Kā izpētīt herba cistanches ģenētisko daudzveidību?
Mar 14, 2022
Pētījums par Herba Cistanches ģenētisko daudzveidību, ko veic RAPD
Kontaktpersonu:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da
(Ķīniešu Materia Medica institūts, Ķīnas Ķīniešu medicīnas akadēmija, Pekina 100700)
Abstrakts
Mērķis:Lai izpētītu populācijuģenētiskā daudzveidībagadaCistanche deserticolaunCistanche tubulosa.
Metodes:Divas savvaļas populācijasCistanche deserticolaun četras savvaļas populācijasCistanche tubulosatika analizēti ar RAPD, unģenētiskā daudzveidībano populācijām tika analizēta POPGENE programmatūras versija 1.31.
Rezultātus:Polimorfu loci vidējais procentuālais daudzumsCistanche deserticolabija 47,37%, abu populāciju polimorfie loci bija 39,47% un 35,53%, un vidējā Nei gēnu daudzveidība bija 0,135 8. Šenona s bija vairāk. Statusa informācijas indekss ir 0,207 2, bet gēnu diferenciācijas koeficients Gst = 0,254 6. Vidējais polimorfisko loci procentuālais daudzums Cistanche bija 27,59%, un polimorfisko loci procentuālais īpatsvars katrā populācijā svārstījās no 19,54% līdz 25,29%, no kuriem Andjē populācijā bija visaugstākie 25,29%, un vidējā Nei gēnu daudzveidība bija 0. 082 3, Šenonas polimorfisma informācijas indekss ir 0,1258, gēnu diferenciācijas koeficients Gst =0,175 5.
Secinājums:Cistanche deserticolaunCistanche tubulosair zināma diferenciācija starp populācijām. Gadaģenētiskā daudzveidībatuksneša Cistanche ir ievērojami augstāks nekā Cistanche tubulosa un ir diferencējies divos ekotipos.
Atslēgvārdi: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; IZVAROŠANA; ģenētiskā daudzveidība
[Ķīniešu bibliotēkas klasifikācijas numurs] S 567 [Dokumenta identifikācijas kods] A [raksta numurs] 1001-5302 (2004) 08-0727-04
Cistanche ir parazītisks augs, kas pieder pie Cistanche ģints Lidanaceae ģimenē, kas pazīstams arī kā Dayun, kas ir vērtīgs ķīniešu ārstnieciskais materiāls. Galvenie Cistanche deserticola avoti manā valstī irCistanche deserticolaY.C.Ma un C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Cistanche deserticola saimniekaugi ir Haloxylon ammodendron un Haloxylon ammodendron, kas galvenokārt tiek izplatīti Alashan līgā Iekšējā Mongolijā, Siņdzjanas ziemeļos, Qinghai, Gansu un citās vietās. Cistanche deserticola izplatība ir tāda pati kā saimniekaugiem. Manā valstī Cistanche cistanche tiek izplatīts tikai apgabalos ap Taklimakanas tuksnesi uz dienvidiem no Tianshan kalniem Siņdzjanā, un tā izplatība nav pilnībā sinhronizēta ar saimnieku Tamarix. Citi reģioni, piemēram, Siņdzjanas ziemeļi, Gansu, Qinghai, Ningxia, Iekšējā Mongolija, Shaanxi un citas Tamarix augu vietas, nav parazītiskie Cistanche Tubula[2]. Sakarā ar straujo cistanche pieprasījuma pieaugumu pēdējos gados, kā rezultātā tā resursi tiek iznīcināti, savvaļas cistanche resursi ir samazinājušies tikai līdz dažām galvenajām ražošanas jomām. Abas ir uzskaitītas kā apdraudētas aizsargājamas augu sugas manā valstī [3], starp kurāmCistanche deserticolair iekļauts CITES II pielikumā [4].
Pēc vairāku gadu pētījumiem Cistanche mākslīgās audzēšanas pētījumi ir bijuši veiksmīgi, un tas ir liela mēroga veicināšanas un stādīšanas stadijā. Tomēr tas, kā novērst Cistanche sugu iznīkšanu rūpnieciskās ražošanas laikā, kā pēc iespējas ātrāk atjaunot ierobežoto savvaļas populāciju un saglabāt vērtīgos savvaļas dīgļplazmas resursus, ir atslēgas, lai panāktu tās ilgtspējīgu izmantošanu. Kas attiecas uz Cistanche aizsargājamo mantojumu [Saņemtais datums], 2004-03-11 [Fonda projekts] Zinātnes un tehnoloģijas ministrijas sociālās labklājības projekts (2001.109); Zinātnes un tehnoloģijas ministrijas projekts "Desmitais piecgades plāns" (2001BA701A09a) [Atbilstošais autors] * Huang Luqi, Tel:( 010) 64014411-2955, E-pasts: huangluqi @263.net Pārraides izpēte joprojām ir tukša. Šajā pētījumā tiek izmantota RAPD tehnoloģija, lai izpētītu 2 savvaļas populācijasCistanche deserticolaun 4 savvaļas populācijasCistanche tubulosa, un analizēt abus Atšķirībaģenētiskā daudzveidībaparedzams, ka tas nodrošinās svarīgu eksperimentālu ģenētisko pamatu, lai aizsargātu Cistanche, kas ir vērtīgas ķīniešu zāles.
1. Materiāls un metodes
1.1. Materiāli
Cistanche deserticolatika savākts no Jimsar apgabala Siņdzjanā un Senās Alxa līgas Jilantai apgabala Iekšējā Mongolijā. Cistanche populācijas tika savāktas no Minfengas apgabala un Yutian apgabala, Siņdzjanā. Minfengas apgabals pašlaik ir apgabals ar vislielāko Cistanche cistanche ražu ar vislielāko blīvumu un salīdzinoši pilnīgām dabisko mežu kopienām. Paraugu ņemšanas vietas Andil, Sawuzek, Yatongguz un Daheyan no Yutian apgabala ir galvenās ražošanas teritorijas, kas atrodas Andiras upē, Yeyike upē, Yatongguzi upē un Kelaniya Upes lejtecē attālums starp populācijām ir vairāk nekā 50 km. Katrā populācijā nejauši tika atlasīti 19-30 indivīdi. Paraugus ātri izžāvēja silikagelā un izmantoja DNS ekstrakcijai (1. tabula).
1. tabula Cistanche deserticola un Cistanche tubulosa populāciju paraugu ņemšana un ražošanas apgabali
1.2 DNS ekstrakcija
Kopējā DNS ekstrakcijas metodē tiek izmantota metode ar augstu sāls saturu, zemu pH līmeni [5]. DNS paraugs tika pakļauts spektrofotometram, lai noteiktu DNS veidnes koncentrāciju, pēc tam RAPD analīzei tika izmantota 1% agarozes gēla elektroforēze, EB krāsošana, novērošana un fotografēšana ultravioletajā gaismā, elektroforēzes DNS ar skaidrām joslām un mazāk sārņu.
1.3 RAPD praimeru pārbaude
Tā kā eksperimentā tika konstatēts, ka vienam un tam pašam gruntējumam ir neapmierinoša ietekme uz abu vienlaicīgu pastiprināšanuCistanche deserticolaun Cistanche tubulosa, grunti tika pārbaudīti neatkarīgi. Pastiprināšanai un skrīningam tika izmantoti 150 nejauši praimeri (10 bp), 25 μL reakcijas sistēma Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd.; katrs gruntējums izmantoja 2 populācijas veidnes un 1 sterilizētu dubultu destilētu ūdeni kā tukšu kontroli, un ieguva 10 gruntējumus Cistanche deserticola pastiprināšanai ar skaidrām joslām, spēcīgu polimorfismu un labu atkārtojamību: S490, S1 101, S1 131, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S2 140; 10 gruntis noCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.
1.4 PCR pastiprināšana un produktu noteikšana
Izvēlētie praimeri tika izmantoti, lai pastiprinātu veidnes DNSCistanche deserticolaunCistanche tubulosaar PCR. Genoma DNS tika atšķaidīta līdz 50 ng·μL -1 saskaņā ar izmērīto koncentrāciju kā veidni. Kopējais reakcijas tilpums ir 25 μL, no kuriem 10 × PCR buferšķīdums 2,5 μL, Mg2 + 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP maisījums (katrs 2,5 mM) 1 μL, 5 μM Primer 1 μL, veidne DNS 1 μL, sterilizēts divkārt destilēts ūdens 18,8 μL, iepriekš minētais PCR pastiprināšanas šķīdums ir Šanhajas Sangona produkts. Amplifikācija tika veikta ar PTC-100 termisko ciklu. Amplifikācijas programma bija 94 °C pirmsdenaturēšana 5 min un pēc tam 40 cikli. Katrs cikls ietvēra 94 °C 45 s, 34 °C 1 min, 72 °C 1 min 30 sekundes un, visbeidzot, pagarināt 72 °C temperatūrā 5 minūtes. Pastiprinātie produkti tika elektroforēti uz 2,0% agarozes gela (kas satur EB) 1×TAE buferī un novēroti un fotografēti syngene gēla attēlveidošanas sistēmā.
1.5 Statistika un datu analīze
Elektroforēzes spektrā atbilstošo reakcijas produkta stāvokli uz gēla salīdzina saskaņā ar molekulmasas standartu un novērtē pastiprinātā produkta molekulmasu. Grupa ar joslu tiek ierakstīta kā 1, un grupa bez joslas tiek ierakstīta kā 0, veidojot 0/1 matricas grafiku un ievadot datoru, izmantojot POPGENE32, lai aprēķinātu Polimorfisko vietņu (PPL) procentuālo daudzumu katrā populācijā, Nei gēnu daudzveidības indeksu (H), Šenona polimorfisma informācijas indeksu (I), gēnu diferenciācijas koeficientu (Gst), gēnu daudzveidību (Ht),Ģenētiskā daudzveidība(Hs), Nei (1978) ģenētiskā identitāte (I) un ģenētiskais attālums (D) populācijā, un klasteru analīze tika veikta, izmantojot UPGMA metodi.
2. Rezultāti un analīze
2.1 Cistanche ģenētiskā daudzveidība
Visos paraugos tika iegūtas joslas ar molekulmasu no 200 līdz 2 200 bp (1., 2. attēls). Kopumā 76 loci tika konstatēti 60 paraugos no 2 populācijāmCistanche deserticola, no tiem 36 bija polimorfs loci, kas veidoja 47,37%, H = 0,135 8, I = 0,207 2. Starp tiem Jimsar PPL ir 39.47%, un Gilanty's ir 35.53%. H ir 0. attiecīgi 0 95 3 un 0,1 070, un I ir attiecīgi 0,15 12 un 0,163 7. Kopumā 86 indivīdiem no 4 Cistanche populācijām tika atklāti 87 loci, no kuriem 24 bija polimorfie loci, kas veidoja 27, 59%, H = 0, 084 8, I = 0, 1278. Augstākais PPL bija Andils ar 25,29%, savukārt PPL bija zemāks Savuzekā un Yatungusi (abi ar 19,54%). H ir 0,062 1 ~0,080 0, es esmu 0,095 0 ~0,116. H un I lielums atbilst katras populācijas PPL lieluma tendencei, un koeficienti ir lielākie Andjē, kam seko Dayan. Tā paša PPL gadījumā Savuzek's H = 0,064 1 Summa I = 0,097 0 ir nedaudz lielāka par Yatunguska 0,062 1 un 0,095 0 (2. tabula).
1. attēls RAPD pastiprināja dažu tuksneša paraugu joslasCistanche deserticola, grunts S490 1~10. Garantie paraugi; 11 ~20. Jimpster paraugi M-DNS marķieris (200 ~ 2 000 bp)
2. attēls RAPD pastiprināja dažu Cistanche Tubulosa, grunts S2 042 1-20 paraugu joslas. Siņdzjanas Andjē parauga M-DNS marķieris (200 ~ 2 000 bp)
2. tabulaģenētiskā daudzveidībagadaCistanche deserticolaunCistanche tubulosaPopulācijas
2.2 Cistanche ģenētisko variāciju analīze
Atbilstoši līmenimģenētiskā daudzveidībapopulācijās (Hs), diferenciācijā starp populācijām (Dst) un ģenētisko atšķirību proporciju starp populācijām kopējās ģenētiskajās atšķirībās (Gst), var redzēt, ka Cistanche deserticola Ht kopējā ģenētiskā daudzveidība = 0,13 5 8, kur Hs = 0,101 2, Gst =0,254 6. Cistanche Ht=0,082 2, no kuriem Hs=0,067 8, Gst=0,175 5 (3. tabula). Iepriekš minētie rezultāti liecina, ka starp populācijām ir zināma ģenētiskās variācijas pakāpe. Atšķirība starp Cistanche deserticola tuksneša populācijām veidoja 25,46% no kopējām variācijām, un Cistanche tubulosa populāciju variācijas veidoja 17,55% no kopējām atšķirībām.
3. tabula Ģenētisko variāciju analīzeCistanche deserticolaunCistanche tubulosa.
2.3 Ģenētiskā attāluma un klasteru analīze starp Cistanche deserticola populācijām
Abu populāciju ģenētiskais attālumsCistanche deserticolair 0,080 0, un ģenētiskā identitāte ir 0,9231. Četru Cistanche populāciju ģenētiskais attālums bija 0,012 0~0,031 5, un ģenētiskā identitāte bija 0,9690~0,988 1 (4. tabula). Cistanche deserticola un cistanche tubulosa indivīdu kopa liecina, ka Cistanche deserticola var tikt apvienota divās atšķirīgās grupās atkarībā no populācijas, savukārt cistanche tubulosa dažādos indivīdus nevar sagrupēt pēc populācijas, kas arī norāda, ka ģenētiskā diferenciācija starp Cistanche deserticola populācijām ir salīdzinoši augsta. Liela, bet ģenētiskā diferenciācija starp Cistanche tubulosa populācijām ir maza.
4. tabula Ģenētiskā identitāte (apakšā pa kreisi) un ģenētiskais attālums (augšējā labajā stūrī)cistanche tubulosa.
3. Diskusija
3.1 Cistanche ģenētiskā daudzveidība
Līmenisģenētiskā daudzveidībaaugi nav atdalāmi no to bioloģiskajām īpašībām, dzīvotnēm, izcelsmes un evolūcijas. Starp tiem vislielākā ietekme ir selekcijas sistēmai, izplatības diapazonam, dzīvības formai un ziedputekšņiem un sēklu izkliedes metodēm [6]. Saskaņā ar ge Song et al. [7] alozīmu datu statistiskajiem rezultātiem par 499 augu sugām 165 ģintīs, Cistanche polimorfismam sugu līmenī jābūt apmēram 50%, un polimorfismam populācijas līmenī jābūt apmēram 40%. Ap 0,17. Šajā eksperimentā iegūtie polimorfisma līmeņi ir zemāki par šīm vidējām vērtībām. Tajā pašā laikā, salīdzinot ar polimorfisko loci līmeni, kas iegūts ar RAPD metodēm vairākiem bieži sastopamiem apdraudētiem augiem, piemēram, 32% apdraudēto sugu Silver Fir[18], 22,5% no punduru peonijas un 27,6% no purpura peonijas[9] Var redzēt, ka ģenētiskā daudzveidībaCistanche deserticola ir nedaudz zemāks par vidējo līmeni, savukārt Cistanche tubulosa ģenētiskā daudzveidība jau ir ārkārtīgi zema.
3.2 Cistanche zemās ģenētiskās daudzveidības iemesli
Cistanche ir īpašs parazītisks augs, kas vienlaikus tiek izplatīts šaurās tuksneša teritorijās. Tāpēc unikālais dzīvesveids un salīdzinoši šaurā dzīves zona var būt raksturīgs iemesls, kāpēcģenētiskā daudzveidībano Cistanche parasti ir zemāks nekā parastajiem augiem.
Atšķirībaģenētiskā daudzveidībastarp Cistanche deserticola un Cistanche tubulosa var būt saistīts ar atšķirību abu izplatības diapazonā un to, vai tie ir sinhronizēti ar saimniekdatora sadalījumu. Cistanche tubulosa izplatīšanas zona ir ievērojami mazāka nekā Cistanche deserticola izplatīšanas zona, un tās izplatība ir ārkārtīgi nesinhrona ar saimniekaugu. Pētījumi liecina, ka Tamarix sugu vidū ir liela daudzveidība. Piemēram, Zhang Juan et al. ziņoja, ka Tamarix sibiricus ģenētiskā daudzveidība bija pat 98,7 %[10], savukārt Cistanche ģenētiskā daudzveidība ir ārkārtīgi vāja, kas norāda uz ilgtermiņa attīstību. Cistanche tubulosa, iespējams, ir piedzīvojusi nopietnus vēstures trūkumus, kā rezultātā tika zaudēts liels daudzumsģenētiskā daudzveidība.
Tajā pašā laikā, saskaņā ar izmeklēšanām, tika konstatēts, ka neviens noCistanche deserticola20 km attālumā no cilvēku apmetnēm varēja atklāt un ziedēt normāli. Cistanche lielās un mazās bedrītes tika izraktas, īpaši Cistanche cauruļu ziedu galvenajās ražošanas zonās. Tāpēc to izraisīja liels rakšanas apjoms. Izcelsmes trūkums un biotopu iznīcināšana var būt galvenie cilvēka radītie iemesli zemajamģenētiskā daudzveidībano Cistanche.
3.3 Cistanche ģenētiskā diferenciācija
Ģeogrāfiskā attāluma dēļ starp Siņdzjanu un Iekšējo Mongoliju ģeogrāfiskā izolācija izraisīja diferenciāciju un izolāciju starpCistanche deserticolapopulācijas, un abas populācijas veidoja atšķirīgus ģenētiski atšķirīgus ekotipus, jo tie pielāgojās vietējiem biotopu apstākļiem. Sakarā ar tā šauro izplatības diapazonu un biežo gēnu apmaiņu starp populācijām ģenētiskā diferenciācija starp populācijām ir mazāka nekā Cistanche deserticola.
3.4 Ieteikumi Cistanche aizsardzībai
Ģenētiskā daudzveidībair priekšnoteikums sugu ilgtermiņa izdzīvošanai, lai izvairītos no izmiršanas. Samazinājumsģenētiskā daudzveidībasamazinās iedzīvotāju spēju pielāgoties vides pārmaiņām gan īstermiņā, gan ilgtermiņā [11]. Tāpēc Cistanche ģenētiskās daudzveidības aizsardzība ir ļoti svarīga, lai aizsargātu šo reto un vērtīgo ķīniešu medicīnu. Tā kā Cistanche ir suga ar īpašu ekoloģisko tipu, tā galvenokārt jāaizsargā in situ, un Cistanche dabiskās aizsardzības bāze ir jāizveido atbilstoši tās ģenētiskajai daudzveidībai. Piemēram, parCistanche tubulosa, tā kā ģenētiskā daudzveidība galvenokārt nāk no populācijas iekšienes, populācijas ar lielu ģenētisko daudzveidību būs prioritārie aizsardzības objekti [12], piemēram, Minfeng's Angier un Yutian's Daheyan var būt Tas ir uzskaitīts kā Cistanche dabiskās aizsardzības bāze. Kas attiecas uzCistanche deserticola, Iekšējās Mongolijas un Siņdzjanas populācijās ir notikušas būtiskas izmaiņas, tāpēc būtu vēl vairāk jāpastiprina eksperimentālie pētījumi, lai noteiktu populācijas, kurām ir piešķirta prioritāte aizsardzībai. Tajā pašā laikā veikt fundamentālus pētījumus par Cistanche reproduktīvās bioloģijas un apputeksnēšanas ekoloģiju, lai sniegtu informāciju tās turpmākai aizsardzībai.
Atsauces
[1] Viņš Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei utt. Identifikācijas datiCistancheun komerciālu zāļu materiālu izpēte. Ķīniešu medicīniskie materiāli, 1997, 20(3):117.
[2] Liu Mingtings. Tamarix augu visaptveroša izpēte un vispārēja pielietošana. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995. gads.
[3] Fu Guoli. Ķīniešu augu Sarkanā grāmata. Pekina: Science Press, 1992.
[4] Ķīnas Tautas Republikas apdraudēto sugu importa un eksporta pārvaldības birojs, Ķīnas Tautas Republikas apdraudēto sugu zinātniskā komiteja. Konvencija par starptautisko tirdzniecību ar apdraudētajām savvaļas dzīvnieku un augu sugām (CITES), II pielikums. 2003.41.
[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding u.c. Vairāku apdraudēto augu un to radinieku kopējās DNS ieguve un identificēšana. Acta Botany, 1994, 36:528.
[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Augu selekcijas sistēma, ģenētiskā struktūra un aizsardzībaģenētiskā daudzveidība. Bioloģiskā daudzveidība, 1996, 4(2): 92.
[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Augu evolucionārā bioloģija. Uhaņa: Uhaņas universitātes prese, 1994. gads.
[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming u.c. RAPD sudraba egles ģenētiskās daudzveidības analīze. Ķīniešu zinātne (C), 1997, 40(2): 145.
[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen u.c. Sākotnējais ziņojums par punduru peoniju un purpursarkano peoniju RAPD analīzi. Ķīniešu augu taksonomijas žurnāls, 1995, 33(4): 350.
[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Iepriekšējs pētījums parĢenētiskā daudzveidībano Tamarix lanceolate dabiskajām populācijām. Yunnan Botāniskais pētījums, 2003, 25(5):557.
[11] Ellstrand N C, Elam D R. Populācijas ģenētikas sekas nelielam populācijas lielumam: ietekme uz augu saglabāšanu. Gada pārskats Ekoloģija un sistemātika, 1993, 34:217.
[12] Liu Džanlins, Džao Guifangs. Populācijas ģenētikas princips un tā pielietojums retu un apdraudētu augu aizsardzībā. Bioloģiskā daudzveidība, 1999, 7(4): 340.
No: Ķīnas žurnāls Materia Medica; 29. sējums, 2004. gada 8. augusts
