Izmaiņas cilvēka eritrocītu membrānā, kas pakļauta Uncaria Tomentosa ūdens un etanola ekstraktiem

Kontaktpersona:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakts: Uncaria tomentosa (Willd.)DC ir Dienvidamerikas un Centrālamerikas koksnes alpīnistu suga, ko izmanto astmas, reimatisma, hipertensijas terapijā un asins attīrīšanā. Mūsu iepriekšējais pētījums parādīja, ka U.tomentosaekstraktiizmainīta cilvēka eritrocītu forma, kas varētu būt saistīts ar ekstraktos esošo savienojumu iekļaušanu eritrocītu membrānā. Šī pētījuma mērķis bija noteikt, kā UI.tomentosa ekstraktos esošie savienojumi iekļaujas cilvēka eritrocītu membrānā. Pētījumā novērtēta U. tomentose lapu un mizas ūdens un etanola ekstraktu ietekme uz cilvēka eritrocītu osmotisko pretestību, eritrocītu iekšpuses viskozitāti un eritrocītu plazmas membrānas plūstamību. Cilvēkseritrocītitika inkubēti ar pētītajiem ekstraktiem koncentrācijās 100 250 un 500 ug/mL 2,5 un 24 stundas. Visi pārbaudītie ekstrakti izraisīja eritrocītu membrānas plūstamības samazināšanos un palielināja eritrocītu osmotisko jutību. Etanola ekstrakti no mizas un lapām palielināja eritrocītu viskozitāti. Lielākās pētāmo parametru izmaiņas tika novērotas šūnās, kas inkubētas ar mizas etanola ekstraktu. Mēs uzskatām, ka savienojumi no U. tomentosa ekstrakta galvenokārt iekļaujas ārējā, hidrofilā eritrocītu membrānas monoslānī, tādējādi aizsargājot eritrocītus pret oksidatīvā stresa nelabvēlīgo ietekmi.

Atslēgvārdi: eritrocīti; membrānas plūstamība; osmotiskā pretestība; Uncaria tomentosa; ekstrakti

Noklikšķiniet, lai uzzinātu vairāk informācijas

1. Ievads

Uncaria tomentosaekstraktiTos parasti izmanto, lai atbalstītu dažādu slimību ārstēšanuantioksidants[1-4] un imūnstimulējošas [5,6] aktivitātes. Ir pierādīts, ka U.tomentosa ekstraktiem ir arī pretvēža [7-9], antimutagēna [10,11] un antiherpetiska iedarbība [11].

Etnomedicīnas aptaujas un citi pētījumi ir parādījuši daudzus šī auga pielietojumus dažādu kultūru tradicionālajā medicīnā, piemēram, iekaisumu, artrītu, astmas, vēža, kuņģa čūlu, urīnceļu slimību un asinsizplūdumu ārstēšanā [12,13]. Šādas daudzveidīgas īpašības ir saistītas ar U. tomentosa sarežģīto ķīmisko sastāvu, kas galvenokārt saistīts ar augstu dažādu bioloģiski aktīvo sekundāro metabolītu, galvenokārt fenola un alkaloīdu, saturu [14].

Daudzos rakstos ir norādīta arī UI.tomentosa ekstraktu (lieto terapeitiskās devās) labvēlīgā iedarbība (bez blakusparādībām) asins šūnās gan in vivo[15,16], gan in vitro pētījumos [17-19]. Sheng et al. [20] nenovēroja nekādas izmaiņas asinīs pēc augstas koncentrācijas U. tomentosa ekstrakta C-MED-100TM ievadīšanas veseliem brīvprātīgajiem. Viņi nenovēroja nekādas statistiski nozīmīgas izmaiņas, tostarp hemoglobīna līmeni, hematokrīta vērtību un vidējo sarkano asins šūnu (RBC) tilpumu, kas drīzāk izslēdza iespējamu priekšlaicīgu U. tomentosa ekstraktiem pakļauto RBC izvadīšanu.

Līdzīgi klīniskie pētījumi, ko veica Piscoya et al. [21] pacientiem ar ceļa osteoartrītu, novērtējot Uncaria gujanensis efektivitāti šīs slimības terapijā, netika konstatētas izmaiņas hematokrītā, hemoglobīna līmenī, kā arī eritrocītu sedimentācijas ātrumā (ESR), salīdzinot ar grupu. pacientiem, kuri saņēma placebo. Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi par lielākām cilvēku grupām, lai izslēgtu priekšlaicīgu cilvēku likvidēšanas iespējueritrocītino cilvēku aprites, kas pakļauti Uncaria sugām. Mūsu iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka etanola un ūdens ekstrakti no U. tomentosa lapām un mizas pat ļoti augstā koncentrācijā 500 ug/ml nebija toksiski eritrocītiem. Mēs arī novērojām, ka pētītie ekstrakti mazināja hemoglobīna oksidāciju un lipīdu peroksidāciju, kā arī samazināja ROS veidošanos un hemolīzi, ko izraisīja toksisks 24-dihlorfenols (2,4-DCP)[17]. Turklāt mēs atklājām U. tomentosa ekstraktu aizsargājošu iedarbību uz katalāzes aktivitāti cilvēka eritrocītos, kas inkubēti ar 2,4-DCP un kateholu [22].

Augu polifenolu fizioloģisko koncentrāciju ir grūti novērtēt. Literatūrā parasti ir sniegta informācija par ieteicamajām preparātu devām vai pārbaudīto savienojumu koncentrācijām (cilvēkiem 210-500 mg/dienā vai dzīvniekiem 350-500 mg/kg ķermeņa masas) [23,24 ].

Daži savienojumi uzsūcas, nemainot formu, savukārt citi, īpaši glikozīdu veidā, absorbcijas laikā tiek atņemti no visiem vai daļai cukura atlikumu. Zarnu flora piedalās arī augu polifenolu transformācijā.

Lielākā daļa absorbētās devas tiek izvadīta no organisma ar urīnu un fekālijām. Tiek lēsts, ka pēc 1-3 h ievadīšanas plazmā tiek konstatēti ne vairāk kā 10-20 procenti no uzņemtās kvercetīna un izoflavonu devas (genisteīna un daidzeīna). Tiek uzskatīts, ka antocianīni uzsūcas mazāk efektīvi — tiek lēsts, ka to uzsūkšanās ir 1-2 procenti no sākotnējās devas [25]

Oksidatīvais stress rodas, kad ROS līmenis šūnā pārsniedz šūnas līmeniantioksidantsaizsardzības sistēma. Sarkanās asins šūnas ir īpaši jutīgas pret oksidatīvo stresu, jo to membrānā ir liels polinepiesātināto taukskābju saturs un hemoglobīna automātiskā oksidēšanās. Cilvēka eritrocītu membrāna sastāv no piesātinātajām taukskābēm, mononepiesātinātajām taukskābēm, polinepiesātinātajām taukskābēm un garās ķēdes N-3 polinepiesātinātajām taukskābēm [26]. Oksidētāji maina membrānas stīvumu, izmaina membrānas dipola potenciālu un izraisa spektrīna-hemoglobīna kompleksu veidošanos [27]. Lai tiktu galā ar oksidatīvo stresu, eritrocīti ir aprīkoti ar specializētu citoskeletu, kas nodrošina mehānisko stabilitāti un elastību, kas nepieciešama, lai izturētu spēkus, kas rodas cirkulācijas laikā. Eritrocītu membrāna sastāv no lipīdu divslāņa, transmembrānu proteīniem un proteīnu pavedienu tīkla (piemēram, spektrīna, F-aktīna, proteīna 4.1 un aktīnu saistošo proteīnu domēna, aducīna, tropomiozīna un tropomodulīna), kas veido membrānas skeletu. visa to membrānas citoplazmas virsma [28]. ROS spēj arī izraisīt eriptozi, mainot membrānas fosfatidilserīna (PS) translokāciju [29]. Oksidatīvais stress var izraisīt arī šūnu reduktīvo komponentu izsīkumu un izraisīt strukturālas un funkcionālas izmaiņas sarkano asins šūnu membrānā: fosfatidilserīna un siālskābes degradāciju, kas ir galvenās sastāvdaļas, kas nosaka negatīvo lādiņu membrānas ārējā pusē [30].

Ir pierādīts, ka no U.tomentosa izolētajiem polifenoliem piemīt ļoti spēcīgas antioksidatīvas īpašības. Vairāki ziņojumi liecina, ka no dažādām U. tomentosa daļām iegūtie ūdens un metanola ekstrakti aizsargā šūnas no brīvo radikāļu veidošanās un lipīdu peroksidācijas in vitro, kā arī inhibēja brīvo radikāļu izraisītos DNS bojājumus un šūnu nāvi [2,3,31]. Iepriekšējā pētījumā mēs arī parādījām, ka UI.tomentosa ekstrakti fizioloģiskos apstākļos aizsargā eritrocītus pret ROS veidošanos un hemolīzi. Turklāt mēs pierādījām, ka .tomentosa etanola ekstraktiem bija visspēcīgākā aizsargājošā iedarbība [17].

Lai noskaidrotu, vai pārbaudītie savienojumi spēj iekļūt membrānā (un kādā dziļumā tie atrodas), tika novērtēta eritrocītu membrānas plūstamība. Daudzi fizikāli un ķīmiski faktori ietekmē membrānas plūstamību[32,33]. Ķīmiskās vielas ietver ksenobiotikas, kas izraisa lipīdu un proteīnu oksidāciju, un savienojumus, kas interkalējas

membrānā [34,35]. Svešu savienojumu iekļaušana membrānas struktūrā var izjaukt tās elementu izvietojumu, kā rezultātā parasti mainās membrānas plūstamība. Membrānas plūstamības izmaiņas var izraisīt eritrocītu disfunkciju, kā arī eritrocītu reoloģisko īpašību izmaiņas [36]. No otras puses, vielām ar antioksidanta īpašībām, kas spēj iekļūt membrānā, var būt aizsargājoša loma pret šūnu [37]. Tāpēc, lai noskaidrotu, vai U.tomentosa ekstraktos esošie savienojumi var iekļauties iekšējās un/vai ārējās membrānas bukletā, mēs novērtējām membrānas plūstamības izmaiņas dažādos līmeņos, kā arī novērtējām eritrocītu osmotisko pretestību un iekšējo viskozitāti. Mēs izvēlējāmies salīdzinoši augstas koncentrācijas (bet ne toksiskas, kā parādīts iepriekšējos pētījumos) testējamos ekstraktus, lai novērotu iespējamās pētāmo parametru izmaiņas, kā arī noteiktu ekstrakta komponentu atrašanās vietu eritrocītu membrānā.

2. Rezultāti

2.1. Membrānas plūstamība

2.1.1. Pasūtījuma parametrs S

Pēc 2h un 24h eritrocītu inkubācijas ar ūdens un etanola ekstraktiem no mizas un lapām statistiski tika konstatētas būtiskas izmaiņas secības parametrā S 1.attēlā parādītas vidējās un standartnovirzes vērtības četrām (2 h inkubācija) un piecām( 24 stundu inkubācija) neatkarīgi eksperimenti. Pēc 2 h inkubācijas visi ekstrakti, kas pētīti ar 500 ug/ml, izraisīja sakārtotības parametra S palielināšanos cilvēka eritrocītos. Pēc 24 h inkubācijas statistiski tika novērotas nozīmīgas pētāmā parametra izmaiņas gan pie 250 ug/mL, gan pie 500 ug. /mL no visiem pārbaudītajiem ekstraktiem.

2.1.2. Korelācijas laiks TB un laiks TC

Pēc 2 h inkubācijas tika novērotas statistiski nozīmīgas izmaiņas korelācijas laikā TB un laikā tc eritrocītiem, kas apstrādāti tikai ar etanola ekstraktu 500 ug/ml. Pēc 24 stundu inkubācijas sarkano asins šūnu, kas apstrādāti ar jebkuru pārbaudītu ekstraktu, statistiski nozīmīgas izmaiņas laikā līdz un laikam Tc netika novērotas (1. tabula).

2.2. Sarkano asinsķermenīšu iekšējā viskozitāte

Pēc 2 un 24 stundu ilgas eritrocītu inkubācijas ar ūdeni un etanola ekstraktiem no mizas un lapām koncentrācijās no 100 līdz 500 ug/ml statistiski nozīmīgas eritrocītu iekšējās daļas relatīvās viskozitātes izmaiņas netika novērotas (2. attēls). . Grafiki parāda vidējās un standarta novirzes vērtības četriem (2 h) un pieciem (24 h) neatkarīgiem eksperimentiem.

Jāņem vērā, ka pēc 2 h un īpaši pēc 24 h eritrocītu inkubācijas ar etanola ekstraktiem no mizas bija novērojama tendence palielināties eritrocītu internuma viskozitātei (rezultāti nebija statistiski nozīmīgi) (2. attēls). .

2.3. Osmotiskā trauslums

Eritrocītu inkubācija ar ūdens un etanola ekstraktiem no mizas un lapām koncentrācijā 100 ug/L tika veikta 2 h, 5 h un 24 h. Osmotiskās pretestības diagramma (3. attēls) parāda vidējos rezultātus 5 neatkarīgiem eksperimentiem katram inkubācijas laikam. Diagrammas lasāmības labad standarta novirzes netika uzzīmētas. IC5o diagrammas (4. attēls) parāda aprēķinātās vidējās un standarta novirzes vērtības 5 neatkarīgiem eksperimentiem katram inkubācijas laikam.

Pēc 2 stundu ilgas eritrocītu inkubācijas ar pārbaudītajiem ekstraktiem netika novērotas šo šūnu osmotiskās jutības izmaiņas, līdz ar to arī ICs0 parametru vērtības izmaiņas (3. un 4. attēls). Tika arī atzīmēts, ka pārbaudītie ekstrakti pēc 5 h inkubācijas palielināja cilvēka eritrocītu osmotisko jutību. Izņemot ūdens lapu ekstraktu, citi ekstrakti sensibilizēja RBC pret osmotiskā stresa radītiem bojājumiem. Eritrocīti, kas inkubēti ar pētītajiem ekstraktiem, tika pakļauti hemolīzei augstākās NaCl koncentrācijās, salīdzinot ar kontroles RBC (3. attēls). IC50 parametru vērtību pieaugums bija arī statistiski nozīmīgs eritrocītiem, kas inkubēti 5 stundas ar ūdens un etanola mizas ekstraktiem un etanola lapu ekstraktu (4. attēls). Pēc 24 stundu inkubācijas eritrocītos, kas tika apstrādāti ar visiem pārbaudītajiem ekstraktiem, tika novērota lielāka jutība pret osmotisko stresu, salīdzinot ar

kontrolēt eritrocītus (3. attēls). Līdzīgi statistiski nozīmīgs IC vērtību pieaugums tika novērots eritrocītos, kas tika inkubēti ar visiem pētītajiem U.tomentosa ekstraktiem (4. attēls).

3. Diskusija

Iepriekšējais pētījums parādīja, ka U.tomentosa ekstrakti mainīja cilvēka eritrocītu morfoloģiju [19]. Tika konstatēta šistocītu veidošanās, kas liecināja par ekstraktu komponentu iekļaušanu eritrocītu membrānas ārējā monoslānī[38,39]. Cits pētījums parādīja, ka U. tomentosa ekstraktos esošie savienojumi kavē hemoglobīna noplūdi (hemolīzi), iespējams, noslēdzot šūnu membrānu [17]. Viena no bioloģiskās membrānas īpašībām, kas izriet no tās struktūras un komponentu mijiedarbības, ir membrānas plūstamība. Membrānas plūstamība ir apgriezti proporcionāla tās viskozitātei.

Izmantojot paramagnētiskās rezonanses spektroskopiju (EPR), eritrocītu membrānas, kas inkubētas ar etanolu un ūdens ekstraktiem no mizas un lapām, plūstamību noteica divos taukskābju atlikuma 5 un 16 oglekļa atomu līmeņos.

Pamatojoties uz EPR spektriem, kas iegūti 5-doksistearīnskābes spintagam (5-DSA), tika aprēķināts S-kārtojuma parametrs, kas sniedza informāciju par plūstamības izmaiņām 5 oglekļa atomu līmenī. taukskābju atlikumu. Pasūtījuma parametram S tika novērots statistiski nozīmīgs tā vērtības pieaugums pēc eritrocītu inkubācijas ar etanolu un ūdens ekstraktiem no U. tomentosa mizas un lapām, kas parādīja.

membrānas plūstamības samazināšanās taukskābju atlikuma 5 oglekļa atomu līmenī. Statistiski nozīmīgs parametra S pieaugums tika novērots pēc 2-h eritrocītu inkubācijas ar etanola ekstraktiem no mizas, kā arī ūdeni un etanola ekstraktu no lapām 250 ug/mL un 500 ug/mL, savukārt ūdens ekstrakts no mizas miza tikai pie 500 ug/ml izraisīja izmaiņas apspriežamajā parametrā (1.A attēls). Inkubācijas laika pagarināšana līdz 24 stundām izraisīja statistiski nozīmīgu S parametra pieaugumu eritrocītos, kas inkubēti ar visiem pētītajiem ekstraktiem, sākot no to koncentrācijas 250 ug/ml (1.B attēls). Membrānas plūstamības samazināšanās taukskābju atlikuma 5 oglekļa atomu līmenī, iespējams, ir saistīta ar polifenolu ietekmi uz plazmas membrānas struktūru, kā aprakstījuši Duchnowicz et al.[40]. Korena et al[37] pētījumi liecina par polifenolu labvēlīgo ietekmi uz kopējo asins, īpaši eritrocītu, antioksidantu spēju. Viņi apgalvoja, ka cirkulējošie eritrocīti un, iespējams, arī citas asins šūnas varētu būt pastāvīgi pārklāti ar polifenoliem no papildinātām barības vielām, kas darbojas kā antioksidantu noliktavas un tādējādi var darboties kā aizsargi pret oksidatīvā stresa kaitīgajām sekām. Polifenola savienojumi, kas noteikti U. tomentosa, tiek klasificēti kā sekundāri metabolīti, kas pozitīvi ietekmē cilvēka ķermeni. Tiem piemīt antioksidanta aktivitāte, helātus metālu jonus (dzelzi, varu) un atbalsta antioksidantu enzīmu darbību. Polifenolu aizsargājošā iedarbība uz cilvēka organismu galvenokārt ir saistīta ar šūnu aizsardzību pret oksidatīvo stresu, kas var būt saistīta ar dažādu slimību, tostarp aterosklerozes vai vēža, attīstības novēršanu [41,42]. Pētījumu veica Heitzman et al. [43], kā arī mūsu pētījums[17] parādīja polifenolu klātbūtni U.tomentosa ekstraktos. Autori, analizējot dažādus ekstraktus, noteica augstāko polifenolu saturu etanola ekstraktā no mizas un zemāko ūdens ekstraktā no lapām. Fenola savienojumi, kas atrodas Ul. tomentosa galvenokārt pārstāv tanīni, flavonola atvasinājumi, katehīni, tanīni (tostarp katehīni un epikatehīni) un procianidīni. Polifenoliem to struktūras dēļ ir atšķirīga šķīdība ūdenī, taču tie visi labi šķīst organiskajos šķīdinātājos. Tāpēc etanola ekstraktiem no augiem parasti ir daudzveidīgāks sastāvs un lielāka polifenolu koncentrācija nekā ūdens ekstraktiem.

16-doksilstearīnskābes spintaga (16-DSA) gadījumā tika noteikti divi korelācijas laiki T un tc. Pēc 2 stundu ilgas eritrocītu inkubācijas ar etanola ekstraktu no mizas koncentrācijā 500 ug/mL tika novērots korelācijas laika tp un laika Tc pieaugums. Tomēr statistiski nozīmīgas izmaiņas šajos parametros pēc 24 stundu inkubācijas netika novērotas. Citi pārbaudītie ekstrakti neizraisīja statistiski nozīmīgas izmaiņas TB korelācijas laikā gan pēc 2 h, gan pēc 24 h inkubācijas. Šī parametra pieauguma tendence tika parādīta eritrocītos, kas inkubēti (īpaši 24 stundas) ar visiem pētītajiem ekstraktiem 500 ug/ml (1. tabula). Korelācijas laiku tB un tc palielināšanās norāda uz plēves stingrību taukskābju atlikuma 16 oglekļa atomu līmenī. Taču nekādas izmaiņas pēc 24 h inkubācijas neliecina, ka tas ir īslaicīgs efekts, ko izraisa ekstrakta komponenti, kas sākotnēji tiek iekļauti membrānā, bet pēc ilgāka inkubācijas laika tiek izņemti ārpus šūnas. Šāda polifenolu iedarbība tika aprakstīta Tarahovska et al. [44]. Šie autori ierosināja, ka flavonoīdi iekļuva lipīdu divslāņu hidrofobajā vietā, īpaši nodalījumos, kas pazīstami kā lipīdu plosti, vai hidrofobās olbaltumvielu kabatās. Flavonoīdiem pēc kompleksa veidošanās ar metāliem joprojām ir antioksidatīvais potenciāls, savukārt to lipofilitāte var palielināties, tādējādi atvieglojot membrānas lipīdu aizsardzību pret oksidēšanos.

Mēs ierosinām, ka polifenoli no U. tomentosa mizas ekstrakta ne tikai iekļuva dziļākos eritrocītu membrānas līmeņos, bet arī tika pārnesti šūnā, ko apstiprināja sarkano asins šūnu iekšējās viskozitātes palielināšanās. Viens no galvenajiem parametriem, kas ietekmē eritrocītu deformējamību, ir to iekšējā viskozitāte [45]. Šajā pētījumā eritrocītu viskozitātes izmaiņas tika novērtētas ar griešanās marķieriem. Ar U.tomentosa ūdens ekstraktiem apstrādāto eritrocītu relatīvās viskozitātes izmaiņas nebija statistiski nozīmīgas gan pēc 2-h, gan 24-h inkubācijas, savukārt etanola ekstrakti izraisīja izmaiņas apspriežamajā parametrā (2. attēls). Tas var norādīt, ka polifenoli satur daudz

augstākas koncentrācijas etanola ekstraktos intensīvi iekļuva RBC membrānā, izraisot izmaiņas eritrocītu iekšējās daļas viskozitātē. Eritrocīti, kas inkubēti ar ūdens ekstraktiem, varēja viegli kompensēt to viskozitātes izmaiņas, ko izraisīja zemāka polifenolu vielu koncentrācija (6. attēls).

Tomēr jāuzsver, ka polifenolu atrašanās šūnas membrānas dziļākajos slāņos un līdz ar to iekļūšana šūnā, vienlaikus izjaucot eritrocītu viskozitāti, var notikt tikai pie ļoti augstas šo vielu koncentrācijas, kas nav atrodamas. cilvēka organismā pat pēc terapeitiskās ārstēšanas ar U. tomentosa ekstraktiem. Zemās koncentrācijās polifenoli galvenokārt atrodas ārējā monoslānī, par ko liecina parametra S vērtības izmaiņas. Eritrocītu iekšējās daļas viskozitātes izmaiņas var būt saistītas ar eritrocītu formas izmaiņām. Uz to norādīja izmaiņas priekšējā izkliedes kanāla (FSC) parametrā, kas iegūts no plūsmas citometriskās analīzes un fotoattēliem, kas iegūti no fāzes kontrasta mikroskopiskās izmeklēšanas [19]. Šistocītu veidošanos var izraisīt U.tomentosa ekstraktos esošo polifenolu izvietošana gan ārējās šūnas membrānas vienslāņa hidrofilajā, gan hidrofobajā reģionā, kā liecina izmaiņas secības parametrā S un korelācijas laikos tB un Tc. Sarkano asinsķermenīšu formas izmaiņas var būt saistītas ar ūdens zudumu un viskozitātes palielināšanos šūnās. Turklāt tie var būt saistīti ar eritrocītu osmotiskās pretestības samazināšanos. Izmainītu eritrocītu ievietošana izotoniskā NaCl šķīdumā var izraisīt ātrāku šūnu līzi (salīdzinājumā ar kontroles šūnām), jo palielinās ūdens iedarbība un ir ierobežota eritrocītu membrānas deformācijas iespēja, līdz ar to mainās arī šūnu forma.

Rezultāti parādīja, ka atkarībā no inkubācijas laika U, tomentosa ekstraktiem var būt atšķirīga ietekme uz plazmas membrānas plūstamību un eritrocītu osmotisko pretestību.

Eritrocītu osmotiskā rezistence ir parametrs, kas norāda uz eritrocītu jutību pret hipotoniskas vides iedarbību. Eritrocītus pakļaujot izotoniskajai videi, var novērot nelielu ūdens osmotisko kustību šūnas membrānā, kas nemaina šūnas tilpumu un formu. Hipotoniskas vides gadījumā šūnā iekļūst ūdens, kas izraisa tās tilpuma palielināšanos, kā arī maina formu no diviem ieliektiem diskiem uz sfērisku formu. Šūnas var palielināt savu apjomu tikai līdz zināmai robežai. Turpmāka apjoma palielināšana izraisa šūnu membrānas integritātes traucējumus un šūnu satura izdalīšanos ar osmotisko Ivsis palīdzību. Pēc 2-h ilgas eritrocītu inkubācijas ar U.tomentosa ekstraktiem sarkano asinsķermenīšu osmotiskā jutība nemainās (attēli). 3. un 4.), kā arī tika novērotas IC50 parametra izmaiņas. Tomēr pēc 24-h inkubācijas tika novērota lielāka eritrocītu osmotiskā jutība, un tādējādi tika novērots ICso vērtības pieaugums pret kontroli (3. un 4. attēls). Spēcīgāka iedarbība tika novērota pēc eritrocītu inkubācijas ar etanola ekstraktiem, salīdzinot ar ūdens ekstraktiem. Iespējams, tas ir saistīts ar faktu, ka etanola ekstraktos ir vairāk polifenola savienojumu un tanīnu [17]. Līdzīgas izmaiņas (IC50 vērtības palielināšanos) pēc ilgāka inkubācijas laika (90 min pie 37 grādiem) eritrocītos ar katehīniem novēroja Naparlo et al. [46]. Šie autori ierosināja, ka, iespējams, ilgstošas ​​inkubācijas laikā katehīnus uzņem eritrocīti, kas var izraisīt šūnu iekšējās osmolaritātes palielināšanos un tādējādi vieglāku hemolīzi hipotoniskajos šķīdumos, jo lielāka atšķirība starp šūnu iekšpusi un ārpusi osmolaritāte. Otrs šādu izmaiņu skaidrojums bija ierosinājums, ka katehīni ilgstošas ​​inkubācijas laikā rada ROS, piemēram, ūdeņraža peroksīdu, kas var sabojāt eritrocītu membrānu un palielināt tās trauslumu, tostarp osmotisko trauslumu.

Savienojumu izvietojums eritrocītu taukskābju ķēdes 5. oglekļa līmenī izraisīja šo šūnu paaugstinātu osmotisko jutību (osmotiskās pretestības līkņu nobīde uz augstākām NaCl koncentrācijas vērtībām, IC50 vērtību palielināšanās). Tomēr iepriekšējos eksperimentos, ko veica Bors et al. [17] Izotoniskos apstākļos (0,9 procenti NaCl) U.tomentosa ekstrakti inhibēja hemolīzi, ko izraisīja toksīni, piemēram, 2,4-DCP un katehols. Šie pētnieki arī pierādīja U. tomentosa ekstraktu aizsargājošo lomu pret 2,4-DCP oksidatīvo darbību cilvēka eritrocītos, kas izpaužas kā methemoglobīna un ROS līmeņa pazemināšanās. Tādējādi ekstraktu galīgais efekts organismā, iespējams, ir pozitīvs. In vivo sistēmā U. tomentosa ekstrakti (zemās koncentrācijās) iekļaujas membrānā (neiejaucoties tās struktūrā) un uzrāda antioksidantu aizsargājošas īpašības [12,47]. Pētījumu rezultāti ar žurkām, kā arī veseliem brīvprātīgajiem, kuriem tika ievadīts U.tomentosa, neuzrādīja nekādas izmaiņas sarkano asins šūnu membrānā vai citas izmaiņas eritrocītos, kas izslēdza iespēju priekšlaicīgi izņemt šīs šūnas no asinsrites. 20,48].

Mēs apgalvojam, ka polifenolu saistīšanās ar eritrocītu virsmu var būt atbildīga par to aizsargājošajām īpašībām (novērots iepriekšējos pētījumos). Polifenoli, kas visbiežāk sastopami U.tomentosa ekstraktos, var tieši mijiedarboties ar bioloģiskajām membrānām, kā arī darbojas kā brīvo radikāļu uztvērēji un lipīdu peroksidācijas inhibitori, palielinot šūnu izturību pret oksidatīviem bojājumiem. To apstiprināja jaunākie pētījumi par bioaktīvām membrānām. Kim et al.[49] pievienoja U. tomentosa ekstraktu nanostrukturētas algināta membrānas veidošanas procesā, lai uzlabotu tā bioloģiskās aktivitātes. Autori parādīja, ka membrānām, kas satur komponentus no U. tomentosa, piemīt lieliska antioksidanta aktivitāte, parādot gandrīz 100 procentus no brīvo radikāļu samazināšanas spējas 15 minūtēs.

Šī pētījuma ierobežojums ir pārbaudīto ekstraktu ietekmes uz taukskābju sastāvu eritrocītu membrānā novērtējuma trūkums. Cilvēka eritrocītu membrāna sastāv no piesātinātajām taukskābēm (palmitīns, stearīnskābe), mononepiesātinātajām taukskābēm (palmitolēnskābe, vakēnskābe, cis-oleīnskābe, trans-oleīns), polinepiesātinātās taukskābes (cis-linolskābe, transinolēnskābe, linolēnskābe, eikozanoīds, eikozatriēnskābe). , un garās ķēdes N-3 polinepiesātinātās taukskābes (eikozapentaēnskābe, dokozaheksaēnskābe).

Tomēr šajā pētījumā ekstrakti tika piemēroti eritrocītiem, kas iegūti no veseliem donoriem. Tādējādi var pieņemt, ka eritrocītu membrānas lipīdu sastāvs ir raksturīgs normālām šūnām [26]. Tā kā cilvēka nobriedušiem eritrocītiem nav kodola, tie nesintezē šūnu komponentus, tostarp taukskābes. Šī iemesla dēļ lipīdu sastāvs nedrīkst mainīties pretēji in vivo pētījumiem: ādas plakanšūnu karcinomas gadījumā [26] vai papildināšanas laikā [50,51]. Ir iespējamas flip-flop process, lipīdu oksidēšanās, mijiedarbības maiņa lipīdu domēnos un to sadalījums, bet, tā kā lipīdu biosintēze eritrocītos nenotiek, tiek pievienots eritrocītu membrānas lipīdu kvalitatīvais un kvantitatīvais sastāvs pārbaudīto ekstraktu ietekmē. in vitro ir maz ticams, ka tas notiks.

Rezumējot, U. tomentosa ekstrakti galvenokārt ir īslaicīgi iekļauti membrānā un tieši tās ārējā monoslānī. Tomēr ļoti augstā koncentrācijā tie var iekļūt dziļāk membrānā un galu galā mainīt eritrocītu viskozitāti. Pamatojoties uz iegūtajiem rezultātiem, kā arī literatūras datiem, uzskatām, ka U.tomentosa ekstraktos esošo savienojumu fizioloģiski zemas koncentrācijas atradīsies šūnas membrānas ārējā monoslānī un aizsargās eritrocītus pret oksidatīvo stresu un bojājumiem.

4. Materiāli un metodes

4.1. Ķimikālijas

5-Doksilstearīnskābe (5-DSA),16-doksilstearīnskābe (16-DSA),4-hidroksi-2,2,6,{{ 8}}tetrametilpiperidīns-1-oksils (TEMPOL) tika iegādāts no Sigma-Aldrich, Sentluisa, MI, ASV. Citas ķīmiskās vielas tika iegūtas no Rotas, Karlsrūes, Vācijā un Avantor Performance Materials Polijā, Glivices, Polijas.

4.2.Bioloģiskais materiāls

4.2.1.Stāds

U. fomentosa izejvielu (mizu un lapas) cēla no Instituto Peruano de Investigaciones Fitoterapia Andina Limā, Peru, un to laipni piegādāja Wilcaccora.

Lomianki centrs, Polija. Šī materiāla vispārīgās īpašības iepriekš aprakstīja Pilarski et al. [3].

Vaučera materiāli tika deponēti Polijas Zinātņu akadēmijas Bioorganiskās ķīmijas institūta Fitoķīmijas laboratorijā, Poznaņā, Polijā.

Paraugu sagatavošana: vienu gramu U.tomentosa izejvielas (mizas un lapas) ekstrahēja ar 10 ml ūdens vai 96 procentu etanola tilpumu 37 grādu temperatūrā 8 stundas. Pēc tam ekstraktus centrifugēja ar ātrumu 4000 apgr./min 15 minūtes. Supernatanti tika iztvaicēti ar Speed-Vac līdz sausai masai un pēc tam žāvēti ar P2O5. Šajos apstākļos ūdens ekstrakcijas gadījumā tika aptverti aptuveni 111 mg preparāta uz gramu mizas un aptuveni 158 mg preparāta uz gramu lapu. Ekstrahējot ar 96 procentu etanolu, iegūti 123 mg preparāta uz gramu mizas un 158 mg preparāta uz gramu lapu. Tika iegūti četri ekstrakti, ti, etanola ekstrakts no mizas (Bet), ūdens ekstrakts no mizas (Bag), etanola ekstrakts no lapām (Let), ūdens ekstrakts no lapām (Lag). Pulverveida preparāti tika uzglabāti ledusskapī cieši noslēgtos traukos, no kuriem katram eksperimentam tika sagatavoti izejas šķīdumi [19].

U. tomentosa ekstraktos esošo oksindola alkaloīdu kvalitatīvais un kvantitatīvais sastāvs tika noteikts ar HPLC pirkstu nospiedumu analīzi. Šī materiāla kvantitatīvo alkaloīdu vispārīgos raksturlielumus mēs iepriekš aprakstījām publikācijā Bors et al. [18].

U.tomentosa ekstraktos tika konstatēts unkarīns F, speciofilīns, mitrafilīns, pteropodīns/izomitrafilīns un izopteropodīns. Mitrafilīns un pteropodīns/izomitrafilīns ir alkaloīdi, kas dominē lapu ekstraktos, savukārt pteropodīns/izomitrafilīns dominē mizas ekstraktos. Etanola ekstraktiem bija raksturīgs augstāks alkaloīdu saturs nekā ūdens ekstraktiem (5. attēls).

Polifenolu kvantitatīvās noteikšanas U. tomentosa ekstraktos vispārīgos raksturlielumus mēs aprakstījām iepriekš [17]. HPLC/DAD analīze atklāja, ka mizas etanola un ūdens ekstrakti satur galvenokārt procianidīnu B2 un C1, kā arī (-)-epikatehīnu. Kofeīnskābes atvasinājumi tika noteikti tikai lapu ūdens ekstraktos, savukārt hlorogēnskābe, flavonoli un polimēru proantocianidīni bija visos pētītajos ekstraktos. Augstākās brīvo fenolu kopējās koncentrācijas tika noteiktas mizas etanola ekstraktos. Augsts fenola savienojumu saturs tika konstatēts arī etanola ekstraktā no lapām, savukārt zemāka fenola koncentrācija tika konstatēta ūdens ekstraktā no mizas un etanola ekstraktos no lapām (6. attēls).

Visbeidzot, visi ekstrakti tika izšķīdināti dimetilsulfoksīdā (DMSO). Iegūtais šķīdums tika pievienots nelielā tilpumā 1 μL uz 1 ml eritrocītu suspensijas (DMSO koncentrācija neietekmēja šūnu membrānu). Kā kontroles tika izmantoti eritrocīti, kas papildināti tikai ar DMSO.

4.2.2.Eritrocītu izolēšana

Leikocītu-buffy apvalks tika iegūts no asinīm, kas savāktas Asins bankā Lodzā, Polijā. Leikocītu-buffy apvalks tika centrifugēts (3000 apgr./min 10 minūtes 4 grādos) un divas reizes mazgāts ar fosfātu buferšķīdumu (pH 7,4).

Izolētus eritrocītus, kas suspendēti PBS, inkubēja 2, 5 un 24 stundas ar četru veidu ekstraktiem (etanola un ūdens ekstraktiem no mizas un etanola un ūdens ekstraktiem no lapām) koncentrācijā 100 ug/mL, 250 ug/mL. un 500 ug/mL Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka pētītie ekstrakti šajās koncentrācijās neizraisīja eritrocītu bojājumus, bet tiem bija aizsargājoša iedarbība uz sarkanajiem asinsķermenīšiem [17,19,22].

4.3. Membrānas plūstamība

Eritrocītu membrānas plūstamība tika noteikta, izmantojot elektronu paramagnētiskās rezonanses (EPR) spektroskopiju (Brucker 300 Spectrometer, Vācija), izmantojot 5-doksilstearīnskābi (5-DSA) un 16-doksilstearīnskābi ( 16-DMR) griešanas etiķetes. No EPR spektriem, kas iegūti 5-DSA spin-label, tika aprēķināts secības parametrs S. Korelācijas laiki TB un TC tika aprēķināti no EPR spektriem, kas iegūti 16-DSA spin-label. Pasūtīšanas parametrs Sas, kā arī korelācijas laiki TB un tc parāda apgriezto korelāciju ar membrānas plūstamību. Kārtības parametrs S un korelācijas laiki tB un tc tika aprēķināti, kā aprakstīts Kotera et al. pētījumā. [52].

4.4. Sarkano asins šūnu iekšējā viskozitāte

TEMPOL spin-etiķete tika izmantota, lai noteiktu eritrocītu iekšējo viskozitāti [53]. TEMPOL šķīdumu (20 mM), kas izšķīdināts buferšķīdumā (PBS), pievienoja eritrocītu suspensijai ar 50 procentu hematokrītu. Pēc 30-minūtes inkubācijas eritrocīti tika trīs reizes mazgāti ar 80 mM K3Fe(CN6 šķīdumu, lai samazinātu signālu no spin-iezīmes, kas atrodas starpšūnu telpā. Pamatojoties uz spektru, kas iegūts TEMPOL ūdenī un eritrocītos , rotācijas korelācijas laiks tika noteikts pēc formulas:

-(2)"-1

(1)

kur: k — konstante nitroksīda griešanās marķējumam, k=6.5×10-9s mT-l, ho — viduslīnijas augstums, h_1 — augstās līnijas augstums lauka līnija, Wo — centra līnijas platums.

Relatīvā viskozitāte tika noteikta pēc formulas:

TR

_C

(2)"1 B

kur: TR — marķiera rotācijas korelācijas laiks eritrocītos, TB — marķiera rotācijas korelācijas laiks PBS, c — eritrocīta iekšējā viskozitāte, 1B — PBS viskozitāte (pieņemta vērtība 1).

4.5. Osmotiskā trauslums

Pēc eritrocītu inkubācijas ar U. tomentosa ekstraktiem šūnas tika centrifugētas pie 3000apgr./min 10 minūtes 4 grādu temperatūrā. Pēc tam šūnas tika mazgātas ar 0, 9% NaCl šķīdumu. Šis solis tika atkārtots divas reizes. Pēc supernatanta noņemšanas RBC tika suspendēti NaCl šķīdumā koncentrācijas diapazonā no 0, 2 līdz 0, 9 procentiem (izvēlēti 15 punkti). Šūnas tika inkubētas 30 minūtes 37 grādos un pēc tam centrifugētas ar ātrumu 3000 apgr./min 10 minūtes 4 °C temperatūrā. Supernatanta optiskais blīvums tika mērīts pie 540 nm (Adobe), izmantojot mikroplates absorbcijas lasītāju (BioTek Elx808, BIOTEK).

Hemolīzi katrā mēģenē izteica procentos, ņemot hemolīzi destilētā ūdenī kā 100 procentus (A100 procenti):

×100 (3)

Hemolīzes procents (procenti o)= Aole

A100

4.6. Statistiskā analīze

Rezultāti tika parādīti kā vidējais ± SD, kas sasniegts no 4 līdz 6 atsevišķiem eksperimentiem (4-6 asins donori), turpretim katram indivīdam (donoram) eksperimenta punkts bija 2-3 atkārtojumu vidējā vērtība. Vairāki salīdzinājumi starp grupu vidējām atšķirībām tika analizēti ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey post hoc tests. Atšķirības tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām p<0.05. all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" statistica="" software(statsoft,="" inc,="" tulsa,="" va,="">

Atsauces

1. de Azevedo, BC; Rokso, M.; Borges, MC; Peiksoto, H.; Krevelīna, EJ; Bertoni, BW; Contini, SH; Lopes, AA; Franča, SC; Pereira, AM; un citi. Uncaria tomentosa ūdens lapu ekstrakta antioksidanta aktivitāte un tās galvenie alkaloīdi Mitra filīns un izmitrafilīns Caenorhabditis elegans. Molecules 2019, 24, 3299. [CrossRef]

2. Navarro, M.; Arnaezs, E.; Moreira, I.; Hurtado, A.; Monge, D.; Monagas, M. Uncaria tomentosa komerciālo mizas produktu polifenoliskais sastāvs un antioksidanta aktivitāte. Antioksidanti 2019, 8, 339. [CrossRef]

3. Pilarskis, R.; Zieli ´nski, H.; Ciesioļka, D.; Gulewicz, K. Uncaria tomentosa (Willd.) DC etanola un ūdens ekstraktu antioksidanta aktivitāte. J. Ethnopharmacol. 2006, 104., 18.–23. [CrossRef]

4. Santo, GD; Grotto, A.; Boligona, AA; Da Kosta, B.; Rembo, CL; Fantīni, EA; Zauers, E.; Lazarotto, LMV; Bertončello, KT; Júnior, OT; un citi. Uncaria tomentosa ekstrakta aizsargājoša iedarbība pret oksidatīvo stresu un genotoksicitāti, ko izraisa glifosāts Roundup, izmantojot zebrazi (Danio rerio) kā modeli. Vide. Sci. Piesārņo. Res. Int. 2018, 25, 11703–11715. [CrossRef]

5. Alens Hols, L.; Arnasons, JT; Kano, P.; Lafrenie, RM Uncaria tomentosa darbojas kā spēcīgs TNF-alfa inhibitors, izmantojot NF-kappaB. J. Ethnopharmacol. 2010, 127, 685–693. [CrossRef]

6. Elgaviša, RA; Abdelrazeks, HMA; Ismail, SAA; Loutfy, NM; Soliman, MTA Uncaria tomentosa ekstrakta hepatoprotektīvā aktivitāte pret subhronisku fipronila iedarbību žurku tēviņiem. Vide. Sci. Piesārņo. Res. Int. 2019, 26, 199–207. [CrossRef]

7. Ciani, F.; Tafuri, S.; Troiano, A.; Cimīno, A.; Fioretto, BS; Gvarino, AM; Policija, A.; Vivo, M.; Evidente, A.; Karotenuto, D.; un citi. Uncaria tomentosa ūdens ekstrakta antiproliferatīvā un proapoptotiskā iedarbība plakanšūnu karcinomas šūnās. J. Ethnopharmacol. 2018., 211., 285.–294. [CrossRef]

8. Zari, A.; Alfartešs, H.; Bakners, C.; Lafreniere, RM Ārstēšana ar Uncaria tomentosa veicina apoptozi B16-BL6 peles melanomas šūnās un kavē B16-BL6 audzēju augšanu. Molecules 2021, 26, 1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Ko'smider, A.; Čepieļevska, E.; Kura's, M.; Guļevičs, K.; Pietrzak, W.; Novaks, R.; Nowicka, G. Uncaria tomentosa Lapu novārījums dažādi modulē ROS veidošanos vēža un normālu šūnu gadījumā un sekas Cisplatīna citotoksicitāte. Molecules 2017, 22, 620. [CrossRef] [PubMed]

10. Almeida, IV; Soares, LC; Lucio, FT; Kantagalli, LB; Atkārtota izmantošana, AF; Vicentini, VEP Augu izcelsmes zāļu Uncaria tomentosa (Willd.) DC ķīmijterapijas iedarbība. Genet. Mol. Res. 2017, 16. [CrossRef] [PubMed]

11. Keons, T.; Kaizers, S.; Feltrīns, C.; de Karvalju, A.; Sincero, TCM; Ortega, GG; Simões, CMO Dažādu Uncaria tomentosa (kaķa nags) preparātu antimutagēnas un antiherpetiskas aktivitātes. Food Chem. Toksikols. 2014, 66, 30.–35. [CrossRef] [PubMed]

12. Batiha, GE-S.; Magdy Beshbishy, ​​A.; Vasefs, L.; Elewa, YHA; Abds El-Haks, ME; Taha, AE; Al-Saghīrs, AA; Devkota, HP; Tufarelli, V. Uncaria tomentosa (Willd. ex Schult.) DC.: Pārskats par ķīmiskajām sastāvdaļām un bioloģiskajām aktivitātēm. Appl. Sci. 2020, 10, 2668. [CrossRef]

13. Santos Araújo, MdC; Farias, IL; Gutjērs, Dž.; Dalmora, SL; Flores, N.; Fariass, J.; de Krūzs, I.; Chiesa, J.; Moršs, VM; Chitolina Schetinger, MR Uncaria tomentosa-Adjuvanta krūts vēža ārstēšana: klīniskais pētījums. Evid. Pamatots papildinājums. Alternatīva. Med. 2012, 2012, 676984. [CrossRef]

14. Navarro Hoyos, M.; Sančess-Patans, F.; Murillo Masis, R.; Martīns-Alvaress, PJ; Zamora Ramiresa, V.; Monagas, MJ; Bartolomé, B. Uncaria tomentosa L. (kaķa nags) fenola novērtējums: lapas, stublāji, miza un koksnes ekstrakti. Molekulas 2015, 20, 22703–22717. [CrossRef]

15. Fariass, I.; do Carmo Araújo, M.; Cimmermans, ES; Dalmora, SL; Benedeti, AL; Alvaress-Silva, M.; Asbāra, ACC; Bērtols, G.; Fariass, J.; Schetinger, MRC Uncaria tomentosa stimulē mieloīdo cilmes šūnu proliferāciju. J. Ethnopharmacol. 2011, 137, 856–863. [CrossRef] [PubMed]

16. Yunis-Aguinaga, J.; Klaudiāno, GS; Markuso, PF; Manrique, WG; de Moraes, JRE; de Moraes, FR; Fernandes, JBK Uncaria tomentosa palielina augšanu un imūno aktivitāti Oreochromis niloticus, kas inficēts ar Streptococcus agalactiae. Zivis. Gliemenes Immunol. 2015, 47, 630–638. [CrossRef] [PubMed]

17. Bors, M.; Bukovska, B.; Pilarskis, R.; Guļevičs, K.; Oszmia ´nski, J.; Michałowicz, J.; Koter-Michalak, M. Uncaria tomentosa ekstraktu aizsargājošā aktivitāte uz cilvēka eritrocītiem oksidatīvā stresa gadījumā, ko izraisa 2,4-dihlorfenols (2,4-DCP) un katehols. Food Chem. Toksikols. 2011, 49, 2202–2211. [CrossRef]

18. Bors, M.; Michałowicz, J.; Pilarskis, R.; Sici ´nska, P.; Guļevičs, K.; Bukowska, B. Uncaria tomentosa ekstraktu bioloģisko īpašību pētījumi uz cilvēka asins mononukleārajām šūnām. J. Ethnopharmacol. 2012, 142, 669–678. [CrossRef]

19. Bors, M.; Sici ´nska, P.; Michałowicz, J.; Wieteska, P.; Guļevičs, K.; Bukowska, B. Uncaria tomentosa ekstraktu ietekmes uz cilvēka eritrocītu izmēru un formu novērtējums (in vitro). Vide. Toksikols. Pharmacol. 2012, 33, 127–134. [CrossRef] [PubMed]