2. nodaļa: Nieru kanāliņu peroksisomas ir nepieciešamas normālai nieru darbībai

Lai iegūtu vairāk informācijas. kontaktpersonatina.xiang@wecistanche.com

Diskusija

Liels peroksisomu daudzums proksimālajā kanāliņā kopā ar nieru anomālijām pacientiem ar ZSD ir stingri norādījis uz peroksisomu nozīmīgu lomunieres. Turklāt vairāku peroksisomu enzīmu nierēm specifiskā ekspresija ir apstiprinājusi domu, ka nieru peroksisomām var būt bioloģiskas funkcijas, kas daļēji atšķiras no funkcijām citos audos (15). Lai pārbaudītu šīs hipotēzes, mēs pārbaudījāmnieru funkcijapelēm, kurām nav īpaši peroksisomunieru kanāliņu. Starp dažādiem peļu modeļiem, kas tika izmantoti, lai pētītu peroksisomu lomu, mēs izvēlējāmies peles, kas ļauj nosacīti ģenētiski inaktivēt Pex5, kas kodē peroksisomu bioģenēzes faktoru PEX5, kas ir būtisks peroksisomu veidošanai. Šis modelis tika izvēlēts, jo (i)Pex5-null pelēm ir vairākas bioķīmiskas un funkcionālas novirzes, kas atgādina tās, kas novērotas pacientiem ar ZSD(11) un (i) liels klāsts peļu modeļu ar audu specifisku Pex5 ablāciju. ir analizēts (16), tādējādi ļaujot salīdzināt peroksisomāla deficīta funkcionālās sekas nieru kanāliņos ar tām, kas novērotas citos audos. Kā pierādīja Baes et al., Pex5-null pelēm bija intrauterīna augšanas aizkavēšanās, smadzeņu anomālijas un smaga hipotonija, un tās nomira pirmajās 72 dzīves stundās (11). Bioķīmiskās analīzes atklāja vairākas ZSD pazīmes, tostarp plazmalogēnu samazināšanos aknās un smadzenēs un spēcīgu VLCFA līmeņa paaugstināšanos plazmā. Pex{{10}}null peļu nierēs pie P0,5 netika konstatētas kortikālās nieru cistas, taču tika novērota glomerulu intrauterīnās nobriešanas aizkavēšanās. Kalcija oksalāta nogulšņu klātbūtne netika pētīta.

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu par cistanche garšaugu priekšrocībām

CKOm pelēm peroksisomālās bioģenēzes ablācija nieru kanāliņos neizraisīja nekādu būtisku fenotipu, izņemot samazinātu KW un BW zīdaiņu cKOm pelēm un samazinātu KW / BW attiecību pieaugušām cKOm pelēm. CKOf pelēm nepilnīga floksētās Pex5 alēles izgriešana kopā ar daudz maigāko Pex5 dzēšanas ietekmi uz nieru transkriptu un metabolomu liecināja, ka dažas atlikušās peroksisomas var palikt nieru kanāliņos. tomērsekssnevar izslēgt arī peroksisomālo funkciju specifiku nierēs. Mēs neatradām nekādas būtiskas morfoloģiskas atšķirības cKOm peļu nierēs, kas varētu izskaidrot zemāko KW vai KW / BW attiecību. Tomēr šīs atšķirības iespējamais iemesls varētu būt tendence samazināt proksimālo šūnu platumu. Svarīgi ir tas, ka cKOm pelēm tika saglabāta nieru homeostatiskā funkcija, neskatoties uz ievērojamām izmaiņām transkriptu ekspresijas līmeņos, kas kodē proteīnus, kas iesaistīti jonu, ūdens, aminoskābju, organisko anjonu un katjonu, fosfātu, urātu un ar megalīna starpniecību saistītajos multili-transepiteliālajā transportēšanā. gand endocītiskais ceļš. Jāatzīmē, ka lielākā daļa pazeminātu transkriptu kodēja transportētājus, kas izteikti proksimālajā kanāliņā, turpretim lielākā daļa augšregulēto transkriptu kodēja transportētājus, kas izteikti nefrona distālākās daļās. Piemēram, palielināta Nkcc2, Clc-Kb, Ncc un ENaC transkriptu ekspresija liecināja par kompensējošu nātrija reabsorbcijas regulēšanu pēc proksimālās. Integrētā nieru transkripta un metaboloma analīze atklāja dziļas izmaiņas dažādos šūnu ceļos, kas saistīti ar šūnu metabolismu, lipīdu membrānas sastāvu un redoksu homeostāzi. CKOm peļu nierēs aptuveni 8 procentiem transkripta un aptuveni 24 procentiem atklāto metabolītu bija atšķirīgs līmenis, salīdzinot ar Ctrl pelēm. Kā gaidīts, daudzi no šiem transkriptiem un metabolītiem bija saistīti ar peroksisomālo funkciju. Tika novērots dramatisks ētera fosfolipīdu plazmalogēnu daudzuma samazinājums, kas tiek sintezēts peroksisomās (~67 procenti cKOm pelēm un ~ 50 procenti cKOf pelēm, visu atklāto plazmalogēnu sugu nesvērtā summa). Plasmalogēni ir galvenie šūnu membrānas fosfolipīdi, kuriem ir arvien vairāk attiecināmo funkciju, tostarp membrānas integritāte, šūnu signalizācija un antioksidantu aizsardzība. Nierēs plazmalogēni veido aptuveni 20 procentus no kopējā fosfolipīdu daudzuma (17), tādējādi liekot domāt, ka vismaz 10 procenti fosfolipīdu sastāva cKOm un cKOf peļu nierēs atšķīrās no attiecīgajām kontrolēm. Plazmalogēnu samazināšanos potenciāli kompensēja palielināts strukturāli līdzīgu fosfatidiletanolamīnu (PE) un fosfatidilholīnu (PC) daudzums, kas uzrādīja būtisku bagātināšanos gan cKOm, gan cKOf peļu nierēs. Jāatzīmē, ka līdzīgs kompensējošs PE un PC pieaugums tika novērots pacientu ar ZSD nierēs (17).

Proksimālo kanāliņu metabolisms galvenokārt ir atkarīgs no taukskābju oksidācijas, ko raksturo augsta ROS paaudze, kas ražota gan mitohondrijās, gan peroksisomās. CKO pelēm ceļi, kas saistīti ar taukskābju noārdīšanos / biosintēzi, tika būtiski regulēti, potenciāli liecinot par mitohondriju enerģijas ražošanas kompensējošu uzlabošanos no šiem substrātiem. Tā kā viena no galvenajām peroksisomu funkcijām ir ROS detoksikācija, mēs izvirzījām hipotēzi, ka peroksisomu bioģenēzes ablācija izraisītuoksidatīvais stresscKO peļu nierēs. Tomēr molekulārās analīzes neatklāja izmaiņas antioksidantu kapacitātē un oksidatīvā stresa biomarķieros. Izaicinājums ar HFD neizraisīja funkcionālā fenotipa izmaiņas, izņemot nelielu urīna tilpuma palielināšanos un kalcija un urātu izdalīšanos ar urīnu cKOm pelēm. Integrētā transkripta un metabolomu analīze ļāva identificēt glutationa ceļu kā iespējamu kompensācijas mehānismu kopējās antioksidantu spējas uzturēšanai nieru proksimālajās kanāliņu šūnās, kurām trūkst peroksisomu.

Nosacīta Pex5 dzēšana augļa aknās (12), aizkuņģa dziedzera šūnās (18) un dažādos centrālās nervu sistēmas šūnu tipos (apskatīta 16. atsaucē) izraisa mainīgu, bet galvenokārt nopietnu orgānu specifisku funkcionālo pasliktināšanos. Nieres gadījumā tas tā nebija. Šajā pētījumā mēs identificējām vairākus iekšējos nieru mehānismus, kas potenciāli ļauj tikt galā ar peroksisomu trūkumu. Tā kā nieres ir orgāns, kam ir augsts asins perfūzijas ātrums, vēl viena iespēja ir vismaz daļai metabolītu, kurus nieres neražo, ja nav peroksisomu, bet kas ir nepieciešami normālai nieru darbībai, ārpusnieru izcelsme. Kopumā mūsu dati liecina, ka nieru kanāliņu peroksisomas nav nepieciešamas normālai nieru darbībai un ka patofizioloģiskās izmaiņas nierēs pacientiem ar ZSD ir ārpusnieru izcelsmes.

Metodes

Dzīvnieki. Pex5a/la/Pax8-ntTA/LC-1 Cre peles ģenerēšanai izmantotās procedūras tika aprakstītas iepriekš (13). Šajā pētījumā izmantotās 3 peļu līnijas ir inbred celmi, kas audzēti uz C57BL/6J peles ģenētiskā fona (The Jackson Laboratory). Pirms visiem eksperimentiem peles tika pielāgotas 12-stundu gaismas/12-stundu tumšajam ciklam. Visi eksperimenti tika veikti diennakts laikā ZT3 (ZT0ir laiks, kad gaisma ir ieslēgta, un ZT12 ir laiks, kad gaisma ir izslēgta).

Tika izmantotas Pex5bxlo/Pax8-rtTA/LC1 trīskāršās transgēnās peles vai mātītes (sauktas par cKOm un cKOf) un Pex5l/a peles (sauktas par Ctrl vai Ctrl). Pex5 rekombinācija jaundzimušajiem tika veikta, pievienojot grūsnām peļu mātītēm dzeramajam ūdenim 0,2% DOX un 2% saharozes 2 nedēļas, sākot no 14. grūtniecības dienas. Pex5 rekombinācijai pieaugušām pelēm 8-nedēļu vecu peļu dzeramajam ūdenim pievienoja DOX un saharozi. Nieru struktūra un funkcija tika novērtēta 4 nedēļas pēc DOX terapijas beigām nedēļu vecām pelēm zīdaiņiem vai 14-nedēļu vecām pieaugušām pelēm. Pēc atšķiršanas 3 nedēļās peles tika barotas ar standarta kontroles diētu, kas satur 4,2 procentus tauku (Sniff zema tauku satura kontroles diēta) vai, ja tika minēts, 4 nedēļas ar atbilstošu HFD, kas satur 20,7 procentus tauku (galvenokārt LCFA).

Metabolisma būri un asins un urīna ķīmija. Peles tika izmitinātas atsevišķos vielmaiņas būros (Tecniplast). Urīna savākšana tika veikta pēc 3-dienas adaptācijas perioda. Urīna un asins ķīmija tika analizēta, kā aprakstīts iepriekš (19). Plazmas un urīna sastāvs tika mērīts Laboratoire Central de Chimie Clinique, Center Hospitalier Universitaire Vaudoise University Hospital (Lozanna, Šveice).

Elektronu mikroskopija. Nieru paraugi tika sagriezti apmēram 1 mm³ gabaliņos un fiksēti glutaraldehīda šķīdumā (EMS) 2,5% fosfāta buferšķīdumā (PB, 0,1 M pH 7,4) (MilliporeSigma) 2 stundas istabas temperatūrā (RT). Pēc tam tos 3 reizes 5 minūtes noskaloja PB buferšķīdumā un pēc tam 2 stundas RT fiksēja ar svaigu 1% osmija tetroksīda (EMS) maisījumu ar 1,5% kālija ferocianīda (MilliporeSigma) PB. Pēc tam paraugus 3 reizes mazgā destilētā ūdenī un dehidrēja acetona šķīdumā (MilliporeSigma) pakāpeniskā koncentrācijā (30 procenti 90 minūtes; 70 procenti 90 minūtes; 100 procenti 120 minūtes; 100 procenti 240 minūtes). Tam sekoja infiltrācija Epon sveķos (MilliporeSigma) pakāpeniskās koncentrācijās (Epon/acetons [1/3; v/v] 4 stundas; Epon/acetons [3/1; v/v] 4 stundas, Epon/acetons [1 /1;v/v] 8 stundas; Epons/acetons [1/1; v/v] 24 stundas) un visbeidzot polimerizācija 48 stundas 60 grādu temperatūrā krāsnī. Īpaši plānas 50 nm sekcijas tika sagrieztas ar Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH) un savāktas uz vara spraugu režģa, 2 × 1 mm (EMS), kas pārklāts ar polistirola plēvi (MilliporeSigma). Sekcijas tika pēc 10 minūtes iekrāsotas ar uranilacetātu (MilliporeSigma) 2 procentiem H, O, vairākas reizes noskalotas ar H, O, pēc tam 10 minūtes ar Reinoldsa svina citrātu un vairākas reizes noskalotas ar H, O.

Stereoloģija. Stereoloģijas analīzei tika analizēti 3 nieres garozas gabali uz vienu peli, 15 mikrogrāfi katrā paraugā ar pikseļu izmēru 4,08 nm, izmantojot sistemātisku vienotu nejaušu paraugu ņemšanu ar transmisijas elektronu mikroskopu (Philips CM100, Thermo Fisher Scientific) ar paātrinājuma spriegumu 80 kV ar TVIPS TemCam-F416 digitālo kameru (TVIPS GmbH).

Transkriptomiskā analīze. Visi sekvencēšanas dati ir publiski pieejami, izmantojot NIH Gene Expression Omnibus (piekļuves numurs GSE179202). RNA-Seq bibliotēkas tika sagatavotas, izmantojot 200 ng kopējās nieru RNS, kā aprakstīts Nikolaeva et al. (19). Tika izmantoti Illumina TruSeq SR Cluster Kit v4 reaģenti. Sekvences dati tika apstrādāti, izmantojot Mus musculus. GRCm38.{6}} gēna anotācija, statistiskā analīze tika veikta R (versija 3.4.0). Transkripti ar zemu skaitu tika filtrēti saskaņā ar noteikumu 1 skaits uz miljonu (MPT) vismaz 1 paraugā. Bibliotēkas izmēri tika mērogoti, izmantojot TMM normalizāciju, un log-pārveidoti par CPM, izmantojot voom (20). Galveno komponentu analīze parādīja nelielu atšķirību starp atkārtotajiem paraugiem. Diferenciālā izteiksme starp cKO un Ctrl pelēm tika aprēķināta 1 F testā, izmantojot limmu (21). P vērtības tika pielāgotas, kā aprakstīts (22), FDR vērtībās, lai ņemtu vērā vairākus salīdzinājumus, izmantojot visu transkriptu rezultātus vīriešiem un sievietēm vai atlasīto transportētāju vai ar peroksisomu saistīto transkriptu rezultātus tikai vīriešiem. Atšifrējumi ar FDR<5% were="" considered="" significant.="" comparisons="" of="" expression="" levels="" were="" done="" using="" the="" mean="" fc="" of="" cpm="" in="" cko="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" individual="" values="" were="" normalized="" between="" 0="" and="" 1.="" a="" weighted="" gsea="" was="" performed="" using="" the="" unfiltered="" transcript="" list="" ranked="" by="" signed="" p-value="" (product="" of="" p-value="" and="" sign="" of="" the="" fc).="" the="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" gsekegg="" function="" from="" the="" r="" package="" cluster="" profile(version="" 3.16.1)(23).="" kegg="" pathway="" collections="" were="" restricted="" to="" gene="" sets="" with="" minimum="" and="" maximum="" sizes="" of="" 10="" and="" 500,="" respectively.="" the="" enrichment="" scores="" were="" normalized="" by="" gene="" set="" size,="" and="" their="" statistical="" significance="" was="" assessed="" by="" permutation="" tests="" (n="">

Metabolisma analīze. Metabolīti no saldētiem nieru paraugiem tika identificēti ar īpaši augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas-tandēma masas spektroskopiju un kvantitatīvi noteikti, izmantojot AUC (Metabolon Inc). Neapstrādātās vērtības tika logaritmiski pārveidotas un normalizētas neapstrādātā platības skaita izteiksmē. Divvirzienu ANOVA kontrasta testi tika izmantoti, lai identificētu bioķīmiskas vielas, kas būtiski atšķīrās starp abu dzimumu cKO un Ctrl pelēm. P vērtības tika pielāgotas, kā aprakstīts (22) FDR vērtībās, lai ņemtu vērā vairākus salīdzinājumus, un metabolītus ar FDR.<5% were="" considered="" significantly="" modulated.="" for="" log2fc="" calculation,="" missing="" values,="" if="" any,="" were="" replaced="" with="" the="" minimum="" observed="" value="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="" compound.="" for="" a="" graphical="" representation="" of="" individual="" values="" in="" box-and-whisker="" plots,="" normalized="" values="" were="" divided="" by="" the="" median="" value="" obtained="" in="" mice="" of="" the="" same="" sex,="" for="" each="">

Kopīgās transkripta-metabolomu analīze. Integrēta vielmaiņas ceļa analīze, kurā tika apvienoti gēnu ekspresijas un metabolomikas pētījumos iegūtie rezultāti, tika veikta, izmantojot MetaboAnalyst 5.{1}} tīmekļa vietnes (24) moduli Joint Pathway Analysis. Metabolītu saliktais nosaukums un transkriptu oficiālais gēnu simbols, kas ir ievērojami vairāk vai mazāk bagātīgs (FDR<0.05), along="" with="" their="" respective="" fcs="" in="" ckom="" mice="" as="" compared="" with="" ctrl="" mice,="" were="" inputs.="" the="" integration="" was="" performed="" using="" kegg="" metabolic="" pathways="" with="" default="" settings(hypergeometric="" test="" for="" overrepresentation="" analysis,="" degree="" centrality="" for="" pathway="" topology="" analysis,="" and="" tight="" integration="" by="" combining="" queries).="" pathways="" with=""><0.1 were="" considered="" significantly="" affected="" in="" ckom="">

Krāsojumi. Globālās nieru struktūras, kalcija oksalāta nogulšņu vai neitrālu lipīdu nogulsnēšanās krāsošanas tika veiktas šķērsvirziena nieru šķēlēs, kas bija 5 μm biezas. Izņemot neitrālu lipīdu krāsošanu, peles tika anestēzētas, un to kreisā niere pirms audu savākšanas tika perfūzēta caur vēdera aortu ar 4% paraformaldehīda šķīdumu. Globālās nieru struktūras analīzei parafīnā iestrādātās nieru šķēles tika deparafinētas, rehidrētas, iekrāsotas ar H&E, dehidrētas un uzstādītas ROTI Histokitt (Carl Roth GmbH). Neitrālie lipīdi tika iekrāsoti nieru šķēlēs, kas iestrādātas OCT savienojumā (Tissue-Tek), izmantojot Oil Red O šķīdumu. Kalcija oksalāta nogulsnes tika iekrāsotas saskaņā ar Pizzolato (25) aprakstīto metodi. Īsumā, parafīnā iestrādātās nieru šķēles tika deparafinētas un rehidrētas, pēc tam iegremdētas 1:1 sudraba nitrāta 5% (w/v) un 30% ūdeņraža peroksīda šķīdumā un 30 minūtes tika novietotas zem 60 W spuldzes. Priekšmetstikliņus rūpīgi nomazgāja destilētā ūdenī un nokrāsoja ar Nuclear Fast Red (MilliporeSigma), pēc tam dehidrēja pirms uzstādīšanas.ROTI Histokitt. Gareniskās nieres šķēles no peles, kas tika ārstēta ar kalcija oksalāta nefropātijas izraisītu diētu (1,5% kalcija plus 1,5% hidroksiprolīna, kas sajaukti standarta ēdā 3 nedēļas), kalpoja kā kalcija oksalāta nogulsnēšanās nierēs pozitīva kontrole. Rezultāti tika analizēti, izmantojot Zeiss AxioScan.Z1 slaidu skeneri ar 100x vai 200x sākotnējo palielinājumu.

ELISA un Trolox tests.{0}}HNE tika mērīts, izmantojot Lipīdu peroksidācijas (4-HNE) Testa komplektu no Abcam (ab238538). Kopējās un neenzimātiskās antioksidantu spējas tika novērtētas ar Trolox testa komplektu no Abcam (ab65329).

Statistika. Visi dati ir izteikti kā vidējais ± SEM. Statistiskie testi un nozīmīguma slieksnis ir aprakstīti attēlu leģendās vai atbilstošās sadaļās Metodes. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot R pakotnes vai GraphPad Prism programmatūras versiju 8.2.1. Visiem t-testiem bija 2 astes.

Studiju apstiprināšana. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Šveices dzīvnieku aprūpes vadlīnijām, kas atbilst Nacionālo veselības institūtu dzīvnieku aprūpes vadlīnijām, un tos apstiprinājušas Šveices kantons (Canton de Vaud) un federālās veterinārās iestādes (atļauja 31827 uz DF) (Direction generalale). de P'agriculture, de la viticulture et des affairs vetérinaires, Epalinges, Šveice).

Iepriekšēja publikācija: daļa no šī darba ir iesniegta kā kopsavilkums Amerikas Nefroloģijas biedrības 2021. gada ikgadējā sanāksmē (2021. gada 4. novembrī. https://www.asn-online.org/education/kidney-week/2021) /program-abstract.aspx?controlId=3605774).