Karboksipeptidāzes E nosacīti nokautas peles demonstrē mācīšanās un atmiņas trūkumus un neirodeģenerāciju 1. daļa

Karboksipeptidāze E (CPE) ir daudzfunkcionāls proteīns ar daudzām neenzimātiskām funkcijām dažādās sistēmās. Iepriekšējie pētījumi, izmantojot CPE izsitumu peles, ir parādījuši, ka CPE ir neiroprotektīva iedarbība pret stresu un ir iesaistīta mācībās un atmiņā.

Izturība pret stresu un atmiņa ir divi neatdalāmi aspekti. Neatkarīgi no tā, vai tas ir darbs, mācības vai dzīve, mēs saskarsimies ar visa veida spiedienu. Dažreiz šis stress var likt mums justies nomāktiem, nemierīgiem, nogurušiem un pat ietekmēt mūsu atmiņu. Šajā gadījumā mums ir jāatrod daži veidi, kā uzlabot mūsu stresa izturību un atmiņu.

Pirmkārt, stresa toleranci var uzlabot ar vingrinājumiem. Pētījumi liecina, ka vingrinājumi var palīdzēt cilvēkiem mazināt trauksmi un depresiju. Turklāt atbilstoša vingrošana var arī veicināt vielmaiņu, uzlabot miegu un uzlabot fizisko sagatavotību. Tas viss palīdz uzlabot mūsu stresa toleranci un atmiņu.

Otrkārt, psiholoģiskās konsultācijas ir arī efektīvs līdzeklis stresa izturības uzlabošanai. Saskaroties ar grūtībām un neveiksmēm, nekavējoties sazinieties ar ģimeni vai draugiem, lai atbrīvotu savas iekšējās sliktās emocijas un samazinātu psiholoģisko slogu, lai jūs varētu labāk stāties pretī spiedienam un izaicinājumiem.

Turklāt labi miega ieradumi ir svarīgi arī atmiņas un stresa izturības uzlabošanai. Slikts miegs var izraisīt fizisku nogurumu, depresiju un atmiņas zudumu. Tāpēc mums ir jāveido labi gulēšanas paradumi, katru nakti jānodrošina pietiekams miega laiks un jānodrošina miega kvalitāte.

Visbeidzot, svarīga ir arī pozitīva attieksme. Jums jāsaglabā laba attieksme, jāturpina mācīties un pilnveidot savas prasmes, aktīvi jāsastopas ar izaicinājumiem, jāsaglabā optimistiska attieksme grūtībās un jātic, ka varat pārvarēt spiedienu un gūt panākumus.

Īsāk sakot, stresa izturība un atmiņa ir divi cieši saistīti aspekti. Izmantojot vingrinājumus, psiholoģiskas konsultācijas, labus miega ieradumus un pozitīvu attieksmi, mēs varam efektīvi uzlabot savu spēju izturēt stresu un atmiņu, kā arī labāk stāties pretī dažādiem dzīves un darba izaicinājumiem. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls, kam ir daudz unikālu efektu, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Maltās gaļas iedarbīgumu nodrošina dažādas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp skābe, polisaharīdi, flavonoīdi utt. Šīs sastāvdaļas var dažādos veidos veicināt smadzeņu veselību.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

Tomēr CPE funkcijas neironos joprojām lielā mērā nav zināmas. Šeit mēs izmantojām Camk2a-Cre sistēmu, lai nosacīti izslēgtu CPE neuronus. Savvaļas tipa, CPEflox/− un CPEflox/flox peles 3 nedēļu vecumā tika atšķirtas, marķētas un apcirptas ar asti genotipa noteikšanai, un tām tika veikti atklātā lauka, objektu atpazīšanas, Y-labirinta un baiļu kondicionēšanas testi. nedēļas vecs.

CPEflox/flox pelēm bija normāls ķermeņa svars un glikozes metabolisms. Uzvedības testi parādīja, ka CPEflox/flox pelēm bija traucēta mācīšanās un atmiņa, salīdzinot ar savvaļas tipa un CPEflox/- pelēm. Pārsteidzoši, CPEflox/flox peļu subiculum (Sub) reģions bija pilnībā deģenerēts, atšķirībā no CPE pilnas nokautas pelēm, kurām ir CA3 reģiona neirodeģenerācija. Turklāt dubultkortīna imūnkrāsošana liecināja, ka CPEflox/flox pelēm tika ievērojami samazināta neiroģenēze hipokampa zobainajā daļā.

Interesanti, ka CPEflox / flox pelēm TrkB fosforilācija hipokampā tika samazināta, bet no smadzenēm iegūto neirotrofisko faktoru līmenis nebija. Gan hipokampā, gan muguras mediālajā prefrontālajā garozā mēs novērojām samazinātu MAP2 un GFAP ekspresiju CPEflox/flox pelēm. Kopumā šī pētījuma rezultāti parāda, ka specifisks neironu CPE izsitums izraisa centrālās nervu sistēmas disfunkcijas, tostarp mācīšanās un atmiņas deficītu, hipokampu subdeģenerāciju un neiroģenēzes traucējumus.

IEVADS

Karboksipeptidāze E (CPE), kas pazīstama arī kā neirotrofiskais faktors{0}}, ir daudzfunkcionāls proteīns ar daudzām būtiskām neenzimatiskām funkcijām endokrīnās un nervu sistēmās [1]. CPE ir bagātināts ar nobriedušiem sekrēcijas pūslīšiem un spēlē izšķirošu lomu peptīdu hormonu un neiropeptīdu biosintēzē [2]. CPE arī darbojas kā daudzu proproteīnu, tostarp proinsulīna, proenkefalīna, pro-opiomelanokortīna un pro-smadzeņu izcelsmes neirotrofiskā faktora (pro-BDNF) šķirošanas receptors [3].

Dabiski sastopama aptaukošanās fenotipa peles mutācija ar nosaukumu "tauki" ir kartēta ar CPE gēnu [4]. Nākamais pētījums liecināja, ka CPE-tauku/tauku un CPE-knockout (KO) pelēm bija līdzīgi fenotipi, tostarp neauglība un pieaugušo aptaukošanās [5]. Ir ziņots, ka cilvēka CPE gēnā ir mutācijas, tostarp nulles mutācijas, mutācijas, kas rada saīsinātus proteīnus, un tādas, kurām ir izvadīti galvenie katalītiskie atlikumi [6].

Homozigoti indivīdi ar smagām mutācijām ir slimīgi aptaukojušies un viņiem ir hipogonādisms. Turklāt 2. tipa diabēta pacientiem ir konstatēts CPE missense polimorfisms. Mutācija maina CPE enzīmu aktivitāti, un pacientiem ir agrīna 2. tipa diabēta sākums [7]. Turklāt CPE ir svarīga loma vezikulārajā transportā, kā parādīts hipokampu neironos un sinapsēs [8].

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka augsts CPE līmenis tiek ekspresēts hipokampā un tam ir neirotrofiska loma, neatkarīgi no tā fermentatīvās aktivitātes, aizsargājot pret stresa izraisītu piramīdveida neironu nāvi un kognitīviem traucējumiem [9, 10]. Stress pasliktina virknes neironu struktūru un funkcijas. smadzeņu reģioni [11].

Prefrontālā garoza (PFC) ir galvenais stresa neiropatoloģiskais mērķis, kas ir saistīts ar daudziem kortikālajiem un subkortikālajiem reģioniem un veicina kognitīvās funkcijas [12, 13]. Dorsālais mediālais PFC (dmPFC) ietver rostralanterior cingulāro garozu un prelimbisko garozu, kas ir reģioni, kas iesaistīti sāpju, emociju un izziņas modulācijā. Ir pierādīts, ka dmPFC funkcionālā inaktivācija izraisa negatīvas emocijas un samazina izziņas spēju [14]. DmPFC neironu darbība sniedz informāciju par pagātnes izvēlēm un rezultātiem, un dmPFC noņemšana vai inaktivācija pasliktina norādījumu vadību [15].

Turklāt stress izraisa neironu tīklu traucējumus, kognitīvo disfunkciju, hipokampu deģenerāciju un samazinātu neiroģenēzi [10]. Piramīdveida neironi dmPFC un hipokampā uzrāda atrofiju zem stresa, un psihosociālais un savaldības stress izraisa atrofiju aptuveni 3–4 nedēļu laikā [11, 16]. Temorfoloģiskās izmaiņas atšķiras atkarībā no smadzeņu reģiona. Hronisks sasprindzinājuma stress izraisa dendrītu ievilkšanu un samazina mugurkaula blīvumu dmPFC un hipokampa prelimbiskajā zonā [17].

Stresa izraisītā hipokampu apikālā dendrīta sarežģītības samazināšanās atbilst hipokampu funkciju traucējumiem, piemēram, mācīšanās un atmiņas traucējumiem [18]. Turklāt neironu bojājumi un apoptoze CA3 reģionā izraisa telpiskās atmiņas deficītu [19]. Uzvedībā ir konstatēts, ka stress pasliktina dažādas no hipokampa atkarīgas funkcijas, piemēram, atmiņu [20].

CPE tiek modulēts dažāda veida spriedzes ietekmē un ir svarīgs neironu aizsardzībā. Neironi hipokampā un garozā pārregulē CPE ekspresiju pēc išēmiskā stresa, kas ir saistīts ar neironu izdzīvošanu [21].

Turklāt pēc CPEknockout (KO) peles saņēma stresa paradigmu, kad tās tika atšķirtas 3 nedēļu vecumā, tām bija CA3 reģiona deģenerācija un pavājināta neiroģenēze zobratā (DG) [1, 22].

Šajā pētījumā mēs izmantojām kopīgu neironiem raksturīgu Camk2aCre sistēmu, lai izdzēstu neironu CPE. Mēs izveidojām CPE nosacīto KO (cKO) peles modeli, lai izpētītu CPE funkciju zuduma fenotipu smadzeņu neironos. Mēs novērtējām stresa paradigmas (atšķirtas, ausis iezīmētas un apgrieztas astes) ietekmi 3 nedēļu vecumā CPE-cKO pelēm. Mēs izmantojām objektu atpazīšanu, Y labirintu un baiļu kondicionēšanas testus 8–10 nedēļu vecumā, lai novērtētu kognitīvo veiktspēju. Turklāt mēs analizējām neironu un astrocītu fenotipus, kā arī neiroģenēzi hipokampā.

METODES

Dzīvnieki

Camk2a-Cre peles un CPEflox / flox peles tika iegūtas no CyagenBiosciences (Suzhou, Ķīna). Visi dzīvnieki tika izmitināti apkārtējās vides temperatūrā (22 grādi ± 2 grādi) ar dabiskās gaismas/tumsas ciklu, un tiem tika nodrošināta brīva piekļuve tīram ūdenim un standarta grauzēju barībai. Camk2a-Cre un CPEflox/floxpeles tiek sauktas par CPE-cKO pelēm. 3 nedēļu vecumā peles tika atšķirtas no krūtīm, tika apzīmētas ar ausīm un apgrieztas astes, lai noteiktu genotipu, izraisot emocionāla un fiziska stresa paradigmu. Mēs atsaucamies uz Camk2a-Cre; CPEflox/flox peles kā CPEcKO, Camk2a-Cre; CPEflox/- peles kā heterozigotas (HE) un CPE-/- peles kā savvaļas tipa (WT). Visas eksperimentālās procedūras dzīvniekiem apstiprināja Ķīnas Minzu universitātes Eksperimentālo dzīvnieku ētikas komiteja.

Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR)

Nogrieztās astes tika savāktas, lai izolētu DNS PCR un identificētu genotipu. Primeru secības ir šādas:

Ķermeņa masa

WT, CPEflox/− un CPEflox/flox peles (1–20 nedēļu vecums; n=10 katram genotipam) tika nosvērtas katru nedēļu, ko izmantoja svara izmaiņu noteikšanai. Katras peles svars tika aprēķināts katrai grupai.

Glikoze plazmā

Venozās asinis no peļu astēm tika savāktas un noteiktas ar glikozes līmeņa asinīs monitoringa sistēmu (Juvela, Ķīna) pēc 12 stundu badošanās. Asins paraugi tika ņemti no astes vēnas 0 min., lai noteiktu glikozes līmeni tukšā dūšā. Pēc tam katrai pelei intraperitoneāli injicēja 1 g / kg glikozes šķīdumu. Pēc tam mēs noteicām glikozes līmeni plazmā 15, 30, 60, 90 un 120 minūtes, lai izmērītu glikozes līmeni asinīs.

Uzvedības testi

Lai novērtētu WT, CPEflox/− un CPEflox/flox peļu uzvedību, 8–10- nedēļas veciem dzīvniekiem tika veikti atklāta lauka, objektu atpazīšanas, Y labirinta un baiļu kondicionēšanas testi.

Atvērts lauks

Izpētes uzvedība tika mērīta, izmantojot atklāta lauka aparātu (50 × 50 × 40 cm). Katrs dzīvnieks tika novietots vienā aparāta stūrī un tika mērīts 7 minūtes. Nobrauktais attālums tika reģistrēts pēdējās 5 minūtes ar video attēlveidošanas sistēmu (Taimenga, Čendu, Ķīna).

Objektu atpazīšana

Objektu atpazīšanas tests tika izmantots, lai pārbaudītu mācīšanos un atmiņu pelēm. Apmācības dienā uz aparāta diagonāles tika novietoti divi identiski objekti (50 × 50 × 40 cm). Dzīvniekiem tika atļauts brīvi izpētīt 7 minūtes. Testēšanas procedūrā viens objekts tika aizstāts ar jaunu objektu tajā pašā diagonālē, kur notika apmācības diena. Dzīvniekiem tika atļauts brīvi izpētīt 7 minūtes. Izpētes laiks 2–3 cm attālumā ap jauno objektu tika reģistrēts pēdējās 5 minūtes.

Y labirints

Izpētes aktivitāte un darba atmiņa tika mērīta, izmantojot Y-mazeaparātu (rokas garums: 30 cm, rokas platums: 6 cm, sienas augstums: 15 cm). Katrs dzīvnieks tika novietots centrālajā zonā. Ierakstu skaits un izmaiņas rokās tika reģistrēts 7 minūtes ar video attēlveidošanas sistēmu (Taimeng, Chengdu, Ķīna). Rezultāts tika aprēķināts kā labojumu skaits/kopējais rokas ievades numurs.

Bailes kondicionēšana

Baiļu kondicionēšana sastāvēja no divām kamerām, un iesaldēšanas monitora kaste (23 × 23 × 30 cm) tika novietota lielākā skaņu izolējošā telpā (30 × 30 × 37 cm). Sasalšanas monitora kastē bija metāla režģis pēdu triecienam, un tika reģistrētas dzīvnieku vertikālās un horizontālās kustības. Pirmā diena bija kondicionētu refleksu treniņš. Procedūra bija šāda: bezdarbība 60 sekundes un pēc tam stimulēšana 12 reizes.

Stimulācijas saturs ietvēra nosacītu stimulu 30 s (75 dB), kam sekoja izsekošanas intervāls (30 s), un tas beidzās ar 2 s pēdas triecienu (30 mA) un 15 s bezdarbības. Pēc sešām stundām tika veikts īstermiņa atmiņas tests, un stimulu skaits tika samazināts līdz 6. Stimulācijas procesa laikā katrs izmēģinājums sastāvēja no kondicionētā stimula, kam sekoja izsekošanas intervāls (30 sekundes), un tas beidzās bez pēdas trieciena.

Ilgtermiņa atmiņas tests tika veikts nākamajā dienā ar vienas dienas intervālu. Metode bija tāda pati kā īstermiņa atmiņai, lai noteiktu ilgtermiņa atmiņas kvalitāti.

For more information:1950477648nn@gmail.com