CD8 un CD4 T šūnu populācijas cilvēka nierēs
Mar 25, 2022
Abstract:Priekšvēsture: pierobežas vietās un iekšējos orgānos audu rezidentu atmiņas T šūnas (TRM) veicina imūno barjeru pret patogēniem, piemēram, vīrusiem, baktērijām, sēnītēm un vēzi. Tomēr informācija par šo šūnu klātbūtni un darbību cilvēka nierēs ir niecīga. Lai labāk izprastu T šūnu mediēto imunoloģisko aizsardzību šajā orgānā, mūsu mērķis bija noteikt veselos un alotransplantātos esošo CD8 un CD4 T šūnu fenotipiskos un funkcionālos aspektus.nieres audi. Metodes: izmantojot daudzkanālu līdzcilvēku citometriju, mēs novērtējām T šūnu fenotipu un funkciju veselos nieru audu paraugos (n=5) unnieresallotransplantāta audi (n=7) un salīdzināja šos aspektus ar T šūnām perifērajās asinīs no veselām kontrolēm (n=13). Rezultāti:Nieresaudu paraugos bija ievērojams daudzums CD8 un CD4 T šūnu. Atšķirībā no cirkulējošām šūnām,nieresT šūnas bieži ekspresēja CD69 un CD103 un biežāk aktīvi pārvietojās. Turklāt gandrīz visinieresT šūnas ekspresēja CXCR3 un bieži ekspresēja CXCR6, salīdzinot ar T šūnām cirkulācijā. Ievērojami,nieresT šūnas ražoja lielāku IFN daudzumu nekā cirkulējošās šūnas un bieži bija polifunkcionālas. Secinājums: funkcionālās T šūnas ar TRM raksturīgajām iezīmēm dzīvo cilvēkānieresaudus. Šīs šūnas biežāk darbojas ciklā un bieži ekspresē CXCR3 un CXCR6.
Atslēgvārdi:audu rezidenti limfocīti; T-šūnas; CD8; CD4; CD69; CD103; nieres; allografts
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIeru SLIMĪBU
1. IevadsPastāvīgās atmiņas T šūnas (TRM) saglabājas audos, lai nodrošinātu ilgstošu lokalizētu aizsardzību pret patogēniem. Atšķirībā no recirkulējošām T šūnām, TRM populācijas nevar noteikt perifērajās asinīs, un tās būtiski atšķiras no recirkulējošām T šūnu populācijām to fenotipa, funkcijas un metabolisma ziņā [1]. Patiešām, tas nav pārsteidzoši, ņemot vērā faktu, ka dažādas orgānu sistēmas, piemēram, plaušas, ir pakļautas lielākai dažādu patogēnu slodzei nekā cirkulācijai, kas parasti ir izolēta no ārpasaules [2].TkM aizturi audos saglabājas gadiem ilgi, un to veicina mehānismi, kas ietver sfingozīna-1-fosfāta receptoru1 (S1PR1)-sfingozīna 1-fosfāta (SP1) asi. S1PR1 ir receptors, ko ekspresē T šūnas, kas mediē izeju no sekundārajiem limfoīdiem orgāniem, saistoties ar bioaktīvo signalizācijas molekulu SP1, kas ir svarīgs T šūnu tirdzniecības starpnieks. Šo asi var pārtraukt CD69, ar membrānu saistīts c tipa lektīns, kas antagonizē S1PR1 ekspresiju, tādējādi veicinot aizturi. Turklāt pelēm S1PR1 ekspresiju inducē transkripcijas faktors Krüppel līdzīgais faktors 2 (KLF2), kas tika konstatēts kā pazemināts TRM, tādējādi arī kavējot limfocītu izvadīšanu [3]. Savukārt tika pierādīts, ka KLF2 pazemināšanos veicina Blimpl transkripcijas faktora homologs T šūnās (Hobit), kas tiek ekspresēts TpM specifiskā veidā peles T šūnās [4]. Turklāt daži TRM izsaka arī CD103 (integrīnu E), tādējādi TRM var identificēt, izmantojot CD69 un CD103 ekspresiju [1].
Lai gan zināšanas par TRM fenotipu un funkcijām pieaug par dažādiem cilvēka audiem, par šiem aspektiem ir maz zināmsnieres. Šeit T šūnas tiek pakļautas atšķirīgam patogēnu kopumam, piemēram, baktērijām, kas paceļas no apakšējo urīnceļu, un renotropiem vīrusiem, piemēram, poliomas vīrusa BK (BKPyV). Patiešām, mēs nesen aprakstījām, kā cilvēka nierēs ir T šūnu apakškopa, kas ekspresē CD69 un/vai CD103, starp kurām ir CD8 T šūnas, kas īpaši vērstas uz BKPyV proteīnu viriona proteīnu1 (VP1) un lielo T antigēna (LTAG) proteīnu [5]. Mēs un citi parādījām arī ar gļotādu saistītu invariantu T (MAIT) šūnu klātbūtni CD69/CD{7}}nieresaudi [6,7].
Lai labāk saprastu, kāda veida T šūnas veido lokalizētu imūnreakciju šajā orgānā, mēs izmantojām daudzkanālu plūsmas citometriju, lai izpētītu fenotipu un funkciju.nieresTRM, izolēti no donoranieresnieru transplantācijas saņēmēju (RTR) un veselu materiālunieresaudus, kas atrodas blakus nieru skaidrām šūnu karcinomām, lai redzētu, kā šīs populācijas salīdzina ar T šūnu populācijām cirkulācijā.Mēs atradām šo cilvēkunieresaudos ir ievērojams daudzums CD4 un CD8 T šūnu, kas ekspresē tikai CD69, CD69 un CD103 vai nevienu no šiem marķieriem. Mēs atklājām, ka CD69-CD103- šūnas atrodasnieresaudi būtiski atšķiras no T šūnām cirkulācijā un var būt TRM populācija, kurai trūkst kanonisko TRM marķieru. Turklāt mēs parādām, ka nieru T šūnas biežāk pārvietojas, salīdzinot ar asinīm, par ko liecina palielināta Ki-67 ekspresija. Mēs arī atklājām, ka CD8 un CD4 T šūnas atrodasnieresaudi gandrīz vienmēr ekspresē CXCR3 un bieži ekspresē CXCR6. Šie atklājumi norāda uz šo ķīmokīna receptoru lomu nieru rezidentu atmiņas T šūnu populāciju piesaistē un uzturēšanā.
2. Materiāli un metodes
2.1. Pacienti un paraugiParaugi tika iegūti no Amsterdamas UMC atrašanās vietas AMC Biobank Renal Diseases. Šajā Biobankā pacientu paraugi, piemēram, asins unnieresaudi, tiek savākti un uzglabāti no veselīga dzīvesveidanieresdonoriem un RTR, kas tiek ievēroti pirms un pēc nieres transplantācijas. Šis pētījums tika veikts saskaņā ar principiem, kas izklāstīti Helsinku un Stambulas deklarācijās, un visi dalībnieki sniedza rakstisku informētu piekrišanu pirms uzņemšanas Biobankā. Turklāt audu atlikumus no pacientiem, kuriem tika veikta audzēja nefrektomija (nieru audus, kas atrodas tālu no audzēja), ziedoja Patoloģijas nodaļa un uzglabāja arī Biobankā. Šie audi tika apstrādāti anonīmi saskaņā ar Nīderlandes Medicīnas zinātnisko biedrību federācijas rīcības kodeksu (Human Tissue and Medical Research: Code of Conduct for Responsible Use, 2011 www.federa.org).
2.2. Perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC)Asins paraugi tika iegūti no citomegalovīrusa (CMV) seronegatīvām veselām kontrolēm (dzīvāmnieresdonori pirms operācijas, n= 13). Šī pētījuma dalībnieku raksturojums ir parādīts 1. tabulā. PBMC tika izolēti no nātrija heparīna asinīm ar standarta blīvuma gradienta centrifugēšanu un pēc tam tika uzglabāti kriokonservēti līdz analīzes dienai.
2.3. Nieru audiVeseli nieru audu paraugi (n {0}}) tika iegūti no nierēm, kuras tika ķirurģiski izņemtas nieru šūnu karcinomas (tālu neaudzēju audu no nieres kontralaterālā pola) un transplantāta nieru audu (n {{1) dēļ. }}) tika iegūts no eksplantētiem nieru alotransplantātiem pēc transplantācijas neveiksmes. Šos paraugus attiecīgi dēvē par veseliem un transplantāta nieru paraugiem. Nieres garozas šķēles tika sasmalcinātas 1- mm kubos ar McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redinga, CA, ASV), pārnestas uz 50 ml mēģenēm un mazgātas ar aukstu PBS, līdz vairs nebija asiņu. bija redzami klāt, un supernatants bija dzidrs. Tika pievienota iepriekš uzkarsēta (37 grādi) gremošanas vide, 40 ml uz 10 g audu (IV tips (50 KU/mL) (Sigma Aldrich, Cvindrehta, Nīderlande), IV tipa kolagenāze (0,5 mg/mL) (Worthington Biochemical, Leikvuda, NJ, ASV), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 ul/ml teļa augļa serums (FCS, VWR International BV, Amsterdama, Nīderlande), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdama, Nīderlande), penicilīns-streptomicīns (Biochrom GMBH, Berlīne, Vācija) HBSS (Westburg BV, Leusden, Nīderlande)) un inkubēts kratītājā 20 minūtes 37 grādu temperatūrā. Siltā suspensija tika pārnesta uz C cauruli (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Vācija) un tika pakļauta M_spleen_04.01 programmai GentleMacs (Miltenyi). Gremošanas barotne tika dezaktivēta ar aukstu PBS un iegūtā šūnu suspensija tika izlaista caur šūnu sietiņu, lai iegūtu vienas šūnas suspensiju, kas tika pakļauta standarta blīvuma gradienta centrifugēšanai saskaņā ar ražotāja protokolu (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Norvēģija). ). Izolētās mononukleārās šūnas (nieru MNC) bijakriokonservēts līdz analīzes dienai IMDM, kas papildināts ar 20 procentiem FCS, 000036 tilp./tilp. procenti -merkaptoetanola, 5 procenti DMSO, penicilīnu un streptomicīnu.
2.4. Plūsmas citometrijaMērījumi tika veikti ar LSRFortessa plūsmas citometru (BD Biosciences). Katram paraugam tika analizēti 2 × 1 0 6 PBMC vai 0, 5 × 106 līdz 10 × 106 nieru MNC. Katras krāsošanas reakcijas tilpums bija attiecībā pret šūnu skaitu, un antivielu koncentrācija palika nemainīga. Šūnas tika inkubētas ar virsmas antivielām (papildu tabula S1) 30 minūtes 4 grādu temperatūrā tumsā. Mirušās šūnas tika izslēgtas, izmantojot fiksējamu dzīvotspējas krāsvielu eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, Sandjego, CA, ASV). Monoklonālās antivielas ar intracelulāriem mērķiem (papildu tabula S1) tika pievienotas pēc šūnu fiksācijas un permeabilizācijas, izmantojot FoxP3 / transkripcijas faktora krāsošanas komplektu (eBioscience Inc.). Tika ievērotas publicētās metodes plūsmas citometrijai un šūnu šķirošanai imunoloģiskiem nolūkiem [8]. Fenotipiskajai analīzei izmantotā vārtu noteikšanas stratēģija ir atrodama S1 papildu attēlā. Mēs iepriekš esam parādījuši, ka nevienu no analizētajiem marķieriem neietekmēja gremošanas metode, ko izmantoja nieru MNC izolēšanai [7].
Audu paraugu ierobežojumu dēļ paraugi no aizkaru paneļiem tika izslēgti. CD3 plus šūnu skaits, kas analizēts vienā paraugā veselos PBMC, veselos nieru MNC un TX nierēs, ir atrodams S3 attēlā. MNC paraugi tika analizēti tikai tad, ja tie satur vairāk nekā 50 procentus dzīvu šūnu limfocītos, kā to novērtēja dzīvotspējas dve, un CD69/CD103 bāzes T šūnu apakšgrupas tika tālāk raksturotas tikai tad, ja to kopējais šūnu skaits pārsniedza 50.
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru mazspēju
2.5. Stimulācijas testsPBMC un nieru MNC tika stimulēti, kā aprakstīts iepriekš [7, 9]. PBMC un nieru MNC tika atkausēti DNSāzes I klātbūtnē (200 KU/mL), nomazgāti un ļauti uz nakti atgūties neapstrādātās, apaļas dibena, 96-iedobju plāksnēs (Corning) barotnē (RPMI, kas papildināta ar 10% FCS un penicilīna-streptomicīna) koncentrācijā 20 × 106/mL (100 μL/iedobē).
Nākamajā rītā, lai stimulētu šūnas, tika pievienots forbola 12-miristāta 13-acetāts (PMA, 10 ng/mL; Sigma Aldrich) un jonomicīns (1 ug/ml; Sigma Aldrich). Tikai barotne tika pievienota kā negatīva kontrole. Visas inkubācijas tika veiktas barotnē CD28 (klons 15E8; 2 ug/mL), CD29 (klons TS 2/16; 1 ug/mL), brefeldīna A (10 ug/ml, Invitrogen) un GolgiStop ( BD Biosciences) gala tilpumā 200 ul 4 stundas 37 grādu temperatūrā un 5 procentu CO2.
Pēc tam šūnas 30 minūtes inkubēja ar virsmas antivielām (S2 papildu tabula). Mirušās šūnas tika izslēgtas, izmantojot fiksējamu dzīvotspējas krāsvielu eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, Sandjego, CA, ASV). Monoklonālās antivielas intracelulārai krāsošanai (S1 tabula) tika pievienotas pēc šūnu fiksācijas un permeabilizācijas, izmantojot Cytofix/Cytoperm reaģentu komplektu (BD Biosciences). Šūnas divas reizes mazgāja un analizēja ar LSRFortessa plūsmas citometru. Funkcionālajā analīzē izmantoto vārtu stratēģiju var atrast S2 papildu attēlā. Lai noteiktu katras T šūnu apakškopas polifunkcionalitāti, katras populācijas vidējais funkciju skaits tika aprēķināts, izmantojot šādu formulu: ((to šūnu procentuālā daļa, kas ražo 1 citokīnu]*1) plus ([to šūnu procentuālā daļa, kas ražo 2 citokīnus]*2) plus ([to šūnu procentuālā daļa, kas ražo 3 citokīnus]*3) plus ([to šūnu procentuālā daļa, kas ražo 4 citokīnus]*4) plus ([to šūnu procentuālā daļa, kas ražo visus 5 citokīnus]*5))/100.
2.6.Datu analīze
Dati tika analizēti, izmantojot FlowJo versiju 10 (FlowJo, Ashland, OR, ASV). Visas diagrammas un skaitļi tika izveidoti, izmantojot Graphpad Prism versiju 8.00 operētājsistēmai Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, ASV). Tā pati programma tika izmantota arī datu statistiskajai analīzei. Lai noteiktu nesapāroto paraugu nozīmīgumu, tika izmantots neparametrisks Mann-Whitney-U tests. Pāru paraugu salīdzināšanai tika izmantots Vilkoksona parakstītā ranga tests. p-vērtības<0.05 were="" considered="" statistically="">
3. Rezultāti
3.1. Atšķirīga CD8 un/vai CD4 ekspresija un audu rezistences marķieri, ko veic T šūnas veselos nieru audosPirmkārt, mēs salīdzinājām CD4 un CD8 ekspresiju ar CD3-pozitīvām T šūnām perifērajās asinīs ar šūnām, kas konstatētas veselos nieru audos. CD4-CD8 plus (CD8) T šūnas ievērojami biežāk tika konstatētas nieru audos nekā asinīs ((vidēji) 25 procenti pret 38 procentiem) (attēls la). Turpretim CD4*CD{{9} }(CD4)T šūnas tika konstatētas biežāk asinīs nekā nieru audos ((70 procenti pret 52 procentiem) la attēls). Kopumā veselos nieru audos CD4 T šūnas tika novērotas biežāk nekā CD8 T šūnas (1.b attēls).
Pēc tam mēs pētījām audu dzīvesvietas marķieru CD69 un CD103 ekspresiju CD8 un CD4-definētās T šūnu apakškopās. Kā gaidīts, perifēro asiņu šūnas praktiski neizpaudās CD69 un CD103 (1.c attēls). Veselos audos CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus un CD69-CD103 plus fenotipi tika izteikti ar 46 procentiem, 45 procentiem, Attiecīgi 6,6 procenti un 1,8 procenti CD8T šūnu, 61 procenti, 38 procenti, 0,44 procenti un 0,43 procenti CD4T šūnu (attēls lc). Visbeidzot, CD8, bet jo īpaši CD4 T šūnas tika atklātas ievērojamā skaitā vesela cilvēka nieru audos. Turklāt CD69 un CD103, audu dzīvesvietas marķieru, ekspresija tika atklāta galvenokārt starp T šūnām, kas atrodamas veselos audos, nevis asinīs.
3.2. Dažādi kopīgu apakškopu apzīmējošo marķieru izteiksmes modeļi pēc T šūnu veselības/nieru audiem
CD45RA, tirozīna fosfatāze, CCR7, ķīmokīna receptors, par kuru zināms, ka tie veicina T šūnu apriti uz sekundāriem limfoīdiem orgāniem, un CD28 un CD27, abi kostimulējošie receptori, kas ir spēcīgi iesaistīti T šūnu aktivācijā, ir visi marķieri, ko tradicionāli izmanto funkcionālo T šūnu apakškopu identificēšanai J1{ {53}},1l. Mēs vēlējāmies izpētīt, cik lielā mērā šo apakšgrupu sadalījums asinīs atšķiras no sadalījuma nieru audos. Kā gaidīts, lielākās cirkulācijā konstatētās CD8 T šūnu apakšgrupas (ti, tās, kas attiecas uz 5 procentiem vai vairāk no kopējās populācijas) bija tās, kurām bija CD45RA plus CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (naivas T šūnas vai TN, ( mediāna) 13 procenti), CD45RA-CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (centrālās atmiņas Tšūnas vai TcM, 6 procenti), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27 plus (TEv1,3{56}} procenti), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27-(Tau2,10 procenti), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 procenti) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 procenti) un CD45RA plus CCR7-CD28-CD27-(TEMRA) ,10 procenti) fenotips. Veselos audos gandrīz neviena (0,6 procenti) CD8 T šūnu ar TN fenotipu netika atklāta, un tikai dažām (0,8 procentiem) bija Tax fenotips. Turpretim veselos nieru audos konstatētās CD8 T šūnas sastāvēja no ievērojama TEv1-(22 procenti), TEM2-(12 procenti), Tpx3-(18 procenti), TEx{ {65}} (23 procenti) un TEyRA (11 procenti) T šūnu populācijas (attēls ld un attēls S4). Aplūkojot CD4 T šūnas asinīs, lielākās populācijas bija tās, kurām bija Ty-(35 procenti), TcM (25 procenti), TEMl-(16 procenti), TFM2-(9 procenti) un populācija ar citādi nenorādītu CD45RAtCCR7-CD28 plus CD27* fenotipu (0,4 procenti) (1.d attēls un S4 attēls). Veselos nieru audos dažas CD4 T šūnas izteica TN- (3 procenti) vai TcM. -(3 procenti) fenotips. Tā vietā veselos audos tika atklāts ievērojams skaits šūnu ar TEM1-(22 procenti), TEM2-(40 procenti) vai TEM4 (14 procenti) fenotipu (attēls ld un attēls S4). . Noslēgumā jāsaka, ka CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definēto CD8 un CD4 T šūnu apakškopu sadalījums asinīs un veselos nieru audos būtiski atšķiras.
3.3. CD8 un CD4 T šūnas veselos cilvēka nieres audos biežāk sastāv no aktīvi ciklējošām šūnāmPēc tam mēs pētījām, vai pastāv atšķirības citotoksiskā efektora-atmiņas profilam raksturīgo marķieru ekspresijā starp CD8 un CD4 T šūnu populācijām asinīs un nieru audos. Pirmkārt, mēs apskatījām T-box transkripcijas faktoru T-bet un eomeso-dermin (Eomes) izteiksmi. Šie transkripcijas regulatori ir tieši iesaistīti akūtās fāzes efektoršūnu ģenerēšanā, tādu molekulu kā interferona-y un granzīma B ekspresijas inducēšanā un sekundāro atmiņas reakciju veidošanā. Kā gaidīts, T-bet ekspresija bija bieži sastopama starp asinsrites CD8 T šūnām (54 procenti), savukārt asinsrites CD4 T šūnas reti izteica šo transkripcijas faktoru (13 procenti). Interesanti, ka CD4 T šūnām T-bet ekspresija bija ievērojami augstāka starp T šūnām, kas konstatētas veselos nieru audos nekā cirkulācijā (53 procenti pret 13 procentiem). Dažas izpausmes bieži tika konstatētas arī asinsrites CD8 T šūnās (59 procenti), bet atkal reti sastopamas asinsrites CD4 T šūnās (15 procenti). Tomēr Eomes ekspresija bija biežāka starp CD4 T šūnām nieru audos (32 procenti) nekā asinīs (2.a, b attēls).
Pēc tam mēs pētījām granzīma B, serīna proteāzes, ekspresiju, kas, kā zināms, mediē apoptozi pēc citotoksisko T šūnu injekcijas citoplazmā. Saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem T-bet un granzīma B ekspresija tika konstatēta ievērojamā skaitā cirkulējošās CD8 T šūnās (28 procenti). Tomēr tā ekspresija bija reta starp cirkulējošām CD4 T šūnām (1 procents). CD8 T šūnām granzīma B ekspresija nieru audos un cirkulējošās populācijās bija līdzīga (28 procenti ys.23 procenti) (2.c attēls). Interesanti, ka nieru CD4 T šūnās konstatētās augstākās T-bet un Eomes ekspresijas frekvences neatbilda augstākam granzīma B ekspresijas biežumam šajā nodalījumā (5 procenti). Pēc tam mēs apskatījām KLRGl ekspresiju, koinhibējošu receptoru, ko, kā zināms, galvenokārt ekspresē citotoksiskas akūtās fāzes efektoršūnas un efektoratmiņas šūnas. KLRG1 bieži ekspresēja cirkulējošās CD8 T šūnas (54 procenti), bet ne CD4 T šūnas ( 10 procenti). Netika konstatētas atšķirības starp anatomiskajiem nodalījumiem KLRG1l ekspresijā CD8 vai CD4 T šūnām. Visbeidzot, mēs izpētījām Ki-67 izteiksmi — marķieri, kas apzīmē aktīvi cikliskas šūnas. Saskaņā ar iepriekšējiem novērojumiem Ki-67 ekspresija starp cirkulējošām CD8 un CD4 T šūnām bija reta (attiecīgi 1 procents un 2 procenti). Interesanti, ka starp CD8 T šūnām, bet īpaši starp CD4 T šūnām, Ki-67 ekspresija ievērojami biežāk tika konstatēta T šūnās nieru audos (attiecīgi 3 procenti un 11 procenti) (2.e attēls). Noslēgumā jāsaka, ka CD4 T šūnas tika konstatētas veselā cilvēka nieru audos, bet ne CD8 T šūnas šajā nodalījumā, biežāk izteiktas T-bet un Homes. Tomēr tas neizraisīja biežāku granzīma B ekspresiju nieru CD4 T šūnās. Turklāt, lai gan kopējais ciklisko šūnu skaits bija zems, nieru audi saturēja ievērojami aktīvāk cikliskās CD8 un CD4 T šūnas nekā cirkulācija.
3.4. CD8 un CD4 T šūnas veselos nieres audos ir gandrīz visas CXCR{4}}pozīcijasPēc tam mēs meklējām atšķirības citu marķieru ekspresijā, kas raksturīgas ne uzreiz citotoksisku atmiņas šūnu cirkulējošām populācijām, kā parādīts iepriekš cirkulējošām T šūnu populācijām. Vispirms mēs apskatījām IL-7R ekspresiju, kas galvenokārt izpaužas naivās un agrīni diferencētās atmiņas šūnās asinsritē, kur tā ir iesaistīta homeostatiskās proliferācijas uzturēšanā [10,12,13]. Perifērajās asinīs IL{5}Ra bieži ekspresēja CD8 T šūnas (84 procenti) un CD4 T šūnas (98 procenti). CD8 un CD4 T šūnas veselos nieru audos izteica šo marķieri ievērojami retāk nekā cirkulējošās T šūnas (attiecīgi 71 procenti un 76 procenti) (2f attēls).
Pēc tam mēs pētījām dažādu citu ķīmokīnu receptoru ekspresiju Interesanti, ka CXCR3, ķīmokīna receptors, kas iesaistīts Tšūnu pārvietošanā uz iekaisušiem audiem[14-17], tika ekspresēts ar ārkārtīgi lielu CD8 un CD4 T šūnu skaitu nieru audos (99). attiecīgi procenti un 91 procents), un ievērojami retāk ar cirkulējošām T šūnām (attiecīgi 58 procenti un 26 procenti) (2.g attēls). Visbeidzot, mēs noteicām CXCR6 ekspresiju, kas, kā zināms, ir saistīta ar TRM populāciju veidošanu [18-22]. Kamēr CXCR6 ekspresēja tikai neliela cirkulējošo CD8 T šūnu populācija (16 procenti), un praktiski ne cirkulējošās CD4 T šūnas. ievērojami lielāka CD8 un CD4 T šūnu daļa nieru audos izteica šo molekulu (attiecīgi 40 procenti un 40 procenti) (2.h attēls). Noslēgumā jāsaka, ka marķieri, kas parasti saistīti ar ne uzreiz diferencētu stāvokli cirkulācijā, iespējams,-7Ra, CCR7, CD28 un CD27, nieru CD8 un T šūnās tika ekspresēti ievērojami retāk, salīdzinot ar tiem, kas atrodas asinīs. Turpretī nieru T šūnas biežāk ekspresēja CXCR6 un gandrīz vienmēr ekspresēja CXCR3.
3.5. Atšķirības fenotipā starp veselām nierēm un alotransplantāta T šūnām ir minimālasTālāk mēs vēlējāmies izpētīt, vai šie atradumi saglabājās audos no transplantētiem nieru alotransplantātiem, kas iegūti dažādām klīniskām indikācijām (1.Attiecībā uz CD8 un CD4 T šūnu skaitu veselos un alotransplantāta audos atšķirības netika novērotas (3.a attēls). Tomēr mēs pamanījām nenozīmīgu tendenci, ka veselos audos ir vairāk CD4T šūnu un mazāk CD8T šūnu nekā allotransplantāta audos (3.b attēls). Turklāt, aplūkojot CD69/CD103 ekspresiju un CD45RA/CCR7/CD28/CD{11}}definētās apakškopas, CD69/CD{13}} vai CD45RA/CCR7/CD28/CD{17}} tika atzīmētas noteiktas apakškopas neatkarīgi no CD8 / CD4 fenotipa (3.d attēls un S5 attēls). Pārbaudot citotoksiskām cirkulējošām T šūnām raksturīgāko marķieru ekspresijas frekvences, mēs neatradām atšķirības T-bet, KLRG1 vai granzīma B ekspresijā starp veselām nieru vai allotransplantāta T šūnām (3.a, gh attēls). Mēs atklājām, ka Eomes ekspresija tika novērota retāk allotransplantāta audu CD4 T šūnās nekā veselu audu T šūnās (3f attēls). Atšķirības citu marķieru izteiksmē netika novērotas. (Attēls 3-l un attēls S5b-d). Visbeidzot, izņemot zemāku Eomes ekspresijas biežumu allotransplantāta CD4 T šūnās, šūnu populācijas pētījuma populācijās neatšķīrās.
3.6. CD69-CD103-T šūnas nieru audos atšķiras no cirkulējošām šūnāmŅemot vērā līdzīgo CD8 un CD4 T šūnu fenotipisko sastāvu, kas atrodams veselos nieru audos un nieru transplantāta audos, mēs apkopojām abu pētījumu grupu datus, lai turpinātu pētīt šo šūnu īpašības saskaņā ar CD69 un CD103 ekspresiju. Tā kā CD69-CD103 plus šūnas vienmēr tika noteiktas ļoti zemās frekvencēs (<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Pirmkārt, mēs pētījām atšķirības šajās apakšgrupās saskaņā ar CD69/CD103 koekspresiju nieru T šūnu populācijās (4. attēls un S6. attēls). Interesanti, ka gan CD8, gan CD4 T šūnām tika novērotas būtiskas atšķirības CD45RA/CCR7/CD28/CD{10}}definēto apakškopu sadalījumā starp CD69-CD103-, CD69 un CD{ {14}}un CD69*CD103* apakškopas. CD8 T šūnām CD69-CD103-šūnas saturēja ievērojamu TeyRA šūnu populāciju (21 procents), kas bija daudz mazāka starp CD69 plus CD103- un CD69 plus CD103 apakškopām (5,8). procenti un 2,2 procenti, attiecīgi). Tā vietā šajās pēdējās populācijās bija daudz lielākas TEy3 (attiecīgi 13 procenti, 30 procenti un 32 procenti) un TEy4 (attiecīgi 8 procenti, 19 procenti un 33 procenti) apakšpopulācijas. CD4 T šūnām dažas TEyRA šūnas tika novērotas CD69-CD103-, CD69*CD103- un CD69 plus CD103* apakšgrupās (2,6 procenti, 0 procenti un 1,7 procenti, attiecīgi). Tā vietā šajās šūnās bija lielas TFw1 (attiecīgi 26 procenti, 24 procenti un 10 procenti) un TEy2 (attiecīgi 30 procenti, 46 procenti un 27 %) apakšpopulācijas. Starp CD69 un CD{58}}un jo īpaši CD69*CD103*šūnu vidū tika novērota daudz lielāka TEM4 apakšpopulācija (attiecīgi 6 procenti, 11 procenti un 34 procenti).
Ņemot vērā šīs atšķirības un iepriekšējo novērojumu, ka nieru T šūnu populācijas gandrīz nesatur TN un TcM šūnas, mēs tālāk pētījām nieru audos atrastās CD{0}}CD103- šūnas, lai noteiktu, cik lielā mērā šīs šūnas bija ne tikai cirkulējošās šūnas, kas iet cauri nieru cirkulācijai. Lai to izdarītu, mēs salīdzinājām šīs šūnas ar cirkulējošām šūnām. CD69-CD103~šūnas nieru audos būtiski atšķīrās no cirkulācijas šūnām: T-bet, Ki-67 un CXCR3 biežāk ekspresēja nieru T šūnas neatkarīgi no CD8/CD4 fenotipa (attēls). 5.a-c). Turpretim IL-7R, CCR7, CD28 un CD27 nieres T šūnas CD69-CD103- ekspresēja ievērojami retāk neatkarīgi no CD8/CD4 fenotipa (5. d attēls). g). CD69-CD103-CD4 T šūnas nieru audos ekspresēja KLRG1 ievērojami biežāk nekā asinīs un CD69-CD103-CD8 T šūnas nieru audos Eomes ekspresēja ievērojami biežāk nekā asinīs.
Tālāk mēs vēlējāmies redzēt, kā CD69 un CD103 koekspresija ietekmēja funkcionālā potenciāla marķierus. Pirmkārt, mēs apskatījām marķierus, kas saistīti ar citotoksisku potenciālu. Lai gan tika novērotas atšķirības starp atsevišķām apakšpopulācijām, CD8 T šūnās netika novēroti nekādi T-bet un Eomes modeļi, kad CD69 vai CD103 tika ekspresēti (6.a, b attēls). Turpretim CD4 T šūnās šie transkripcijas faktori palielinājās kopā ar CD69 un CD103 koekspresija (6.a, b attēls). Aplūkojot KLRG1, mēs pamanījām, ka CD8 T šūnām KLRG1 ekspresija samazinājās kopā ar CD69 / CD103 koekspresiju. CD4 T šūnām tika novērota līdzīga tendence. Tomēr šeit tikai CD{17}}CD103-šūnas ekspresēja KLRG1 ar lielāku frekvenci nekā CD69 plus CD103- un CD69 plus CD103* šūnas (6.c attēls). Granzīma B ekspresijas frekvences arī samazinājās kopā ar audu dzīvesvietas marķieriem, un tā ekspresijas biežums bija viszemākais starp CD69 un CD103 * šūnām gan CD8, gan CD4 T šūnās (6.d attēls). Ki-67 ekspresija, kas bija augstāka starp nieru T šūnām, salīdzinot ar T šūnām asinīs, neatšķīrās atkarībā no CD69 vai CD103 koekspresijas (6.e attēls).
Pēc tam mēs pētījām marķierus, kas parasti ir saistīti ar necitotoksisku atmiņas profilu saskaņā ar CD69 / CD103 koekspresiju. IL-7Ra, CCR7 un CD28 ekspresija bija visaugstākā CD69-CD103- populācijās, ar tendenci noteikt ekspresiju kopā ar CD69/CD103 koekspresiju (6.f-h attēls). ). Pēc tam mēs apskatījām CXCR3 un CXCR6 izteiksmi. Abus ķemokīna receptorus visbiežāk ekspresēja CD69tCD103t šūnas neatkarīgi no CD8 / CD4 fenotipa, un tiem bija tendence pieaugt ar CD69 / CD103 koekspresiju. Tikai CXCR6 šī tendence bija statistiski nozīmīga, ietekmējot gan CD8, gan CD4 Tells (6.j, k attēls). Noslēgumā jāsaka, ka nieru audos esošās CD69-CD103- šūnas būtiski atšķiras no šūnām cirkulācijā un var attiekties uz citu TBv populāciju, kam nav raksturīga CD69 vai CD103 ekspresija. Vienīgais marķieris, kas konsekventi atšķīrās neatkarīgi no CD8/CD4 fenotipa CD69 un CD103 koekspresijas ziņā, bija CXCR6.
3.7.T-šūnas nieru audos biežāk ražo interferonu nekā T-šūnas asinīsVisbeidzot, mēs pētījām citokīnu ražošanas jaudu, izmantojot CD8/CD{1}}definētas T šūnu populācijas nieru audos. Pirmkārt, mēs salīdzinājām interferona-y (IFNy), audzēja nekrozes faktora (TNF), interleikīna-2 (IL-2), granulocītu-makrofāgu koloniju stimulējošā faktora (GM-CSF) veidošanos. IL-17, ko izraisa stimulētas CD8/CD4-definētas T šūnu populācijas, kas atrodamas asinīs, līdz tām, kas atrodas veselos nieru audos (7.a–e attēls). Interesanti, ka tikai IFNy konsekventi ekspresēja lielāks T šūnu īpatsvars veselos nieru audos, salīdzinot ar T šūnām asinīs, neatkarīgi no CD8 / CD4 fenotipa (7.a attēls). Atšķirības tika pamanītas arī atsevišķu apakškopu līmenī. Konkrēti, TNF un GM-CSF biežāk ražoja CD4 T šūnas nieru audos (7b.c attēls). Attiecībā uz polifunkcionalitāti (ti, vienlaikus ražoto citokīnu skaitu), tika konstatēts, ka CD4 T šūnas nieru audos ir polifunkcionālākas nekā CD4 šūnas asinīs (7.f attēls).
Tālāk mēs apskatījām citokīnu ražošanas jaudas atšķirības starp stimulētām T šūnām no veseliem un alotransplantāta audiem. Starp T šūnām no veseliem vai alotransplantāta nieru audiem netika konstatētas atšķirības atsevišķu citokīnu ražošanā vai vairākos vienlaikus ražotos citokīnās (S7 attēls). Tā kā CD69 tiek ekspresēts, stimulējot T šūnas, mēs pētījām tikai atšķirību starp CD103-negatīvajām un CD103-, kas ekspresē CD4 un CD8 T šūnām (7.g attēls). Salīdzinot CD4 un CD8 T šūnas, kas ekspresē CD103 ar šūnām, kas neizpauž CD103 nieru audos, mēs ievērojām, ka CD8 un CD4 CD103 šūnas ekspresē vairāk IFNy nekā CD{15}} šūnas (7.g attēls). Turklāt, lai gan IL-1ZA producējošās šūnas bija zems starp CD103 plus CD8 un CD4 T šūnām nieru audos, tās konsekventi tika konstatētas šajā populācijā biežāk nekā CD103- populācijā. Visbeidzot, vairāk T' šūnu nieru audos ražoja IFNy, salīdzinot ar cirkulējošām T šūnām, neatkarīgi no CD8 / CD4 fenotipa. Patiešām, vislielākais IFNy veidojošo šūnu procentuālais daudzums tika konstatēts starp CD103-izpaužošām CD4 un CD8 nierēm iegūtajām T-šūnām. Turklāt T šūnas nieru allotransplantātos attiecībā uz šiem parametriem neatšķīrās no tām, kas atrodas veselos nieru audos.
4. Diskusija
Šajā pētījumā mēs apskatījām T šūnu apakškopu daudzveidību atbilstoši CD8 un CD4 ekspresijai un audu dzīvesvietas marķieriem CD69 un CD103 cilvēka nierēs un salīdzinājām ar tām ar asinīm. Nieru audos patiešām tika atklāts ievērojams CD8 un CD4 T šūnu skaits. Turklāt šīs T šūnas nierēs saturēja ievērojamu skaitu CD69*CD{8}}šūnu. Tika atklātas arī CD69 plus CD103 plus šūnas, bet pārsvarā starp CD8 T šūnām un praktiski nebija CD4 T šūnās. Līdzīgs konstatējums iepriekš attiecās uz plaušu TRM [23]. Kā gaidīts, šādas CD69 un CD{15}}izpaušanas populācijas gandrīz nebija apgrozībā. Pārsteidzoša atšķirība, salīdzinot T šūnas nierēs ar asinīs esošajām šūnām, attiecās uz atšķirīgu tradicionālo CD45RA/CCR7/CD28/CD{19}}definēto apakškopu sadalījumu. Interesanti, ka CD28 ekspresija biežāk netika izteikta, kad T šūnas vienlaikus ekspresēja CD69 atsevišķi vai kombinācijā ar CD103. Teorētiski tam vajadzētu padarīt šīs populācijas mazāk jutīgas pret CD80 un CD kostimulējošiem signāliem86. Citas atšķirības bija saistītas ar augstāku CXCR3, CXCR6 un Ki{27}} izteiksmes biežumu. Turklāt nieru T šūnas biežāk saturēja IFNy ražojošas šūnas un bieži bija polifunkcionālas. Patiešām, nierēs CD103 plus Tpys saturēja vairāk IFN veidojošo šūnu nekā to CD{31}}negatīvie kolēģi. Turklāt CD103T šūnas biežāk ražoja IL-17, lai gan tas attiecās uz nelielu populāciju.
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru INFEKCIJU
Attiecībā uz biežāku CXCR3 ekspresiju ar CD8 un CD4 nieru T šūnām, iepriekš tika pierādīts, ka CXCR3/CXCL10 ass ir iesaistīta TpM populāciju veidošanā ādā, aknās un limfoīdos audos [24-28]. Turklāt tas ir iesaistīts cilvēku tirdzniecībā ar saspringto epitēliju un iekaisumiem vispārīgā nozīmē [14-17]. Ņemot vērā augsto CXCR3 biežumu starp šīm T šūnām veselos nieru audos, šķiet, ka CXCR3 ir saistīts arī ar TRM homeostāzi nieru audos, un tas var nebūt saistīts ar iekaisumu vai bīstamības signāliem. Attiecībā uz CXCR6 jau ir pierādīts, ka CXCR6/CXCL16 ass ir būtiska Tpst pārvietošanai uz dažādiem nodalījumiem, piemēram, plaušām, ādu, aknām un smadzenēm, un tā var attiekties uz universālu mehānismu, kas ir būtisks TRM virzīšanai un noturēšanai uz un audos, arī attiecībā uz TRM cilvēka nieru audos [18-22].
Farbers un kolēģi ir plaši raksturojuši un salīdzinājuši CD8 un CD4 TRM populācijas, kas dzīvo dažādos cilvēka audu veidos, kas iegūti no orgānu donoriem. Viņi aprakstīja, kā TRM populācijas plaušās, liesā, tievajās zarnās un dažādos sekundāros limfoīdos audos atšķiras attiecībā uz transkriptu, kā arī dažādu proteīnu, tostarp citokīnu, ekspresiju, kas pētīti pašreizējā pētījumā [29-31. Tomēr šie pētījumi neietvēra TRM populācijas cilvēka nierēs un datus par to
priekšmeta ir maz. Mēs iepriekš parādījām, ka alotransplantāta nierēs ir nosakāmas CD8 T šūnas, kuru mērķauditorija ir poliomas vīrusa BK VP1 un LTAG proteīni, kas iegūti no vīrusa, kam ir spēcīgs tropisms nieru epitēlija šūnām. Šīs vīrusam specifiskās T šūnas ekspresēja CD69 un CD103 lielākā skaitā nekā to kolēģi, kas konstatēti to pašu pacientu asinsritē. Turklāt šīs T šūnas parasti izteica CD45RA-CD27-granzīma B negatīvo fenotipu[5]. Vēlāk citi ir ziņojuši arī par TRM populācijām cilvēka nieru audos, kas iegūti no transplantācijas nefrektomijas. Šajā publikācijā autori ziņo, ka T šūnas šajos audos galvenokārt attiecās uz CD8 T šūnām [321. Tā vietā mēs atklājām, ka CD4 T šūnas faktiski veidoja lielāko T šūnu apakškopu. Tomēr mēs arī atklājām, ka līdzsvars mainījās, lai gan ne būtiski, uz lielāku CD8 T šūnu skaitu allotransplantāta audos, salīdzinot ar veseliem nieru audiem. Tādējādi šo neatbilstību var izskaidrot ar citu pētījumu grupu, un var gadīties, ka veselības jomā imunoloģiskā aizsardzība ir vairāk vērsta uz ārpusšūnu draudiem, piemēram, baktērijām, salīdzinot ar intracelulāriem draudiem, piemēram, vīrusiem un vēzi saimniekiem ar novājinātu imūnsistēmu. Mēs neatradām citas atšķirības pētītajos marķieros starp veselām nierēm un alotransplantāta T šūnām. Tomēr, lai noteiktu, vai tas tā patiešām ir, ir jāizmanto turpmāki pētījumi, izmantojot metodes ar plašāku skatījumu uz transkriptiem, piemēram, RNS sekvencēšanu vai proteomu, piemēram, masas spektrometriju.
Turklāt de Leur et al. aprakstiet, kā TRM nierēs bieži ekspresēja granzīmu B, kamēr mēs atklājām tikai mazus granzīma B daudzumus gan veselos, gan alotransplantāta nieru audos [32]. Tomēr mēs atklājām ievērojamas T-bet un Eomes ekspresējošas T šūnas nieru audos, kas cirkulējošās T šūnu populācijās parasti patiešām ir saistītas ar augstāku granzīma B ekspresiju [10]. Lai gan pēdējais var nebūt pārsteidzošs, ņemot vērā faktu, ka granzīma B ekspresiju arī tieši inducē T-bet [33, 34], šī saistība starp nieru T šūnām pašreizējā pētījumā nebija acīmredzama. Kā mēs un citi esam parādījuši, ka arī cilvēka plaušu, smadzeņu un ādas TRM [25,26,3536], kā arī no nierēm iegūtiem audiem MAIT ælls 【6,7】 ir maz granzīma B. saturs, lai gan bieži vien pauž ievērojamu daudzumu T-bet un Eomes, tā varētu būt (cilvēka) TkM kopīga iezīme. Turklāt tika novērots, ka plaušās TRM granzīma B ekspresija pēc stimulācijas strauji tiek regulēta [35l, kas liecina, ka tas varētu notikt arī citos TeM. Šeit autori izvirzīja hipotēzi, ka šāda "slēpta citotoksicitāte kalpo, lai aizsargātu audu strukturālo integritāti no citotoksisko T šūnu bojājumiem.
Noslēgumā mēs parādām, ka T cll nieru audos atrodas ievērojamā skaitā un ietver populācijas, kas bieži ekspresē CD69 plus un CD103 plus , molekulas, ar kurām T šūnas pielīp pie audiem un saglabājas tajos. Tomēr šķiet, ka nieru audos esošās CD69-CD103- T šūnas atšķiras no cirkulējošām T šūnām un var attiekties uz citu atšķirīgu TiM populāciju, kas, iespējams, saglabājas nierēs, izmantojot citus atklātus mehānismus. Vēl viena iespēja varētu būt, ka šīs CD69-CD103-T šūnas attiecas uz populāciju, kas tikai nesen izgāja no asinsrites, un Hejs tikai īslaicīgi ieguva jaunas fenotipiskās pazīmes mijiedarbības ar nieru mikrovidi dēļ. Lai noskaidrotu šīs iespējas, ir nepieciešama turpmāka šīs populācijas izpēte. Turklāt. CD8 un CD4 nieru T šūnas bieži aktīvi pārvietojās un biežāk ekspresēja CXCR6. Turklāt CD8 un CD4 populācijas izspieda īpaši augstu CXCR3 ekspresiju, spēcīgi ietekmējot šos ķemokīna receptorus, kā arī CXCR6 TRM uzkrāšanos un noturību cilvēka nierēs. Tāpēc ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai uzlabotu mūsu tēlu par Tpv populācijām cilvēka nierēs. Neskatoties uz to, šeit sniegtie atklājumi ir stabils pirmais solis, lai detalizētāk raksturotu T šūnu populācijas nieru audos un to lomu veselībā un slimībās.
