Cirkulējošās MiRNS 2. tipa diabēta pacientiem ar un bez albumīnūrijas Malaizijā

AbstraktsIevads: Diabēta nieru slimība(DKD) joprojām ir galvenais hroniskas nieru slimības cēlonis. Ir ziņots par cirkulējošo miRNS disregulāciju, kas liecina par to patoloģisko lomu DKD. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt diferencēti izteiktas miRNS 2. tipa cukura diabēta (T2DM) pacientu serumos ar un bez albuminūrijas atlasītā Malaizijas populācijā.Metode:Četrdesmit viens T2DM pacients, kas tika uzraudzīts kopienas klīnikā, tika sadalīts normālās (NA), mikro (MIC) un makroalbuminūrijas (MAC) grupās. MiRNS diferenciālie līmeņi 12 paraugos tika noteikti, izmantojot uz ceļu vērstu (cilvēka fibrozi) miScript miRNA qPCR masīvu, un tika apstiprināti 33 paraugos, izmantojot miScript pielāgoto qPCR masīvu (CMIHS02742) (Qiagen GmbH, Hildena, Vācija).Rezultāti:3 miRNS palielināšanās tendences serumā, proti, miR-874-3p, miR-101-3p un miR-145-5p T2DM pacientiem ar MAC, salīdzinot ar pacientiem ar NA. Statistiski nozīmīga miR- 874-3p (p= 0.04) un miR-101-3p (p= 0.01) tika redzēts validācijas grupā. Nozīmīgas negatīvas korelācijas starp aprēķināto glomerulārās filtrācijas ātrumu (eGFR) un miR-874-3p (p= 0.05), miR-101-3p (p= 0.03) un miR-145-5p (p= 0.05), kā arī pozitīva korelācija starp miR-874-3p un vecumu (p= 0.03) tika parādīti ar Pīrsona korelācijas koeficientu analīzi.Secinājums:Šajā pētījumā tika konstatēta iepriekš zināmu miRNS, proti, miR-145-5p un, iespējams, jaunu, proti, miR-874-3p un miR-101-3p, regulēšana T2DM pacientu serumā. . Starp eGFR un šīm miRNS bija nozīmīga korelācija. Šī pētījuma rezultāti ir snieguši iepriecinošus pierādījumus, lai turpinātu pētīt šo atšķirīgi izteikto miRNS iespējamo lomu.DKD.

Noklikšķiniet, lai cistanche herba nieru slimībām

Ievads

Diabētiskā nieru slimība (DKD) veido 39% no beigu stadijas nieru slimības gadījumiem ASV [1]. Tāpat DKD joprojām ir galvenais hroniskas nieru slimības (HNS) cēlonis Malaizijā, veicinot 69% jauno dialīzes pacientu 2018. gadā [2]. Tiek uzskatīts, ka DKD patoloģiju galvenokārt izraisa hiperglikēmija, kā rezultātā aktivizējas intracelulārie signalizācijas ceļi un galu galā nieru fibroze [3]. Neskatoties uz progresu pārvaldībā, pašreizējie biomarķieri un terapija nespēj novērst tās progresēšanu līdz nieru slimībai beigu stadijā [3]. Tāpēc steidzami ir nepieciešama labāka izpratne par DKD starpniekiem un mehānismiem.

Mikroribonukleīnskābe (miRNS) ir mazu nekodējošu RNS saime, kas ir kļuvusi par svarīgu gēnu ekspresijas pēctranskripcijas regulatoru [4]. Ir novērota miRNS nepareiza ekspresija un to iesaistīšanās DKD šūnu mehānismā [3]. Šī pētījuma mērķis bija noteikt atlasīto miRNS ekspresijas modeli 2. tipa cukura diabēta (T2DM) pacientu serumā ar un bez albuminūrijas. Visā pasaulē līdzīgi pētījumi ir veikti dažādās populācijās, kā minēts iepriekš [5–7]. Mūsu mērķis bija izpētīt miRNS atšķirīgās ekspresijas modeli, kas ir saistīts ar fibrotiskiem ceļiem T2DM pacientiem, no kuriem daži iepriekš ir pētīti DKD. Iepriekšējie pētījumi liecina par etniskām atšķirībām miRNS ekspresijā [8, 9]. Tāpēc papildus tam, ka šis pētījums var apstiprināt iepriekšējos atklājumus, tas potenciāli var atklāt jaunas miRNS, kas, iespējams, ir unikāli izteiktas Malaizijas populācijā.

Materiāli un metodes

Pētījuma populācija

Šajā šķērsgriezuma pētījumā no 2019. gada janvāra līdz aprīlim piedalījās 41 esošs T2DM pacients, kas tika uzraudzīts kopienas klīnikā. Šis pētījums ietvēra 2-pakāpju procedūru: (1) miRNS 12 pacientu serumā (skrīninga kohorta). ) tika profilēti un (2) visatbilstošākās miRNS tika apstiprinātas ar serumiem no 33 pacientiem (saukta par validācijas kohortu). Tajā bija iekļauti 4 pacienti no skrīninga kohortas. Rakstiska piekrišana tika iegūta no atsevišķiem pacientiem. Ētiskais apstiprinājums šim pētījumam tika iegūts no Malaizijas Veselības ministrijas Medicīnas pētījumu un ētikas komitejas (MREC). Iekļaušanas kritēriji bija T2DM pacienti un pieejamā klīniskā un laboratoriskā informācija. Pacienti ar 1. tipa DM; kas nav DKD; blakusslimības, piemēram, vēzis, akūta drudža slimība vai nesenas infekcijas; grūtniecība; un pēcdzemdību periodi tika izslēgti.

No pacienta medicīniskajiem dokumentiem tika iegūta šāda informācija: (1) demogrāfiskie dati, tostarp vecums un dzimums; (2) klīniskie dati, piemēram, asinsspiediens, svars, T2DM ilgums, ārstēšana un citas diabēta komplikācijas; (3) laboratorijas dati, tostarp glikozes līmenis plazmā tukšā dūšā, glikozēts hemoglobīns A1c (HbA1c), albumīna un kreatinīna attiecība un kreatinīna līmenis serumā. Pacienti tika sadalīti 3 grupās pēc to albuminūrijas līmeņa, normoalbuminūrijas (NA), mikroalbuminūrijas (MIC) un makroalbuminūrijas (MAC).

Definīcija

Šajā pētījumā

NA, MIC un MAC tika definēti kā albumīna un kreatinīna attiecība<30, between 30 and 300 and >300 mg/g kreatinīna, attiecīgi, vismaz 2 no 3 punktveida urīna kolekcijām [10]. Aprēķinātais glomerulārās filtrācijas ātrums (eGFR) tika aprēķināts, pamatojoties uz hroniskas nieru slimības-epidemioloģijas kreatinīna vienādojumu.

Seruma sagatavošana

Vacutainer Ņemtie tukšā dūšā (mazāk par vai vienādi ar 8 h) pilnas asins paraugi 10-mL BD ®SSTTM mēģenēs (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ASV) tika atstāti istabas temperatūrā 30-min. recēšanu pirms 10- min centrifugēšanas pie 1,900 g. Augšējā fāze tika novākta, filtrēta ar 022- μm Minisart®PES filtru (Sartorius, Gottingena, Vācija) un alikvotā veidā sadalīta mikrocentrifūgas mēģenēs uzglabāšanai –80 grādu temperatūrā līdz analīzei.

Kopējā miRNS

Izolēšana Kopējā miRNS tika izolēta, izmantojot miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen GmbH) saskaņā ar ražotāja protokolu. Īsāk sakot, Qiazol Lysis Reagent tika pievienots 200 μL seruma alikvotai denaturācijai, kam sekoja miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control C. elegans miR-39 miRNS imitācija (Qiagen GmbH), lai uzraudzītu RNS atjaunošanos un apvērstu. transkripcijas efektivitāte. Fāzu atdalīšanai tika pievienots hloroforms, kam sekoja 100% etanola pievienošana augšējai ūdens fāzei. Skalošanas soļi tika veikti, izmantojot buferšķīdumu RWT, buferšķīdumu RPE un 80% etanolu. RNS tika eluēts, RNeasy MinElute centrifūgas kolonnas membrānai pievienojot 14 μL RNāzes nesaturošu ūdeni. RNS daudzums un kvalitāte tika noteikta ar NanoDrop 1000 spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, Inc., Vilmingtona, DE, ASV), pirms uzglabāšanas -80 grādu temperatūrā līdz izmantošanai. MiRNS reversā transkripcija (RT) uz cDNS un priekšamplifikācija tika veikta attiecīgi ar miScript RTII komplektu (Qiagen GmbH) un miScript PreAMP PCR komplektu (Qiagen GmbH), saskaņā ar ražotāja protokolu, izmantojot 6 μL šablona RNS un 5 μL atšķaidīta. cDNS, attiecīgi

Kvantitatīvā reāllaika polimerāzes ķēdes reakcijas analīze

Cirkulējošās miRNS skrīninga kohortas serumā tika identificētas ar uz ceļu fokusētu (cilvēka fibrozi) miScript miRNA qPCR masīvu (Qiagen GmbH), un atlasītās miRNS vēlāk tika apstiprinātas validācijas grupā ar pielāgotu miScript miRNA qPCR masīvu (CMIHS02742) ( Qiagen GmbH) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Katra reakcija ietvēra cDNS veidni, 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay un RNase nesaturošu ūdeni un atšķaidītu veidnes cDNS, lai kopējais tilpums būtu 25 μL. Kvantitatīvā reāllaika PCR tika veikta ar Eppendorf Mastercycler ep realplex 4, kas tika ieprogrammēts šādi: 15 min 95 grādos, 15 s 94 grādos, 30 s 55 grādos un 30 s 70 grādos ar 40 cikliem.

MiRNS relatīvā kvantitatīva noteikšana

Reāllaika PCR datu analīze tika veikta, izmantojot Qiagen Gene Globe Data Analysis Center programmatūru (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Relatīvā ekspresija (RE) tika iegūta ar 2−∆Ct metodi, kurā katras miRNS ekspresija tika normalizēta atbilstoši mājturības gēna SNORD95 vai globālā Ct Mean ekspresijai. Reizes izmaiņas tika aprēķinātas no normalizētās miRNS ekspresijas katrā grupā (MIC vai MAC), dalot ar normalizēto miRNS ekspresiju kontroles grupā (NA). p vērtības tika aprēķinātas, pamatojoties uz neatkarīgu paraugu t-testu, kurā tika pārbaudītas atkārtotas RE (2−∆Ct) vērtības katram gēnam kontroles grupā un testa grupās. Turpmāka qPCR datu analīzes pārbaude tika veikta manuāli, izmantojot Microsoft Excel un IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp, Ar monk, NY, USA) 25. laidienu Microsoft Windows programmatūrai.

MiRNS atlase skrīninga kohortā validācijai

Initially, the relative quantification of miRNAs in the screening cohort was based on the global Ct mean normalization method, and Ct >30 tika uzskatīta par negatīvu izteiksmi, kā to ieteicis Qiagen GeneGlobe datu analīzes centrs (https://geneglobe.qiagen. com/analyze/). Tiešsaistes papildu 1. tabula (visu tiešsaistes piegādes materiālu skatiet www.karger.com/doi/10.1159/000518866) parāda RE 84 miRNS skrīninga grupā, kas normalizēta līdz globālajam Ct vidējam rādītājam. Validācijai tika izvēlēti MiRNS ar ievērojamām ±2.{7}}kārtīgām izmaiņām un labu kvalitāti, kā to nosaka programmatūra. Turklāt citas miRNS tika izvēlētas, pamatojoties uz to p vērtību klasifikāciju un to iesaistīšanos iepriekšējos pētījumos par DKD un DKD saistītajiem ceļiem, kur tika izvēlētas miRNS ar vislielāko iespējamo ziņojuma RNS mērķu skaitu. Tiešsaistes papildu 2. tabulā parādīti papildu kritēriji, kas izmantoti miRNS atlasei apstiprināšanai. Validācijas analīzē miRNS ekspresija tika normalizēta līdz SNORD95, jo globālā Ct vidējā metode nebija piemērota un Ct> 35 tika uzskatīta par negatīvu izteiksmi. Lai standartizētu, mēs atkārtoti analizējām atlasītās miRNS RE skrīninga grupā, pamatojoties uz SNORD95 normalizāciju, un to izmantoja turpmākai analīzei, salīdzinot ar validācijas kohortu.

Statistiskā analīze

Normality check of continuous variables was done using both statistical tests (Shapiro-Wilk, Kolmogrov-Smimov, skewness, and kurtosis) and visual inspection of plots (histogram, normal Q-Q, and detrended normal Q-Q). Continuous data were presented as either mean ± standard deviation or median (interquartile range). A comparison of 2 independent groups was done using an independent samples t-test (Tables 2–4). Comparison of >2 neatkarīgas grupas tika veiktas, izmantojot neatkarīgo paraugu Kruskal-Wallis testu (1. tabula). Kategorisko mainīgo lielumu salīdzinājums tika veikts, izmantojot vai nu nejaušības χ2 testu, vai Fišera precīzu testu (1. tabula). Korelācija starp atlasītajiem miRNA RE un nepārtrauktajiem mainīgajiem (demogrāfiskajiem un klīniskajiem datiem) tika veikta, izmantojot Pīrsona korelācijas koeficientu. Vairāku regresijas testu izmantoja, lai analizētu lineāro saistību starp atlasīto miRNA RE un tā nozīmīgajiem prognozētājiem. Statistiskie aprēķini tika veikti, izmantojot IBM SPSS (Statistical Package for the Social Science; IBM Corp) 25. versiju operētājsistēmai Microsoft Windows un statistikas programmatūras pakotni Prism 8 (GraphPad, Sandjego, CA, ASV). Statistiskais nozīmīgums tika definēts kā p < 0.05.

Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

Skatīt šeit: https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

IEGŪT DABĪGU ORGANISKO CISTANŠES EKSTRAKTU AR 25% EHINAKOZĪDU UN 9% AKTEOZĪDU NIERU INFEKTĀCIJAI