Hrizogenamīds A no endofītiskās sēnītes, kas saistīta ar Cistanche Deserticola un tās neiroprotektīvo ietekmi uz SH-SY5Y šūnām

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Ievads

Cistanche deserticola(YC Ma) ir parazitārs augs, kura dzimtene ir Ķīnas ziemeļrietumi. Šī auga kāts ir svarīga tradicionālā ķīniešu medicīna, un to izmanto nieru mazspējas un neirastēnijas ārstēšanai ("Ķīniešu medicīnas vārdnīca", 1977). Feniltanoīdu glikozīdi noCistanchedeserticolaIr ziņots, ka tiem ir darbības galvaskausa nervu slimību profilaksē un ārstēšanā un brīvo radikāļu attīrīšanā [1, 2]. Pamatojoties uz to, ka endofītiskās sēnes var ražot jaunus ārstnieciskos komponentus un tādus pašus/līdzīgus kā no saimniekaugiem, jaunu aktīvo savienojumu meklēšana no svarīgu ārstniecības augu endofītiskajām sēnēm parāda jaunu ārstniecības resursu attīstības vērtību. Veicot jaunu endofītisko sēņu neiroprotektīvo savienojumu meklējumus noCistanchedeserticolasavākti no Iekšējās Mongolijas Ķīnas ziemeļrietumos, trīs aktīvie celmi tika pārbaudīti, izmantojot SH-SY5Y šūnas. Tostarp sēnītes Nr. 005 kultūras buljons, kas autentificēts kā Penicillium chrysogenum, uzrādīja nozīmīgu neirocītu aizsardzības efektu pret oksidatīvā stresa izraisītu šūnu nāvi SH-SY5Y šūnās. Pētījumi par šī celma aktīvajām sastāvdaļām ļāva izolēt hrizogenamīdu A (1) (1. att.), izmantojot bioloģiskās analīzes vadītu izolēšanas procedūru. Turklāt četri zināmi savienojumi tika izolēti un identificēti kā apzīmēti G (2) [3], 2-[(2-hidroksipropionil) amino] benzamīds (3) [4], 2- ,3-dihidrosorbicilīns (4) [5] un (9Z,12Z)-2,3-dihidroksipropiloktadeka-9, 12-dienoāts (5) [6] , salīdzinot to spektroskopiskos datus ar literatūras datiem. Šeit mēs ziņojam par hrizogenamīda A izolāciju, identificēšanu un neiroprotektīvo iedarbību.

Cistanche deserticola

Materiāli un metodes

Sēnīšu materiāls Penicillium chrysogenum Nr. 005 paraugs tika izolēts no C. deserticola saknes, kas savākta no Iekšējās Mongolijas Ķīnas ziemeļrietumos. Uz kartupeļu dekstrozes agara makroskopiski veidojās izkliedētas, gludas, samtainas, zili zaļas kolonijas, kas dažkārt bija aizaugušas ar gaišām hifām; uz koloniju virsmas bieži bija redzami daudzi gaiši dzelteni pilieni; reverss dzeltens. Tika veikta GenBank meklēšana ar 18S ribosomu DNS gēnu secību Nr. 005 (1676 nukleotīdi; Gen-Bank pievienošanās numurs EU203859). Rezultāti norāda uz Penicillium chrysogenum sugu kā tuvāko atbilstību. Pamatojoties uz tā makroskopisko izskatu un 18S rDNS gēnu secību, Nr.005 ir Penicillium chrysogenum celms.

Fermentācija un ekstrakcija

Sēne tika audzēta statiskos apstākļos 24 grādu temperatūrā 3{{10}} dienas 35 1000-ml koniskajās kolbās, kas satur šķidru barotni (30{{2{{22} }}} ml/kolbā), kas sastāv no glikozes (10 g/litrā), maltozes (20 g/litrā), mannīta (20 g/litrā), mononātrija glutamāta (10 g/litrā), KH2PO4 (0,5 g/litrā), MgSO4·7H2O (0,3 g/l), kukurūzas mērcēšanas šķidrums (1,0 g/l) un rauga ekstrakts (3,0 g/l) un jūras ūdens pēc pH noregulēšanas līdz 7,0. Raudzēto visu buljonu (10,5 litri) trīs reizes ekstrahēja ar EtOAc, lai iegūtu EtOAc šķīdumu, kas tika koncentrēts pazeminātā spiedienā, lai iegūtu neapstrādātu ekstraktu (9,5 g).

Attīrīšana

Neapstrādāts ekstrakts (9,5 g) tika sadalīts 15 frakcijās silikagela kolonnā, izmantojot pakāpenisku gradienta eluēšanu ar petrolēteri/Me2CO. Frakcija 2, eluēta ar 8:2 petrolēteri/Me2CO, tika pārkristalizēta no MeOH, iegūstot 3 bezkrāsainu adatu veidā (8.{{10}} mg). Frakcija 3 (19.{{30}} mg), kas tika eluēta ar 7:3 petrolēteri/Me2CO, tālāk tika atdalīta ar apgrieztās fāzes kolonnu (RP18, 40 6{{38). }} mm, Merck; MeOH - H2O 3:2→4:1→MeOH), lai iegūtu fr. 3 7 (8.0 mg), kas tika attīrīts ar plašu PHPLC (60 procenti MeOH, kas satur {{70}},1 procentus TFA, 4.{77} } ml/minūtē), lai iegūtu 4 (2.{{80}} mg). Frakcija 4 (26,0 mg), eluēta ar 6:4 petrolēteri/Me2CO, tālāk tika atdalīta ar apgrieztās fāzes kolonnu (RP18, 40 x 60 mm, Merck; MeOH - H2O 3:2 → 4:1 → MeOH), lai iegūtu fr. 4-3 (5,4 mg) un fr. 4-9 (7,6 mg). Pēc tam fr. 4-3 tika atdalīts ar plašu PHPLC [YMC-pack ODS (A), 10 250 mm, 5 mm, 4,0 ml/min] (60 procenti MeOH, 4,0 ml/minūtē), iegūstot 2 (1,0 mg) un fr. 4-9 tika atdalīts ar plašu PHPLC (80% MeOH, 4,0 ml/minūtē), iegūstot 1 (4,0 mg) un 5 (2,6 mg). 1: iegūts gaiši dzeltenā cietā veidā; [a]D25 24,5 grādi (c 0,155, MeOH); UV (MeOH) l max 208, 251 nm; CD (MeOH) (skat. 4. att.); IR (KBr) n max 3433, 3200, 3076, 2928, 2862, 1677, 1440, 1370, 1324, 1188, 1029 cm1; 1H- un13C-NMR (skat. 1. tabulu); HRESI-MS m/z 448,2951 [MH] (aprēķināts C28H38N3O2, 448,2964)

DPPH radikālas attīrīšanas efekts

MeOH šķīdums (160 ml) ar dažādu parauga koncentrāciju (1.0 mg/ml 0,0001 mg/ml) tika pievienots 40 ml DPPH (1,1- difenils{{8). }}pikrilhidrazils; Sigma) MeOH šķīdums (1,5 10 4 M). Pēc maigas sajaukšanas un atstāšanas uz 30 minūtēm istabas temperatūrā optiskais blīvums tika mērīts pie 520 nm, izmantojot spektrofotometru. Katra parauga antioksidanta aktivitāte tika izteikta kā IC50 (mg/ml vai mM, kas nepieciešama, lai par 50 procentiem kavētu DPPH radikāļu veidošanos) un aprēķināta no logaritmiska devas inhibīcijas līknes.

cistanche deserticola neiroprotektīvs līdzeklis

Šūnu kultūra un ārstēšana ar zālēm

Cilvēka neiroblastomas SH-SY5Y šūnas tika kultivētas DMEM barotnē un uzturētas 37 grādu temperatūrā mitrinātā atmosfērā ar 50 procentiem CO2. Šīs šūnu suspensijas (180 ml) ar blīvumu 5*104 šūnu ml-1 tika izklātas 96- iedobju mikrotitrēšanas plāksnēs un inkubētas 24 stundas virs nosacījuma. Hrizogenamīda A šķīdumu (2, 0 ml DMSO) dažādās koncentrācijās pievienoja katrai iedobei, izņemot kontroles un modeļa grupu, un tālāk inkubēja 1 stundu tādos pašos apstākļos. H2O2 (Sigma Chemical Co., MO, ASV) tika pievienots, lai izraisītu apoptozi SH-SY5Y šūnās ar galīgo koncentrāciju 200 mM 24 stundas. Šūnu dzīvotspēja tika noteikta, izmantojot MTT testu. MTT, kas izšķīdināts ar fosfātu buferšķīdumā, tika pievienots inkubācijas beigās līdz galīgajai koncentrācijai 5, 0 mg / ml (PBS), un pēc tam inkubēja 37 grādu temperatūrā 4 stundas. Izmetot supernatantu, iegūtais formazāna produkts tika izšķīdināts.

Rezultāti un diskusija

1 tika iegūta kā gaiši dzeltena cieta viela. Molekulārā formula tika noteikta kā C28H37N3O2 ar HRESI-MS (novērots [MH] pie m/z 448,2951, saukts par [MH] C28H38N3O2, 448,2964). IR spektrs liecināja par NH (3433 un 3200 cm 1 ) un karbonilgrupas(-u) (1677 cm-1) klātbūtni. 1H-NMR (1. tabula) spektrs, kas reģistrēts DMSO-d6, atklāja trīs metilgrupas (d H 0,62, 0,87, 0,98) un divus maināmus protonu signālus (d H 10,36 un 8,29). Turklāt trīs ortosa savienoti aromātiskie signāli (d H 6,90 dd, J 7,3, 7,3 Hz, 6,94 d, J 7,3 Hz un 7,18 J 7,3 Hz) norādīja uz 1,2, 3-triaizvietotu benzola gredzenu. Metilēna protoni (d H 3,23) savienojumā ar olefīna protonu (d H 5,27) kopā ar diviem vinila metiliem (d H 1,67 un 1,70) liecināja par 3-metil-2-butenilgrupas klātbūtni. 1. Šo protonu un vēl 14 metīna un/vai metilēna protonu vienas saites savienojumi tika noteikti ar HMQC eksperimentu. 13C-NMR un DEPT (1. tabula) spektri, kas atklāja 28 signālus, arī apstiprināja šo divu fragmentu klātbūtni [triaizvietots benzola gredzens (dC 123,6 CH, 120,8 CH, 127,7 CH, 122,1 QC un 140,4 QC) un a{101} {79}}metil-2-butenilgrupa (dC 28 CH2, 121,9 CH, 132,3 QC, 25,5 CH3 un 17,7 CH3)]; turklāt divi karbonilgrupas (dC 183.1 un 172.3), četri sp3 ceturtdaļoglekli (dC 46.5, 58.7, 60.4 un 62.3), divi sp3 metīni (dC 46.1 un 58.7) un seši sp3 metilēni (dC 418,3, 318,3, 20.3, 30.3). Tika novēroti arī 35,2, 39,9 un 64,9). Tā kā tika reģistrēti 6 no 12 nepiesātinājuma gadījumiem, tika secināts, ka 1 satur sešus gredzenus. Turpmāka šo spektrālo datu izvērtēšana, kā arī 1 H-1 H COZY un HMBC rezultāti atklāja, ka 1 ir cieši saistīts ar sēnīšu metabolītu markfortīna grupu [7]. HMBC korelāciju interpretācija (2. att.) norādīja uz daļējas struktūras A klātbūtni (HMBC korelācijas 1-NH pret C-8 un C-9; H-6 pret C{{ 136}}; H-5 uz C-7 un C-9; H-26 uz C-28 un C-8 un H{{143 }} uz C-29 un C-30) un B (HMBC korelācijas H-10 līdz C-3, C-22, C-21, C-11, C-12; H-20 līdz C-13, C-18, C-22, C-11 un { {157}}NH līdz C-13, C-10) un C, sešu locekļu G gredzens [8] ar metilētu oglekli pie C-17 (HMBC korelācijas H{{ 163}} līdz C-17, C-16). Apakšstruktūras A līdz B līdz C-3 savienojamību atbalstīja galvenās HMBC korelācijas no H-4 un 1-NH līdz C-3; H-10 uz C-2 un C-9. Saikne starp struktūru B un C ar slāpekļa atomu tika secināta, izmantojot galvenās HMBC korelācijas no H-12 uz C-17 un C-13 un salīdzinot to atbilstošās ķīmiskās nobīdes C{{176 }} un C-17 (dC 64,9 un 58,7). Iepriekš minētā analīze liecināja, ka 1 struktūra ir līdzīga markfortīnam A, izņemot sānu ķēdes atšķirības benzola gredzenā un metilgrupas C -17 sešu locekļu G gredzenā. Tātad bruto struktūra 1 tika piešķirta, kā parādīts 1. attēlā

1 relatīvā stereoķīmija tika noskaidrota, pamatojoties uz NOESY datiem (3. att.). Iepriekšējie pētījumi atklāja, ka 2-oksindola alkaloīdu tipa savienojumiem ir tāda konformācija, kurā centrālais piecu locekļu gredzens ir ortogonāls pret oksindola apakšvienības plakni [9].

NOESY korelācijas starp H{{0}} un H-10a, H-25 un starp 19-NH un H-10a norādīja, ka tās ir abi ciklopentanona gredzena priekšpusē, kas tos orientē uz H-4, fiksējot relatīvo stereoķīmiju pie C-3, kā parādīts attēlā. NOESY mijiedarbība starp H-21, H-12a, H-10b, H-23 un H-24 novietoja atbilstošos aizvietotājus kopā uz priekšējās virsmas. ciklopentanona gredzens. 1. piedāvātā relatīvā stereoķīmija atbilst markfortīna A relatīvās stereoķīmijas attiecīgajām iezīmēm [7]. Kokvilnas efekts pie 200-250 nm rodas no diketopiperazīna amīda saišu np* pārejas, kas ir biciklo-[2.2.2] diazaoktāna diketopiperazīna kodola diagnostikas līdzeklis [10, 11]. 1 CD spektrs (4. att.) korelēja ar attiecīgajiem -brevianamīda A reģioniem [11]. Tātad 1 absolūtajai stereoķīmijai jābūt 3S, 11S, 13S, 17S, 21R, un tai tika piešķirts hrizogenamīda A nosaukums. Sākotnējais krizogenamīda A aizsargājošās iedarbības novērtējums uz neirocītiem tika novērtēts, izmantojot oksidatīvā stresa izraisītu šūnu nāvi SH-SY5Y. šūnas ar MTT testu. Hrizogenamīda A brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitāte vispirms tika pārbaudīta, izmantojot DPPH kā brīvo radikāļu donoru. Atšķirībā no C vitamīna (IC50: 29,0 mM), krizogenamīds A neuzrādīja nekādu spēju (IC50, kas ir lielāks vai vienāds ar 100 mM) iztvert DPPH brīvos radikāļus koncentrācijā līdz 100 mM. Tikmēr mēs pārbaudījām, vai krizogenamīds A aizsargā šūnas pret oksidatīvā stresa izraisītu šūnu nāvi SH-SY5Y cilvēka neiroblastomā

šūnas. Ūdeņraža peroksīda izraisītais oksidatīvais stress izraisīja šūnu dzīvotspējas samazināšanos par 43 procentiem, salīdzinot ar kontroles grupu. Hrizogenamīds A inhibēja šūnu nāvi, ko izraisīja ūdeņraža peroksīds, uzlabojot šūnu dzīvotspēju par 59,6 procentiem koncentrācijā 1*10-4 mM. Šie dati liecināja, ka krizogēnamīdam A bija neirocītu aizsardzības efekts pret oksidatīvā stresa izraisītu šūnu nāvi, nevis ar antioksidantu aktivitāti. Indola alkaloīdi, kam piemīt neparasta biciklo [2.2.2] diazaoktāna gredzenu sistēma, ir izolēti no dažādām sēņu ģintīm, piemēram, Aspergillus [12, 9, 13], Penicillium [14 16] un Malbranchea [17]. 1 bija jauns šīs savienojumu grupas loceklis, tam bija skelets, kas, domājams, būs starpprodukts citrīna administratoru A un B biosintēzē, par ko 2005. gadā tika ziņots kā par jaunu pentaciklisko spiroīna dolinona alkaloīdu klasi [18]. No struktūras viedokļa ir svarīgi norādīt, ka 1 ir unikāla struktūra ar metilēšanu pozīcijā C-17 un 2- oksindola daļu, kam C-7 ir izoprēna vienība. Dažiem no šiem līdz šim izolētajiem indolalkaloīdiem piemīt spēcīga pretparazītu aktivitāte [19], cilvēka audzēja šūnu inhibīcija [13] un citotoksicitāte [10]. Cik mums ir zināms, tas ir pirmais ziņojums par šāda veida alkaloīdu izraisītu neiroprotekciju.

AtzinībaŠo darbu finansiāli atbalstīja Ķīnas Nacionālais dabaszinātņu fonds (Nr. 30472136).

cistanche deserticola neiroprotektīvs: anti-Alcheimera slimība

Cistanche deserticola ir daudz efektu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Atsauces

1. Li LL, Wang XW, Wang XF. Antilipīdu peroksidācija un glikozīdu pretradiācijas darbībaherba Cistanches. Ķīna J Chin Mater Med 22: 364–367 (1997)

2. Xie JH, Wu CF. Etanola ekstrakta iedarbībaCistanche deserticolapar monoamīna neirotransmiteru saturu žurku smadzenēs. Chin Trad Herb Drugs 24: 417–419 (1993)

3. Dai JR, Carte BK, Sidebottom PJ, Yew ALS, Ng SB, Huang Y, Butler MS. Circumdatin G, jauns alkaloīds no sēnītes Aspergillus ochraceus. J Nat Prod 64: 125–126 84 2. att. atslēgas HMBC un 1 H-1 H COZY korelācijas. 3. att. NOESY no 1. 4. att. CD spektrs no 1. (2001.

4. Kettering M, Sterner O, Anke T. Antibiotikas sēnīšu ķīmiskajā komunikācijā. Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences 59: 816–823 (2004)

5. Trifonov LS, Bieri JH, Prewo R, Dreiding AS, Hoesch L, Rast DM. Trīs Verticillium intertextum metabolītu izolēšana un struktūras noskaidrošana: sorbicilīns, dihidrosorbicilīns un bisvertinohinols. Tetrahedron 39: 4243-4256 (1983)

6. Zhang GL, Xing QY, Zhang MZ. Glikolipīdi no Mirabilis Himalaya. Phytochemistry 45: 1213-1215 (1997)

7. Polonsky J, Merrien MA, Prange T, Pascard C, Moreau S. Markfortīna A, jauna alkaloīda no Penicillium roqueforti, izolācija un struktūra (rentgena analīze). JCS Chem Comm 13: 601–602 (1980)

8. Lee BH, Kornis GI, Cialdella JI, Clothier MF, Marshall VP, Martin DG, McNally PL, Mizsak SA, Whaley HA, Wiley VH. Mikrobioloģiskā hidroksilēšana pie sešiem atsevišķiem markfortīna oglekļa atomiem A. J Nat Prod 60: 1139–1142 (1997)

9. Whyte AC, Gloer JB, Wicklow DT, Dowd PF. Sklerotiamīds: jauns paraherkvamīdu klases loceklis ar spēcīgu pretinsektānisku aktivitāti no Aspergillus sclerotiorum sklerocijām. J Nat Prod 59: 1093–1095 (1996)

10. Kato H, Yoshida T, Tokue T, Nojiri Y, Hirota H, Ohta T, Williams RM, Tsukamoto S. Notoamides AD: prenilēti indola alkaloīdi, kas izolēti no jūras izcelsmes sēnītes, Aspergillus sp. Angew Chem Int Ed 46: 2254–2256 (2007)

11. Williams RM, Kwast E, Coffman H, Glinka T. Ievērojama, enantio-diverģenta brevianamīda A un B bioģenēze. J Am Chem Soc 111: 3064–3065 (1989)

12. Banks RM, Blanchflflower SE, Everett JR, Manger BR, Reading C. Novel anthelmintic metabolites from an Aspergillus sugas: the aspergillimides. J Antibiot 50: 840-846 (1997)

13. Qian-Cutrone J, Haung S, Shu YZ, Vyas D, Fairchild C, Menendez A, Krampitz K, Dalterio R, Klohr SE, Gao Q. J Am Chem Soc 124: 14556–14557 (2002)

14. Vilsons BJ, Yang DTC, Hariss TM. Breviamīda A ražošana, izolēšana un provizoriskie toksicitātes pētījumi no Penicillium Viridicatum kultūrām. Appl Microbiol. 26: 633–635 (1973)

15. Bērzs AJ, Rasels RA. Pētījumi saistībā ar biosintēzi XLIV. Brevianamīdu B, C, D un F strukturālie skaidrojumi. Tetrahedron 28: 2999–3008 (1972)

16. Liesch JM, Wichmann CF. Jauni pretnematodālie un pretparazītu līdzekļi no Penicillium Charles. II. Paraherkvamīdu B, C, D, E, F un G. J. Antibiot 43: 1380–1386 (1990) struktūras noteikšana 17. Martinez-Luis S, Rodriguez R, Acevedo L, Gonzalez MC, Lira-Rocha A, Mata R Malbranheamīds, jauns kalmodulīna inhibitors no sēnītes Malbranchea aurantiaca. Tetrahedron 62: 1817–1822 (2006)

17. Mishima T, Tsuda M, Kasa Y, Ishiyama H, Fukushi E, Kawabata J, Watanabe M, Akao K, Kobayashi J. Absolute stereochemistry of citrinadins A and B from a marine derived fungus. J Org Chem 70: 9430–9435 (2005)

18. Lopez-Greta MP, Gonzalez MC, Ciavatta L, Ayala I, Moya P, Primo J. Insekticīda aktivitāte paraherkvamīdiem, paraherkvamīdiem, tostarp paraherkvamīds H un paraherkvamīds I, divi jauni alkaloīdi, kas izolēti no Penicillium cluniae. J Agric Food Chem 54: 2921–2925 (2006)

cistanche deserticola neiroprotektīvs līdzeklis: pret Alcheimera slimību un Parkinsona slimību