CD73 Pārmērīga ekspresija podocītos: jauns podocītu traumas marķieris cilvēka nieru slimībā
Feb 26, 2022
Abstrakts:CD73 ceļš ir svarīgs pretiekaisuma mehānisms dažādos slimību apstākļos. Novērojumi peļu modeļos liecināja, ka CD73 varētu būt aizsargājoša lomanieru bojājumi; tomēr nav tiešu pierādījumu par tās lomu cilvēkānieru slimībair aprakstīts līdz šim. Šeit mēs izvirzījām hipotēzi, ka podocītu traumas cilvēkamnieru slimībasmaina CD73 ekspresiju, kas var atvieglot podocitopātiju diagnostiku. Mēs novērtējām CD73 ekspresiju un vienu no tā funkcionāli svarīgajiem mērķiem - 2. tipa C-C hemokīna receptoru (CCR2) - podocītos nonierebiopsijas 39 pacientiem ar podocitopātiju (tai skaitā fokālo segmentālo segmentālo glomerulosklerozi (FSGS), minimālo izmaiņu slimību (MCD), membrānu glomerulonefrītu (MGN) un amiloidozi) un kontroles grupu. Podocītu CD73 ekspresija katrā slimības grupā bija ievērojami palielinājusies, salīdzinot ar kontroli (p< 0.001–p="">< 0.0001).="" moreover,="" there="" was="" a="" marked="" negative="" correlation="" between="" cd73="" and="" ccr2="" expression,="" as="" confirmed="" by="" immunohistochemistry="" and="" immunofluores-="" cence="" (pearson="" r="−" 0.5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="−" 0.4705,="" p="0.0313," respectively),="" thus="" suggesting="" a="" protective="" role="" of="" cd73="">nieru bojājums.Visbeidzot, mēs identificējam CD73 kā jaunu potenciālu cilvēka podocitopātiju diagnostikas marķieri, jo īpaši MCD, kas ir bēdīgi slavens ar to, ka trūkst patoloģisku pazīmju, kas atpazīstamas ar gaismas mikroskopiju un imūnhistoķīmiju.
Atslēgvārdus:podocīts; minimālas izmaiņas slimība; CD73; CKR 2;nieru bojājums;Nieru mazspēja
Ievads
Adenozīna trifosfāta (ATP) kā visuresošā intracelulārā enerģijas avota evolucionārā izšķirošā loma ir atjaunināta pirms vairāk nekā trim desmitgadēm ar revolucionāru priekšstatu, ka purīnerģiskās sistēmas locekļi (ATP, adenozīna di- un trifosfāts (attiecīgi ADP un AMP) var arī piegādāt ekstracelulārus signālus, lai mediētu šūnu mijiedarbību [ 1 , 2 ]. Šī koncepcija noveda pie izpratnes, ka purīnerģiskā sistēma piedalās imūnreakciju veidošanā, modulējot receptoru ekspresijas profilu, citokīnu sekrēciju, reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos un intracelulāro patogēnu gremošanu [3–7]. Ekstracelulārais ATP tiek pārveidots/defosforilēts ADP un AMP, izmantojot CD39 (ekto-nukleosidtrifosfāta difosfosfosfolāze 1), un, visbeidzot, AMP tiek noārdīts līdz adenozīnam ar CD73 (ecto-5 0 nukleotidādāze) [ 8 ]. CD73 var būt ar membrānu saistītā vai šķīstošā veidā. Membrānas formai ir dimera struktūra, kas sastāv no divām identiskām 70 kD apakšvienībām, kas saistās ar plazmas membrānu, izmantojot saikni starp C-termināla serīnu un glikozilfosfatīdila inozitolu (GPI) [ 9 ]. Ievērības cienīgi, CD39 substrāti ATP un ADP, šķiet, ir konkurētspējīgi CD73 inhibitori [ 9 - 11 ]. CD73 ekspresija tādējādi atspoguļo kritisko adenozīna līmeņa noregulēšanas ceļu ekstracelulārā telpā. CD73 nav šūnai vai orgānam specifiska molekula; tā izpausme uz dažādu orgānu leikocītiem, endotēliju, epitēlija vai mezenhīma šūnām (niere, plaušas, aknas, resnās zarnas, smadzenes un sirds) un cilmes šūnas ir labi dokumentētas [ 12 – 14 ]. Par adenozīna aizsargājošo lomu caur slāpekļa oksīda (NO) sintēzes ceļu aknu išēmijas izraisītā aknu išēmijas izraisītā ievainojumā vispirms ziņoja Peralta et al. [ 15 ]. Saskaņā ar šiem datiem ir pierādīts, ka tā darbība uzlabo akūtus plaušu bojājumus, alotransplantāta elpceļu atgrūšanu, akūtu transplantāta un saimniekorganisma slimību un sepsi [4,16–19].
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIERU MAZSPĒJU
Kā pārliecinoši parādīts vairākos peles modeļos, CD73 var piedalīties tubulo-glomerulārā mijiedarbībāniere. Ir pierādīts, ka CD73 mediēta adenozīna ģenerēšana, kas iegūta ar CD73 no cauruļveida izcelsmes ATP išēmijas-reperfūzijas bojājuma laikā, vājina iekaisumu, inhibējot neitrofilo leikocītu efektora funkciju [ 20 ]. Turklāt PELĒM, kurām trūkst CD73, ir autoimūns iekaisums, ko papildina samazināts podocītu skaits un endotēlija fenestrācijas [ 21 ]. Šī parādība bija saistīta ar paaugstinātu pretiekaisuma citokīnu, piemēram, audzēja nekrozes faktora (TNF)-alfa vai čemokīna C-X-C motīva liganda 2 (CXCL-2), līmeni serumā. Cilvēka uzstādījumānieru slimība,ir postulēts, ka podocītu bojājumi, iespējams, ir adaptīvo un destruktīvo mehānismu sajaukums šūnu reakcijai uz patoloģiskiem stimuliem, ne vienmēr atspoguļojot publicētos novērojumus no in vitro vai dzīvnieku modeļiem. Podocītu ievainojumu etioloģija mainās no mehāniskā stresa (glomerulāra hiperfiltrācija), oksidatīvā stresa (piemēram, hipertensijas vai diabētiskās nefropātijas, toksiska ievainojuma, iekaisuma šūnu infiltrācijas vai dzīvnieku modeļiem ar minimālu izmaiņu slimību) līdz imunoloģiskam stresam (t.i., imūnkomplekss un komplementa mediēts bojājums glomerulonefrīta laikā) [ 22 ]. Glomerulonefrīta iekaisuma iestatījums var stimulēt podocītus sintezēt dažādus citokīnus, iespējams, izmantojot CC chemokine receptoru 2 (CCR2) mediētu signalizāciju. Tomēr maz ir zināms par CD73 lomu cilvēkānieru slimība, jo īpaši hroniska iekaisuma un podocītu traumu apstākļos.
Šajā pētījumā mēs izvirzījām hipotēzi, ka CD73 ir nozīme cilvēka glomerulāro slimību patoģenēzē, un analizējām podocītu CD73 ekspresiju cilvēkamnierebiopsijas no pacientiem ar podocitopātiju saistītām patoloģijām. Mēs pierādām, ka CDD73 podocītu virsmas ekspresijair uzticams marķieris, kas pastiprina CD73 diagnostisko vērtību minimālu izmaiņu slimības (MCD) gadījumā. Turklāt mēs ziņojam par negatīvu korelāciju starp podocītu CCR2 un CD73 ekspresiju, kas liecina, ka CD73 pārmērīga ekspresija ir adaptīva reakcija uz glomerulāru bojājumu.
Rezultātus
Podocītu bojājumu klīniskie dati un ultrastrukturālā attēlveidošana1. tabulā ir izklāstīts pētījumā iekļauto gadījumu klīniskais attēlojums attiecībā uz vecumu, dzimumu, kreatinīnu un kopējām proteinūrijas vērtībām. Visiem FSGS pacientiem bija primāra NOS (citādi nav norādīta) forma. No 12 MGN pacientiem 5 bija fosfolipāzes A2 receptoru (PLA2R) pozitīvi (42%). Amiloidozes grupā 2 pacientiem bija AA-amiloidoze (16,7%) un 10 AL-amiloidoze (83,3%); 2 pacientiem ar AL-amiloidozes gaismas ķēdes kappa bija acīmredzama (20%) un 8 bija pozitīvas lambda grupā (80% al-amiloidozes grupā). Visiem pacientiem ar MCD, FSGS, MGN un amiloidozi podocītu bojājumi tika skaidri noteikti ar elektronu mikroskopijas palīdzību (1. attēls).
1. attēls. Ultrastrukturāls primāro un sekundāro podocītu bojājumu attēls. ( a ) Podocītu ķermeņa izplatīšanās uz glomerulārās pamatnes membrānas (bultas) ar pēdu procesu ievilkšanu MCD gadījumā. ( b ) Plaša podocītu pēdu procesa izsmiešana (bultiņa) un citoplazmatiska vakuolizācija (zvaigzne) pacientam ar primāru FSGS. ( c ) Pēdu procesa efacement (bulta), vakuolizācija un pamanāmas organellas (dubultā bultiņa) ar pamatā esošo epimembranozu elektronu blīvo materiālu (zvaigzni) primārajā membrānas glomerulonefrīta gadījumā. d) amiloīda-fibrilu (divu galvu bulta) subepitheliāla uzkrāšanās ar secīgu podocītu atslāņošanos (kā neatgriezeniska podocītu bojājuma pazīme) pacientam ar AL-amiloidozi (lambda). Visi elektronu mikrogrāfi ir parādīti ar 4000 × palielinājumu. Ieliktņi – atbilstošie gaismas mikroskopijas fotomikrogrāfi (40 ×/0,65 NA; skalas joslas izmērs: 50 μm (a,c,d) un 100 μm b) apakšpunktā); PAS krāsošana).
CD73 virsmas ekspresija ir saistīta ar podocītu traumu cilvēka nieru slimībā
Lai izpētītu, vai podocīti ekspresē CD73 fizioloģiskajā vidē, un lai novērtētu CDD73indifferentdences, kas saistītas arpodocītu bojājumiem, weperformim- munohistoķīmiskā CD73 ekspresijas analīze. Ultrastrukturālā analīze apstiprināja podocītu bojājumus kā citoskeletālus pārkāpumus ar vismaz pēdu procesa izzušanu (1. attēls). Mūsu negatīvās kontroles grupā bez podocītu bojājuma nevarēja noteikt būtisku CD73 podocītu ekspresiju, neskatoties uz iekšējās kontroles pozitivitāti (peritubulārie kapilāri), kas parasti iekrāso pozitīvu (2. attēls). No otras puses, podocītu bojājumu grupas (MCD, FSGS, MGN un amiloidoze) uzrādīja statistiski ļoti nozīmīgu podocītu CD73 (p) regulēšanu< 0.0001);="" the="" significant="" increase="" was="" consistent="" also="" when="" comparing="" single="" entities="" with="" negative="" controls="" (p="" at="" least="">< 0.001).="" interestingly,="" the="" extent="" of="" cd73="" upregulation="" tended="" to="" be="" lower="" in="" the="" mcd="" group,="" albeit="" significantly="" lower="" only="" in="" comparison="" with="" mgn="" samples="" (p="0.0043)" (figure="" 2).="" in="" podocyte="" damage="" groups,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" semiquantitative="" cd73="" score="" and="" proteinuria="" on="" binary="" (nephrotic/non-nephrotic)="" or="" quantitative="" (g/24="" h)="" level="" (spearman="" r="−" 0.0807,="" p="0.6302" and="" spearman="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," respectively;="" figure="" 3a).="" overall,="" there="" was="" no="" correlation="" between="" cd73="" score="" and="" creatinine="" level="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" figure="" 3b).="" additionally,="" we="" could="" not="" detectsignificant="" correlation="" between="" cd73="" expression="" and="" hypertension="" (spearman="" r="−" 0.03024,="" p="0.8384)" or="" diabetes="" mellitus="" (spearman="" r="−" 0.1784,="" p="">
No podocītiem atvasināta CD73 regulēšana cilvēka glomerulārās slimībās negatīvi korelē ar CCR2 receptora ekspresiju un nekorelē ar nefrīna un podocīna ekspresijuNovērtējot publicētos datus par makrofāga CCR2 ekspresijas pazemināšanos pēc CD73 pārmērīgas ekspresijas cilmes šūnu modelī, mēs izvirzījām hipotēzi, ka CD73 regulēšana podocītu bojājuma laikā apgriezti korelē ar iekaisuma CCR2 ekspresiju un veica imūnhistoķīmisko CCR2 analīzi. Kontroles grupā nevarēja noteikt CCR2 ekspresiju vai tikai vieglu izteiksmi bez būtiskām atšķirībām salīdzinājumā ar CD73 parakstu tajos pašos paraugos. Turpretī lielākajā daļā paraugu no podocītu bojājumu biopsijām bija vērojama galvenokārt ievērojama virsmas CCR2 (tomēr ar dažādu intensitāti) regulēšana, un tā parasti tika regulēta salīdzinājumā ar kontroles grupu (p = 0,0206; Papildu attēls S1). Slimības grupas šajā ziņā būtiski neatšķīrās viena no otras.
Mēs arī analizējām iespējamo korelāciju starp CD73 un CCR2 izteiksmes intensitāti. Patiešām, salīdzinot CD73 un CCR2 punktus no podocītu traumu biopsijas kohortas, var novērot izteiktu negatīvu korelāciju (Spearman r = − 0,4821, p = 0,0052), (4. attēls). Jāatzīmē, ka glomeruliem ar CD73 pozitīviem podocītiem bija tendence uzrādīja samazinātu CCR2 ekspresiju ne tikai podocītos, bet arī apkārtējās šūnās, piemēram, parietālās epitēlija šūnās (4. attēls). Apgriezto korelāciju apstiprināja, novērtējot CD73/CCR2 imūnfluorescējošu līdzkrāsošanu bojātos podocītos ar konfokālu mikroskopiju (Spearman r = − 0,4478, p = 0,0282), (5. attēls). Lai risinātu iespējamo saistību starp CD73 pozitivitāti un podocītiem raksturīgo olbaltumvielu ekspresijas (zudumu), mēs veicām papildu imūnfluo recentingus nefrīnam un podocīnam un novērtējām to ekspresijas modeli kontroles, MCD un FSGS grupās (6.a attēls), kā arī iekrāsošanu ar CD73 paraugos ar podocītu bojājumu (6.b–e attēls). Mēs nevarējām noteikt būtisku korelāciju starp podocīna vai nefrīna ekspresijas vidējo fluorescences intensitāti vienā pusē un vidējo CD73 izpausmi otrā pusē (n = 39, Spearman r = 0,212, p = 0,1948 podocīnam un n = 60, Spearman r = 0,01906, p = 0,8851 nefrīnam).
Diskusija
Mēs šeit pirmo reizi aprakstām CD73 izpausmi uz ievainoto podocītu virsmas cilvēkamNieru slimība. AnalizējotNierubiopsijas no pacientiem ar ievērojamiem podocītu bojājumiem, piemēram, MCD, FSGS, MGN un amiloidozes gadījumā, mēs ziņojam par ievērojamu podocītu CD73 ekspresijas regulēšanu katrā no šīm grupām, salīdzinot ar kontroliNieresneatkarīgi no podocītu bojājuma etioloģijas. Turklāt mēs ziņojam par apgrieztu korelāciju starp CD73 un CCR2 ekspresiju podocītu bojājumu grupu podocītiem. Ir pierādīts, ka paaugstināts podocītiem raksturīgs CCR2 mediē diabētunieru bojājumspelēm [ 23 ]. Turklāt ir ziņots, ka CCR2 blokāde FSGS Adriamicīna izraisītā peļu modelī samazina proteinūriju un glomerulārus ievainojumus [ 24 ]. Nesens Pētījums, ko veica Lee et al., izmantojot arī peles modeli, norāda, ka CCR2 izsīkums var uzlabot aptaukošanās izraisītu albuminūriju, bloķējot oksidatīvo stresu un lipīdu uzkrāšanos [ 25 ]. Patiešām, in vitro sistēmā, kas izmanto mezenhimālās cilmes šūnas (MSC) no peļu perikarda audiem, ir pierādīts, ka CD73 pārmērīgi ekspresējošie MSC diktē reparatīvos procesus, izmantojot pretiekaisuma aktivitāti, cita starpā arī tāpēc, ka tiek inhibētaCCR2 pozitīva makrofāga infiltrācija [ 13 ]. Tādējādi, ņemot vērā mūsu rezultātus un publicētos datus, ir vilinoši postulēt, ka CD73 ekspresija podocītos var aizsargātnieru bojājums, iespējams, izmantojot ceļus, kas vājina CCR2. CCR2 signalizācija ir cieši saistīta ar makrofāgu adhēziju un aktivāciju [ 26 , 27 ]. Tā kā makrofāgi var ietekmēt ar podocitopātiju saistīto patoģenēzinieru slimības(piemēram, primārais MGN, kur CD68 + , CCR2 + makrofāgu infiltrācija ir atzīta par nozīmīgu beigu stadijas rādītājuNieru mazspēja[ 28 ]), tālāki pētījumi par saistību starp monocītu/makrofāgu saturu, izcelsmi (infiltrācija pret rezidentu), aktivācijas profiliem (M1—proinflammatory vs. M2 — alternatīvi aktivizēts) un CD73 ekspresiju cilvēkamnieru slimībair nepieciešami, lai pārbaudītu mūsu rezultātu atbilstību iepriekšējiem datiem no peļu modeļiem.
Iekaisuma mikromilieu, ko var redzēt hipoksijas, išēmijas-reperfūzijas vai autoimūnu audu bojājumu gadījumā, vairākas šūnas atbrīvo purīnerģiskās signalizācijas sistēmas locekļus, galvenokārt iekaisuma ATP vai ADP formā [ 29 , 30 ]. Šajos apstākļos ekto-nukleotidāzeCD73 un tāproduktadenosīns ir svarīgifaktori, kas nodrošina reaģēšanas regulējumu un apklusināšanu. Dzīvnieku modeļos ir pierādīts, ka CD73 ir aizsargājošsniereišēmijas reperfūzijas traumas un tā trūkums izraisīja podocītu disfunkciju, izraisot autoimūnu iekaisumu unnieru slimība[ 21 , 31 ]. Citi peļu in vivo eksperimenti, izmantojot išēmijas reperfūzijas-ievainojumu, atklāja svarīgo CD73 pretiekaisuma ietekmi, ko izsaka proksimālās cauruļveida epitēlija šūnas, un tā izšķirošo iedarbībuniereaizsardzība diabētiskās nefropātijas laikā, izmantojot adenozīna–endotēlija Adora2ba receptoru signalizāciju [20,32]. Podocitopātijas ir visbiežāk sastopamā glomerulāru bojājumu grupa, kas izraisa olbaltumvielu uriju. MCD, "primārās" podocitopātijas prototips, ir visizplatītākais nefrotiskās proteīnūrijas cēlonis bērniem > 1 gada vecumā [ 33 , 34 ]. Pašreizējās hipotēzes par MCD patoģenēzi liecina par citokīnu un citu imūno mediatoru nozīmīgu lomu podocītu-glomerulārā pagraba membrānas integritātes traucējumos [ 35 – 38 ]. Neatbilstība starp redzamu izmaiņu neesamību gaismas mikroskopijā un smagu proteinūriju ir MCD pazīme; ultrastrukturāli pierādījumi par podocītu bojājumiem, ko izraisa elektronu mikroskopija, tādējādi ir conditio sine qua non mcd diagnozei līdz šim. Šis diagnostikas algoritms uzsver turpmāku pirmās līnijas diagnostikas rīku nozīmi šajā sakarā. CD73 ekspresijas izpēte, jo īpaši elektronu mikroskopijas ierobežotas pieejamības apstākļos, tādējādi varētu palīdzēt atšķirt glomerulārus (t.i., podocitopātiskus) un ekstraglomerulārus (piemēram, cauruļveida vai paraproteinēmiskus) proteinūrijas avotus. Salīdzinājums starp imūnhistoķīmiju un imūnfluorescenci mūsu pētījumā runātu par labu pēdējam.
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIERU SLIMĪBU
Vairākas publikācijas ir pārliecinoši dokumentējušas aberantu podocītu specifisko proteīnu izplatību un zudumu dažādāsnieru slimībaiestatījumus, kas ietver podocītu traumas un proteinūriju, kā nesen pārskatīts [ 39 ]. Mūsu pētījumā podocītu bojājumu grupā mēs nevarējām noteikt būtisku korelāciju starp podocīna/nefrīna fluorescences intensitāti un CD73 ekspresijas intensitāti. Tomēr specifiski ierobežojumi izslēdz podocīna/nefrīna patofizioloģisko interpretāciju salīdzinājumā ar CD73 statistikas datiem. Pirmkārt, fluorescences intensitātes novērtēšanai mēs izvēlējāmies podocītus, izmantojot konfokālās mikroskopijas tehnisko palielinājumu un izšķirtspējas spējas. Lai gan šie apstākļi viegli ļauj noteikt podocītu ķermeņus, galvenie procesi un jo īpaši pēdu procesi joprojām ir neskaidri, tāpēc, iespējams, nav atzīmēti / analizēti. Otrkārt, korelācija starp CD73 ekspresiju un podocītiem raksturīgiem proteīniem veselos glomerulos nav attaisnojama: lai gan podocīna un nefrīna novērtējums šajā līmenī būtu likumīgs (jo ir pamatoti pieņemt, ka neviena cita glomerulārās šūnas neizpauž šos proteīnus), to nevar apgalvot par CD73, ko daļēji izsaka vismaz endotēlija šūnas. Treškārt, vidējās fluorescences intensitātes novērtējums vien kā neatkarīgs podocītu traumas marķieris ir apšaubāms, jo tas neattiecas uz podocīna un nefrīna patoloģisko, granulēto izplatīšanās modeli glomerulusā, ko mēs varētu skaidri novērot 6. attēlā. Tāpēc mēs nelabprāt piedēvējam CD73-podocīna un CD73-nefrīna korelācijas neesamību mūsu analīzē uz šo marķieru atšķirīgiem molekulārajiem ceļiem. Ir vajadzīgi turpmāki podocītu in vitro un dzīvnieku pētījumi, lai izpētītu iespējamo iejaukšanos starp šīm signālveida kaskādēm.
Kopā ņemot, atzīstot nelielu parauga lielumu par mūsu pētījuma galveno ierobežojumu, mēs šeit demonstrējam pastāvīgu CD73 pārmērīgu ekspresiju ar ievainotiem podocītiem un iesakāmCD73 kā jaunu podocitopātijas diagnostikas marķieri. Minimālu izmaiņu gadījumā mūsu rezultāti var palīdzēt identificēt bojātos podocītus un izraisīt mazāk laika un izmaksu ziņā patērējošu diagnostikas procesu. Turklāt mūsu rezultāti atbilst publicētajiem datiem no peļu eksperimentālajām pieejām un liecina par aizsargājošu mijiedarbību starp CD73 un CCR2 cilvēkamnieru slimība. Ir nepieciešami turpmāki daudzcentru pētījumi ar lielākām pacientu grupām, lai pievērstos CD73 signalizācijas mehānismiem cilvēkamniereslimība un tās prognostiskā vērtība. Tāpat būtu nepieciešami lielāki kohortas skaitļi, lai noteiktu iespējamo korelāciju starp slimības smagumu un CD73 ekspresiju.
Materiāls un metodes
Studiju kohortaKopumā šajā pētījumā iekļautās 49 biopsijas no 49 dažādiem pacientiem tika diagnosticētas laikā no 2018. gada 1. janvāra līdz 2019. gada 31. decembrim Manheimas Universitātes slimnīcā, Heidelbergas Universitātē. Papildu atlases kritēriji bija reprezentatīva biopsija ar iespēju veikt trīskāršu diagnostiku ar imūnhistoķīmiju un EM, atbilstošu klīnisko informāciju, skaidru diagnozi un pietiekamu materiālu šim pētījumam. Visi pacienti bija pieauguši un kaukāzieši. Pētījumos tika iekļautas 39 biopsijas no pacientiem ar dažādu etioloģiju podocītu traumām (7 biopsijas no pacientiem ar primāru fokālu segmentālu glomerulosklerozi — FSGS; 8 no minimālas izmaiņas slimības — MCD; 12 no pacientiem ar membrānu glomerulonefrītu — MGN; 12 no pacientiem ar amiloidozi). Negatīvās kontroles bijanierebiopsijas no 10 pacientiem bez podocītu bojājumiem un bez proteinūrijas (6 pacientiem ar vieglu nefrosklerozi, 2 pacientiem ar intersticiālu nefrītu un 2 pacientiem bez patoloģiskām izmaiņām). Visas iepriekš minētās biopsijas tika iekļautas podocītu CD73 ekspresijas analīzē; attiecībā uz CCR2, pēc parafīna sekciju izslēgšanas ar nepietiekamu nesklerotisko glomerulu skaitu (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Histoloģija, imūnhistoķīmija, imunofluorescence un elektronu mikroskopija1 μ m sērijas sekcijas tika veiktas ar iestrādātu parafīnunierebiopsijas un iekrāsotas ar hematoksilīnu/eozīnu (H/E), periodisku skābes-šifu (PAS), Masson trīshroma iekrāsošanu, kā arī standarta rutīnas imūnhistoķīmiju diagnostikas nolūkos. Formalīna fiksēto parafīnu iegulto biopsiju imūnhisto- ķīmiskā un imunofluorescējošā krāsošana tika veikta manuāli, izmantojot trušu anti-cilvēka CD73 monoklonālo antivielu (klons D7F9A, Šūnu signalizācija, Frankfurte pie Mainas, Vācija) un peļu monoklonālo anti-cilvēka CCR2 antivielu (klons 7A7; Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste), trušu poliklonālās anti-cilvēka antivielas pret nefrīnu (Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) un trušu anti-cilvēka podocīna antivielas (Sigma, Saint Louis, MO, ASV) saskaņā ar ražotāja protokoliem. Visas biopsijas tika iekļautas podocītu CD73 ekspresijas analīzē ar imūnhistoķīmiju; CCR2 parafīna sekcijām ar nepietiekamu nesklerotisko glomerulu skaitu (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIERU DARBĪBU
Gaismas mikroskopija un morfometriskā analīzeAttēlu iegūšana un analīze tika veikta, izmantojot PreciPoint skenēšanas mikroskopu M8 ar Olympus PlanCN 40 × /0.65 mērķi un MicroPoint programmatūru (v.5 May 2016; PreciPoint, Freisinga, Vācija). Podocītu CD73 virsmas ekspresijas puskvantitīvs novērtējums imūnhistoķīmiskā iekrāsošanā tika novērtēts, izmantojot 0–3 punktu skalu (0—bez izteiksmes; 1–fokusa segmentālā pozitivitāte (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50% podocītu pozitīvi<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50% glomerulu). CD73 pozitīvie un negatīvie podocīti tika analizēti attiecībā uz CCR2 līdz ekspresiju, izmantojot uz intensitāti balstītu puskvantitīvu vērtēšanas sistēmu (0—bez ekspresijas, 1— vāja ekspresija, 2 — mērena ekspresija un 3 — spēcīga ekspresija, saskaņā ar biopsijas iekšējo CCR2 pozitīvo kontroli — endotēliju un imūnšūnu infiltrēšanos). Novērtēšanu neatkarīgi veica divi patologi (SP un ZP) aklā veidā.
Konfokālā mikroskopijaPodocītu CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) un kodolu (DAPI) attēli tika iegūti secīgi ar Olympus FV1000 motorizēto konfokālo mikroskopu, kas aprīkots ar HeNe 594 nm, Argon 488 nm un UV diodes 405 nmlaser un fotomultipplieru caurulēm (PMT), ko kontrolē FluoView programmatūra, izmantojot 60 × /1.35 UPlanSApo mērķi. 12 bitu attēli ar 512 × 512 pikseļu rāmjiem un pikseļu izmēru 0,41 μ m pārskatiem un 0,10 μ m augstai izšķirtspējai tika iegūti, saglabājot nemainīgus visus mikroskopa iestatījumus. Attēli tika tālāk pusautomātiski apstrādāti un analizēti, izmantojot iekšēji izstrādātu ImageJ makro (piekļuves datums: 2020. gada 15. decembris). Īsāk sakot, attēli tika segmentēti atsevišķiem podocītiem, tika piemērots slieksnis un vidējā intensitāte tika mērīta, statistiski analizēta un attēlota. Visi attēli tika apstrādāti ar pastāvīgiem iestatījumiem un parādīti ar vienu un to pašu pseidokrāsu, kas vienlīdz lineāri pielāgota atsevišķiem kanāliem sapludinātos attēlos
Statistiskā analīzeStatistiskāanalīzeswereperformusingGraphPadPrismv. 8.4.3software(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, ASV). Visi dati tiek paziņoti kā vidējie ± SEM. Statistiskās atšķirības tika aprēķinātas, izmantojot pārī savienotu vai nesalīdzinātu t-testu, kā arī Pearson korelācijas analīzi, kā norādīts.
