Cistanche polisaharīdu apoptotiskā ietekme uz leikēmiju

Autors:

LI Jans,DŽANGS Džins,DŽANGS Jing-Nans,un citi.

Iekšējā Mongolija, Ķīna

Lai izpētītu apoptotisko efektuCistanche polisaharīdi( CDP) uz cilvēkuakūta leikēmijašūnu līnija Jurkat šūnas.MetodesMTT tests tika izmantots, lai noteiktu CDP ietekmi uz šūnu proliferāciju, Western blotēšana tika izmantota, lai noteiktu kaspāzes-9 un kaspāzes-3 aktivizāciju., un tika pārbaudītas arī apoptotiskās signāla molekulas.RezultātiT šūnu proliferāciju inhibēja 1 mg / ml un 2 mg / ml CDP, T šūnu apoptozi izraisīja 5 mg / ml CDP, unprokaspāzes-9 un prokaspāzes-3 izpausmes tika ievērojami samazinātas. Šūnu virsmas receptoru CD45 un CD71 ekspresiju ievērojami kavēja 5 mg / ml CDP, Tika ierosināta EＲK fosforilēšanās, un JNK fosforilācija tika kavēta.

Secinājumi

【Atslēgas vārdi】Cistanche polisaharīdi; Apoptoze; Ｒ receptors; kaspāze-9; kaspāze-3

Akūta limfoblastiska leikēmija (ALL) ir limfātiskās sistēmas ļaundabīga klonāla slimība ar augstu imūnfenotipa neviendabīguma pakāpi. , viegli recidīvs utt. Pašlaik plaši izmantotās ārstēšanas metodes ietver kaulu smadzeņu transplantāciju, indukcijas terapiju, imūnterapiju, kombinēto ķīmijterapiju utt. Tā kā vairumam ķīmijterapijas zāļu ir ierobežotas spējas mērķēt un iznīcināt audzējus, tās var izraisīt nopietnus gremošanas sistēmas, asins sistēmas, sirds un cerebrovaskulāri utt. Ārstēšanas laikā to bieži pavada nopietnas blakusparādības, no kurām dažas ir pat letālas. Ķīmijterapijai progresējot, organismam ir tendence attīstīties tolerancei pret ķīmijterapijas zālēm, palielinot slimības atkārtošanās risku.

Tāpēc ļoti efektīvas, zemas toksicitātes un ļoti mērķtiecīgas leikēmijas terapijas vai adjuvantas terapijas meklēšana ir kļuvusi par pašreizējās uzmanības centrā.Cistanchemongoļu valodā sauc par Čagangaoju. Tas pieder Ledangaceae ģimenei un Cistanche ģints. Tas ir parazitārs uz tuksneša koku saknēm, un tam ir "tuksneša žeņšeņa" reputācija.

Galvenās Cistanche aktīvās sastāvdaļas ir feniletanola glikozīdi, lignāni, betaīni, sterīni, aminoskābes un polisaharīdi. Pretiekaisuma, pretvīrusu, antioksidantu, imūnregulācijas un citi efekti.

Pētījumi ir atklājuši, kaCistanche polisaharīds (CDP),kā viena no galvenajām aktīvajām sastāvdaļām,ir pretaudzēju un imūnmodulējoša iedarbība.Pētnieki atklāja, ka CDP ir nozīmīga iznīcinoša ietekme uz leikēmijas šūnām K562 un THP-1, un ierosināja, ka CDP ir noteikta lomaleikēmijas profilakse vai ārstēšana. Turklāt tradicionālā ķīniešu medicīnas savienojums, cistanche, akūtu slimību ārstēšanaileikēmija, Cistancheir arī viena no svarīgākajām sastāvdaļām. Tomēr īpašais darbības mehānismsCistanchenav zināms. Šajā rakstā par izolāciju un attīrīšanuCistanche CDPtika pētīti, un tika pētīta CDP nogalināšanas ietekme un ar to saistītais mehānisms uz cilvēka akūtas leikēmijas šūnu līniju Jurkat.

1.1. Galvenie reaģenti un instrumenti

Cistanche pulveris tika iegādāts no Sichuan VečistančeGroup Co, Ltd., cilvēka akūtas leikēmijas šūnu līnija Jurkat tika iegādāta no Šanhajas Šūnu bioloģijas institūta šūnu bankas, tiazolzilais (MTT) un nātrija dodecilsulfāts (SDS) tika iegādāts no Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāts no Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., cisteīnu saturoša kaspaze-3, kaspaze-9, CD71, CD45, fosforilēta c-Jun aminotermināla kināze (p -JNK) un fosforilētās ekstracelulārās signālu regulētās kināzes (p-ERK) antivielas tika iegādātas no Cell Signaling Technology, ASV, un aktīna antivielas tika iegādātas no Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Elektroķīmiska Luminiscences (ECL) substrāts tika iegādāts no Thermo. Scientific Company of Amerikas Savienotajās Valstīs un citi reaģenti bija vietējās analītiskās kvalitātes. Gel-View 6000 plus viedā attēlu darbstacija (Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd. produkts), Revolve FL otrādi fluorescences mikroskops (Echo Laboratories, ASV produkts), EPOCH mikroplašu lasītājs (Beijing Bo Teng Instrument Co., produkts, SIA).

1.2. CDP atdalīšana un attīrīšana Ņem 500 gCistanche ekstrakta pulveris, iemērc uz nakti 95 procentu etanolā, filtrē ar marli, savāc filtra atlikumus, vāra ar karstu ūdeni 60 grādos 2 h/laikā, kopā 3 reizes. Pēc beigām filtrātus trīs reizes apvienoja, pazeminātā spiedienā koncentrēja līdz 2/3 no sākotnējā tilpuma, pievienoja 3 reizes vairāk 95% etanola un ļāva nostāvēties 4 grādu temperatūrā nakti. Nākamajā dienā centrifugējiet pie 4 000 apgr./min 10 minūtes, savāc nogulsnes, atdala olbaltumvielas ar Sevag metodi, nogulsnē ar absolūto etanolu, liofilizē, lai iegūtu CDP.

1.3 Šūnu kultūra Cilvēka akūtas leikēmijas šūnu līnija tika uzglabāta šķidrā slāpeklī Jurkat laboratorijā. Lietojot, šūnas tika ātri atgūtas 37 grādu ūdens vannā un kultivētas RPMI1640 barotnē (satur 100 V/ml penicilīna un 100 V/ml streptomicīnu) ar 10% FBS. Šūnas tika kultivētas 37 grādu 5 procentu CO2 šūnu inkubatorā, pasāžas ik pēc 2 līdz 3 dienām, un eksperimenti tika veikti, kad šūnas iegāja logaritmiskajā augšanas fāzē.

1.4. MTT eksperiments Jurkat šūnas logaritmiskās augšanas fāzē tika paņemtas, centrifugētas, lai iegūtu šūnu granulas, un saskaitītas ar 5 × 105 šūnas/ml. Paņemiet 96-iedobes šūnu kultūras plāksni, katrā iedobē inokulējiet 100 ul šūnas un pēc tam pievienojiet 100 ul RP-MI1640 pilnu barotni kā kontroles grupu; eksperimentālā grupa tika sadalīta 3 grupās, vispirms izmantojot RPMI1640 barotni, lai sagatavotu dažādas CDP koncentrācijas, un pēc tam katrai iedobei pievienojot 100 ul RP-MI1640 barotnes. Lai noteiktu CDP galīgo koncentrāciju attiecīgi 1, 2 un 5 mg/ml, tika izmantotas ul Jurkat šūnas un 100 ul CDP šķīdums. Katra grupa tika izveidota ar 5 dublētām iedobēm un inkubēta 37 grādu šūnu inkubatorā 48 stundas. Pēc inkubācijas katrā iedobē pievienojiet 20 ul MTT (izejas šķīduma koncentrācija ir 5 mg/ml), ievietojiet to atpakaļ šūnu inkubatorā un turpiniet inkubēt 4 stundas un visbeidzot pievienojiet 100 ul 20 procentu. SDS, lai uz nakti izšķīdinātu formazānu 37 grādos un izmantotu nākamajā dienā. Katras grupas absorbcija pie 570 nm tika noteikta ar mikroplašu lasītāju, un dažādu koncentrāciju CDP inhibīcijas ātrums uz Jurkat šūnu proliferāciju tika aprēķināts pēc formulas.

1.5. Western blotēšana Jurkat šūnas logaritmiskās augšanas fāzē tika iesētas 6-iedobes plāksnē ar blīvumu 2 × 105 šūnas/ml, 500 ul/iedobē un 500 ul RPMI1640 pilnīga barotne tika pievienota kontrolei. grupai. Izveidojiet 3 eksperimentālās grupas, 1, 2 un 5 mg/ml polisaharīdu apstrādes grupas, CDP

Iepriekš izšķīdināts pilnīgā barotnē RPMI1640, 500 ul šūnu un 500 ul dažādu koncentrāciju CDP šķīdumu pievienoja 6-iedobes plāksnei un inkubēja 37 grādu temperatūrā 48 stundas. Pēc kultivēšanas katras grupas šūnu suspensijas savāca, centrifugēja pie 1 500 apgr./min 5 minūtes, lai iegūtu šūnu granulas, un divas reizes nomazgāja ar iepriekš atdzesētu fosfātu buferšķīdumu (PBS). Pēc mazgāšanas katrai grupai pievienoja 20 ul šūnu līzes buferšķīduma, un šūnas 30 minūtes lizēja uz ledus. Kopējais proteīns tika ekstrahēts un šūnu koncentrācija tika pielāgota, izmantojot Bredforda metodi. SDS-poliakrilamīda gēla elektroforēzei (PAGE) no katras grupas tika paņemti 20 ug proteīna, un proteīns tika pārnests uz polivinilidēnfluorīda (PVDF) membrānu ar elektroporāciju. Bloķēts ar beztauku piena pulveri istabas temperatūrā 1 stundu, pievienotas truša anti-cilvēka kaspāzes-3 un kaspāzes-9 antivielas ar atšķaidījuma attiecību 1:1 000, inkubēts istabas temperatūrā 1 h, 3 reizes izskalots ar fosfāta Tween bufera (PBST) kratītāju (10 min/reize), pievienot ar mārrutku peroksidāzi (HRP) iezīmētu sekundāro antivielu (1:1 000), inkubēt 1 stundu istabas temperatūrā, izskalot 3 reizes ar PBST, 1 reizi noskalojiet ar PBS, pievienojiet ECL substrātu un izmantojiet Attēlveidošanai tika izmantota viedā attēla darbstacija, un tika salīdzinātas katras grupas joslu izmaiņas, lai pētītu CDP izraisīto Jurkat šūnu apoptozi. Lai noteiktu ar apoptozes ceļu saistītus proteīnus, šūnu kultūras un CDP apstrādes apstākļi bija tādi paši kā iepriekš. Pēc reakcijas šūnas tika lizētas olbaltumvielu kvantitatīvai noteikšanai. Proteīns tika pārnests uz PVDF membrānu ar SDS-PAGE un elektroporāciju. Pēc 1 stundu ilgas bloķēšanas ar vājpiena pulveri tika pievienotas anti-CD71, CD45, p-JNK un p-ERK antivielas (1:1 000) un inkubētas istabas temperatūrā 1 stundu. Ar HRP iezīmēto sekundāro antivielu (1:1 000) inkubēja 1 stundu, un visbeidzot attēlveidošanai tika izmantota viedā attēlveidošanas darbstacija, lai pētītu saistītās CDP izraisītās Jurkat šūnu apoptozes signalizācijas molekulas. Iegūtās eksperimentālās joslas tika iekrāsotas pelēkā krāsā ar attēlu J (1.8.0).

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu Cistanche ietekmi uz pretaudzēju un pretvēža iedarbību

1.6. Statistiskā analīze SPSS21.0 programmatūra tika izmantota t-testam un dispersijas analīzei

2 Cistanche funkcijas rezultāti ir ieslēgtileikēmija

2.1. Šūnu proliferācijas līmenis

CDP tika veiksmīgi izolēts ar vairāk nekā 9{{20}} procentu cukura saturu un mazāk nekā 5 procentiem olbaltumvielu saturu. Šūnu proliferācijas kavēšanas ātrums 1 mg/ml CDP grupā bija (19,1 ± 2,1) procenti, savukārt 2 mg/ml un 5 mg/ml CDP grupās bija (44,2 ± 5,2). ) ) procenti un ( 47, 8 ± 4, 4) procenti , norādot, ka CDP var būtiski kavēt Jurkat šūnu proliferāciju atkarībā no devas. 2.2. Salīdzinot ar kontroles grupu (0,62±0.04, 0,56±{{40}}.{{49) }}7), apoptozes līmenis Jurkat šūnās, kas apstrādātas ar 5 mg/ml CDP, izraisīja kaspāzes-9 un kaspāzes{{30}} enzīmus. Pro-form pro-kaspāze-9 ( 0. 09 ± 0. 02) un pro-kaspāze-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) bija ievērojami samazinātas, un 1 mg/ml un 2 mg/ml CDP grupas bija ievērojami mazāk efektīvas attiecībā uz prokaspāzi-3 šūnās. Kaspāzes-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) un prokaspāzes-3 saturam (0,48±0,04, 0,44±0,05) nebija būtiskas ietekmes, tas ir, zems. CDP koncentrācija neizraisīja Jurkat šūnu apoptozi, bet galvenokārt kavēja šūnu proliferāciju, kā parādīts 1.

1-4: atsauces grupa,

1 mg/ml CDP grupa, 2 mg/ml CDP grupa, 5 mg/ml CDP grupa; tāds pats kā nākamajā attēlā

1. attēls CDP ietekme uz kaspazi-9 un kaspāzi-3 Jurkat šūnās

Cistanche polisaharīdu ietekme Ietekme uz leikēmiju

2.3. CD71 un CD45 relatīvie ekspresijas līmeņi apoptozes receptoru kontroles grupā bija 1.00±0.04, {{10}},54±54± 0.{{20}}2. 5 mg/ml CDP grupa var būtiski inhibēt CD71 (0.05±0.02). 01) un CD45 (0. 13 ± {{40}}. 03); 1 mg/ml un 2 mg/ml CDP grupas zināmā mērā varēja inhibēt CD71 ekspresiju (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07). Nav būtiskas ietekmes uz CD45 ekspresiju (0,51). ±0,01, 0,48±0,02). Skatīt 2. attēlu.

2. attēls CDP ietekme uz receptoru ekspresiju uz šūnu membrānas virsmas

2.4. Ar apoptozi saistīti ceļi

P-JNK un p-ERK relatīvie ekspresijas līmeņi atsauces grupā bija 1,20±0.08 un 0,21±0 .03. 5 mg / ml CDP grupa izraisīja apoptozi un ievērojami samazināja JNK fosforilācijas līmeni. ( 0. 32 ± 0. 04) , būtiski paaugstināja ERK fosforilācijas līmeni (1. 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP paaugstināja JNK fosforilācijas līmeni (1.12 ± 0. 06 , 1.06 ± 0.06) būtiski neietekmēja, bet tomēr palielināja ERK fosforilācijas līmeni. (0. 54 ± 0. 04, 0. 63 ± 0. 02). Skatīt 3. attēlu.

3. attēls CDP ietekme uz JNK un ERK fosforilāciju

3 Diskusija

Pēdējos gados pētījumos konstatēts, ka CDP ir zināma inhibējoša iedarbība uz leikēmijas šūnu līnijām, taču konkrētais darbības mehānisms vēl nav zināms.

Apoptozes procesā kaspāze -9 ir viena no augšpus signālmolekulām no kaspāzes atkarīgajā apoptozes procesā. Pēc signāla stimulācijas prokaspāze-9 tiek masveidā hidrolizēta, lai iegūtu aktivētu šķeltās kaspāzes formu-9, kas turpina raidīt apoptotiskos signālus uz leju, lai veicinātu apoptozes procesu. Kaspāze -3 ir efektora tipa kaspāzes molekula un ir galvenā signalizācijas molekula no šūnu kaspāzes atkarīgās apoptozes procesā. Normālos apstākļos tas pastāv arī proenzīma (prokaspāzes-3) veidā. Pēc hidrolīzes aktivizēšanas tiek ražots liels daudzums šķeltās kaspāzes. -3, tas lizēs dažādas galvenās olbaltumvielu molekulas šūnās un galu galā izraisīs apoptozi. CDP pieder pie bioloģisko makromolekulu aktīvajiem polisaharīdiem un nevar brīvi iekļūt šūnās caur šūnu membrānu. Tāpēc CDP inducē apoptozi, ietekmējot receptoru ekspresiju un izplatību uz Jurkat šūnu membrānu virsmas, tādējādi pārraidot signālus uz šūnu iekšpusi un visbeidzot aktivizējot kaspāzes ģimeni. proteīnu, kas izraisa šūnu apoptozi. Šis pētījums parāda, ka zema CDP koncentrācija neizraisa Jurkat šūnu apoptozi, bet galvenokārt kavē šūnu proliferāciju. CD71, pazīstams arī kā transferīna receptors, ir II tipa transmembrānas glikoproteīna receptors, kas iesaistīts dzelzs absorbcijā un šūnu augšanas un attīstības regulēšanā. CD71 ir ļoti izteikts pacientiem ar akūtu leikēmiju un ir saistīts ar primāro zāļu rezistenci, tas ir, CD71 ekspresiju. Jo augstāka vērtība, jo sliktāka ir pirmās ķīmijterapijas iedarbība. Tāpēc CD71 ir viens no palīgdiagnozes marķieriem. CD45 tiek ekspresēts uz visu veidu leikocītu virsmas, ko sauc arī par leikocītu kopējo antigēnu. Tas pieder pie I tipa transmembrānas glikoproteīna un ir cieši saistīts ar T šūnu attīstību un diferenciāciju. CD45 ir dažādi ekspresijas līmeņi un allosteriskie veidi dažādos leikēmijas veidos, tāpēc to var izmantot kā vienu no marķieriem leikēmijas diferenciāldiagnozei un imūnfenotipēšanai. CD45 monoklonālās antivielas ir plaši izmantotas leikēmijas, īpaši pret zālēm rezistentas leikēmijas, ārstēšanā. Friesen et al. konstatēja, ka radionuklīdi

Ar marķētu CD45 mAb var izraisīt apoptozi pret zālēm rezistentās leikēmijas šūnu līnijās, aktivizējot kaspāžu ģimenes proteīnus (tostarp kaspāzi-3, kaspāzi-8 un kaspāzi-9). CDP inducē Jurkat šūnu apoptozi, pirmkārt, iedarbojoties uz šūnu membrānas virsmas receptoriem CD45 un CD71, ietekmējot abu ekspresiju un izplatīšanos, pārraidot šūnās apoptozes signālus un visbeidzot aktivizējot kaspazi-9 un kaspazi{{8 }}, izraisot apoptozi. Tomēr gan kaspāze-9, gan kaspāze-3 atrodas lejpus apoptotiskā ceļa, un ir jāturpina pētīt augšupējās signālmolekulas. Šajā pētījumā CDP koncentrācijā 5 mg/ml izraisīja Jurkat šūnu apoptozi, vienlaikus kavējot CD45 ekspresiju, kas bija līdzīga iepriekš aprakstītajai CD45 monoklonālajai antivielai. Tāpēc, raugoties no ar apoptozi saistīto receptoru CD45 un CD71 viedokļa,Cistancheir zināms potenciāls leikēmijas ārstēšanai vai adjuvantai ārstēšanai.Mitogēnu aktivētās proteīnkināzes sistēmas (MAPK) tiek ekspresētas visās eikariotu šūnās.

Cistanche tabletes leikēmijas ārstēšanas imūnsistēmas uzlabošanai

Tas ir ļoti svarīgs informācijas pārraides ceļš, kas veic ārpusšūnu stimulācijas signāla transdukciju uz intracelulāro un sastāv no serīna/treonīna proteīnkināzēm, tostarp ERK, JNK un p38MAPK. Tās fosforilēšana un defosforilēšana ir šūnu dzīves aktivitāšu slēdži, un tie ir iesaistīti un regulē šūnu augšanas, proliferācijas, diferenciācijas, aktivācijas un apoptozes procesu. Šis pētījums liecina, ka JNK defosforilācija ir iesaistīta CDP izraisītā T šūnu apoptozē, savukārt ERK fosforilācija ir iesaistīta abos procesos, jo CDP kavē šūnu proliferāciju un inducē apoptozi.

Noslēgumā,Cistanche CDPir citotoksiska iedarbība uz T-limfocītu leikēmijas šūnu līniju Jurkat, parādot, ka zemas koncentrācijas (zem 2 mg/ml) kavē šūnu proliferāciju, bet augstas koncentrācijas (5 mg/ml) inducē apoptozi.Cistanche CDPinducē apoptozi Jurkat šūnās, galvenokārt ietekmējot un mainot šūnas.

Ar apoptozi saistīto receptoru CD71 un CD45 ekspresija uz membrānas virsmas pārraida signālus uz šūnu iekšpusi, vēl vairāk izraisot ERK fosforilēšanos un JNK defosforilāciju un visbeidzot kaspāzes -9 aktivāciju, kas savukārt aktivizē kaspāzi{{4} } lai izraisītu apoptozi.