lvValoda
Mājas / Zināšanas / Saturs

Zināšanas

Himēriskā cilvēka papilomas vīrusa

Dec 07, 2023

Abstract:

Šajā pētījumā HIV-1 P18I10 CTL peptīds, kas iegūts no HIV-1 gp120 V3 cilpas, un HIV-1 gp41 T20 anti-fūzijas peptīds tika ievietots HPV16 L1 kapsīda proteīnā. lai izveidotu himēriskus HPV: HIV (L1:P18I10 un L1:T20) VLP, izmantojot zīdītāju šūnu ekspresijas sistēmu. HPV: HIV VLP tika attīrīti ar hromatogrāfiju. Mēs pierādījām, ka P18I10 vai T20 peptīdu ievietošana HPV16 L1 kapsīdu proteīnu DE cilpā neietekmēja himēriskā HPV: HIV VLP in vitro stabilitāti, pašsavienošanos un morfoloģiju. Svarīgi, ka tas netraucēja ne HIV-1 antivielu reaktivitāti, kas vērsta uz secīgiem un konformācijas P18I10 un T20 peptīdiem, kas atrodas uz himēriskā HPV: HIV VLP, ne arī HPV16 L1-specifisko antivielu indukciju in vivo. Mēs novērojām, ka himēriskās L1:P18I10/L1:T20 VLP vakcīnas var izraisīt HPV16-, bet vājas HIV-1-specifiskas antivielu atbildes reakcijas un izraisīt HPV16- un HIV-1-specifisku T- šūnu reakcijas BALB / c pelēm. Turklāt tas varētu būt potenciāls pastiprinātājs, lai palielinātu HIV specifiskās šūnu atbildes reakcijas heterologajā imunizācijā pēc ievadīšanas ar BCG.HIVA vakcīnu. Šis pētnieciskais darbs dotu ieguldījumu jaunas himēriskas HPV izstrādes virzienā: uz HIV VLP balstīta vakcīnas platforma HPV16 un HIV{42}} infekcijas kontrolei, kas ir steidzami nepieciešama jaunattīstības un rūpnieciski attīstītajās valstīs.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Atslēgvārdi:

HIV-1; HPV16; vakcīna; vīrusiem līdzīgas daļiņas; P18I10; T20 enfuvirtīds; BCG.HIVA; humorālā imunitāte; T šūnu mediēta imunitāte

1. Ievads

Cilvēka imūndeficīta vīruss-1 (HIV-1), kas izraisa iegūtā imūndeficīta sindromu (AIDS), tika atklāts pagājušā gadsimta astoņdesmito gadu sākumā, un kopš tā laika tas ir kļuvis par globālu epidēmiju [1]. Lai gan ļoti aktīva pretretrovīrusu ārstēšana (HAART) kopā ar profilaksi pirms ekspozīcijas (PrEP) var reāli ietekmēt HIV-1 infekcijas kontroli, vakcinācija joprojām ir fundamentāla pieeja sabiedrības interesēs un mērķtiecīgi. globālās HIV{7}} epidēmijas beigām [2]. Neraugoties uz vairāk nekā trīs gadu desmitiem ilgajiem rūpīgajiem HIV{9}} pētījumiem un daudzajiem vakcīnu klīniskajiem pētījumiem, līdz šim licencēta HIV{10}} vakcīna joprojām nav pieejama. RV144 pētījums, kas tika veikts Taizemē, bija pirmais gadījums, kas atklāja nelielu 31,2% efektivitāti pret HIV{14}} infekcijas iegūšanu [3]. Lielākā daļa citu HIV{16}} vakcīnu kandidātu, kurām tika veikti klīniskie pētījumi, galvenokārt balstījās uz DNS, rekombinantiem vīrusu vektoriem vai apakšvienību proteīnu modeļiem [4,5]. Ideālā gadījumā efektīva HIV-1 vakcīna spēj izraisīt iedzimtas imūnās atbildes, neitralizēt antivielas, lai novērstu vīrusu infekciju [6], kā arī citotoksiskās T limfocītu (CTL) atbildes reakcijas, lai iznīcinātu inficētās šūnas [7]. Tomēr katras atbildes reakcijai var būt vajadzīgas dažādas vakcīnas stratēģijas, kas garantē atsevišķus, bet paralēlus izstrādes centienus. Imunogēnu un ievadīšanas vektoru atlase būtiski ietekmēs HIV-1 vakcīnu darbību un specifiku [8,9]. Atkārtotās neveiksmes, izmantojot standarta pieejas HIV-1 vakcīnas izstrādei, lika atpazīt ievadīšanas vektora atlases, primārās pastiprināšanas režīmu un imunogēna specifiskuma nozīmi gan humorālajā, gan šūnu reakcijā. Jau ir zināmi vairāk nekā 100 cilvēka papilomas vīrusa (HPV) veidi, un tiek uzskatīts, ka HPV 16. un 18. genotips ir atbildīgs par aptuveni 70% dzemdes kakla vēža gadījumu visā pasaulē [10]. HPV L1 vīrusam līdzīgās daļiņas (VLP), kas klasificētas kā apakšvienību vakcīnu veids, pārsvarā var izraisīt salīdzināmas L1- specifiskas humorālas reakcijas uz savvaļas tipa virionu un arī T šūnu mediētas atbildes reakcijas [11–13]. Šobrīd tirgū ir licencētas trīs HPV profilaktiskās vakcīnas, un tās visas ir balstītas uz HPV L1 kapsīda proteīna VLP. Divas no tām, Gardasil (Merck, Rahway, Ņūdžersija, ASV) un Gardasil -9 (Merck) tiek ražotas, izmantojot rauga (Saccharomyces cerevisiae) ekspresijas sistēmu, bet otru, Cervarix (GSK, Brentford, UK), ražo. ar bakulovīrusa ekspresijas vektora/kukaiņu šūnu (BEVS/IC) sistēmu [14]. Līdz šim optimālie HPV16 L1 proteīnu ražošanas apstākļi zīdītāju ekspresijas sistēmā nav bijuši labi izveidoti. Tādējādi kombinētas vakcīnas izstrāde, kas aizsargātu pret HPV un HIV infekcijām, ir loģisks darbs cīņā pret šiem diviem galvenajiem globālajiem patogēniem.

Iepriekšējā pārskata publikācijā par vīrusu līdzīgu daļiņu (VLP) balstītu HIV-1 vakcīnu izstrādes koncepcijām mēs minējām, ka bezapvalka VLP, piemēram, papilomas vīrusa VLP, varētu būt funkcionāla loma kā ievadīšanas vektoriem. HIV-1 CTL vai neitralizējošo antivielu epitopi [15,16]. Šī hipotēze ir apstiprināta vairākiem himēriskiem liellopu papilomas vīrusiem (BPV) L1 VLP, kas uzrāda P18I10 CTL epitopu no gp120 HIV-1 apvalka proteīna (Env) V3 cilpas un gp41 HIV{16}} Env 2F5 epitopu vai MPER reģionu. [17–22]. Cilvēka papilomas vīrusa tipa -16 (HPV16) L1 kapsīdu proteīnu strukturālās iezīmes ir līdzīgas BPV kapsīdu proteīnu strukturālajām iezīmēm, un tās var pašas salikt viena slāņa L1 VLP [23]. Pieci no HPV16 L1 olbaltumvielām veido pentamēru, un 72 no pentamēriem pašsavienojas HPV16 VLP [24]. Tomēr joprojām nav skaidru pierādījumu tam, ka himēriskie HPV16: HIV kapsīdu proteīni varētu būt stabili in vitro un pašmontēties morfoloģiski neatņemamos VLP. No otras puses, ir pierādīts, ka HPV16 L1 VLP ir ļoti imunogēni un spēj izraisīt antigēniem specifiskas T un B šūnu imūnās atbildes [11–13]. Joprojām ir jānoskaidro, vai HIV-1 epitopu parādīšanās ar HPV: HIV VLP varētu būt imunogēna. Šajā pētījumā mūsu mērķis bija izstrādāt kimērisku uz VLP balstītu HPV: HIV vakcīnu, izmantojot cilvēka 293F šūnas, kas ir labi izveidota zīdītāju šūnu ekspresijas sistēma. HPV 16 L1 proteīns darbojās kā strukturālais vakcīnas karkass, un P18I10 un T20 peptīdi tika atlasīti kā HIV-1 imunogēni un ievietoti HPV 16 L1 proteīna DE cilpā. Imūndominējošais P18I10 CTL epitops, kas satur 10 aminoskābes (311.–320. atlikumi: RGP GRAFVTI), ir atvasināts no HIV-1 apvalka glikoproteīna gp120 trešā mainīgā domēna (V3). P18I10 peptīds ir identificēts kā H-2Dd ierobežota MHC I klases molekula, kas izraisa citotoksiskas T limfocītu (CTL) reakcijas [25,26]. T20 peptīds, kas pazīstams kā enfuvirtīds un veidots kā pretretrovīrusu multimērisks saplūsmes peptīds, sastāv no 36 aminoskābju sekvences (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF), kas imitē C-gala heptādes spirāles secību tuvu membrānai.0 HIV -1 apvalka glikoproteīna 41 (gp41) proksimālais ārējais reģions (MPER) [27]. Šie divi HIV-1 T (P18I10) un B (T20) šūnu epitopi tika izvēlēti kā sākumpunkts un koncepcijas eksperimenta pierādījums kimēriskajam VLP balstītam HPV: HIV vakcīnas izstrādes platformai.

Pēdējo desmit gadu laikā ir pārbaudīti daudzi dažādi uz VLP balstītas HIV-1 vakcīnas primārās pastiprināšanas formāti [15]. Lai gan lielākā daļa iepriekšējo HIV-1 VLP [28] vai himērisko BPV: HIV VLP [17–22] vakcīnu stratēģiju bija vērstas uz imūnreakcijas ierosināšanu, izmantojot homologu primārās pastiprināšanas shēmu, divi iepriekšējie pētījumi liecina, ka heterologā imunizācija. kas sastāv no rekombinantiemMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG), kas ekspresē HIV-1 Gag prime un HIV-1 Gag VLP pastiprinājumu, var veicināt T-šūnu imunitātes uzlabošanos [29,30]. Mūsu pētnieku grupā mēs esam pierādījuši sākšanu ar rBCG, kas ekspresē HIVA imunogēnu, un pastiprināšanu ar rekombinanto vīrusu vektoru MVA.HIVA bija droša un izraisīja HIV-1-specifiskas T-šūnu imūnās atbildes reakcijas BALB/c pelēm [31–33]. HIVA imunogēns, ko izstrādājis Dr. Tomas Hanke, sastāv no pilna garuma HIV-1 Gag proteīna, kas apvienots ar vairākiem CTL epitopiem, tostarp P18I10 epitopiem C-galā [34]. Tāpēc mūsu mērķis bija novērtēt, vai BCG.HIVA varētu pastiprināt HIV: HPV (L1:P18I10) VLP izraisītās T-šūnu imūnās atbildes BALB/c pelēm.

Šajā pētījumā himēriskie HPV: HIV (L1:P18I10 un L1:T20) imunogēni tika izstrādāti un ražoti, izmantojot 293F ekspresijas sistēmu. Himēriskā L1: P18I10 un L1: T20 proteīna ekspresija tika apstiprināta ar imūnkrāsošanu. HPV: HIV VLP pēc tam tika attīrīti ar 3-pakāpju hromatogrāfijas metodi, tostarp katjonu (CEC), izmēra izslēgšanas (SEC) un heparīna afinitātes (H-AC) hromatogrāfiju. Pēc tam attīrīta HPV in vitro stabilitāte, in vitro pašsavienošanās un morfoloģija: HIV VLP tika apstiprināti attiecīgi ar nesamazinošu SDS-PAGE, molekulmasas testu un transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM). Secīgie un konformācijas P18I10 un T20 peptīdi uz himēriskā HPV: HIV VLP tika raksturoti ar anti-HIV-1 gp120 V3 un 2F5 monoklonālām antivielām in vitro, izmantojot Western blot un netiešo ELISA testu. Visbeidzot, HPV: HIV VLP imunogenitāte tika novērtēta BALB / c peļu modelī. Mēs pierādījām, ka himēriskās L1:P18I10 un L1:T20 VLP bāzes vakcīnas var izraisīt HPV16- un HIV-1-specifiskas antivielu atbildes reakcijas un himēriskās L1:P18I10 VLP var izraisīt HPV16- un HIV{36}} {37}}specifiskas T-šūnu atbildes reakcijas BALB/c pelēm. Tā kā imunogēnas HPV: HIV vakcīnas izstrāde un ražošana joprojām nav sasniedzama, šis pētījums sniedza pamata stratēģiju, kas varētu būt tā vērta, lai atbalstītu globālos centienus izstrādāt jaunas himēriskas VLP vakcīnas, lai kontrolētu HPV un HIV{40}} infekcijas.

2. Materiāli un metodes

2.1. Vakcīnas celma BCG.HIVA2auxo.int izveide

Rekombinants BCG, kas ekspresē HIVA imunogēnu, iepriekš tika izveidots, izmantojot E.coli-mycobacterial integratīvo atspoles vektoru p2auxo.int. E. coli/mikobaktēriju vektora, kas ekspresē HIVA antigēnu, uzbūve tika aprakstīta iepriekš [31–33]. BCG.HIVA2auxo.int tika atšķaidīts ar PBS-Tween20 līdz 2 × 107 cfu/ml, apstrādāts ar ultraskaņu, lai izjauktu baktēriju kopas, un inokulēts aizmugurējā barības spilventiņā vai BALB/c pelēm (50 µL, 106 cfu/peli).

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

2.2. Baktēriju kultūras un transformācija

E. coli glicīna auksotrofā celma M151GlyA šūnas (Invitrogen, Waltham, MA, ASV), ko nodrošina Dr. Pau Ferrer, tika kultivētas minimālā M9-atvasinājuma barotnē (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/l; KH2PO4, 3 g/l; NaCl, {{10}},5 g/l; NH4Cl, 1 g/l, glikoze, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0,1 mmol/L; tiamīns, 0},1 g/L; FeCl3, 0.{56 }}25 g/l; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.{101}}3 mg/l; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) , papildināts ar glicīnu (70 µg/ml). E. coli M151Gly šūnas tika transformētas ar p2auxo.HIVA plazmīdām elektroporācijas ceļā. Šim nolūkam E. coli kultūras tika audzētas līdz optiskajam blīvumam 0,9 pie 600 nm un transformētas, izmantojot Bio-Rad gēnu impulsu elektroporatoru pie 2,5 kV, 25 µF un 200 Ω. Pēc tam transformētās šūnas tika kultivētas uz M9-D agara plāksnēm (sastāvdaļas, kā aprakstīts iepriekš, ar pievienotu 1,5% baktoagara) bez glicīna piedevas atlasei vai ar glicīna piedevu kā kontroli. Lizīna auksotrofiskais BCG celms BCG∆lys, ko laipni nodrošināja WR Jacobs Jr., BR Bloom un T. Hsu, tika pārveidots ar p2auxo.HIVAint plazmīdas DNS ar elektroporācijas palīdzību. Mikobaktērijas kultivēja Middlebrook 7H9 buljona barotnē vai Middlebrook agara 7H10 barotnē, kas papildināta ar albumīna-dekstrozes katalāzi (ADC; Difco), kas satur 0,05% Tween 80. L-lizīna monohidrohlorīds (Sigma, Kawasaki, Japāna) tika izšķīdināts ūdenī un izmanto kā papildinājumu ar galīgo koncentrāciju 40 µg/ml. Transformācijai BCG tika kultivēts līdz optiskajam blīvumam 1, 5 pie 600 nm un transformēts, izmantojot Bio-Rad gēnu impulsa elektroporatoru pie 2, 5 kV, 25 µF un 1000 Ω. Pēc tam transformanti tika kultivēti ar ADC papildinātā Middlebrook agara 7H10 barotnē, kas satur 0, 05% Tween 80 bez lizīna piedevas.

2.3. Šūnu līnijas un šūnu kultūra

293F šūnas (Tibco), kas iegūtas no cilvēka embrija nieres (HEK) 293 šūnām, tika kultivētas FreeStyle 293 ekspresijas vidē (Tibco), kas papildinātas ar 5 ml/l penicilīna-streptomicīna (Tibco), un inkubētas 37 ◦C inkubatorā. mitrināta atmosfēra ar 5% CO2 uz orbitālās kratītāja platformas, kas rotē ar ātrumu 125 apgr./min.

2.4. L1:P18I10 un L1:T20 proteīnu ražošana, izmantojot ekspresijas sistēmu 293F

Konstrukcija pCDNA3.1 saturēja L1:P18I10 vai L1:T20 DNS kodēšanas sekvences, kas atbilst attiecīgi himēriskajiem L1:P18I10 un L1:T20 proteīniem. HIV-1 P18I10 CTL peptīds (RGPGRAFVTI) vai T20 peptīds (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) tika ievietots HPV16 L1 kapsīda proteīna DE cilpā. HPV16 L1 DE cilpas secība, kas kodē 130–136 aminoskābes, tika aizstāta ar P18I10I10 vai T20 peptīdu. L1:P18I10 vai L1:T20 DNS kodējošās sekvences tika modificētas ar Kozaka secību, optimizētas ar cilvēka kodonu, papildinātas ar HindIII un XbaI restrikcijas enzīmu vietām, un klonētas pcDNA3.1(+) vektorā, izmantojot GeneArt gēnu sintēzes pakalpojumus ( Thermo Fisher, Waltham, MA, ASV). Rekombinantā plazmīda DNS (pDNS) tika transformēta E. coli DH5 kompetentās šūnās (Invitrogen) amplifikācijai un ekstrahēta, izmantojot plazmīdu Maxi komplektus (QIAGEN, Hilden, Vācija). 293F šūnas tika kultivētas ar 30 ml FreeStyle 293 ekspresijas barotni 125 ml Erlenmeijera kolbā (Korninga, Ņujorka, NY, ASV) līdz blīvumam 1,0 × 106/ml un īslaicīgi transficētas ar L1:P18I10 vai L1:T20 pDNAs. polietilēnimīns ar MW 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) ar optimizētu DNS attiecību pret PEI 1:3 (w/w) un DNS attiecībā pret barotni 1:1 (w/v), saskaņā ar saskaņā ar ražotāja norādījumiem [35]. 293F šūnas tika novāktas 96 stundas pēc transfekcijas. 293F šūnas var sasniegt saplūstošo blīvumu 3, 6 × 106 šūnas / ml ar aptuveni 50% dzīvotspēju.

2.5. Imunofluorescences krāsošana

Šūnas tika permeabilizētas uz stikla priekšmetstikliņa ar 100% aukstu acetonu. Pēc tam fiksētās šūnas tika pārbaudītas ar anti-HPV16 L1 antivielu CAMVIR-1 (Abcam, Kembridža, Apvienotā Karaliste) un notvertas ar anti-peles IgG-FITC (Sigma). Imūnās krāsotās šūnu monoslāņi tika rūpīgi mazgāti ar PBS un pārklāti ar montāžas barotni ar DAPI (Abcam). Imunofluorescences attēli tika pārbaudīti apgrieztā mikroskopā ar 40x palielinājumu. Transfekcijas efektivitāti noteica FITC (zaļās) pozitīvo šūnu attiecība pret DAPI (zilā krāsā) iekrāsotajām šūnām.

2.6. HPV attīrīšana: HIV (L1:P18I10 un L1:T20) VLP

Pavisam 108 transfektētas 293F šūnas 125 ml Erlenmeijera kolbā (30 ml barotnes/kolba) tika savāktas, centrifugējot ar ātrumu 1500 apgr./min 5 minūtes un divas reizes nomazgātas ar PBS. Šūnu granulas tika atkārtoti suspendētas līzes buferšķīdumā, kas sagatavots ar 1% Triton X-100, proteāzes inhibitoru (1:100) (Millipore) un benzonāzi (25 U/ml) (Millipore). Šūnu lizāti tika dzidrināti ar 0, 45 µm PVDF šļirces filtru (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 un L1:T20) VLP paraugi tika sērijveidā attīrīti, izmantojot katjonu apmaiņu (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, ASV), izmēra izslēgšanu (Capto Core 700, GE) un afinitāti (HiTrap Heparin HP). , GE) hromatogrāfija. Hromatogrāfiskie protokoli tika aprakstīti mūsu iepriekšējos pētījumos [36, 37] un sekoja ražotāja protokolam [38]. L1 proteīna signāls katrā attīrīšanas posmā tika raksturots ar Western blot analīzi un pārbaudīts ar anti-HPV16 L1 antivielu CAMVIR-1 [39].

2.7. Nesamazējoša SDS-PAGE

HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 VLP tika sajaukti ar 2x Laemmli parauga buferšķīdumu (BIO-RAD) bez 5% (v/v) 2-merkaptoetanola ({{11}). }ME) un reaģēja istabas temperatūrā (RT) 24 stundas. Paraugi tika atdalīti ar 8–16% TGX traipu nesaturošiem proteīna gēliem (BIO-RAD). Pēc tam gēli tika pārnesti uz PVDF membrānām. Membrānas tika pārbaudītas ar anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb atšķaidījumā 1:4000. Pēc tam membrānas inkubēja ar anti-peles IgG peroksidāzes konjugātu (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) atšķaidījumā 1:4000. Signāls tika izstrādāts un vizualizēts ar hemiluminiscenci, izmantojot Western Blot ECL substrāta komplektu (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV). Blota attēli tika iegūti, izmantojot Odyssey Fc attēlveidošanas sistēmu.

2.8. Molekulārās masas analīze

HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 VLP bez 2-ME apstrādes tika filtrēti caur 1000 kDa molekulmasas robežvērtības (MWCO) ultrafiltrācijas ierīcēm (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 VLP ar 2-ME apstrādi tika nodoti caur 100 kDa MWCO ultrafiltrācijas ierīcēm (Amicon). Retentāti tika atjaunoti līdz sākotnējam tilpumam un savākti no filtra ierīces parauga rezervuāra, savukārt filtrāti tika savākti centrifūgas caurules apakšā. L1 signāls tika mērīts, izmantojot dot blot, kas pārbaudīts ar anti-HPV16 L1 mAb un noteikts ar anti-peles IgG-peroksidāzes konjugātu (Sigma-Aldrich). Attēli tika iegūti, izmantojot Odyssey Fc attēlveidošanas sistēmu ķīmijluminiscences kanālā.

Desert ginseng-Improve immunity

Citanche tubulosa priekšrocības- stiprināt imūnsistēmu

2.9. Negatīvā krāsošana un transmisijas elektronu mikroskopija

Pēc oglekli pārklāto vara režģu (Sigma-Aldrich) uzlādēšanas ultravioletajā gaismā 5 minūtes, komerciālie HPV16 L1 (Abcam), attīrīti L1:P18I10 un L1:T20 VLP līdzsvaroti ar 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl). ) tika absorbēti uz režģiem 1 minūti un trīs reizes noskaloti ar miliQ ūdeni. HPV: HIV VLP tika negatīvi iekrāsoti ar 2% uranilacetātu pie pH 4,5 (Sigma-Aldrich) 1 minūti. Krāsošanas līdzekļu pārpalikums tika noņemts ar Whatman kvalitatīvo filtrpapīru (Sigma-Aldrich). Režģi tika ievietoti sausinātāja kamerā vismaz 2 stundas pirms novērošanas. Attēli tika iegūti, izmantojot transmisijas elektronu mikroskopu (Tecnai Spirit 120 kV) ar palielinājumu attiecīgi SA135K (100 nm) un SA59000 (200 nm).

2.10. Nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēze un Western blotēšanas analīze

Vienādos daudzumos (500 ng) HPV16 L1 proteīna (Abcam), attīrīto L1:P18I10 un L1:T20 VLP sajauca ar 2x Laemmli parauga buferšķīdumu, kas satur 5% 2-ME, un vārīja 95 ◦C temperatūrā 5 minūtes. . Paraugi tika atdalīti ar 8–16% TGX beztraipu proteīna gēliem un pēc tam pārnesti uz PVDF membrānu (Millipore, Burlington, MA, ASV), izmantojot daļēji sausu pārsūtīšanas ierīci (Bio-Rad). Membrāna tika bloķēta ar 5% vājpienu TBST. Pēc tam membrānas tika pārbaudītas ar anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb atšķaidījumā 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 cilpas mAb (NIBSC, EVA3012) atšķaidījumā 1: 40 un HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) attiecīgi atšķaidījumā 1:4000. Pēc tam membrānas inkubēja ar anti-peles IgG peroksidāzes konjugātu (Sigma-Aldrich) atšķaidījumā 1:4000. Signāla attīstībai tika izmantots Western ECL substrāta komplekts (BIO-RAD). Blota attēli tika iegūti, izmantojot Odyssey Fc attēlveidošanas sistēmu ķīmijluminiscences kanālā.

2.11. Peļu imunizācija, serumu savākšana un splenocītu izolēšana

Šis ir sākotnējais koncepcijas pierādījuma pētījums, lai pierādītu HPV imunogenitāti: HIV VLP (L1:P18I10 un L1:T20 VLP). Mūsu HPV deva, ievadīšanas veids un primārā pastiprinājuma intervāls: HIV VLP atsaucās uz iepriekšējiem pētījumiem, kuros peles imunizēja ar liellopu papilomas vīrusu (BPV): HIV VLP antivielu reakcijas ierosināšanai [20,21]. Attīrīts HPV: HIV VLP tika emulģēti ar vienādu tilpumu (225 µg uz katru 0,5 ml devu) alumīnija hidroksifosfāta sulfāta (Thermo Fisher), lai nodrošinātu licencētajai Gardasil{13}} HPV vakcīnai līdzīgu formulu [40]. Visām peļu grupām bija vienāds dzimumu sadalījums (vīrieši n=4 un sievietes n=4 katrā grupā). Grupās A un B BALB/c peles tika imunizētas intramuskulāri (im) ar attiecīgi 10 µg L1:P18I10 vai L1:T20 VLP, ievērojot homologu primārā pastiprinājuma režīmu. C grupā peles tika inokulētas ar 106 KVV BCG.HIVA2auxo.int intradermāli (id, pie pārtikas spilventiņa) un intramuskulāri ar 10 µg L1:P18I10 VLP. D grupā pozitīvās kontroles peles tika inokulētas ar Gardasil- 9 prime, kam sekoja Gardasil-9 pastiprināšana intramuskulāri ar 10 µg HPV16 L1 VLP. E grupā negatīvās kontroles peles tika imunizētas divas reizes ar PBS buferšķīdumu. Galvenās pastiprināšanas intervāls bija 2 nedēļas. Peles tika nogalinātas 28. dienā. Asins paraugi tika savākti no peļu sirdīm. Serumus ieguva centrifugējot un uzglabāja –20 ◦ C temperatūrā ELISA testam. Peļu liesas tika noņemtas un atsevišķi izspiestas caur šūnu sietiņu (Falcon) ar 5 ml šļirces gumijas virzuli. Pēc sarkano asins šūnu noņemšanas ar ACK lizēšanas buferi (Lonza), splenocīti tika mazgāti un atkārtoti suspendēti limfocītu barotnē R10 (RPMI 1640, kas papildināta ar 10% teļa augļa serumu (FCS), penicilīnu-streptomicīnu, 20 mM HEPES un 15 mM {{ 46}}ME) koncentrācijā 2 × 107 šūnas/ml.

2.12. Ar enzīmiem saistīta imūnsorbcijas pārbaude

Lai pārbaudītu HPV16 L1- un HIV-1- specifiskās antivielas, kas saistās ar himērisku HPV: HIV VLP konstrukcijas in vitro, 50 µL vienādas koncentrācijas (200 ng/mL) rekombinantā HPV16 L1 proteīna (Abcam, ab119880). ), attīrīti L1:P18I10 un L1:T20 VLP 50 mM karbonāta bikarbonāta buferšķīdumā (pH=9.6) (Sigma) tika 2-kārtīgi atšķaidīti un pārklāti uz Maxisorb plāksnēm (Nunc). Plāksnes inkubēja nakti 4 ◦C temperatūrā. Plāksnes tika bloķētas ar bloķējošo buferšķīdumu (5% vājpiena TBST) 37 ◦ C temperatūrā vismaz 2 stundas. Pēc divreiz mazgāšanas ar TBST, ar VLP pārklātās plāksnes inkubēja ar anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb atšķaidījumā 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) atšķaidījumā 1:8000 un anti- HIV-1 gp120 V3 cilpas mAb (NIBSC, EVA3012) atšķaidījumā 1:40 attiecīgi bloķējošā buferšķīdumā 37 ◦C temperatūrā 2 stundas. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar TBST, plāksnes 1 stundu inkubēja ar rekombinanto proteīna G peroksidāzes konjugātu (Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV) atšķaidījumā 1:4000 bloķējošā buferšķīdumā 37 ◦C temperatūrā. TMB tika izmantots, lai izstrādātu ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa (ELISA) signālu, un tas tika apturēts ar 50 µL 2M H2SO4. Katras iedobes optiskais blīvums (OD) tika izmērīts un reģistrēts pie viļņa garuma 450 nm, izmantojot EL × 800 absorbcijas mikroplašu lasītāju.

Lai izmērītu VLP inducētās antivielas BALB/c pelēm, mikrotitrēšanas plates tika pārklātas ar 50 µL 2 µg/ml rekombinantā HPV16 L1 proteīna (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10 peptīdu (NIBSC, ARP34). T20 peptīds (NIBSC, ARP984) attiecīgi ar 50 mM karbonāta-bikarbonāta buferšķīdumu (pH=9,6). Plāksnes inkubēja nakti 4 ◦C temperatūrā. Plāksnes tika bloķētas ar bloķējošo buferšķīdumu (5% vājpiena TBST) 37 ◦ C temperatūrā vismaz 2 stundas. Tajā pašā laikā serumi, kas savākti no grupas AE imunizētām pelēm, tika atšķaidīti ar 5% vājpienu TBST proporcijā 1:50. Pēc divreiz mazgāšanas ar TBST, plāksnes inkubēja ar atšķaidītu serumu 37 ◦ C temperatūrā 2 stundas. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar TBST plāksnēm pievienoja rekombinanto proteīna G HRP konjugātu atšķaidījumā 1:4000 bloķējošā buferšķīdumā un inkubēja 37 ◦C 1 stundu. TMB tika izmantots, lai izstrādātu ELISA signālu un apturēts ar 50 µL 2M H2SO4. Katras iedobes OD tika mērīts pie viļņa garuma 450 nm, izmantojot EL × 800 absorbcijas mikroplašu lasītāju (Biotek).

2.13. IFN-ELISpot tests

Ar enzīmu saistītā imūnās absorbējošās vietas (ELISpot) tests tika veikts, izmantojot komerciālo peles IFN-ELISpot komplektu (Mabtech, Nacka Strand, Zviedrija), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. ELISpot plāksnes (MSISP4510, 96-iedobju plāksnes ar polivinilidēna difluorīda membrānām, Millipore, Middlesex County, MA, ASV) tika apstrādātas ar 70% EtOH un pārklātas ar attīrītu anti-peļu interferona (IFN-) uztveršanas monoklonālo antivielu, kas atšķaidīta fosfātu buferšķīdums (PBS) līdz galīgajai koncentrācijai 5 µg/mL 4 ◦C nakti. Pēc tam katrā iedobē tika pievienoti 2, 5 × 105 svaigi splenocīti. Pēc tam A un B grupas šūnas tika stimulētas ar attiecīgi 2 µg/ml HPV16 L1 VLP un HIV-1 P18I10 peptīdiem. Visi paraugi un kontroles tika izklāti divos iedobēs. ELISpot testi tika inkubēti 16 stundas 37 ◦C, 5% CO2. Pēc tam plāksnes 5 reizes nomazgāja ar PBS, 2 stundas inkubēja ar biotinilētu anti-IFN-monoklonālo antivielu (mAb), kas atšķaidīts PBS 2% teļa augļa serumā (FCS) līdz galīgajai koncentrācijai 2 µg/ml, mazgā 5 reizes. PBS un inkubēja ar streptavidīna-sārmainās fosfatāzes konjugātu PBS 2% FCS. Pēc tam plāksnes 5 reizes nomazgāja ar PBS un pēc tam inkubēja ar 100 µL 5-brom-4-hlor-3-indolilfosfāta (BCIP)/nitrozilā tetrazolija (NBT) substrāta šķīduma (Sigma-Aldrich). , Sentluisa, MO, ASV). Pēc 5–10 minūtēm plāksnes nomazgāja ar krāna ūdeni, žāvēja un radušos plankumus saskaitīja, izmantojot ELISPOT lasītāju (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberga, Vācija). Katram dzīvniekam fona reakciju vidējā vērtība tika atsevišķi atņemta no visām iedobēm, lai varētu salīdzināt IFN plankumu veidojošās šūnas (SFC)/106 starp grupām. Lai definētu pozitīvas atbildes, slieksnis tika definēts kā vismaz pieci plankumi katrā iedobē un atbildes, kas pārsniedz vidējo plankumu skaitu negatīvās kontroles iedobēs plus trīs negatīvās kontroles iedobju standartnovirzes.

2.14. Statistiskā analīze

Visa statistiskā analīze tika veikta, izmantojot Prism 6 GraphPad programmatūru (CA, ASV). Mēs izmantojām datus no eksperimentiem, kas veikti ar 5 dažādām ELISA plākšņu pārklājuma koncentrācijām (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) rekombinantā HPV16 L1 proteīna (Abcam, ab119880) un HPV: HIV VLP. Mēs apkopojām datus no 2 grupām (HPV16 L1 un HPV: HIV VLP) un savācām trīs atkārtojumus katrai pārklājuma koncentrācijai. Diagrammā Prismā dati tika parādīti kā izkliedes diagramma, kas parāda pārklājuma koncentrāciju (ng/mL) uz X ass un OD450 uz Y ass. Tā kā mēs izvirzījām hipotēzi, ka mūsu in vitro ELISA dati ir saistīti lineārā veidā, mēs veicām lineārās regresijas analīzi un salīdzinājām abu līniju slīpumus, lai apstiprinātu šo datu kopu-1 un datu kopu-2 (antivielu). reaktivitāte starp HPV16 L1 un HPV: HIV VLP) savā darbībā atšķiras. Mēs izvēlējāmies 95% ticamības intervālus līdzās vispiemērotākajai līnijai. Prizma automātiski pārklāja lineāro regresijas līniju abās mūsu datu kopās, un tā ir uzzīmējusi punktētu līniju, kas atspoguļo 95% ticamības intervālus. Lineārās regresijas analīzes laikā programmatūra aprēķināja tikai mūsu datu kopas vidējo Y vērtību, kas liecināja par piemērotību. Turklāt Prism mums sniedza komentāru, tāpēc varam secināt, ka atšķirības starp abām nogāzēm ir ārkārtīgi būtiskas.

Mums bija 5 datu komplekti (ELISA) un 4 komplekti (ELISPOT), kas savākti no peļu imunizācijas eksperimentiem. Šajās datu kopās katrā grupā bija vienāds skaits (vīriešu n=4 un sieviešu n=4). Mēs izmantojām Gardasil -9-imunizētās peles kā pozitīvās kontroles grupu un ar PBS imunizētās peles kā negatīvās kontroles grupu. Mūsu izstrādāto eksperimentu dati nesakrita vai nebija savienoti pārī. Mēs veicām vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), lai noskaidrotu, vai šie rādītāji atšķiras. Vispirms mēs pārbaudījām, ka mūsu dati atbilst Gausa normālajam sadalījumam. Mēs atklājām, ka dažas datu grupas ELISA testā neizturēja Gausa normālā sadalījuma testu. Tāpēc mēs veicām šo datu neparametrisku statistisko analīzi. Turpretim visas datu grupas ELISPOT testā ir izturējušas Gausa normālā sadalījuma testu. Tādējādi mēs veicām šo datu parametrisko statistisko analīzi. Nozīmīguma slieksnis un ticamības līmenis tika iestatīts uz 0,05 (atbilst 95% ticamības intervālam). p vērtība, kas vispārīgi parāda varbūtību, ka starp grupām pastāv atšķirības. Tā kā mūsu galvenās rūpes par šo eksperimentu ir atšķirības starp mūsu grupām, vairāki salīdzinājumi Prismā sniedza mums visu grupu salīdzināšanas rezultātu ar visām citām grupām.

2.15. Ētikas paziņojumi

Sešas līdz astoņas nedēļas vecas BALB/c peles tika iegādātas no Envigo (Inotiv uzņēmums, Čikāga, IL, ASV) un apstiprinājušas vietējās varas iestādes (Generalitat de Catalunya, projekta numurs 11157) un Universitat Autònoma de Barcelona ētikas komiteja. Eksperimenti ar dzīvniekiem stingri atbilda Katalonijas ģenerāldirektorāta (Generalitat de Catalunya) tiesību aktiem par dzīvnieku labturību. Visus eksperimentus apstiprināja vietējā pētniecības ētikas komiteja (procedūra 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).

3. Rezultāti

3.1. L1:P18I10 un L1:T20 imunogēnu projektēšana un HPV novērtēšana: HIV proteīna ekspresija, izmantojot 293F ekspresijas sistēmu

P18I10 peptīds no HIV-1 Env trešā mainīgā domēna (V3) cilpas un T20 peptīds no HIV-1 Env membrānas proksimālā ārējā reģiona (MPER) tika ievietots HPV16 L1 DE cilpas proteīnā, lai radītu kimēru L1. :P18I10 un L1:T20 imunogēni. Himēriskās L1:P18I10 un L1:T20 DNS kodējošās sekvences tika klonētas pcDNA3.1 (+) plazmīdas DNS ekspresijas vektorā īslaicīgai transfekcijai 293F šūnās (1.A attēls). HPV16 L1, himērisko L1:P18I10 un L1:T20 kapsīdu proteīnu monomēru struktūras tika provizoriski prognozētas, izmantojot SWISS modeļa serveri (1B attēls). HPV16 galvenais kapsīda proteīns L1 (7cn2.1.R) tika izvēlēts kā strukturālā veidne, lai izveidotu HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 kapsīda proteīna homoloģijas modelēšanu. Salīdzinot ar saistītā P18I10 peptīda konformāciju iepriekšējā pētījumā [41], mūsu himēriskā L1:P18I10 proteīna P18I10 peptīda galvenās ķēdes virziens no N līdz C gala virziens ir no labās uz kreiso pusi (1B attēls, vidējais un augšējais panelis). un eksponējošās P18I10 sānu ķēdes varētu mijiedarboties ar T šūnu receptoriem (1.B attēls, vidējais un apakšējais panelis). Salīdzinot ar HIV-1 saplūšanas inhibitora peptīda struktūru iepriekšējā pārskata dokumentā [42], uz HPV16 L1 kapsīda proteīna ievietotais T20 peptīds ir parādīts kā spirālei līdzīgs veidojums (1.B attēls, labais un augšējais panelis ), un eksponējošās T20 sānu ķēdes potenciāli varētu atpazīt B šūnu receptori (1.B attēls, labais un apakšējais panelis). Tā kā HPV16 L1 kapsīda proteīni var viendabīgi apvienoties T=7 ikosaedriskā daļiņā ar 72 pentamēriem kapsomēriem [43], augsta blīvuma P18I10 vai T20 peptīdu parādīšana uz himēriskā HPV ārējo virsmu: HIV VLP ir potenciāli spēcīgi imūnstimulējoši. lai izraisītu epitopam specifiskas imūnās atbildes.

Figure 1. L1:P18I10 and L1:T20 immunogen design and construction of chimeric HPV: HIV VLPs by using 293F expression system. (A) The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 DNA coding sequences were cloned into pcDNA3.1+ expression vectors, respectively, for transient transfection in 293F cells. (B) Prediction of monomer structures of HPV16 L1 and chimeric HPV: HIV capsid proteins by using the SWISS-model server. HPV16 major capsid protein L1 (7cn2.1.R) was selected as the structural template to build the HPV16 L1 (left panel), L1:P18I10 (middle panel), and L1:T20 (right panel) capsid protein homology modeling. Secondary structural elements of HPV16 L1 capsid protein are labeled, with letters h1–h5 for the 5 α-helices. Loops of HPV16 L1 capsid protein between strands are labeled BC, CD, DE, EF, FG, and HI. Secondary structural elements of HIV-1 P18I10 and T20 peptides L1 are labeled by the arrows (top panel). The part of the P18I10 and T20 peptide that protrudes above the surface of the HPV16 L1 capsid protein is indicated by the arrows (bottom panel). (C) Immunofluorescence staining of L1 protein in 293F cells. The following pDNA.L1:P18I10 (left), pDNA.L1:T20 (middle), and pDNA.without insertion (right) were transfected in 293F cells. The transfected cells were probed with anti-HPV16 L1 mAb and detected with anti-mouse IgG-FITC (green channel). Cell nuclei were stained with DAPI (blue channel). Immunofluorescence images were merged by using Adobe Photoshop


1. attēls. L1:P18I10 un L1:T20 imunogēna projektēšana un himēriskā HPV: HIV VLP konstrukcija, izmantojot 293F ekspresijas sistēmu. (A) Himēriskās L1:P18I10 un L1:T20 DNS kodējošās sekvences tika klonētas attiecīgi pcDNA3.{13}} ekspresijas vektoros īslaicīgai transfekcijai 293F šūnās. (B) HPV16 L1 un himēriskā HPV monomēru struktūru prognozēšana: HIV kapsīdu proteīni, izmantojot SWISS modeļa serveri. HPV16 galvenais kapsīda proteīns L1 (7cn2.1.R) tika izvēlēts kā strukturālā veidne, lai izveidotu HPV16 L1 (kreisais panelis), L1:P18I10 (vidējais panelis) un L1:T20 (labais panelis) kapsīda proteīna homoloģijas modelēšanu. HPV16 L1 kapsīda proteīna sekundārie strukturālie elementi ir marķēti ar burtiem h1–h5, kas apzīmē 5 -spirāles. HPV16 L1 kapsīda proteīna cilpas starp pavedieniem ir marķētas ar BC, CD, DE, EF, FG un HI. HIV-1 P18I10 un T20 peptīdu L1 sekundārie strukturālie elementi ir apzīmēti ar bultiņām (augšējais panelis). P18I10 un T20 peptīda daļa, kas izvirzīta virs HPV16 L1 kapsīda proteīna virsmas, ir norādīta ar bultiņām (apakšējais panelis). (C) L1 proteīna imunofluorescences krāsošana 293F šūnās. 293F šūnās tika transficēti šādi pDNA.L1:P18I10 (pa kreisi), pDNA.L1:T20 (vidū) un pDNA.bez ievietošanas (pa labi). Transfektētās šūnas tika pārbaudītas ar anti-HPV16 L1 mAb un noteiktas ar anti-peles IgG-FITC (zaļo kanālu). Šūnu kodoli tika iekrāsoti ar DAPI (zilu kanālu). Imunofluorescences attēli tika apvienoti, izmantojot Adobe Photoshop

Tā kā HPV16 L1 proteīna C termināla secība infekcijas laikā mediē šūnu kodola importa mehānismus [44], iepriekšējos pētījumos ir identificēti HPV16 L1 proteīna kodola lokalizācijas signāli (NLS) [45]. CAMVIR-1 monoklonālā antiviela tika atlasīta, lai atpazītu HPV16 L1 epitopu (GFGAMDF, 230–236 aa) [39], un fluoresceīna krāsviela FITC tika izmantota kā reportieris, lai uzraudzītu L1:P18I10 un L1 ekspresiju: T20 proteīni. Imūnfluoloģiskie attēli skaidri parādīja, ka HPV16 L1 (zaļā krāsā) galvenokārt tika lokalizēts 293F šūnu kodolos (zilā krāsā). Ar kontroles plazmīdu transektētās 293F šūnās (pcDNA3.1 plazmīda bez ieliktņa) netika novērots L1 signāls (1.C attēls). Rezultāti liecināja, ka gan himēriskos L1:P18I10, gan L1:T20 kapsīdu proteīnus var ekspresēt, izmantojot polietilēnimīna (PEI) mediētu transfekciju un atpazīt ar HPV16 L1 CAMVIR-1 monoklonālo antivielu.

3.2. L1:P18I10 un L1:T20 VLP attīrīšana, izmantojot hromatogrāfijas metodes

The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa un heterologa apakšējā josla<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.

Figure 2. Purification and characterization of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Schematic process flowchart of L1:P18I10 and L1:T20 VLP purification by chromatography. (B, C) Western blot analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLP samples from each purification step. The signal of L1 in each purification step was characterized by Western blot analysis probed with anti-HPV16 L1 mAb. The arrow indicates the molecular weight of ~56 kDa of L1:P18I10 and ~58 kDa of L1:T20 proteins. Lane 1: clarified cell lysate (CCL); Lane 2: flow-through (FT) from cation exchange chromatography (CEC) sample loading; Lane 3: CEC eluate; Lane 4: FT from CEC 2M NaCl regeneration step; Lane 5: size exclusion chromatography (SEC) FT-1; Lane 6: SEC FT-2; Lane 7: FT from heparin affinity chromatography (H-AC) sample loading; Lane 8: H-AC eluate; Lane 9: FT from H-AC 2M NaCl regeneration step; Lane 10: 10-fold diafiltration.


2. attēls. L1:P18I10 un L1:T20 VLP attīrīšana un raksturojums. (A) Shematiska procesa blokshēma L1:P18I10 un L1:T20 VLP attīrīšanai ar hromatogrāfiju. (B, C) L1:P18I10 un L1:T20 VLP paraugu Western blot analīze no katra attīrīšanas posma. L1 signālu katrā attīrīšanas posmā raksturoja ar Western blot analīzi, kas pārbaudīta ar anti-HPV16 L1 mAb. Bultiņa norāda L1: P18I10 ~ 56 kDa un L1: T20 proteīnu ~ 58 kDa molekulmasu. 1. josla: dzidrināts šūnu lizāts (CCL); 2. josla: caurplūde (FT) no katjonu apmaiņas hromatogrāfijas (CEC) parauga ielādes; 3. josla: CEC eluāts; 4. josla: FT no CEC 2M NaCl reģenerācijas posma; 5. josla: izmēru izslēgšanas hromatogrāfija (SEC) FT-1; 6. josla: SEC FT-2; 7. josla: FT no heparīna afinitātes hromatogrāfijas (H-AC) parauga ielādes; 8. josla: H-AC eluāts; 9. josla: FT no H-AC 2M NaCl reģenerācijas posma; 10. josla: 10-locījuma diafiltrācija.

3.3. L1:P18I10 un L1:T20 VLP in vitro stabilitāte un pašmontāža

Lai apstiprinātu, ka attīrītiem HPV: HIV VLP bija līdzīga stabilitāte in vitro kā HPV16 L1 VLP, mēs veicām nereducējošu SDS-PAGE, lai novērtētu HPV: HIV kapsīdu proteīnu disulfīdu šķērssaistījumu (3.A attēls). Ir zināms, ka pH, jonu stiprums, temperatūra [52] un redoksvide korelē ar HPV16 L1 kapsīdu proteīnu [53] disulfīda saitēm. HPV L1 VLP mēdz pašmontēties pie zema pH un lielas jonu stiprības. Lai maksimāli izjauktu VLP, parasti ir nepieciešama augsta reducējošā līdzekļa koncentrācija, piemēram, 5% 2-merkaptoetanols (2-ME) salīdzinoši ilgu laiku [54]. Ja nebija reducētāju 2-ME, tikai neliela daļa no HPV-16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 proteīna migrēja uz monomēriem ar šķietamo molekulmasu (MW) 55 kDa. . Apmēram 70% L1 proteīnu bija disulfīds saistīti lielākos dimēros vai pentamēros ar paredzamo MW 110 kDa un 280 kDa (3.A attēls, 2., 4. un 6. josla). Turpretim gandrīz visi HPV-16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 proteīni demontāžas buferšķīdumā parādījās monomēru struktūrās neredukējošā SDS-PAGE (3.A attēls, 3., 5. un 7. josla). Šie rezultāti liecināja, ka attīrītu L1:P18I10 un L1:T20 VLP stabilitātei in vitro bija līdzīgi disulfīdu šķērssavienojumi kā HPV16 L1 VLP ar tādiem pašiem pH, jonu stipruma un termiskajiem apstākļiem. Šķiet, ka attīrītie VLP tiek sadalīti līdz pentamēru, trimeru un dimēru līmenim pēc ilgstošas ​​iedarbības ar augstu reducējošo vielu koncentrāciju. Šie dati saskan ar iepriekšējiem pētījumiem [53,54] Tomēr HPV: HIV VLP izjaukšana joprojām nebija pabeigta (monomēri).

Figure 3. In vitro stability of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Disulfide cross-linking of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in non-reducing SDS-PAGE. The HPV16 L1 VLPs, purified L1:P18I10, and L1:T20 VLPs were mixed with Laemmli sample buffer in the absence or presence of 2-mercaptoethanol (2-ME), respectively, and analyzed by non-reducing SDS-PAGE. The position of the L1 monomer (55 kDa), L1 dimer (110 kDa), and L1 pentamer (280 kDa) are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 VLP; Lane 3: HPV16 L1 VLP treated with 2-ME; Lane 4: L1:P18I10 VLP; Lane 5: L1:P18I10 VLP treated with 2-ME; Lane 6: L1:T20 VLP; Lane 7: L1:T20 VLP treated with 2-ME. (B) Molecular mass analysis of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. Assembled VLPs untreated with 2-ME (lanes 2, 4, and 6) were filtered out through 1000kDa molecular weight cutoff (MWCO) diafiltration devices (upper panel). Disassembled VLPs treated with 2-ME (lanes 3, 5, and 7) were filtered out through 100kDa MWCO centrifugal filter devices (lower panel). Retentates (R) were collected from filter device sample reservoirs, while the filtrates (F) were collected at the bottom of centrifuge tubes. The L1 protein signal was detected by using a dot blot probed with anti-HPV16 L1 mAb.


3. attēls. L1:P18I10 un L1:T20 VLP stabilitāte in vitro. (A) L1:P18I10 un L1:T20 VLP disulfīda šķērssaistīšana nereducējošā SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP, attīrīti L1:P18I10 un L1:T20 VLP tika sajaukti ar Laemmli parauga buferšķīdumu attiecīgi bez 2-merkaptoetanola (2-ME) vai tā klātbūtnē, un analizēti ar nereducējošo metodi. SDS LAPA. L1 monomēra (55 kDa), L1 dimēra (110 kDa) un L1 pentamēra (280 kDa) pozīcija ir norādīta ar bultiņu. 1. josla: proteīna molekulmasas marķieris; 2. josla: HPV16 L1 VLP; 3. josla: HPV16 L1 VLP apstrādāts ar 2-ME; 4. josla: L1:P18I10 VLP; 5. josla: L1:P18I10 VLP apstrādāta ar 2-ME; 6. josla: L1:T20 VLP; 7. josla: L1:T20 VLP apstrādāta ar 2-ME. (B) L1:P18I10 un L1:T20 VLP molekulmasas analīze. Samontētie VLP, kas nav apstrādāti ar 2-ME (2., 4. un 6. josla), tika filtrēti caur 1000 kDa molekulmasas robežvērtības (MWCO) diafiltrācijas ierīcēm (augšējais panelis). Izjauktie VLP, kas apstrādāti ar 2-ME (3., 5. un 7. josla), tika filtrēti caur 100 kDa MWCO centrbēdzes filtra ierīcēm (apakšējais panelis). Retentāti (R) tika savākti no filtra ierīces paraugu rezervuāriem, savukārt filtrāti (F) tika savākti centrifūgas mēģenes apakšā. L1 proteīna signāls tika noteikts, izmantojot dot blot, kas pārbaudīts ar anti-HPV16 L1 mAb.

To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) un tika saglabāti retentātos. Šis modelis sakrita ar datiem, kas tika novēroti nereducējošā SDS-PAGE. Lai gan visas VLP grupas, kas apstrādātas ar 2-ME, tika parādītas monomēru joslā (~ 55 kDa) nereducējošajā SDS-PAGE (3.A attēls, 3., 5. un 7. josla). Tomēr attiecīgie samazinātie VLP netika filtrēti caur 100 kDa ultrafiltrācijas membrānām (3.B attēls, apakšējais panelis). Šie rezultāti liecināja, ka himēriskais HPV: HIV proteīni spēj paši savākties lielākās daļiņās, bet maksimālai VLP sadalīšanai monomēros bija nepieciešama ne tikai disulfīda saišu samazināšana, bet arī citi denaturējoši faktori, piemēram, pH vai jonu stiprums.

3.4. L1:P18I10 un L1:T20 VLP morfoloģiskais raksturojums

Transmisijas elektronu mikroskopija (TEM) tika izmantota, lai pārbaudītu HPV16 L1 un HPV: HIV VLP morfoloģisko konformāciju. HIV-1 P18I10 un T20 peptīdi tika ievietoti attiecīgi HPV16 L1 proteīna DE cilpās. Šie komerciālie HPV16 L1 un himēriskie HPV: HIV kapsīdu proteīni var spontāni pašmontēties in vitro integrālos VLP, kuru diametrs ir aptuveni 50–60 nm (4A–C attēls, labais panelis). Salīdzinot ar iepriekšējos pētījumos publicētajiem HPV16 L1 VLP elektronu mikrogrāfiem [55,56], HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 VLP ikozaedriskā struktūra šeit bija mazāk kontrastējoša un neskaidra. To varētu attiecināt uz negatīvo traipu reaģentu, ko izmantojām šajā pētījumā. Mūsu nesenajā pētījumā, kas publicēts iepriekšējā pētījumā [37] un citā notiekošajā darbā, kurā tiek veikta salīdzinošā pārskatīšana (dati nav parādīti), mēs esam ieguvuši labu elektronu mikrogrāfiju kvalitāti un izšķirtspēju, ja no rauga un bakulovīrusa iegūti L1: P18I10 VLP (tā pati himēra konstrukcija) tika līdzsvaroti PBS un negatīvi iekrāsoti ar fosfotungstīnskābi (PTA). Tā kā šajā pētījumā mēs izmantojām dažādas VLP ražošanas un attīrīšanas sistēmas, no zīdītāju šūnām iegūtie L1: P18I10 un L1: T20 VLP tika līdzsvaroti ar Tris-HCl un negatīvi iekrāsoti ar uranilacetātu. Lai gan elektronu mikrogrāfiju varētu uzlabot, mēs joprojām varējām novērot skaidru modeli, ka lielākā daļa HPV16 L1, L1: P18I10 un L1: T20 kapsīda proteīna TEM ekrānā var patstāvīgi savākties morfoloģiskos VLP (4A–C attēls, kreisais panelis). ). Pamatā HPV VLP ir aizsargāti pret agregāciju augsta sāls daudzuma apstākļos [57]. Dažas no nosakāmās HPV16 L1 un HPV agregācijas: HIV VLP zema sāls satura Tris-HCl buferšķīdumā varēja redzēt zemākā palielinājumā (4A–C attēls, kreisais panelis). No šiem rezultātiem mēs secinājām, ka daļējas L1 DE cilpas sekvences modifikācija, ievietojot HIV-1 P18I10 vai T20 peptīdus, būtiski neietekmēja HPV: HIV VLP morfoloģiju.

Figure 4. Electron micrographs of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (A) Morphology of HPV16 VLPs. (B) Morphology of L1:P18I10 VLPs. (C) Morphology of L1:T20 VLPs. Purified VLPs were absorbed on UV-charged carbon-coated copper grids, and negatively stained with 2% uranyl acetate. Images were acquired under transmission electron microscopy. The bar represents 200 nm at magnification 59,000 (left panel) and 100 nm at magnification 135K (right panels), respectively


4. attēls. L1:P18I10 un L1:T20 VLP elektronu mikrogrāfijas. (A) HPV16 VLP morfoloģija. (B) L1:P18I10 VLP morfoloģija. (C) L1:T20 VLP morfoloģija. Attīrīti VLP tika absorbēti uz UV lādētiem ar oglekli pārklātiem vara režģiem un negatīvi iekrāsoti ar 2% uranilacetātu. Attēli tika iegūti transmisijas elektronu mikroskopijā. Josla attēlo attiecīgi 200 nm pie palielinājuma 59, 000 (kreisais panelis) un 100 nm pie palielinājuma 135K (labie paneļi).

3.5. HPV-16 un HIV-1 epitopu attēlojums un reaktivitāte 

Lai apstiprinātu, ka secīgi HIV-1 P18I10 vai 2F5 epitopi tika parādīti hromatogrāfijā attīrītos L1:P18I10 vai L1:T20 VLP, tika veikta Western blot analīze un netiešā ELISA, izmantojot epitopam specifiskus mAb. Mēs atlasījām labi zināmu monoklonālo antivielu (mAb) ar nosaukumu CAMVIR-1, lai atpazītu HPV16 L1 proteīna augsti konservēto epitopu (GFGAMDF, aa 230–236) [39,58]. Iepriekš publicēts mAb, kura mērķauditorija ir HIV-1 gp120 V3 cilpas epitops (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308–322), tika izvēlēts, lai noteiktu secīgus P18I10 epitopus (RGPGRAFVTI, aa311–320) [59]. No otras puses, T20 peptīda raksturošanai tika izvēlēta plašā neitralizējošā antiviela (bnAb), kas atpazīst HIV-1 gp41 2F5 epitopu (ELDKWA) pret plašu HIV-1 laboratorijas celmu klāstu [ 60,61]. Western blot tests, kas tika pārbaudīts ar HPV16 L1 mAb, uzrādīja joslas 55, 56 un 58 kDa, kas atbilst attiecīgi HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 proteīnam (5A, B attēls, pa kreisi). L1:P18I10 proteīna molekulmasa (MW) bija līdzīga HPV16 L1 proteīnam (5.A attēls, pa kreisi). Josla, kas atbilst L1:T20 proteīnam, tika novērota nedaudz augstāka par HPV16 L1 proteīnu, kā prognozēts no papildu aminoskābju secības (5.B attēls, pa kreisi). Aptuveni 56 un 58 kDa joslas, kas atbilst L1:P18I10 un L1:T20 proteīnam, tika noteiktas Western blot testā, kas tika pārbaudīts attiecīgi ar anti-HIV-1 gp120 V3 un 2F5 mAb (5.A, B attēls, pa labi). ). Mēs uzskatījām, ka anti-2F5-iekrāsotā L1:T20 proteīna molekulmasa (MW) bija pareiza un atbilst paredzētajam 58 kDa (5.B attēls pa labi). Tomēr anti-HIV-1 gp120 V3-iekrāsotā L1:P18I10 proteīna MW ir nedaudz mazāks (5.A attēls pa labi). To varētu saistīt ar himērisko L1: P18I10 proteīnu neviendabīgo struktūru. Tā kā SDS-PAGE denaturēšanas apstākļos secīgā epitopa konformācija var tikt zaudēta. Tāpēc mēs tālāk veicām netiešo ELISA, lai parādītu konformācijas P18I10 peptīdu, kas pareizi parādīts mūsu himēriskajos L1: P18I10 VLP (attēls 5E). No otras puses, mūsu izmantotā anti-HIV-1 gp120 V3 cilpas antiviela atpazina visu HIV-1 V3 cilpu, nevis P18I10 epitopu. Līdz ar to kopējais anti-V3 signāls bija zemāks (5.A, B attēls, labie paneļi). Tomēr šie rezultāti norādīja, ka secīgie HIV-1 P18I10 un T20 peptīdi ir parādīti HPV: HIV VLP.

Figure 5. Presentation of HPV-16 and HIV-1 epitopes. (A, B) Sequential epitope detection of chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were analyzed by Western blot, using anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 and 2F5 mAb. The HPV16 L1 VLPs were used as a control. The molecular weight of the L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa), and L1:T20 (58 kDa) proteins are indicated by the arrow. Lane 1: protein molecular weight marker; Lane 2: HPV16 L1 protein; Lane 3: L1:P18I10 protein; Lane 4: L1:T20 protein. (C, D) Binding of HPV16 L1 mAb to chimeric L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. (E) Binding of anti-HIV-1 gp120 V3 mAb to chimeric L1:P18I10 VLPs. (F) Binding of HIV-1 2F5 mAb to chimeric L1:T20 VLPs. The line graph of indirect ELISAs was performed to detect the conformational epitopes of recombinant HPV16 L1, L1:P18I10, and L1:T20 VLPs bound to anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 or 2F5 mAbs, respectively. Data are representative of three independent experiments. A simple linear regression test was done to compare the line difference of purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs with the standard curve of commercial L1 VLPs; ns: not significant; ** p < 0.01.


5. attēls. HPV-16 un HIV-1 epitopu attēlojums. (A, B) Himērisko L1:P18I10 un L1:T20 VLP secīga epitopa noteikšana. Attīrītie L1:P18I10 un L1:T20 VLP tika analizēti ar Western blot, izmantojot anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 un 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP tika izmantoti kā kontrole. L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) un L1:T20 (58 kDa) proteīnu molekulmasa ir norādīta ar bultiņu. 1. josla: proteīna molekulmasas marķieris; 2. josla: HPV16 L1 proteīns; 3. josla: L1:P18I10 proteīns; 4. josla: L1:T20 proteīns. (C, D) HPV16 L1 mAb saistīšanās ar himēriskajiem L1:P18I10 un L1:T20 VLP. (E) Anti-HIV-1 gp120 V3 mAb saistīšanās ar himēriskajiem L1:P18I10 VLP. (F) HIV-1 2F5 mAb saistīšanās ar himēriskajiem L1:T20 VLP. Netiešo ELISA līniju diagramma tika veikta, lai noteiktu rekombinanto HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 VLP konformācijas epitopus, kas saistīti attiecīgi ar anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 vai 2F5 mAb. Dati atspoguļo trīs neatkarīgus eksperimentus. Tika veikts vienkāršs lineārās regresijas tests, lai salīdzinātu attīrīto L1:P18I10 un L1:T20 VLP līniju atšķirību ar komerciālo L1 VLP standarta līkni; ns: nav nozīmīgs; ** p < 0,01.

Turklāt, lai noteiktu, vai HIV{{{{50}}}} konformācijas epitopi, kas atrodas uz HPV: HIV VLP var tikt identificēti ar gp120 V3 un 2F5 neitralizējošām antivielām in vitro, mēs veicām netiešo ELISA testu, lai pārbaudītu. epitopu saistīšanas specifika un reaktivitāte. Kā parādīts 5C attēlā, D, HPV16 L1, L1:P18I10 un L1:T20 VLP tika atpazīti ar anti-L1 mAb. Mēs veicām lineāro regresijas analīzi, lai salīdzinātu katras atšķaidīšanas līnijas slīpumu. Rezultāti atklāja, ka L1:P18I10 vai L1:T20 VLP L1 epitopu saistīšanās specifika neatšķīrās no HPV16 L1 VLP. Turklāt anti-HIV-1 gp120 V3 mAb spēja saistīt L1:P18I10 VLP, bet ne HPV16 L1 VLP (5. attēls). Turklāt 2F5 mAb varēja atpazīt L1:T20 VLP, bet ne HPV16 L1 VLP (5.F attēls). Pēc lineārās regresijas analīzes gp120 V3 epitopu saistīšanās specifikas atšķirība starp L1:P18I10 un HPV16 L1 bija ārkārtīgi nozīmīga (p <0,01%). L1:T20 VLP 2F5 epitopu saistīšanās specifika būtiski atšķīrās no HPV16 L1 VLP (p < 0,01%). Šis modelis atklāja, ka hidrofobie šūnu lipīdi nav nepieciešami 2F5-neitralizējošu antivielu saistīšanai ar HPV: HIV VLP in vitro. Lai gan anti-HIV-1 gp120 V3 un 2F5 neitralizējošo antivielu pret HPV: HIV VLP reaktivitāte ir salīdzinoši neliela, anti-HIV-1 gp120 V3 un 2F5 mAb saistīšanās ar HPV: HIV VLP bija nozīmīga. specifisks epitopam.

3.6. L1:P18I10 un L1:T20 VLP imunogenitāte pēc BALB/c pelēm imunizācijas

Mēs novērtējām HPV{0}} un HIV-1-specifiskās imūnās atbildes pēc BALB/c peļu imunizācijas ar L1:P18I10 un L1:T20 VLP. Imunizācijas grafiks ir parādīts 6.A attēlā. Tā kā VLP izraisītā imunogenitāte pēc gļotādas ievadīšanas parasti bija vājāka nekā pēc sistēmiskas ievadīšanas, peles tika imunizētas intramuskulāri ar vienu sesto daļu Gardasil-9 HPV16 L1 devas [22,62]. Alumīnija hidroksifosfāta sulfāta adjuvants himēriskā HPV devai (10 µg/100 µL): HIV VLP tika pielāgots tādai pašai koncentrācijai (1 mg/1 ml) kā Gardasil{19}}. Lai novērtētu dzimumu atšķirības vakcinācijas rezultātos, tika novērtēta antivielu atbildes reakcija starp peļu tēviņiem (n=4) un mātītēm (n=4). Grupā L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP un Gardasil-9 peļu mātīšu anti-HPV16 L1 antivielu atbildes reakcijas vidēji bija augstākas nekā peļu tēviņiem (6.B attēls). 2 no 4 (50%) L1:P18I10 VLP imunizētām mātītēm, 3 no 4 (75%) L1:T20 VLP imunizētām mātītēm un visām (100%) Gardasil imunizētajām peļu mātītēm izraisīja augstāku anti-L1 antivielu titru nekā peļu tēviņi. Anti-L1 atbildes reakcijas, ko izraisīja peļu mātītes Gardasil-9 grupā, bija ievērojami augstākas nekā peļu tēviņiem (p=0.0041) (6.B attēls). Ļoti zems anti-L1 antivielu atbildes līmenis tika konstatēts BCG.HIVA ievadīšanas un L1:P18I10 VLP pastiprināšanas grupā. Šis modelis atbilst iepriekšējiem atklājumiem, kas apraksta, ka BCG galvenokārt izraisa T-šūnu reakcijas, nevis IgG veidošanos [63].

Figure 6. Induction of humoral immune responses by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A) All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Groups A and B: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 or L1:T20 VLPs intramuscularly (i.m.); Group C: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group D: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group E: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Sera were collected and diluted at a titer of 1:50 for ELISA assay. (B) HPV L1-specific IgG in male and female mice. (C–E) Epitope-specific IgG induced by L1:P18I10 and L1:T20 VLPs. ELISA was performed to analyze anti-L1, anti-P18I10, and anti-T20 IgG induced by BALB/c mice following different prime-boost combinations as described above. Data are shown as mean ± S.D. One-way ANOVA (nonparametric) test was done to compare differences between groups. OD: opticaldensity. Ns not significant; ** p < 0.01


6. attēls. Humorālo imūnreakciju indukcija ar L1:P18I10 un L1:T20 VLP BALB/c pelēm. Imunizācijas grafiks ir attēlots (A) Visām peļu grupām bija vienāds dzimumu sadalījums (vīrieši n=4 un mātītes n=4). A un B grupas: homologa primārā pastiprināšanas imunizācija ar 10 µg L1:P18I10 vai L1:T20 VLP intramuskulāri (im); C grupa: ievadīšana ar 106 cfu rBCG.HIVA intradermāli (id) un pastiprināšana ar 10 µg L1:P18I10 VLP im; D grupa: homologa primārā pastiprinājuma vakcinācija ar Gardasil-9, kas satur 10 µg HPV16 L1 VLP im; E grupa: imunizācija divreiz ar PBS buferšķīdumu. Galvenās pastiprināšanas intervāls bija 2 nedēļas. Šī izmēģinājuma beigu punkts bija 28. diena. ELISA testam serumi tika savākti un atšķaidīti ar titru 1:50. (B) HPV L1-specifisks IgG vīriešu un sieviešu dzimuma pelēm. (C–E) Epitopam specifisks IgG, ko inducē L1:P18I10 un L1:T20 VLP. ELISA tika veikta, lai analizētu anti-L1, anti-P18I10 un anti-T20 IgG, ko BALB/c pelēm inducēja pēc dažādām primārā pastiprinājuma kombinācijām, kā aprakstīts iepriekš. Dati ir parādīti kā vidējais ± SD Vienvirziena ANOVA (neparametrisks) tests tika veikts, lai salīdzinātu atšķirības starp grupām. OD: optiskais blīvums. Ns nav nozīmīgs; ** p < 0,01

Mēs novērtējām, vai peles, kas imunizētas ar L1:P18110 un L1:T20 VLP, var izraisīt HPV -16 L1-specifiskas un HIV-1 epitopam specifiskas antivielas BALB/c pelēm. VLP inducētās IgG antivielas peļu serumos tika mērītas ar ELISA metodi, kas pārklāta attiecīgi ar rekombinanto HPV16 L1 proteīnu, P18I10 vai T20 peptīdiem. L1-specifiskā IgG statistiskā atšķirība pie seruma titra 1:50 tika konstatēta Gardasil-9 grupā, salīdzinot ar PBS kontroles grupu (p=0.0039). Anti-L1 atbildes reakcijas ar Gardasil-9, L1:P18I10 un L1:T20 VLP imunizētām pelēm bija līdzīgas un būtiski neatšķīrās (6.C attēls). BCG.HIVA2auxo.int prime un L1:P18I10 VLP pastiprināšanas peles izraisīja ļoti zemu anti-L1 IgG līmeni. Šie rezultāti liecināja, ka HPV: HIV VLP imunizētās peles radīja tādu pašu anti-L1 IgG līmeni kā Gardasil -9-immunizētās peles (6. C attēls). Lai gan šķiet, ka L1:P18I10 VLP grupai skaitliski ir tendence uz augstāku P18I10 epitopam specifisko IgG līmeni nekā citās imunizācijas grupās, šīs atšķirības nebija statistiski nozīmīgas (6.D attēls). Dažām ar L1:P18I10 VLP imunizētām pelēm (4 no 8, 50%) tika novērotas augstākas anti-P18I10 saistošās antivielas, salīdzinot ar Gardasil imunizētajām pelēm. Alternatīvi, T-testa analīze atklāja, ka atšķirība starp L1:P18I10 VLP un Gardasil-9 grupu bija nozīmīga (p=0.005) (dati nav parādīti). L1:T20 VLP grupā tika konstatēta ievērojami augstāka antivielu reakcija pret T20 peptīdu, salīdzinot ar Gardasil-9 grupu (p=0,0083). Kā gaidīts, anti-T20 titri nebija nosakāmi Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP un BCG.HIVA prime kombinācijā ar L1:P18I10 VLP pastiprināšanas grupām (6. attēls). T20 peptīda specifiskās antivielas titrs bija salīdzinoši zems. Tas, visticamāk, ir saistīts ar: (1) T20 ir subdominants peptīds; (2) MPER vai 2F5 neitralizējošu antivielu ierosināšanai nepieciešami peptīdu-lipīdu konjugāti (6.E attēls). Kopumā mūsu rezultāti parādīja, ka L1:P18I10 un L1:T20 VLP var izraisīt HPV16-, bet vāju HIV-1-specifisku antivielu reakciju pelēm.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Lai novērtētu HPV un HIV specifiskās T-šūnu imūnās atbildes reakcijas pelēm, mēs ievērojām imunizācijas grafiku, kas parādīts 7.A attēlā. Turklāt heterologā BCG.HIVA2auxo.int ievadīšana un L1:P18I10 VLP pastiprināšana tika salīdzināta ar homologo L1:P18I10 VLP primāro un pastiprināto imunizāciju, lai novērtētu specifisko HPV16 un HIV-1 T-šūnu imūnreakciju biežumu. Nebija atšķirību starp Gardasil-9 un PBS grupām attiecībā uz IFN sekrēciju pēc splenocītu stimulācijas ar HPV16 L1 VLP. L1- specifiskās IFN sekrēcijas atšķirības arī nebija nozīmīgas starp L1:P18I10 VLP un Gardasil-9 grupām. Mēs secinājām, ka vājā L1-specifiskā IFN sekrēcija varētu būt saistīta ar HPV16 L1 VLP zemo koncentrāciju (2 µg/ml), ko izmanto kā stimulus. BCG.HIVA2auxo.int prime un L1:P18I10 VLP pastiprinājuma grupa izraisīja lielāku IFN izdalošo splenocītu biežumu un tika novērotas būtiskas atšķirības IFN sekrēcijā, salīdzinot ar pelēm, kas vakcinētas ar Gardasil-9 grupu (p {{36). }}.0103). 3 no 8 pelēm (~38%) izraisīja visaugstākās L1- specifiskās IFN atbildes reakcijas (7.B attēls). Tas varētu būt saistīts ar nespecifisko BCG adjuvantikumu saskaņā ar mūsu iepriekšējiem pētījumiem [64–66]. Acīmredzamais primārais efekts, pat izmantojot savvaļas tipa BCG, atbilst rBCG atvasinājumu spējai darboties kā spēcīgiem adjuvantiem turpmākajām revakcinācijām [64, 65]. Attiecībā uz HIV-1-specifiskajām T-šūnu reakcijām vislielākais kopējais IFN plankumu veidojošo šūnu (SFC)/106 splenocītu daudzums tika novērots pelēm, kas tika apstrādātas ar BCG.HIVA2auxo.int, salīdzinot ar pelēm, kuras saņēma Gardasil{54}. } vakcīnas vai L1:P18I10 VLP. Pelēm, kas tika ievadītas ar BCG.HIVA un pastiprinātas ar L1:P18I10 VLP, tika novērota ievērojami lielāka IFN sekrēcija, salīdzinot ar pelēm, kas vakcinētas ar L1:P18I10 VLP homologo primāro pastiprinājumu (p=0.0268). Turklāt pelēm, kas vakcinētas ar L1:P18I10 VLP, tika novērota ievērojami augstāka IFN sekrēcija, salīdzinot ar pelēm, kuras saņēma Gardasil-9 vakcīnu (p=0.0157) (7.C attēls). Kā gaidīts, IFN sekrēcija Gardasil{77}} un PBS grupās nebija nosakāma. Šie rezultāti parādīja, ka (1) L1:P18I10 VLP izraisīja HIV-1-specifiskas T-šūnu imūnās atbildes; (2) L1:P18I10 VLP izraisīja HPV specifiskas T-šūnu imūnās atbildes un (3) BCG.HIVA2auxo.int varēja pastiprināt HIV-1-specifiskās T-šūnu imūnās atbildes, ko izraisīja L1:P18I10 VLP.

Figure 7. Induction of HPV16 and HIV-1 specific T cell responses by chimeric L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA in BALB/c mice. The immunization schedule is depicted in (A). All mouse groups had equal gender distribution (male n = 4 and female n = 4). Group A: homologous prime-boost immunization with 10 µg L1:P18I10 VLPs intramuscularly (i.m.); Group B: priming with 106 cfu rBCG.HIVA intradermally (i.d.) and boosting with 10 µg L1:P18I10 VLPs i.m.; Group C: homologous prime-boost vaccination with Gardasil-9 containing 10 µg of HPV16 L1 VLPs i.m.; Group D: immunization twice with PBS buffer. The prime-boost interval was 2 weeks. The endpoint of this trial was on day 28. Splenocytes were isolated for IFN-γ ELISpot assay. T-cell immune responses to HPV16 and HIV-1 were assessed ex vivo by IFN-γ ELISpot after splenocyte stimulation with HPV16 L1 VLP and P18I10 peptide. (B, C) HPV16 L1- and HIV-1 P8I10-specific T-cell responses elicited by L1:P8I10 VLPs and BCG.HIVA prime combined with L1:P18I10 VLP boost. Data are shown as median ± S.D. A one-way ANOVA test was done to compare differences between groups. Ns not significant; * p < 0.05.


7. attēls. HPV16 un HIV-1 specifisku T šūnu reakciju indukcija ar himēru L1:P8I10 VLP un BCG.HIVA BALB/c pelēm. Imunizācijas grafiks ir attēlots (A). Visām peļu grupām bija vienāds dzimumu sadalījums (vīrieši n=4 un sievietes n=4). A grupa: homologa primārā pastiprinājuma imunizācija ar 10 µg L1:P18I10 VLP intramuskulāri (im); B grupa: ievadīšana ar 106 cfu rBCG.HIVA intradermāli (id) un pastiprināšana ar 10 µg L1:P18I10 VLP im; C grupa: homologa primārā pastiprinājuma vakcinācija ar Gardasil{19}}, kas satur 10 µg HPV16 L1 VLP im; D grupa: imunizācija divreiz ar PBS buferšķīdumu. Galvenās pastiprināšanas intervāls bija 2 nedēļas. Šī pētījuma beigu punkts bija 28. diena. Splenocīti tika izolēti IFN-ELISpot testa veikšanai. T-šūnu imūnās atbildes reakcijas uz HPV16 un HIV-1 tika novērtētas ex vivo ar IFN-ELISpot pēc splenocītu stimulācijas ar HPV16 L1 VLP un P18I10 peptīdu. (B, C) HPV16 L1- un HIV-1 P8I10-specifiskas T-šūnu atbildes reakcijas, ko izraisa L1:P8I10 VLP un BCG.HIVA primārais savienojums ar L1:P18I10 VLP pastiprinājumu. Dati ir parādīti kā mediāna ± SD Tika veikts vienvirziena ANOVA tests, lai salīdzinātu atšķirības starp grupām. Ns nav nozīmīgs; * p < 0,05.

4. Discussion

Gan HPV16, gan HIV{1}} ir seksuāli transmisīvas slimības, un pašlaik tās ir daudzu vakcīnu pētījumu uzmanības centrā. Lai gan HPV profilaktiskās vakcīnas ir komercializētas un HIV{2}} pārnešana ir lielā mērā kontrolēta ar pretretrovīrusu ārstēšanu (ART) un PrEP, efektīva, droša un pieejama himēriska HPV: HIV vakcīna pret abiem vīrusiem ir steidzama nepieciešamība. Šajā pētījumā (1) mēs parādījām, ka 293F ekspresijas sistēma un hromatogrāfiskās attīrīšanas metode varētu būt iespējamas pieejas, lai ražotu un attīrītu himēriskos L1:P18I10 un L1:T20 VLP; (2) mēs apstiprinājām, ka P18I10 vai T20 peptīdu ievietošana HPV16 L1 kapsīdu proteīnu DE cilpā neietekmēja himēriskā HPV in vitro stabilitāti, pašsavienošanos un morfoloģiju: HIV VLP; (3) Secīgie un konformācijas P18I10 vai T20 peptīdi, kas pakļauti himēriskā HPV DE cilpām: HIV VLP var noteikt ar anti-HIV-1 gp120 V3 un 2F5 neitralizējošām antivielām in vitro; (4) Himēriskie L1:P18I10 un L1:T20 VLP BALB/c pelēm var izraisīt HPV, bet vājas HIV{34}}specifiskas saistošas ​​antivielas. Turklāt HIV-1 P18I10 vai T20 peptīdu ievietošana HPV16 L1 proteīnā neietekmēja HPV16 L1-specifisko antivielu indukciju in vivo; (5) L1:P18I10 VLP var izraisīt gan HPV16, gan HIV-1-specifiskas T-šūnu atbildes reakcijas; (6) BCG.HIVA primārais un L1:P18I10 VLP pastiprinājums izraisīja vislielāko IFN veidojošo splenocītu daudzumu salīdzinājumā ar L1:P18I10 VLP homologo primāro pastiprinājumu BALB/c pelēm. Šie atklājumi atbalstīja HIV{59}} vakcīnu turpmāku attīstību, pamatojoties uz rBCG un himērisko HPV: HIV VLP. Kopumā šis pētījums sniedz bāzes stratēģiju, kas var būt cienīga, lai atbalstītu globālos centienus izstrādāt jaunas himēriskas VLP bāzes vakcīnas HPV un HIV infekciju kontrolei.

Šajā pētījumā L1:P18I10 un L1:T20 VLP var izraisīt tādu pašu anti-HPV16 L1 saistošo antivielu līmeni kā HPV Gardasil{8}} vakcīna. Tomēr L1:P18I10 un L1:T20 VLP izraisa tikai zemu P18I10 un T20 epitopam specifisko HIV saistošo antivielu atbildes reakciju. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka tas varētu būt tādēļ, ka ELISA testa plates ir pārklātas ar attiecīgi rekombinanto HPV16 L1 proteīnu, HIV-1 P18I10 peptīdu un HIV-1 T20 peptīdu. Peļu anti-L1 antivielas, ko inducē mūsu L1:P18I10 un L1:T20 VLP, var mērķēt uz vairākiem saistošiem L1 proteīna epitopiem. Turpretim peļu anti-HIV-1 antivielas, ko izraisa mūsu L1:P18I10 un L1:T20 VLP, ir vērstas tikai uz vienu HIV peptīdu (P18I10 vai T20) uz HPV: HIV VLP. Līdz ar to anti-HIV-1 saistošo antivielu kopējās maksimālās OD450 vērtības bija daudz zemākas nekā anti-HPV16 L1 antivielām.

Iemesls, kāpēc mēs izvēlējāmies HPV16 L1 kapsīda proteīna DE cilpu kā provizorisko HIV-1 imunogēna ievietošanas reģionu, atsaucās uz iepriekšējo pētījumu, kurā peles tika imunizētas ar liellopu papilomas vīrusu (BPV): HIV VLP antivielu reakcijas ierosināšanai [20]. Ir zināms, ka epitopi, kas atrodas HPV L1 galveno kapsīdu proteīnu virsmas pakļautajās DE un FG cilpās, galvenokārt veicina vakcīnas izraisītās krusteniski neitralizējošās antivielas [67]. Turklāt iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka HIV-1 MPER ievietošana BPV L1 DE cilpā var izraisīt daļēji neitralizējošas antivielas, kas īpaši atpazīst MPER dabisko konformāciju HIV-1 Env [20]. Tomēr dati nav parādījuši, vai rekombinantā BPV L1:MPER VLP ietekmē imunogenitāti un neitralizāciju pret BPV pēc HIV-1 MPER ievietošanas BPV L1 proteīnā. Mūsu pētījumā, izmantojot HPV16 L1 VLP kā HIV antigēna piegādes vektoru, mēs novērojām, ka HIV-1 peptīda ievietošana nav mainījusi HPV L1 struktūru un ka himēriskais HPV: HIV proteīni joprojām spēj veidot VLP. Turklāt mēs īstenojām imūnsatiksmes koncepciju, lai demonstrētu salīdzināmas imūnās atbildes starp HPV: HIV VLP kandidātu (mūsu) un apstiprinātu uz VLP balstītu HPV vakcīnu (licencēta Gardasil{21}}). Mūsu dati atklāja, ka HIV-1 P18I10 vai T20 peptīda ievietošana himēriskajā HPV: HIV VLP var izraisīt līdzīgu HPV16 L1-specifisko saistošo antivielu titru, salīdzinot ar HPV Gardasil{28}} vakcīna. Tipam specifiskās anti-HPV16 L1 saistošās antivielas, kas tika novērotas ar licencētu HPV Gardasil-9 VLP vakcīnu, salīdzinot ar HPV Gardasil-9 VLP vakcīnas himēriskajām versijām, atbilda mūsu datiem.

Optimālā HIV-1 svešā antigēna garums un vieta, kas iekļauta HPV16 L1 VLP, un iegūtā himēriskā HPV stabilitāte in vitro: HIV VLP ir jāpārbauda pirms peļu imunizācijas. Mūsu pašreizējais pētījums ir parādījis, ka P18I10 vai T20 peptīdu ievietošana HPV16 L1 proteīnā neietekmēja himēriskā HPV: HIV VLP in vitro stabilitāti, pašsavienošanos un morfoloģiju. Šie rezultāti saskanēja ar iepriekšējiem pētījumiem, kas liecināja, ka HIV-1 MPER domēna ievietošana BPV L1 DE cilpas secībā neietekmēja BPV L1 kapsīda proteīna pašsavienošanās spēju VLP [20]. Būtībā epitopi, kas atrodas HPV L1 kapsīdu proteīnu virsmas pakļautajās DE un FG cilpās, galvenokārt veicina L1-specifisku krusteniski neitralizējošu antivielu inducēšanu [67]. Šeit mēs parādījām, ka HIV-1 P18I10 vai T20 peptīdu ievietošana HPV16 L1 DE cilpā neietekmēja L1-specifisko antivielu indukciju ar himērisko HPV: HIV VLP pēc peļu imunizācijas. Turklāt HIV-1 P18I10 vai T20 epitopi uz himēriskā HPV HPV16 DE cilpām: HIV VLP tika konstatēti in vitro un bija imunogēni in vivo. HPV16 L1 VLP veido potenciālu pamatu interesējošā HIV-1 epitopa virsmai. Šajā pētījumā mēs esam veikuši netiešu ELISA, lai parādītu konformācijas P18I10 un T20 peptīdus, kas atrodas uz mūsu himēriskā HPV virsmas: HIV VLP. Nākotnē imūnelektronu mikroskopija varētu būt arī papildu pieeja, lai parādītu P18I10 vai T20 antigēna strukturālo lokalizāciju un organizāciju HPV: HIV VLP.

Pašsavienošanās ir HPV16 L1 VLP in vitro stabilitātes reprezentatīvs indekss. Ir zināms, ka pH, jonu stiprums, temperatūra [52] un redoksvide korelē ar HPV16 L1 kapsīdu proteīnu [53] disulfīda saitēm. Iepriekšējie darbi par papilomas vīrusa VLP liecināja par disulfīda saišu nozīmi L1 galveno kapsīdu pašsavienošanās procesā [68, 69]. Disulfīdu veidošanās liecināja par augstāku L1 kapsīda proteīna cisteīnu atbilstošā ģeometrijā [53]. Šīs disulfīdu šķērssaites savieno 175. un 428. atlikumus (HPV16), kas stabilizē HPV virionus un VLP [70]. Šajā pētījumā mēs analizējām starpmolekulāros disulfīdu šķērssavienojumu modeļus kā netiešus pierādījumus, lai pierādītu, ka mūsu L1: P18I10 un L1: T20 kapsīdu proteīniem ir tendence paškomplektēties in vitro. Attēlā 3A mēs parādījām, ka attīrītiem L1:P18I10 un L1:T20 VLP bija līdzīgi starpmolekulārie disulfīdu šķērssavienojumi kā HPV16 L1 VLP ar tādiem pašiem pH, jonu stipruma un termiskajiem apstākļiem. Attēlā 3B mēs arī parādījām, ka attīrīti L1: P18I10 un L1: T20 proteīni in vitro spēj paši savākties lielākās daļiņās (lielākas par L1 pentamēru, MW 280 kDa). Tāpēc kopā ar morfoloģiskās pašsavienošanās VLP modeli (lai gan ikosaedriskā struktūra nebija diezgan laba), kas novērots 4. attēlā, mēs secinājām, ka mūsu attīrītais himēriskais HPV: HIV VLP ir stabils in vitro. Papildus VLP stabilitātei ir jāņem vērā arī daudzi citi kritiski faktori, kas varētu ietekmēt himēriskā HPV imunogenitāti: HIV VLP, piemēram, imunogēna ievietošanas vieta starp dažādām VLP cilpām [71], deva, primārās pastiprināšanas intervāli un ievadīšanas veids [22]. utt.

P18I10 peptīdi, kas iegūti no HIV-1 gp120 V3 cilpas, tiek parādīti HIV inficētajās šūnās, izmantojot galvenās histokompatibilitātes kompleksa (MHC-I) I klases molekulas [26]. CD8+, citotoksiskie T limfocīti (CTL), varētu atpazīt MHC-I ierobežotos P18I10 antigēnus un izdalīt dažādus citokīnus, piemēram, IFN-, lai likvidētu HIV inficētās šūnas [72–75]. Rekombinantā vīrusa vai plazmīdu DNS ir labs vakcīnas nesējs, lai ekspresētu P18I10 peptīdus saimniekšūnās un izraisītu P18I10-specifiskas šūnu atbildes reakcijas caur MHC-I ceļu [76–79]. Piemēram, ar kombinētu DNS primāro un modificēto vaccinia vīrusa Ankaras (MVA) pastiprināšanas shēmu pietika, lai izraisītu IFN un CTL atbildes reakcijas pret P18I10 epitopu [79]. Gluži pretēji, eksogēni P18I10 peptīdi netiek efektīvi prezentēti CD8+ T-šūnām, izmantojot MHC-I ceļu [80, 81], un tiem ir nepieciešami atbilstoši adjuvanti [82–85] vai antigēna nesēji, piemēram, VLP. Piemēram, sintētisko P18I10 peptīdu, kas papildināti ar adjuvantiem, imunogenitāte bija neliela, jo nebija T-palīgu noteicošo faktoru [82–85]. Iepriekš tika ziņots, ka HIV-1 Gag VLP [86], B hepatīta virsmas antigēna (HBsAg) VLP [87], parvovīrusa VP2 VLP [88] un papilomas vīrusa L1 VLP [17–19] varētu darboties kā piegādes vektori ar MHC-I ierobežotu CTL epitopu prezentāciju in vivo. Lai gan VLP izraisīto MHC-I ierobežoto T-šūnu reakciju mehānisms joprojām nav skaidrs, VLP daļiņu struktūra varētu veicināt makrofāgu vai dendritisko šūnu endocītu uzņemšanu, tādējādi piekļūstot citozolam un pēc tam nonākot tipiskā MHC-I ceļā [89, 90]. Turklāt tika novērots, ka MHC-I ierobežotais P18I10 determinants inducē CD4+ helper T-šūnu atbildes, izmantojot MHC-II ceļu [91,92]. Hibrīdus BPV1 L1 VLP var izmantot kā antigēnu epitopu nesējus, lai, izmantojot MHC-I un MHC-II ceļus, izraisītu terapeitiskas vīrusam specifiskas CTL atbildes [17,19], nodrošinot daudzsološu stratēģiju vakcīnas izstrādei vīrusu infekcijas kontrolei. Daži agrīnie pētījumi arī norādīja uz BPV L1 VLP, kas ekspresē HIV-1 gp120 V3 cilpas izraisītas gļotādas virsmas HPV16 E7 epitopu vai P18I10 epitopu, kā arī sistēmisku VLP epitopam specifisku humorālo un T šūnu imunitāti [18]. Saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem mēs esam provizoriski pierādījuši, ka mūsu himēriskais HPV: HIV (L1:P18I10) VLP var izraisīt HIV specifiskas T-šūnu imūnās atbildes reakcijas BALB/c pelēm pēc splenocītu stimulācijas ar P18I10 peptīdu. Turklāt BCG.HIVA ievadīšana uzlaboja HIV-1-specifiskās T-šūnu imūnās atbildes reakcijas pelēm. Tomēr L1: P18I10 VLP izraisītajām daudzfunkcionālajām T-šūnu imūnreakcijām būtu nepieciešami turpmāki imunoloģiskie pētījumi.

Plašāka CD8+ T-šūnu reakcija pret vairākiem konservētiem CTL epitopiem ir noderīga, lai pārvarētu HIV-1 ģenētisko daudzveidību un izvairītos no tā [7,93–100]. HIV-1 T-šūnu imunogēnu, piemēram, HIVA, racionālai konstrukcijai vajadzētu būt iespējai reaģēt uz vairākiem CTL epitopiem [34]. HIV-1 HIVA imunogēns, ko izstrādājis Dr. Tomas Hanke, sastāv no pilna garuma HIV-1 Gag proteīna, kas apvienots ar vairākiem CTL epitopiem, tostarp P18I10 epitopiem C-galā [34]. DNS, MVA un rBCG tika izvēlēti kā HIVA imunogēna ievadīšanas nesēji un izraisīja lielu un plašu CTL epitopam specifisku šūnu reakciju, izmantojot heterologus primārās pastiprināšanas režīmus peles un primātu, kas nav cilvēkveidīgie primāti (NHP) modeļos [34, 101]. Mūsu iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka BCG.HIVA prime kombinācijā ar MVA.HIVA pastiprinājumu izraisīja HIV-1-specifiskas IFN ražojošas CD8+ T-šūnas BALB/c pelēm [31–33,102]. Interesanti, ka VLP varētu būt potenciāls pastiprinātājs, lai palielinātu HIV specifiskās šūnu atbildes reakcijas heterologā imunizācijā ar rBCG [29, 30] vai DNS vakcīnām [103, 104]. Piemēram, rBCG, kas ekspresē HIV-1 Gag proteīnu, varētu efektīvi sagatavot T-šūnu imūnsistēmu, lai NHP modeļos palielinātu Gag VLP [29, 30]. Pašreizējā pētījumā mēs esam pierādījuši, ka BCG.HIVA ievadīšana var pastiprināt HPV: HIV (L1:P18I10) VLP izraisītās T-šūnu imūnās atbildes. Mēs tālāk pētīsim polifunkcionālo CD4+, CD8+ un atmiņas T-šūnu reakciju apjomu, ko rada šis rBCG primārais un VLP pastiprināšanas režīms.

Cistanche deserticola-improve immunity -

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Pašlaik mūsu pētniecības grupa koncentrējas uz daudzsološu rBCG izstrādi: HIV vakcīnas, kas ekspresē jaunus HIV-1 T-šūnu imunogēnus, piemēram, tHIVconsvX un HIVACAT (HTI) T-šūnu imunogēnu, lai uzlabotu HIV-1 variantu atbilstība un T-šūnu reakcijas platums. Otrās paaudzes HIVconsvX imunogēni tika izstrādāti, atkārtoti definējot M grupas konservētos reģionus un izmantojot divvērtīgu mozaīkas dizainu, lai maksimāli palielinātu vakcīnā esošo 9-mer T-šūnu epitopu atbilstību globālajiem variantiem [64]. HTI imunogēns tika izstrādāts, lai aptvertu T-šūnu mērķus, pret kuriem T-šūnu atbildes galvenokārt tiek novērotas HIV{12}}inficētiem indivīdiem ar zemu HIV{13}} vīrusu slodzi [65,66]. Tā kā ir pierādīts, ka papilomas VLP ir vairāku CTL epitopu nesēji [17], mūsu mērķis bija konstruēt himēriskus HPV16 L1 VLP, kas satur vairākus konservētus HIV{19}} CTL epitopus kombinācijā ar rBCG, kas ekspresē ThivconsvX vai HTI T-šūnu imunogēnus, lai ierosinātu plašāku. CTL imūnās atbildes reakcijas pret HIV-1. HIV-1 CTL epitopa augstais blīvums un vairākas kopijas uz himēriskā HPV: HIV VLP var uzlabot antigēna piegādi imūnsistēmai un izraisīt biežāku CTL reakciju. Turpretim rekombinantā BCG, visticamāk, radīs mazāku CTL reakciju biežumu lēnas replikācijas in vivo dēļ. Tā kā BCG ir izteikta ietekme uz T šūnu diferenciāciju, kas nozīmē, ka BCG var izraisīt CD8+ T šūnu atmiņu, piedaloties CD4+ T-helper šūnām [105], šī imunogēnā īpašība. var padarīt BCG piemērotu kā primāro līdzekli heterologās primārās pastiprināšanas shēmās. Tādējādi mēs sagaidām, ka mūsu HPV: HIV VLP varētu šķist daudzsološs pastiprinātājs, lai palielinātu HIV-1 CTL reakciju apjomu un plašumu, ja tiek veikta rekombinantā BCG, kas ekspresē jaunu HIV-1 T-šūnu imunogēnu. .

T20 peptīds satur ļoti konservētu lineāro epitopu 2F5 (ELDKWA). Tika ziņots, ka 2F5 antivielai, kas savākta no ilgstoši HIV inficētiem pacientiem, ir plaši neitralizējoša iedarbība [106,107]. Tiek uzskatīts, ka gp41 MPER ir vāji imunogēns, iespējams, saistīts ar tā atrašanās vietu tuvu šūnu un vīrusu fosfolipīdu divslānim [108]. Izmantojot DNS vektorus, kas prezentē MPER lipīdu vidē, ir izdevīga gp{11}}specifisku nAb inducēšana [109–111]. Piemēram, ir pierādīts, ka HIV-1 T20-kodējošās DNS vakcīnas, ko izstrādājusi doktore Britta Vērena, izraisa cross-clade neitralizējošu antivielu (nAb) reakcijas [109]. Turpretim daudzi sākotnējie mēģinājumi inducēt nAbs, kuru mērķauditorija ir gp41, izmantojot peptīdu vai apakšvienību vakcīnas stratēģijas, ir bijuši neveiksmīgi [112–116]. Nesen daži pētījumi liecina, ka BPV L1 VLP, kas ekspresē 2F5 epitopu vai HIV-1 gp41 inducētu 2F5-specifisku antivielu MPER pelēm, izraisīja krustenisko kladu neitralizāciju [20,21]. Līdzīgs imunogenitātes modelis tika konstatēts, kad B hepatīta virsmas antigēns (HBsAg) tika sapludināts ar HIV-1 2F5 epitopu vai MPER [59,117–119]. Šeit mēs parādījām, ka HIV-1 T20 un P18I10 peptīdu prezentācija mūsu himēriskajā HPV16 L1 VLP var izraisīt antivielu atbildes reakciju pret HIV-1 un HPV16. Neitralizējoši epitopi, kas stabilizēti uz konformācijas karkasa, piemēram, HIV-1 funkcionālie pīķi vai VLP, varētu būt B-šūnu imunogēna dizaina galvenais virziens, lai iegūtu plašas neitralizējošās antivielas (bnAbs) [93]. Tomēr lielākā daļa jauno bnAb epitopu (aptuveni 90%) ir nekontinuēti un veidoti reģioni, kas apvienoti 3-dimensiju konfigurācijās [120]. Lai gan ar skaitļošanas modelēšanu varēja paredzēt pārtrauktu epitopu parādīšanos uz proteīna sastatnēm [121], šos bnAb epitopus var iestrādāt neapvalkotā HPV16 L1 proteīna karkasā. Turpretim neliela daļa HIV-1 B-šūnu imunogēnu, piemēram, HIV-1 gp41 MPER (2F5) vai gp120 V3 cilpa (P18IIB), satur lineārus neitralizējošus epitopus un varētu būt piemēroti HPV: HIV proteīna mugurkauls. Tāpēc mēs izvēlējāmies lineāro 2F5 neitralizējošo epitopu, kas ir iekļauts paplašinātajā HIV-1 MPER T20 peptīdā, ņemot vērā labvēlīgo struktūru -spirāles veidošanai [122]. T20 peptīdus var sapludināt un stabilizēt uz L1 kapsīdu pamatnēm, lai izraisītu neitralizējošas antivielu reakcijas, ja varētu uzrādīt 2F5 epitopa dabisko konfigurāciju. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka 2F5 nAb bija saistīti ar himēru HPV: HIV (L1:T20) VLP in vitro. Turklāt L1:T20 VLP var izraisīt arī T20-specifiskas saistošas ​​antivielas BALB/c pelēm. Bija arvien vairāk pierādījumu tam, ka HIV-1 saplūšanu inhibējošām (T20) peptīdu inducētām antivielām ir līdzīgas īpašības kā anti-HIV-1 saplūšanas peptīdam Enfuvirtīdam, lai tās saistītu ar hidrofobu transmembrānas T20 atlikumu, kas atrodas gp41 MPER. HIV-1 saplūšana un veicina vīrusu kontroli [109,123,124]. Saskaņā ar mūsu iepriekšējiem pārskatiem, himērisko VLP vakcīnu racionāls dizains, lai izraisītu HPV un HIV specifiskās neitralizējošās antivielas un CTL reakcijas, vienmēr būtu jāņem vērā imunogēna atlases, antigēna piegādes vektoru un primārās pastiprināšanas režīmu ziņā. Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums ir parādījis alternatīvu zīdītāju šūnu ekspresijas platformu un mērogojamu hromatogrāfiskās attīrīšanas metodi, lai izstrādātu himēriskus HPV: HIV VLP. Mēs uzskatām, ka mūsu jaunās attīrīšanas metodes palīdzēs atgūt antigēnu HPV: HIV VLP no zīdītāju šūnām ar mērķi samazināt laiku, izmaksas un darbaspēku, vienlaikus palielinot rūpnieciskās ražošanas jaudu. Turklāt mēs parādījām, ka HPV16 L1 VLP var darboties kā piegādes platforma HIV-1 peptīdu antigēna pārnēsāšanai, jo P18I10 vai T20 peptīdu ievietošana HPV16 L1 kapsīdu proteīnu DE cilpā neietekmēja himēriskā HPV stabilitāti, pašsavienošanos un morfoloģiju: HIV VLP un to ietekmēja. netraucē HPV16 L{107}specifisko antivielu indukciju in vivo. No otras puses, himērisks HPV: HIV VLP var izraisīt HPV16 un HIV specifiskas B un T-šūnu imūnās atbildes pret abiem vīrusiem. Šajā ziņojumā tika pētīta iespēja izstrādāt HIV{111}} vakcīnas, kuru pamatā ir rekombinantā BCG, kas ekspresē HIV-1 imunogēnus un HPV: HIV VLP, ko var izmantot bērnu HIV{113}} imunizācijai. Tā kā efektīvas himēriskas vakcīnas izstrāde pret HPV16 un HIV joprojām ir izaicinājums, šis darbs ir solis ceļā uz jaunas himēriskās HPV izstrādes: HIV VLP bāzes vakcīnas platforma HPV16 un HIV kontrolei.{118 }} infekcija, kas ir steidzami nepieciešama jaunattīstības un rūpnieciski attīstītajās valstīs.

Atsauces

1. UNAIDS globālā HIV un AIDS statistika-2018 faktu lapa. 2019. Pieejams tiešsaistē: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (apskatīts 2020. gada 15. jūnijā).

2. Baeten, JM PREP HIV: A pakāpe pierādījumiem, bet gaida ietekmi. Nat. Prāvests Urols. 2019, 16, 570–571. [CrossRef]

3. Rērks-Ngarms, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Čiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namvats, C.; De Souza, M.; Adams, E.; un citi. Vakcinācija ar ALVAC un AIDSVAX, lai Taizemē novērstu HIV{2}} infekciju. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209–2220. [CrossRef]

4. Ng'uni, T.; Časāra, C.; Ndhlovu, ZM Galvenie zinātniskie šķēršļi HIV vakcīnas izstrādē: vēsturiskā perspektīva un nākotnes virzieni. Priekšpuse. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]

5. Robinson, HL HIV/AIDS vakcīnas: 2018. Clin. Pharmacol. Tur. 2018, 104, 1062–1073. [CrossRef]

6. Vans, K.; Džans, L. Plaši neitralizējošas antivielas un vakcīnas izstrāde pret HIV-1 infekciju. Priekšpuse. Med. 2020, 14., 30.–42. [CrossRef]

7. Kolinss, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T šūnas HIV kontrolē, ārstēšanā un profilaksē. Nat. Immunol. 2020, 20, 471–482. [CrossRef] [PubMed]

8. Pollards, AJ; Bijker, EM Vakcinoloģijas ceļvedis: no pamatprincipiem līdz jauniem sasniegumiem. Nat. Immunol. 2021, 21, 83–100. [CrossRef]

9. Shapiro, SZ Nodarbības vispārīgiem vakcinācijas pētījumiem no mēģinājumiem izstrādāt HIV vakcīnu. Vakcīna 2019, 37, 3400–3408. [CrossRef]

10. Ahmeds, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaks, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Cilvēka papilomas vīrusa 16. un 18. apakštipa izplatība Jemenas pacientiem ar dzemdes kakla vēzi. Āzijas Klusais okeāns J. Vēzis Iepr. 2017, 18, 1543–1548. [CrossRef]

11. Olčese, VA; Čens, Y.; Šlēgels, R.; Yuan, H. HPV16 L1 cilpas domēnu raksturojums tipam specifiska, konformācijas epitopa veidošanā. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]

12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bouts, D.; Coursaget, P. Šūnu izraisīta imunitāte, ko pelēm inducē HPV 16 L1 vīrusam līdzīgas daļiņas. Microb. Patogs. 1997, 22, 219–225. [CrossRef] [PubMed]

13. Šillers, J.; Lowy, D. Paskaidrojumi par HPV profilaktisko vakcīnu augsto potenciālu. Vakcīna 2018, 36, 4768–4773. [CrossRef] [PubMed]

14. Markowitz, LE; Šillers, JT. Vakcīnas pret cilvēka papilomas vīrusu. J. Inficēt. Dis. 2021, 224, S367–S378. [CrossRef] [PubMed]

15. Čens, CW; Saubi, N.; Džozefs Munē, J. Uz vīrusiem līdzīgām daļiņām balstītu HIV-1 vakcīnu izstrādes koncepcijas. Priekšpuse. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]

16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferers, P.; Džozefs, J. Himērisku vīrusu līdzīgu uz daļiņām balstītu vakcīnu izstrāde cilvēka papilomas vīrusa un HIV ārstēšanai: Gūtās mācības. AIDS Rev. 2019, 21, 218–232. [CrossRef]

17. Liu, WJ; Liu, XS; Džao, KN; Leggata, GR; Frazer, IH Papilomas vīrusa vīrusam līdzīgas daļiņas vairāku citotoksisku T šūnu epitopu piegādei. Virusoloģija 2000, 273, 374–382. [CrossRef]

18. Liu, XS; Abduls-Džabars, I.; Qi, YM; Freizers, IH; Zhou, J. Gļotādas imunizācija ar papilomas vīrusa vīrusam līdzīgām daļiņām pelēm izraisa sistēmisku un gļotādu imunitāti. Virusoloģija 1998, 252, 39–45. [CrossRef]

19. Pengs, S.; Freizers, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Papilomas vīrusa vīrusam līdzīgās daļiņas var piegādāt noteiktus CTL epitopus MHC I klases ceļā. Virusoloģija 1998, 240, 147–157. [CrossRef]

20. Zhai, Y.; Džons, Z.; Zarifārs, M.; Šķēps, GT; Qiao, L. Liellopu papilomas vīrusam līdzīgas daļiņas, kas prezentē konservētus epitopus no membrānas proksimālā ārējā reģiona HIV-1 gp41 inducētās gļotādas un sistēmiskās antivielas. Vakcīna 2013, 31, 5422–5429. [CrossRef]

21. Džans, H.; Huangs, Y.; Fajads, R.; Šķēps, GT; Qiao, L. Gļotādas un sistēmisku neitralizējošu antivielu indukcija pret cilvēka imūndeficīta vīrusa 1. tipa (HIV-1) perorālu imunizāciju ar govju papilomas vīrusa-HIV-1 gp41 himēriskajam vīrusam līdzīgām daļiņām. J. Virols. 2004, 78, 8342–8348. [CrossRef]

22. Sjao, SL; Wen, JL; Kong, Jaunzēlande; Yue, HL; Legats, G.; Frazer, IH Himēriskā BPV1 VLP ievadīšanas ceļš nosaka inducēto imūnreakciju raksturu. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21–29. [CrossRef]

23. Kirnbauers, R.; Taubs, JANET; Greenstone, HEATHER; Rodens, RIHARDS; Dūrsts, M.; Gismans, L.; Lowy, DR; Schiller, JT. Efektīva cilvēka papilomas vīrusa 16. tipa LI un L1-L2 pašsavienošanās vīrusam līdzīgās daļiņās. J. Virols. 1993, 67, 6929–6936. [CrossRef] [PubMed]

24. Zhao, Q.; Poters, CS; Keragers, B.; Landers, G.; Svorens, J.; Tauns, V.; Ābrahāms, D.; Dankans, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Vīrusiem līdzīgu daļiņu raksturojums GARDASIL® ar kriotransmisijas elektronu mikroskopiju. Hum. Vakcīnas Imūnās. 2014, 10, 734–739. [CrossRef] [PubMed]

25. Ačūrs, A.; Lemhammedi, S.; Pikārs, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrims, Z.; Villers, A.; Beikss, F.; Burnijs, A.; Zagury, D. HIV-1 gp160 antigēnam specifiski citotoksiskie T limfocīti un sintētiskais P18IIIB peptīds HLA-A11-immunizētā indivīdā. AIDS Res. Hum. Retrovīrusi 1994, 10, 19–25. [CrossRef]

26. Nakagava, Y.; Kikuči, H.; Takahashi, H. TCR un peptīdu/MHC mijiedarbības molekulārā analīze, izmantojot P18-I10-atvasinātus peptīdus ar vienu D-aminoskābes aizstāšanu. Biofizija. J. 2007, 92, 2570–2582. [CrossRef]

27. Cju, Z.; Čongs, H.; Jao, X.; Su, Y.; Cui, S.; Viņš, Y. HIV -1 Gp41 N-trimera apakškabatas identificēšana un raksturojums: ietekme uz vīrusu iekļūšanu un narkotiku mērķi. Aids 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]

28. Pēters, BS; Čeingsongs-Popovs, R.; Kalovs, D.; Foksāls, R.; Patū, G.; Hodžkins, K.; Weber, JN. Izmēģinājuma II fāzes pētījums par HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) drošību un imunogenitāti asimptomātiskiem HIV seropozitīviem subjektiem. J. Inficēt. 1997, 35, 231–235. [CrossRef]

29. Čege, GK; Burgeri, WA; Stutz, H.; Meiers, AE; Čepmens, R.; Kiravu, A.; Bunjuns, R.; Šefards, EG; Džeikobs, WR; Rybicki, EP; un citi. Spēcīga imunitāte pret auksotrofisko Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost HIV vakcīnas kandidātu primātu modelī, kas nav cilvēkveidīgais primāts. J. Virols. 2013, 87, 5151–5160. [CrossRef]

30. Čege, GK; Tomass, R.; Šefards, EG; Meiers, A.; Bourn, V.; Viljamsons, C.; Maklīns, Dž.; Pelēks, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL. Prime-boost imunizācijas shēma, izmantojot rekombinantās BCG un Pr55gag vīrusam līdzīgas daļiņu vakcīnas, kuru pamatā ir HIV 1. tipa C apakštips, veiksmīgi izraisa Gag specifiskas atbildes paviāniem. Vakcīna 2009, 27, 4857–4866. [CrossRef]

31. Džozefs, J.; Saubi, N.; Es, EJ; Fernandez-Lloris, R.; Gils, O.; Cardona, PJ; Gatels, Dž. M.; Hanke, T. Jaundzimušo peļu vakcinācija ar BCG.HIVA222 + MVA.HIVA uzlabo HIV-1-specifiskās imūnās atbildes: vecuma un imunizācijas ceļu ietekme. Clin. Izstrādātājs Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]

32. Saubi, N.; Gea-Malorquí, E.; Ferers, P.; Hurtado, C.; Sančess-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatels, Dž. M.; Henke, T.; Džozefs, J. Jaunas mikobaktēriju vakcīnas dizaina izstrāde HIV-TB pediatriskās vakcīnas pārnēsāšanai ar BCG lizīna auksotrofu. Mol. Tur. Metodes Clin. Izstrādātājs 2014, 1, 14017. [CrossRef]

33. Mahants, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Ģitarts, N.; Gatels, Dž. M.; Henke, T.; Džozefs, J. BCG.HIVA2auxo.int, kas satur integrējošu ekspresijas vektoru, pirmsklīniskā attīstība HIV-TB Pediatric vakcīnai. Stabilitātes un specifiskas HIV-1 T-šūnu imunitātes uzlabošana. Hum. Vakcīnas Imūnās. 2017, 13, 1798–1810. [CrossRef] [PubMed]

34. Henke, T.; McMichael, AJ Eksperimentālas HIV-1 vakcīnas projektēšana un konstruēšana gada-2000 klīniskajam izmēģinājumam Kenijā. Nat. Med. 2000, 6, 951–955. [CrossRef] [PubMed]

35. Durocher, Y.; Perets, S.; Kamens, A. Augsta līmeņa un augstas caurlaidības rekombinanto proteīnu ražošana ar īslaicīgu suspensijā augošu cilvēka 293-EBNA1 šūnu transfekciju. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]

36. Kima, HJ; Kima, SY; Lims, SJ; Kima, Dž. Lī, SJ; Kim, HJ Cilvēka papilomas vīrusa 16. tipa L1 proteīna vienpakāpes hromatogrāfiska attīrīšana no Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68–74. [CrossRef] [PubMed]

37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferers, P.; Joseph-Munné, J. Himēriskā HPV-HIV proteīna L1P18 ekspresija pichia pastoris; vīrusam līdzīgo daļiņu attīrīšana un raksturošana. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]

38. GE. CaptoTM Core 700 un Capto Q ImpRes izmantošana cilvēka papilomas vīrusam līdzīgu daļiņu attīrīšanā. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1.–4.

39. Maklīns, CS; Čērkers, MJ; Meinke, J.; Smits, GL; Higinss, G.; Stenlijs, M.; Minson, AC Monoklonālās antivielas ražošana un raksturojums pret cilvēka papilomas vīrusa 16. tipu, izmantojot rekombinanto vakcīnas vīrusu. Dž.Klins. Pathol. 1990, 43, 488–492. [CrossRef]

40. Merck Canada Inc. produktu monogrāfija Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1.–71.

41. Ačūrs, A.; Persons, K.; Hariss, RA; Sundbeks, J.; Sentmens, CL; Lindkvists, Y.; Šneids, G.; Kärre, K. H-2D(d) MHC I klases kristāliskā struktūra kompleksā ar HIV-1- atvasinātu peptīdu P18-110 ar izšķirtspēju 2,4 Å: ietekme uz T šūnām un NK šūnām atzīšanu. Immunity 1998, 9, 199–208. [CrossRef]

42. Pangs, V.; Toms, SC; Zheng, YT Pašreizējie peptīdu HIV tipa -1 saplūšanas inhibitori. Antivīruss. Chem. Ķīmijmāte. 2009, 20. [CrossRef]

43. Čens, XS; Garcea, RL; Goldbergs, I.; Kazini, G.; Harisons, SC Mazo vīrusam līdzīgo daļiņu struktūra, kas samontētas no cilvēka papilomas vīrusa L1 proteīna 16. Mol. Cell 2000, 5, 557–567. [CrossRef] [PubMed]

44. Diena, PM; Veisberga, AS; Thompson, CD; Hjūzs, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT. Cilvēka papilomas vīrusa 16 kapsīdi mediē kodola iekļūšanu infekcijas laikā. J. Virols. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]

45. Džou, Dž.; Doorbar, J.; Saule, XY; Crawford, LV; Maklīns, CS; Frazer, IH Cilvēka papilomas vīrusa 16. tipa L1 proteīna kodola lokalizācijas signāla identificēšana. Virusoloģija 1991, 185, 625–632. [CrossRef] [PubMed]

47. Vlps, A.; Midelbergs, APJ; Lua, LHL Vīrusiem līdzīgo daļiņu bioapstrāde: izaicinājumi un iespējas. Pharm. Bioprocess. 2013, 1, 407–409.

47. Bousargin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Pozitīvi lādētas cilvēka papilomas vīrusa 16. tipa kapsīdu proteīnu sekvences ir pietiekamas, lai mediētu gēnu pārnesi mērķa šūnās caur heparāna sulfāta receptoru. J. ģenerālis Virols. 2003, 84, 157–164. [CrossRef]

48. Sasagava, T.; Puško, P.; Stērss, G.; Gschmeissner, SE; Nasers Hajibagheri, MA; Finčs, Dž.; Krofords, L.; Tommasino, M. Cilvēka papilomas vīrusa 6. un 16. tipa vīrusiem līdzīgu daļiņu sintēze un montāža skaldīšanas raugā Schizosaccharomyces pombe. Virusoloģija 1995, 206, 126–135. [CrossRef]

49. Biemelts, S.; Sonnewald, U.; Galmbahers, P.; Vilmicers, L.; Müller, M. Cilvēka papilomas vīrusa 16. tipa vīrusam līdzīgu daļiņu ražošana transgēnos augos. J. Virols. 2003, 77, 9211–9220. [CrossRef]

50. Zahins, M.; Džo, J.; Khanal, S.; miziņa, A.; Meisons, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Millers, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Mērogojama HPV16 L1 proteīna un VLP ražošana no tabakas lapām. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]

51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Karneiro, SM; Villa, LL; Bokardo, E.; Peress-Martinezs, C.; Peress-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Cilvēka papilomas vīrusa tipa 16 L1 vīrusam līdzīgu daļiņu ražošana ar rekombinantām Lactobacillus casei šūnām. Appl. Vide. Microbiol. 2006, 72, 745–752. [CrossRef]

52. Šenks-Reclafs, ML; Džao, Q.; Andersons, C.; Hamms, M.; Augstais, K.; Ngujens, M.; Van, F.; Van, N.; Vangs, B.; Van, Y.; un citi. Gardasil® termiskās stabilitātes novērtējums. Hum. Vakcīna. 2006, 2, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

53. Mukherjee, S.; Toršteinsons, MV; Džonstons, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. Cilvēka papilomas vīrusa 16 vīrusam līdzīgo daļiņu in vitro montāžas kvantitatīvais apraksts. J. Mol. Biol. 2008, 381., 229.–237. [CrossRef] [PubMed]

54. Makartijs, deputāts; Balts, WI; Palmers-Hils, F.; Kēnigs, S.; Suzich, JA Cilvēka papilomas vīrusa 11. tipa vīrusam līdzīgo daļiņu kvantitatīva demontāža un atkārtota salikšana in vitro. J. Virols. 1998, 72, 32–41. [CrossRef] [PubMed]

55. Kirnbauers, R.; Būjs, F.; Čens, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 galvenais kapsīdu proteīns pats savācās vīrusiem līdzīgās daļiņās, kas ir ļoti imunogēnas. Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 1992, 88, 12180–12184. [CrossRef]

56. Patel, MC; Patkars, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Imunogēno cilvēka papilomas vīrusa -16 galveno kapsīdu proteīnu iegūto vīrusam līdzīgu daļiņu ražošana. Indijas J. Med. Res. 2009, 130., 213.–218.

57. Ši, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Došna, S.; Vangs, B.; Grehems, TL; Van, N.; Volkin, DB Cilvēka papilomas vīrusa vīrusam līdzīgu daļiņu stabilizēšana ar nejonu virsmaktīvām vielām. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538–1551. [CrossRef]

58. Kārters, Dž. Wipf, GC; Benki, SF; Kristensens, ND; Galloway, DA Cilvēka papilomas vīrusa tipa 16-specifiskā epitopa identificēšana galvenā kapsīda proteīna L1 C-terminālī. J. Virols. 2003, 77, 11625–11632. [CrossRef]

59. Fon Brunn, A.; Brand, M.; Reihūbers, C.; Moriss-Vortmans, C.; Deinhards, F.; Schdelt, F. HIV-I galvenais neitralizējošais domēns ir ļoti imunogēns, ja tas tiek izteikts uz B hepatīta kodola daļiņu virsmas. Vaccine 1993, 11, 817–824. [CrossRef]

60. Denisons, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sazerlends, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gornijs, MK; Zolla-Paznere, S.; Heinss, BF; un citi. Neitralizējošās HIV-1 gp41 aploksnes II kopas cilvēka monoklonālās antivielas uzrāda polireaktivitāti, saistoties ar fosfolipīdiem un olbaltumvielu autoantigēniem. J. Virols. 2011, 85, 1340–1347. [CrossRef]

61. Tkola, A.; Kusters, H.; Ruserts, P.; Džoss, B.; Fišers, M.; Līmans, C.; Manrike, A.; Hūbers, M.; Rērs, M.; Oksenijs, A.; un citi. HIV-1 atsitiena aizkavēšanās pēc pretretrovīrusu terapijas pārtraukšanas, pasīvi pārnesot cilvēka neitralizējošās antivielas. Nat. Med. 2005, 11, 615–622. [CrossRef]

62. Šenks-Reclafs, M.; Van, F.; Morlijs, T.; Andersons, C.; Hamms, M.; Brauns, M.; Roulends, K.; Pancari, G.; Zormans, J.; Lovs, R.; un citi. Korelācija starp peles potenciālu un in vitro relatīvo potenciālu cilvēka papilomas vīrusa 16. tipa vīrusam līdzīgām daļiņām un Gardasil vakcīnas paraugiem. Hum. Vakcīna. 2005, 1, 191–197. [CrossRef] [PubMed]

64. Kilpelejens, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubī, N.; Soto, CY; Džozefs Munns, J. Rekombinantās Mycobacterium bovis BCG balstītas HIV vakcīnas izstrādes sasniegumi un izaicinājumi: Gūtās atziņas. Expert Rev. Vaccines 2018, 17, 1005–1020. [CrossRef] [PubMed]




Jums varētu patikt arī