Karvedilols, adrenerģisks blokators, nomāc melanīna sintēzi, inhibējot CAMP/CREB signālu ceļu cilvēka melanocītos un ex vivo cilvēka ādas kultūrā

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Myoung Eun Choi 1,†, Hanju Yoo 1,2,†, Ha-Ri Lee 2,3, Ik Joon Moon 1, Woo Jin Lee 1, Youngsup Song 3,*,‡ un Sung Eun Chang 1

Abstract:Kateholamīni darbojas, izmantojot ar G proteīnu saistītus receptorus, izraisot 30 50-cikliskā adenozīna monofosfāta (cAMP) līmeņa paaugstināšanos šūnās dažādās šūnās. Ir kateholamīnu biosintēze un -adrenerģiskie receptorimelanocīti; tādējādi kateholamīniem var būt izšķiroša nozīme ādas pigmentācijā. Tomēr to darbība un mehānismi, kas veicina necilvēcīgas ādas melanoģenēzi, vēl nav pētīti. Tāpēc mēs pārbaudījām karvedilola, neselektīva bloķētāja ar vājām 1-bloķējošām aktivitātēm, iespējamo anti-melanogenētisko iedarbību. Karvedilols samazina melanīna saturu un šūnu tirozināzes aktivitāti, neapdraudot šūnu dzīvotspēju normālam cilvēkammelanocītikā arī Mel-Ab iemūžinātajos peles melanocītos. Karvedilola samazināts ar mikroftalmiju saistītais transkripcijas faktors (MITF), tirozināze, ar tirozināzi saistītais proteīns (TRP)-1 un TRP-2. Ārstēšana ar karvedilolu izraisīja fosfora-cAMP reakcijas elementu saistošā proteīna (CREB) pazemināšanos. Turklāt cAMP līmeņa paaugstināšanās pēc ārstēšanas ar forskolīnu mainīja karvedilola anti-melanogēno darbību. Turklāt karvedilols ievērojami samazināja melanīna indeksu ultravioletā starojuma apstarotās cilvēka ādas kultūrās. Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka karvedilols efektīvi nomāc melanoģenēzi cilvēka organismāmelanocītiun ex vivo cilvēka ādu, inhibējot cAMP/proteīnkināzes A/CREB signālu pārraidi. Karvedilola anti-melanogēnajai iedarbībai ir potenciāla nozīme ādaibalināšanaaģenti.

Atslēgvārdi:karvedilols; adrenerģisks blokators;melanīna sintēze; cAMP/CREB signalizācija

Cistanchespēj kavēt melanīna sintēzi

1. Ievads

Plašam ādas pigmentācijas traucējumu klāstam ir būtiska psiholoģiska un sociāla ietekme uz pacientiem. Ir izstrādātas dažādas ārstēšanas metodes, tostarp sistēmiski un lokāli līdzekļi, kā arī lāzerterapija [1–3]. Tomēr rezultāti bieži vien ir neapmierinoši, un blakusparādības, piemēram, pēc iekaisuma hiperpigmentācija (PIH) un hipopigmentācija, no ārstēšanas ir izplatītas. Turklāt ārstēšana ir dārga un laikietilpīga [4–6].

Kateholamīni, kas ietver dopamīnu, epinefrīnu un norepinefrīnu, ir signālmolekulas, kas darbojas kā neirotransmiteri un endokrīnie hormoni. Ādā kateholamīnu biosintēze un sadalīšanās notiek cilvēka keratinocītos, bet kateholamīnu sintēze melanocītos ir nedaudz atšķirīga [7–9]. Kateholamīni darbojas, izmantojot ar G proteīnu saistītus receptorus (GPCR). Kateholamīnu saistīšanās ar GPCR izraisa intracelulārās adenilateciklāzes aktivāciju, kas sintezē 30, 50- ciklisko adenozīna monofosfātu (cAMP) no ATP [10]. Otrais vēstnesis cAMP iedarbojas, saistoties ar proteīnkināzes A (PKA) R-apakšvienību, kā rezultātā notiek cAMP atbildes elementu saistošā proteīna (CREB) fosforilēšanās. GPCR aktivizē amīni un peptīdi, tostarp glikagons, parathormons, sekretīns un kalcitonīns [10].

Adrenerģisko receptoru antagonisti ietver -receptoru un -receptoru antagonistus. -Receptoru antagonistus iedala neselektīvos, 1-selektīvos un 2-selektīvos aģentos, savukārt receptoru antagonistus klasificē kā neselektīvus, 1-selektīvus un 2-selektīvus. aģentiem, pamatojoties uz to selektīvajām bloķēšanas darbībām. Atšķirībā no pirmās paaudzes neselektīvo receptoru antagonistiem, piemēram, propranolola, timolola un nadolola, karvedilols ir trešās paaudzes neselektīvs blokators, kas parāda vazodilatatora darbību, bloķējot 1-adrenoreceptorus (1-AR). [11]. Tāpēc karvedilols ir neselektīvs bloķētājs ar vājām 1-bloķējošām aktivitātēm [12]. To galvenokārt lieto kā perorālu medikamentu, lai kontrolētu augstu asinsspiedienu un sastrēguma sirds slimību, līdzīgi citiem blokatoriem [12]. Tomēr trešās paaudzes blokatoriem piemīt angiogēna, antioksidanta, antiproliferatīva, antihipertrofiska un antiapoptotiska iedarbība, kas prasa turpmāku skaidrojumu [11]. Dermatoloģijas jomā karvedilolu tā antioksidanta un pretiekaisuma iedarbības dēļ bieži lieto perorālos preparātos, lai ārstētu eritematotelangiektātisko rosaceju [13,14]. Turklāt karvedilola antioksidanta aktivitāte novērš ultravioletā starojuma (UV) izraisītu ādas kanceroģenēzi, padarot to par pievilcīgu līdzekli UV izraisītu ādas slimību ārstēšanai [15–18]. Tomēr karvedilolara ķīmijpreventīvā iedarbība nav tieši saistīta ar AR. [19] Lai gan precīzs mehānisms ir salīdzinoši nezināms, cAMP/PKA un PKC-δ signālu ceļš varētu būt saistīts ar karvedilola īpašībām pret metastāzēm ādā [20].

Pigmentācijas izmeklēšanas sākumposmā cilvēkamelanocītitika konstatēts, ka tas izsaka -1-AR signālu pēc ārpusšūnu indukcijas ar norepinefrīnu. Tomēr -AR netika atrasti pēc stimulācijas ar adrenerģisko signālu ievadīšanumelanocīti[8]. Un otrādi, Cillbro et al. vēlāk pierādīja, ka cilvēka melanocītos pastāv specifisks funkcionāls 2-AR signāls un ka 2-ARstimulācija izraisa pigmentāciju caur 2-AR/cAMP ceļu [7]. Tāpēc tika ierosināta kateholamīnu loma pigmentācijas kontrolē, un cAMP tiek uzskatīta par galveno asi melanoģenēzes kateholamīna kontrolei.

Melanoģenēze ir sarežģīts process, kas ietver vairākus ceļus. Tirozināze, ar tirozināzi saistītais proteīns 1 (TRP-1) un TRP-2, ko sauc arī par dopahroma tautomerāzi (DCT), ir trīs galvenie melanocītiem specifiskie enzīmi, kas iesaistītimelanīna sintēze[21]. Melanoģenēzi izraisa vai kavē daudzi faktori, tostarp hormoni, citokīni, neirotransmiteri, augšanas faktori un mikromolekulas [21–23].

Vissvarīgākais pozitīvais regulators ir melanokortīna-1 receptors un tā ligandi, melanokortīns un adrenokortikotropais hormons [23]. Tomēr dažādi melanoģenēzes faktori ir -endorfīns, estrogēni, androgēni, D3 vitamīns un kateholamīni [23]. Kumulatīvie pierādījumi liecina, ka L-tirozīns un L-DOPA, kas ir melanoģenēzes substrāti un starpprodukti, papildus citu šūnu funkciju regulatoriem darbojas kā melanogēnā ceļa induktori un pozitīvie regulatori [24]. Turklāt Džefs Hovs et al. ierosināja, ka L-tirozīna melanoģenēzes indukciju un regulēšanu veicina tieša L-tirozīna adrenerģisko receptoru aktivizēšana, nevis to izraisa tā vielmaiņas produkti, piemēram, kateholamīni [25]. Savos pētījumos norepinefrīns un epinefrīns stimulēja tirozināzes aktivitāti, bet to induktīvā ietekme uzmelanīna sintēzebija salīdzinoši zemāks par L-tirozīnu [25].

Kateholamīniem var būt svarīga loma ādas pigmentācijas sistēmā; tomēr to ietekme uz melanoģenēzi attiecībā uz trešās paaudzes neselektīvo blokatoru darbību vēl nav izpētīta. Tāpēc šajā pētījumā mēs centāmies izpētīt, vai karvedilols ietekmē melanoģenēzi, un pētījām tā darbības mehānismus cilvēkiem.melanocītiun ex vivo cilvēka āda un tās iespējamā izmantošana kā abalināšanaprodukts.

kavē melanīna veidošanos arherba cistanches

2. Rezultāti

2.1. Karvedilols nomāc melanoģenēzi

Karvedilola citotoksicitāte pret normālu cilvēkumelanocīti(NHM) un Mel-ab šūnas tika novērtētas ar WST šūnu proliferācijas testu. Karvedilola koncentrācija 10 µM sāka parādīt citotoksicitāti gan pret NHM, gan Mel-ab šūnām (1.A, B attēls). Tāpēc turpmākajos novērtējumos mēs izmantojām 8 µM karvedilola, kas nav citotoksisks NHM.

Ārstēšana ar karvedilolu samazināja melanīna saturu atkarībā no devas, neietekmējot NHM dzīvotspēju (1.C attēls). Melanīna saturs tika samazināts par 28,36 procentiem pēc 96 hof 8 µM karvedilola apstrādes (1.C attēls). 100 mg/ml arbutīna pievienošana samazināja melanīna saturu mazākā mērā nekā karvedilols (1.C attēls). Pēc 4 dienu ārstēšanas ar karvedilolu melanīna saturs samazinājās atkarībā no laika (attēls 1D). Tomēr ārstēšana ar forskolīnu (FSK) 4 dienas pēc iepriekšējas apstrādes ar karvedilolu izraisīja melanīna satura palielināšanos (1. E attēls). FSK palielina MITF transkripciju līdz lielākajai pakāpei pēc 2 stundām NHM, un tiek uzskatīts, ka tā darbojas, izmantojot cAMP. /PKA/CREB ceļš (1.F attēls).

2.2. Karvedilols kavē MITF un tā mērķa gēnu ekspresiju un samazina fosfo-CREB līmeni NHM

Tā kā karvedilols samazināja melanīna uzkrāšanos, mēs pētījām šūnu tirozināzes aktivitāti. Ārstēšana ar karvedilolu samazināja šūnu tirozināzes aktivitāti no devas atkarīgā veidā NHM (2.A attēls). Tirozināzes aktivitāte samazinājās par 28,48 procentiem pēc 96 stundu ilgas apstrādes ar 8 µM karvedilolu (2.A attēls). Pēc tam mēs noskaidrojām, vai karvedilols ietekmē MITF ekspresiju, kam ir izšķiroša loma tirozināzes un pakārtoto melanogēno gēnu regulēšanā. Ārstēšana ar FSK paaugstināja intracelulāro cAMP līmeni un mainīja karvedilola anti-melanogēno iedarbību. Karvedilols pēc 72 stundām ievērojami samazināja MITF, kas ir melanoģenēzes centrālais transkripcijas faktors, olbaltumvielu līmeni (2.B attēls). Turklāt pēc apstrādes ar karvedilolu tika samazināta tā mērķa gēnu, piemēram, tirozināzes un TRP{10}}, ekspresija (2.B attēls). Šie rezultāti liecina, ka karvedilols kavē melanoģenēzi, samazinot MITF signālu pārraidi.

Pēc tam mēs pētījām melanoģenēzes intracelulāros signalizācijas ceļus, kas regulē MITF transkripciju, mērot fosfo-CREB un fosfo-ERK ekspresijas līmeņus. Pēc ārstēšanas ar karvedilolu fosfo-ERK līmenis laika gaitā nemainījās; tomēr fosfo-CREB līmenis tika pazemināts (2.B attēls). Saskaņā ar iepriekšējiem novērojumiem, mūsu rezultāti atklāja, ka karvedilolīns inhibē melanoģenēzi, inhibējot cAMP / PKA / CREB signālu ceļu. Turklāt ārstēšana ar FSK mainīja karvedilola anti-melanogēno darbību, palielinot cAMP līmeni.

2.3. Melanīna indekss un imūnhistoķīmiskā krāsošana ex vivo cilvēka ādas kultūrā

Epidermas melanocītu blīvums un melanīna indekss cilvēka ādas kultūras audu sekcijās ex vivo tika noteikts ar Melan-A un Fontana-Masson krāsošanu attiecīgi. Karvedilols neietekmēja Melan-A skaitu (plus)melanocītiparaugā, kas apstrādāts ar karvedilolu plus UV starojumu (UVR), salīdzinot ar paraugu, kas apstrādāts tikai ar UVR (3.A attēls). HMB45 (plus) melanocīti var norādīt, ka melanocītu aktivitāte palielinājās pēc UVR terapijas un tika apgriezti pazemināta pēc ārstēšanas ar karvedilolu (3.B attēls). Tomēr melanīna saturs bija ievērojami samazināts paraugos, kas apstrādāti ar karvedilolu plus UVR, salīdzinot ar to paraugos, kas apstrādāti tikai ar UVR (3.C attēls). Lai aprēķinātu melanīna indeksu, tika aprēķināta un salīdzināta Fontana-Masson iekrāsotā laukuma daļa no kopējā laukuma starp paraugu, kas pakļauts UVR iedarbībai, un karvedilola plus UVR iedarbībai pakļauto paraugu (attēls 3D). Katra parauga šūnu lizāti tika analizēti ar Western blotassay, kas atklāja, ka tirozināzi, TRP1 un DCT palielināja UVR un samazināja ārstēšanu ar karvedilolu (3E attēls). Tā rezultātā karvedilols ievērojami samazināja melanīna indeksu un ar melanoģenēzi saistītos proteīnus, parādot tā anti-melanogēno iedarbību uz cilvēka ādu, kas apstrādāta ar UVR.

3. Diskusija

Melanīns ir pigments, kas atbild par ādas un matu krāsu, un to sintezē melanosomāsmelanocīti. Lai gan epidermas melanīnam ir svarīga aizsargājoša loma pret UVR, melanīna pārprodukcija un uzkrāšanās ādā izraisa traucējošus ādas hiperpigmentārus traucējumus, piemēram, PIH, ar fotonovecošanos saistītu dispigmentāciju, melasmu un saules lentigīnus [18, 26]. Tādēļ melanoģenēzes kavēšana ir bijusi ādas skaistuma un veselības medicīnisko un kosmētisko procedūru uzmanības centrā. Ir pieliktas ievērojamas pūles, lai identificētu jaunus un efektīvus pretpigmentācijas līdzekļus. Tomēr konkrēto līdzekļu anti-melanoģenēzes mehānismi pašlaik ir neskaidri un parasti ir novērtēti peles šūnās, kas dod rezultātus, kas ne vienmēr atbilst cilvēka ādas pētījumos [27, 28]. Turklāt, tā kā melanocītu melanoģenēzi stingri regulē keratinocīti un citas blakus esošās šūnas, kokultivētas cilvēka šūnas vai ex vivo cilvēka āda ir uzticamāki eksperimentālie iestatījumi, lai izpētītu efektīvas.balināšanaaģenti [29]. Lielākā daļa ādas balināšanas līdzekļu, neatkarīgi no tā, vai tie ir dabiski vai ķīmiski iegūti, var izraisīt ādas toksicitāti vai kairinājumu, ko zināmā mērā var paredzēt, izmantojot in vitro šūnu dzīvotspējas testus ar melanocītiem. Mūsu pētījumā karvedilols neuzrādīja citotoksicitāti, ja to lietoja mērenās devās.

cistanche bienfaits

Hidrohinona lokālie krēmi var izraisīt nevēlamus hipopigmentācijas traucējumus un ādas toksicitāti [30–32]. Turklāt dažibalināšanakosmētikai ir postošas ​​sekas, izraisot hipopigmentāciju, sadaloties tirozināzes proteīniem [33–35]. Balinošos līdzekļus var izmantot lielākās devās atkarībā no lietotāja, lai maksimāli palielinātu hiperpigmentāru bojājumu balināšanu. Tāpēc nepārtraukti tiek pētīti centieni atklāt drošus un veselīgus ādas balināšanas līdzekļus.

Tāpēc šis pētījums tika izstrādāts tā, lai to veiktu normālās cilvēka šūnās un ex vivo cilvēka ādā. Turklāt, pamatojoties uz kateholamīnu izveidoto G signālu darbības mehānismu, kas palielina šūnu cAMP līmeni, mēs uzskatījām, ka adrenerģiskais blokators var samazināt cAMP līmeni un kavēt UVR/cAMP/CREB signālu ceļu, kas ir galvenais UV izraisītas ādas hiperpigmentācijas mehānisms. [36,37]. Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka adrenerģiskie blokatori, kas samazina cAMP līmeni, samazinamelanīna sintēze.

Turklāt, lai izstrādātu drošubalināšanauzticami un reproducējami anti-melanoģenēzes mehānismi ir jāīsteno paralēli. Fizioloģiski nozīmīgākais stimuls ir UV un starp UVR signāliem epidermaimelanocīti, CREB ass ir visizplatītākais melanoģenēzes regulēšanas ceļš cilvēka epidermā [29]. UV iedarbība secīgi aktivizē cAMP ražošanu, PKA un transkripcijas faktoru CREB, kas savukārt inducē MITF un pakārtoto mērķa melanogēno gēnu ekspresiju [38, 39]. Papildus CREB fosforilēšanai, ko veic PKA, jaunākie pētījumi ir parādījuši, ka CREB regulētā transkripcijas koaktivatora (CRTC) 3 piesaiste CREB transkripcijas kompleksam ir nepieciešama arī cAMP stimulētam MITF. MITF veic vissvarīgāko lomu regulēšanāmelanīna sintēzeun rezultātā iegūtā melanogēno enzīmu transkripcija [26,40,41]. Šī intracelulārā signalizācijas procesa laikā melanoģenēzi regulē galvenais enzīms tirozināze un papildu fermentatīvie proteīni, piemēram, TRP-1 un DCT [1–4]. Šajā pētījumā karvedilols efektīvi samazināja CREB fosforilēšanos, kas norāda, ka tas samazināja MITF un tirozināzes proteīnus, inhibējot MITF transkripciju (4. attēls). Ņemot vērā, ka MITF mRNS gēnu regulēšanu sarežģīti kontrolē un glābj citas intracelulāras signalizācijas molekulas un koaktivatori, MITF transkripcijas līmeņa regulēšana ir daudzsološa stratēģija veselīgu ādu balinošu sastāvdaļu izpētei, jo MITF izdzīvošanas funkcija tiek saglabāta un izglābta [1, 38, 40]. Patiešām, kad mēs pētījām FSK izraisītu MITF transkripciju, tika konstatēts, ka MITF mRNS ir sava maksimālā reakcijas līkne melanoģenēzei un šūnu izdzīvošanai šūnu homeostāzes gadījumā. Bioloģiskās funkcijasmelanocītišķita, ka to iekšēji regulē citi atgriezeniskās saites signāli cilvēka melanocītos. Turklāt karvedilolam ir mazāks hipopigmentācijas blakusparādību risks, jo tas vājina šūnu tirozināzes aktivitāti laika gaitā, nevis pēkšņi.

Kateholamīni ietver dopamīnu, epinefrīnu un norepinefrīnu, un tie tiek sintezēti no uztura tirozīna, iedarbojoties ar fermentiem [42]. Kateholamīnu biosintēze un noārdīšanās notiek daudzās šūnās, tostarp simpātisko nervu un smadzeņu neironos, adrenomedulārās šūnās, endotēlija šūnās, neitrofilos un mononukleārajās šūnās [43–45]. Cilvēka ādā kateholamīnu sintēze notiek keratinocītos. Un otrādi, melanocīti arī ekspresē mRNS un fermentus norepinefrīna, bet ne epinefrīna autokrīnai sintēzei [7, 42]. Cilvēkāmelanocīti, -1-AR var būt svarīga reakcija uz norepinefrīnu, betmelanīna sintēzeietekmē arī funkcionālā 2-ARsignalizācija [7,8]. Interesanti, ka pacientiem ar vitiligo ir palielināts 2-AR blīvums keratinocītos [46]. Paaugstināts norepinefrīna līmenis ir konstatēts urīnā un plazmā pacientiem ar ne-segmentalvitiligo, kas nozīmē, ka kateholamīnu metabolisms var būt saistīts ar vitiligo attīstību un progresēšanu. [47]. Turklāt, papildus klasiskajiem stresa neirotransmiteriem, melanocīti ražo neiropeptīdus un hormonus, piemēram, kortikotropīnu atbrīvojošo faktoru un proopiomelanokortīnu. Šo ražošanu stimulē UVR un citi aģenti, kas darbojas ādas neiroendokrīnajā sistēmā [48]. Tāpēc kateholamīnu darbība un melanocītu funkcija ir cieši saistītas dažādos sarežģītos veidos. Turklāt karvedilols var traucēt ķīmiskās reakcijas melanogēnajā ceļā, un šī iespēja ir jāturpina pētīt. Karvedilolam var būt priekšrocības, jo tam ir vienlaicīga pretiekaisuma iedarbība, jo lielākā daļa hiperpigmentāru traucējumu ir klīniski vai subklīniski tumšādainiem pacientiem. Tā kā karvedilola iekļūšana caur ādu ir pētīta gan in vitro, gan ex vivo, karvedilolu var izstrādāt kā lokālu līdzekli.balināšanaaģents nākotnē [49–51].

Sistēmiska karvedilola lietošana var izraisīt bradikardiju, reiboni, hipotensiju, galvassāpes un reiboni. Karvedilola lokāla lietošana parasti neizraisa sistēmiskus simptomus; tomēr, lietojot to pacientiem ar bojātu ādas barjeru, piemēram, ar atopisko dermatītu, šiem simptomiem jāpievērš īpaša uzmanība. Turklāt, lietojot karvedilolu, retos gadījumos ziņots par ekzēmu, niezi un lihenoīdu izvirdumu. Šīs dermatoloģiskas blakusparādības, kā arī kontaktdermatīts jāņem vērā arī, lietojot karvedilolu kā lokālu līdzekli.balināšanaaģents.

Noslēgumā mēs parādījām, ka karvedilols efektīvi samazināja melanoģenēzi cilvēkammelanocītiun ex vivo cilvēka ādai, inhibējot cAMP/CREB/MITF ceļu, kas liecina par tās potenciālo izmantošanu kā efektīvu balināšanas līdzekli. Jāturpina pētīt karvedilola adrenerģisko receptoru funkcionālo iesaistīšanos cilvēka melanocītos.

4. Materiāli un metodes

4.1. Materiāli

Karvedilolu, 3,4-dihidroksi-L-fenilalanīnu (L-DOPA), holēras toksīnu (CT) un 12-otetradekanoilforbola-13-acetātu (TPA) iegādājās no Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, ASV). Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) un Dulbecco fosfātu buferšķīdums tika iegādāts no WelGENE (Daegu, Koreja). Liellopu augļa serums (FBS), antibiotika-antimycotic un tripsīns-EDTA tika iegādāti no Gibco (Grand Island, NY, ASV). Vide 254 (CascadeBiologics, Portlenda, OR, ASV) un FSK ([3R-(3 ,4a ,5 ,6 ,6a ,10 ,10a ,10b )]-5-(Acetiloksi)-3-etenildodekahidro{ {24}},10,10b-trihidroksi-3,4a,7,7,10a-pentametil-1H-nafto[2,1-b]pirān-1-ons ) tika iegādāti no Tocris Bioscience (Bristole, Apvienotā Karaliste).

4.2. Šūnu līnijas un šūnu kultūra

Primārie NHM, kas iegūti no Invitrogen (Carlsbad, CA, ASV), tika uzturēti vidē 254 (Thermo Fisher, Waltham, MA, ASV), kas papildināta ar cilvēka melanocītu augšanas papildinājumu (Thermo Fisher). Mel-ab šūnas, no peles iegūtas spontāni iemūžinātas melanocītu šūnu līnijas, tika iegūtas no Korean Cell Line Bank (KCLB, Seula, Korea) un tika uzturētas DMEM, kas papildināts ar 10 procentiem FBS, penicilīna-streptomicīnu, 100 nM TPA un 1 nM. CT. Visas šūnas tika regulāri uzturētas 37 ◦C mitrā vidē ar 5 procentiem CO2.

4.3. Antivielas un Western blots

Šūnas vienu reizi nomazgāja ar aukstu PBS un lizēja proteīnu līzes buferšķīdumā (1% SDS 10 mMTris un 5 mM EDTA, pH 7,4), kam sekoja inkubācija 98 ◦C 10 minūtes. Olbaltumvielu paraugi tika atdalīti ar 8% SDS-poliakrilamīda gēla elektroforēzi, blotēti uz nitrocelulozes membrānām (GE Healthcare Life Sciences, Čikāga, IL, ASV) un pēc tam bloķēti ar Tris buferšķīdumu, kas satur 0,5 procentus Tween 20 un 5 procentus BSA, un pakļauts imūnblotēšanai. Tirozināzes un TRP{14}} antivielas tika iegādātas no Santa Cruz Biotechnology (Dallasa, Teksasa, ASV), un MITF tika iegādātas no Abcam (Kembridža, Apvienotā Karaliste). -tubulīns (Gentex, Holande, MI, ASV) tika izmantots kā iekšējās slodzes kontrole.

4.4. Melanīna saturs

Karvedilola citotoksiskā iedarbība tika novērtēta, izmantojot Ez-Cytox Cell Viability Assay Kit (Dogen-Bio Co., Ltd., Seula, Korea) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Mel-Ab šūnas un NHM tika iesētas sešu iedobju plāksnēs. ar blīvumu attiecīgi 6 × 105 un 3 × 105 šūnas/iedobē. Šūnas tika apstrādātas ar karvedilolu, kā parādīts attēlos, 3 vai 5 dienas (d). Pirms melanīna satura mērīšanas šūnas tika novērotas fāzes kontrasta mikroskopā un nofotografētas (Olympus, Tokija, Japāna). Šūnas tika izšķīdinātas 550 µl 1 N NaOH 100 ◦ C temperatūrā 30 minūtes un centrifugētas ar ātrumu 13, 000 apgr./min 5 minūtes. Supernatantu absorbcija tika mērīta pie 405 nm ar mikroplašu lasītāju. Intracelulārā melanīna saturs tika parādīts procentos attiecībā pret šūnu neapstrādāto kontroli. Arbutīnu (100 mg/ml) izmantoja kā pozitīvu kontroli.

4.5. Šūnu tirozināzes aktivitāte

Tirozināzes aktivitāte tika novērtēta, mērot L-DOPA dopahroma veidošanās ātrumu. Pēc inkubācijas ar karvedilolu šūnas nomazgāja ledusaukstā PBS un lizēja tirozināzes līzes buferšķīdumā (fosfāta buferis, pH 6,8, kas satur 1 procentu Triton X{ {5}}) ar atkārtotiem sasaldēšanas/atkausēšanas cikliem. Lizāti tika dzidrināti, centrifugējot pie 15, 000 apgr./min 4 ◦C 10 minūtes. Pēc lizāta proteīna līmeņa kvantitatīvas noteikšanas un proteīnu koncentrācijas pielāgošanas ar līzes buferi, 90 µL supernatanta, kas sajaukts ar 10 µL 10 mM L-DOPA tirozināzes līzes buferšķīdumā, tika inkubēts 37 ◦ C temperatūrā. Šūnu aktivitāti noteica, nolasot tirozināzi. 475 nm, izmantojot mikroplate nolasītāju ik pēc 10 minūtēm vismaz 1 stundu. Arbutīns (100 mg / ml) tika izmantots kā pozitīvas kontroles līdzeklis.

herba cistanches

4.6. Imūnhistoķīmiskā analīze

Parafīnā iestrādātie cilvēka ādas audi tika sagriezti 6-µm biezās daļās un iekrāsoti ar Melan-A (Novocastra, Newcastle, UK), Fontana-Masson komplektiem (ID laboratorijas, Londona, ON, Kanāda) un HMB45 (Santa Clara). , CA, ASV), saskaņā ar ražotāju norādījumiem. Melanīna indekss tika noteikts, izmērot iekrāsotā laukuma procentuālo daļu no kopējā audu laukuma, izmantojot programmatūru ImageJ 1.52a (Nacionālie veselības institūti, Bethesda, MD, ASV).

4.7. Statistiskā analīze

Dati tiek parādīti kā vidējie ± vidējā standarta kļūda (SEM), un statistisko nozīmīgumu noteica ar nesapārotu Studenta t-testu, izmantojot GraphPad Prism5 programmatūru (Sandjego, Kalifornija, ASV). Šajā pētījumā p < 0.05,="" p="">< 0,01="" un="" p="">< 0,001="" tika="" uzskatīti="" par="" statistiski="" nozīmīgiem,="" un="" tos="" attēlo="" *,="" **="" un="" ***,="">

Atsauces

1. Džilbro, Dž. M.; Olsson, MJ. Ādas balināšanas līdzekļu melanoģenēze un mehānismi — esošās un jaunas pieejas. Int. J. Kosmētika. Sci. 2011, 33, 210–221. [CrossRef] [PubMed]

2. Lī, JJ; Shin, HJ; Nē, TK; Čoi, KH; Chang, SE Melasmas un pēciekaisuma hiperpigmentācijas ārstēšana ar pikosekundes 755-nm aleksandrīta lāzeru Āzijas pacientiem. Ann. Dermatol. 2017, 29 779–781. [CrossRef] [PubMed]

3. Lī, JJ; Parks, JH; Lī, DY; Lee, JH ieguva divpusēju dispigmentāciju uz sejas un kakla: klīniski piemērotas pieejas. J. Korean Med. Sci. 2016, 31, 2042–2050. [CrossRef] [PubMed]

4. Kangs, HJ; Na, JI; Lī, JH; Roh, MR; Ko, JY; Chang, SE Pēciekaisuma hiperpigmentācija, kas saistīta ar saules lentigīnu ārstēšanu, izmantojot Q-Switched 532-nm Nd: YAG lāzers: daudzcentru aptauja.J. Dermatologs. Ārstēt. 2017, 28, 447–451. [CrossRef] [PubMed]

5. Kato, H.; Araki, J.; Eto, H.; Doi, K.; Hirai, R.; Kuno, S.; Higašino, T.; Yoshimura, K. Prospektīvs, nejaušināts kontrolēts pētījums par perorālo traneksāmskābi, lai novērstu pēciekaisuma hiperpigmentāciju pēc Q pārslēgtā rubīna lāzera. Dermatol. Surg. 2011, 37, 605–610. [CrossRef] [PubMed]

6. Teilors, CR; Andersons, RR Neefektīva ugunsizturīgas melasmas un pēcinflammatoriskās hiperpigmentācijas ārstēšana ar Q-slēdžu rubīna lāzeru. J. Dermatol. Surg. Oncol. 1994, 20, 592–597. [CrossRef]

7. Džilbro, Dž. M.; Mārles, LK; Hibberts, NA; Schallreuter, KU Autokrīnās kateholamīna biosintēze un beta-adrenoreceptoru signāls veicina pigmentāciju cilvēka epidermas melanocītos. J. Izmeklēt. Dermatol.2004, 123, 346–353. [CrossRef]

8. Schallreuter, KU; Korner, C.; Pitelkova, MR; Swanson, NN; Gardner, ML Thealfa-1-adrenoreceptoru signālu pārraides sistēmas indukcija cilvēka melanocītos. Exp. Dermatol. 1996, 5, 20–23.[CrossRef]

9. Šivamani, RK; Ši, B.; Grifits, E.; Vu, SM; Lev-Tovs, HA; Dahle, S.; Čigbrovs, M.; La, TD; Mashburn, C.;Peavy, TR; un citi. Akūts ievainojums maina beta2-adrenerģiskos signālus un kateholamīnu sintētiskos ceļus keratinocītos. J. Izmeklēt. Dermatol. 2014, 134., 2258.–2266. [CrossRef]

10. Emery, AC kateholamīna receptori: GPCR balstītu zāļu atklāšanas prototipi. Adv. Pharmacol. 2013, 68 335–356.

11. Do Vale, GT; Ceron, CS; Gonzaga, NA; Simplicio, JA; Padovan, JC Trīs beta blokatoru paaudzes: vēsture, klases atšķirības un klīniskā pielietojamība. Curr. Hipertensijas. 2019. gada atkl., 15., 22.–31. [PubMed]

12. Maktavišs, D.; Kampoli-Ričards, D.; Sorkin, EM Carvedilol: pārskats par tā farmakodinamiskajām un farmakokinētiskajām īpašībām un terapeitisko efektivitāti. Drugs 1993, 45, 232–258. [CrossRef] [PubMed]

13. Hsu, CC; Lee, JY Izteikts sejas pietvīkums un pastāvīga rosacejas eritēma, ko efektīvi ārstē karvedilols, neselektīvs beta adrenerģisks blokators. J. Am. Akad. Dermatol. 2012, 67, 491–493. [CrossRef][PubMed]

14. Pietschke, K.; Schaller, M. Ilgtermiņa ārstēšana ar izteiktu sejas pietvīkumu un noturīgu rozācijas eritēmu, ārstējot ar karvedilolu. J. Dermatologs. Ārstēt. 2018, 29, 310–313. [CrossRef] [PubMed]

15. Čangs, A.; Yeung, S.; Takars, A.; Huana, KM; Liu, MM; Kanassatega, RS; Parsa, C.; Orlando, R.; Džeksons, EK; Andresens, BT; un citi. Ādas kanceroģenēzes novēršana, izmantojot beta blokatoru karvedilolu. VēzisIepriekšējā. Res. 2015, 8, 27–36. [CrossRef] [PubMed]

16. Čeņs, M.; Liang, S.; Šahids, A.; Andresens, BT; Huang, Y. Beta blokators karvedilols novērsa ultravioleto staru izraisītus bojājumus peļu epidermas šūnās un 3D cilvēka rekonstruētajā ādā. Int. J.Mol. Sci. 2020, 21, 798. [CrossRef] [PubMed]

17. Huanga, KM; Liang, S.; Yeung, S.; Oiyemhonlan, E.; Klīvlenda, KH; Parsa, C.; Orlando, R.; Meiskens, FL, Jr.; Andresens, BT; Huang, Y. lokāli lietots karvedilols vājina saules ultravioletā starojuma izraisītu ādas karcinoģenēzi. Vēzis Iepriekš. Res. 2017, 10, 598–606. [CrossRef]

18. Brenners, M.; Dzirde, VJ Melanīna aizsargājošā loma pret UV bojājumiem cilvēka ādā. Photochem.Photobiol. 2008, 84, 539–549.

19. Klīvlenda, KH; Liang, S.; Čangs, A.; Huana, KM; Čens, S.; Guo, L.; Huangs, Y.; Andresen, BT Carvedilolinhibits EGF-mediētu JB6 P plus koloniju veidošanos, izmantojot mehānismu, kas nav atkarīgs no adrenoreceptoriem.PLoS ONE 2019, 14, e0217038. [CrossRef]

20. Džongs, G.; Zhongbing, M.; Qinye, F.; Zhigang, Y. Carvedilol nomāc migrāciju un ļaundabīgo krūšu šūnu invāziju, inaktivējot Src, iesaistot cAMP/PKA un PKCdelta signalizācijas ceļu. J. Cancer Res. Ther.2014, 10, 998–1003.

21. Rzepka, Z.; Busmans, E.; Beberoks, A.; Wrzesniok, D. No tirozīna līdz melanīnam: signalizācijas ceļi un faktori, kas regulē melanoģenēzi. Postepy Hig. Med. Dosw. Tiešsaistē 2016, 70, 695–708. [CrossRef]

22. Kima, Y.; Čo, JY; Ak, SW; Kangs, M.; Lī, DA; Jungs, E.; Parks, YS; Lee, J. Globulārais adiponektīns darbojas kā melanogēns signāls cilvēka epidermas melanocītos. Br. J. Dermatol. 2018, 179, 689–701. [CrossRef][PubMed]

23. Slominskis, A.; Tobins, dīdžejs; Šibahara, S.; Wortsman, J. Melanīna pigmentācija zīdītāju ādā un tās hormonālā regulēšana. Fiziol. Rev. 2004, 84, 1155–1228. [PubMed]

24. Slominskis, A.; Zmijevskis, MA; Pawelek, J. L-tirozīns un L-dihidroksifenilalanīns kā hormoniem līdzīgi melanocītu funkciju regulatori. Pigment Cell Melanoma Res. 2012, 25, 14.–27. [CrossRef] [PubMed]

25. Howe, J.; Kostantīno, R.; Slominskis, A. Par iespējamo L-tirozīna melanoģenēzes indukcijas un regulēšanas mehānismu. Acta Derm Venereol. 1991, 71, 150–152.

26. D'Mello, SA; Finlejs, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signalizācijas ceļi melanoģenēzē. Int. J.Mol. Sci. 2016, 17, 1144. [CrossRef]

27. Jungs, JA; Kims, BJ; Kima, MS; Tu, HJ; Yoon, ES; Dhonga, ES; Parks, SH; Kim, DW Botulīna toksīna aizsargājoša iedarbība pret ultravioleto staru izraisītu ādas pigmentāciju. Plast. Reconstr. Surg. 2019, 144, 347–356.[CrossRef]

28. Jeong, YM; Ak, VK; Tran, TL; Kim, WK; Sung, SH; Bē, K.; Lī, S.; Sung, JH Rh4 aglikons inhibē melanīna sintēzi B16 melanomas šūnās: Iespējamā proteīnkināzes A ceļa iesaistīšanās.Biosci. Biotehnoloģija. Biochem. 2013, 77., 119.–125. [CrossRef]

29. Kims, YH; Kims, D.; Hong, AR; Kims, JH; Yoo, H.; Kims, Dž.; Kims, I.; Kanga, DR; Chang, SE; Song, Y. Rottlerin terapeitiskais potenciāls ādas hiperpigmentāriem traucējumiem, inhibējot CREB regulēto transkripcijas koaktivatoru transkripcijas aktivitāti. J. Izmeklēt. Dermatol. 2019, 139, 2359–2367.e2.[CrossRef]

30. Das, A.; Gošs, A.; Kumar, P. Ķīmiskā leikodermija hidrohinona dēļ: neparasta parādība. Indijas Dž.Dermatols. Venereol. Leprol. 2019, 85, 567. [CrossRef]

31. Žovs, T.; Hantash, BM Hidrohinona izraisīta depigmentācija: gadījuma pārskats un literatūras apskats.Dermatīts 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

32. Kersija, P.; Stīvensons, CJ Vitiligo un hidrohinona iedarbība darbā, ko rada pašfotografēšanas iekārtu apkalpošana. Sazinieties ar Dermat. 1981, 7, 285–287. [CrossRef] [PubMed]

33. Sasaki, M.; Kondo, M.; Sato, K.; Umeda, M.; Kavabata, K.; Takahaši, Y.; Suzuki, T.; Matsunaga, K.; Inoue, S. Rhododendron, depigmentāciju izraisošs fenola savienojums, iedarbojas uz melanocītu citotoksicitāti, izmantojot no tirozināzes atkarīgu mehānismu. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 754–763. [CrossRef] [PubMed]

34. Jošikava, M.; Sumikava, Y.; Hida, T.; Kamija, T.; Kase, K.; Iši-Osai, Y.; Kato, J.; Kan, Y.; Kamija, S.; Sato, Y.; un citi. Klīniskā un epidemioloģiskā analīze 149 rododendru izraisītas leikodermijas gadījumos.J. Dermatol. 2017, 44, 582–587. [CrossRef] [PubMed]

35. Harris, JE Ķīmisko vielu izraisīts vitiligo. Dermatol. Clin. 2017, 35., 151.–161. [CrossRef] [PubMed]

36. Li-Ša, G.; Yi-He, C.; Na-Dans, Z.; Tengs, Z.; Yue-Chun, L. Karvedilola terapijas ietekme uz sirds cAMPreakcijas elementu saistošo proteīnu ekspresiju un fosforilāciju akūta koksavīrusa B3- izraisīta miokardīta gadījumā. BMC Cardiovasc. Traucējumi. 2013, 13, 100. [CrossRef] [PubMed]

37. Džans, F.; Šteinberga, SF S49G un R389G beta (1)-adrenerģisko receptoru polimorfismi ietekmē signalizāciju, izmantojot cAMP-PKA un ERK ceļus. Fiziol. Genoms. 2013, 45, 1186–1192. [CrossRef]

38. Lī, AY; Noh, M. Epidermas melanoģenēzes regulēšana, izmantojot cAMP un/vai PKC signalizācijas ceļus: ieskats hipopigmentētu līdzekļu izstrādē. Arch. Pharm. Res. 2013, 36, 792–801. [CrossRef]

39. Garsija-Borons, Dž. Abdel-Maleks, Z.; Jimenez-Servantes, C. MC1R, cAMP ceļš un reakcija uz saules UV: horizonta paplašināšana ārpus pigmentācijas. Pigment Cell Melanoma Res. 2014, 27, 699–720.[CrossRef]

40. Lins, CB; Babiarzs, L.; Lībels, F.; Roidons Praiss, E.; Kizoulis, M.; Gendimenico, GJ; Fišers, DE; Seiberg, M.Modulation of microphthalmia associated transkripcijas faktora gēnu ekspresija maina ādas pigmentāciju.J. Izpētīt. Dermatol. 2002, 119, 1330–1340. [CrossRef]

41. Kima, JH; Hong, AR; Kims, YH; Yoo, H.; Kanga, DR; Chang, SE; Song, Y. JNK nomāc melanoģenēzi, traucējot CREB regulēto transkripcijas koaktivatora 3-atkarīgo MITF ekspresiju. Theranostics2020, 10, 4017–4029. [CrossRef] [PubMed]

42. Riosa, M.; Habekers, B.; Sasaoka, T.; Eizenhofers, G.; Tjans, H.; Lendiss, S.; Čikaraiši, D.; Roffler-Tarlov, S. Kateholamīnu sintēzi veicina tirozināze, ja nav tirozīna hidroksilāzes. J. Neurosci. 1999,19, 3519–3526. [CrossRef] [PubMed]

43. Kosentino, M.; Marino, F.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lečīni, S.; Frigo, G. Endogēnā kateholamīnu sintēze, metabolisms, uzglabāšana un uzņemšana cilvēka neitrofilos. Life Sci. 1999, 64, 975–981. [CrossRef]

44. Marino, F.; Kosentino, M.; Bombelli, R.; Ferrari, M.; Lečīni, S.; Frigo, G. Endogēnā kateholamīnu sintēze, metabolisma uzglabāšana un uzņemšana cilvēka perifēro asiņu mononukleārajās šūnās. Exp. Hematol.1999, 27, 489–495. [CrossRef]

45. Sorrento, D.; Santulli, G.; Del Džudice, C.; Anastasio, A.; Trimarko, B.; Iaccarino, G. Endotēlija šūnas spēj sintezēt un atbrīvot kateholamīnus gan in vitro, gan in vivo. Hypertension 2012, 60, 129–136.[CrossRef] [PubMed]

46. ​​Cucchi, ML; Fratīni, P.; Santagostino, G.; Prēda, S.; Orecchia, G. Kateholamīnu daudzums ne-segmentālā vitiligo urīnā palielinās, īpaši tā aktīvajā fāzē. Pigment Cell Res. 2003, 16, 111–116. [CrossRef][PubMed]

47. Zalcers, BA; Schallreuter, KU Personības struktūras izpēte pacientiem ar vitiligo un iespējamu saistību ar traucētu kateholamīna metabolismu. Dermatoloģija 1995, 190, 109–115. [CrossRef][PubMed]

48. Slominski, A. Melanocītu neiroendokrīnā aktivitāte. Exp. Dermatol. 2009, 18, 760–763. [CrossRef]

49. Gannu, R.; Višnu, YV; Kišāns, V.; Rao, YM Karvedilola in vitro iekļūšana caur cūku ādu: transportlīdzekļu un iespiešanās pastiprinātāju ietekme. PDA J. Pharm. Sci. Tehn. 2008, 62, 256–263.

50. Kshirsagar, SJ; Bhalekars, MR; Mohapatra, SK Ar karvedilolu ielādētas transdermālās zāļu piegādes sistēmas izstrāde un novērtēšana: In vitro un in vivo raksturojuma pētījums. Drug Dev. Ind. Pharm. 2012, 38, 1530–1537. [CrossRef]

51. Tanvara, YS; Čauhans, CS; Sharma, A. Carvedilol transdermālo plāksteru izstrāde un novērtēšana.Acta Pharm. 2007, 57, 151–159. [CrossRef] [PubMed]