētniecības grupu Nr. RG-1442-432. Iestāžu pārskata padomes paziņojums: nav piemērojams. Informēts piekrišanas paziņojums: nav piemērojams. Paziņojums par datu pieejamību : Šajā pētījumā sniegtie dati ir pieejami pēc attiecīgā autora pieprasījuma. Interešu konflikti: šim pētījumam nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Abdolmaleki, Z.; Arābs, H.‑A.; Amanpūrs, S.; Muhammadnejad, S. Artemisia sieberi etanola ekstrakta antiangiogēnā iedarbība salīdzinājumā ar tā aktīvo vielu artemizinīnu. Rev. Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326–333. [CrossRef]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Angioģenēze un tās terapeitiskās iespējas. Mediat. Inflflamm. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angioģenēze vēža, asinsvadu, reimatoīdā un citās slimībās. Nat. Med. 1995, 1, 27–31. [CrossRef]
4. Hēbens, A.; Landuits, B.; Hailijs, MS; Vaildjers, H.; Van Osteroma, AT; De Bruijn, EA Asinsvadu endotēlija augšanas faktors un angioģenēze. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549–580. [CrossRef]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Angiogēno augšanas faktoru un to inhibitoru klīniskie pielietojumi. Nat. Med. 1999, 5, 1359–1364. [CrossRef]
6. Kambīze, HF; Webster, NR Endotēlija fizioloģija. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105–113. [CrossRef]
7. Onāts, D.; Brilons, D.; Kolombo, dators; Schmidt, AM Cilvēka asinsvadu endotēlija šūnas: modeļa sistēma asinsvadu iekaisuma pētīšanai diabēta un aterosklerozes gadījumā. Curr. Diabetes Rep. 2011, 11, 193–202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Aterosklerozes iekaisums: no asinsvadu bioloģijas līdz biomarķieru atklāšanai un riska prognozēšanai. Clin. Chem. 2008, 54, 24–38. [CrossRef]
9. Espers, RJ; Nordby, RA; Vilariņjo, JO; Paragano, A.; Cacharron, JL; Machado, RA Endotēlija disfunkcija: visaptverošs novērtējums. Sirds un asinsvadu sistēmas. Diabetols. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudins, B.; Bruneel, A.; Boseluts, N.; Vaubourdolle, M. Protokols cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnu izolēšanai un kultūrai. Nat. Protok. 2007, 2, 481–485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Angioģenēzi kavē tējas dzeršana. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Askorbīnskābes un gallskābes antioksidanta un prooksidanta īpašības. Food Chem. 2002, 79, 307–313. [CrossRef]
13. Dalārija, R.; Vērma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapvals, A.; Kumar, V.; Ņepovimova, E.; Kuca, K. Pārtikas augļu bioaktīvie savienojumi ar to pretnovecošanās īpašībām: visaptverošs pārskats cilvēka mūža pagarināšanai. Antioksidanti 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Dažādu biešu preparātu uzturvērtības, bioaktīvās un fizikāli ķīmiskās īpašības. Pārtikas atkarīgais. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. Par pārošanās uzvedības attīstību kokiem: plēsoņa vai laikapstākļi? Am. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betanīns kā daudzceļu oksidatīvā stresa un iekaisuma modulators: biešu pigments ar aizsargājošu iedarbību uz sirds un asinsvadu slimību patoģenēzi. Krit. Rev. Food Sci. Nutr. 2020, 1.–16. [CrossRef]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Ievērojams dārzenis: tā nitrātu un fitoķīmisko saturu var pielāgot jaunās formās, lai sniegtu labumu veselībai un atbalstītu sirds un asinsvadu slimību terapiju. Antioksidanti 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Sāds, HH; Solimans, MM; El-Rejs, MA; Šehata, SM; Barakat, A.; Jasirs, A.; Sobeh, M. HPLC-ESI- Biešu (Beta vulgaris) lapu un to labvēlīgo īpašību MS/MS analīze 1. tipa diabēta žurkām. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singhs, B.; Nathan, BS Biešu ķīmiskais sastāvs, funkcionālās īpašības un apstrāde - pārskats. Int. J. Sci. Inž. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Beta vulgaris cicla un rubra uzturvērtības un funkcionālais potenciāls. Fitoterapija 2013, 89, 188–199. [CrossRef]