Cistanche polisaharīdi uzlabo ehinakozīda uzsūkšanos in vivo un ietekmē zarnu mikrobiotu

Kontaktpersona: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu, et al

Abstrakts

Polisaharīdi unfeniletanoīdu glikozīdinoCistanche deserticolair pierādīts, ka tiem ir dažādi ieguvumi veselībai, tomēr šo divu veidu savienojumu mijiedarbība in vivo nav detalizēti zināma. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt cistanche polisaharīdu sinerģisko darbību ar feniletanoīda glikozīdu un polisaharīdu ietekmi uz zarnu mikrobiotu. Sprague-Dawley žurkas 20 dienas baroja ar dažāda veida cistanche polisaharīdiem, pēdējā dienā visām žurkām tika ievadītsehinakozīdspie 100 mg/kg. Rezultāti tika salīdzināti galvenokārt pēc farmakokinētisko parametru, zarnu mikrobiotas sastāva un īsās ķēdes taukskābju satura atšķirībām. Rezultāti liecināja, ka visi cistanche polisaharīdi, tostarp neapstrādāti polisaharīdi, ir augstas molekulārāssvara polisaharīdi, un zemas molekulmasas polisaharīdi, varētu regulēt zarnu mikrobiotas daudzveidību, palielināt labvēlīgo baktēriju skaitu un īpaši veicināt Prevotella spp. kā arī uzlabot īso ķēžu taukskābju veidošanos un ehinakozīda uzsūkšanos. Izpētot polisaharīdu sinerģisko darbību ar mazām molekulām, šie atklājumi liecina, ka cistanche polisaharīdi, īpaši zemas molekulmasas polisaharīdi, varētu tikt izmantoti kā zarnu mikrobiotas manipulators veselības veicināšanai.

Atslēgvārdi:CistanchedeserticolapolisaharīdsEhinakozīdsZarnu mikrobiota

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu vairāk informācijas par cistanche produktiem

1. Ievads

Pēdējos gados ir kļuvis skaidrs, ka polisaharīdi modulē zarnu mikrobiotas sastāvu un ka izmaiņas var veicināt vairāku uzturvielu uzsūkšanos [1], radot fizioloģisku funkciju [2, 3]. Ir pierādīts, ka tradicionālās ķīniešu medicīnas (TCM) polisaharīdi ir ideāli kandidāti zarnu mikrobiotas regulēšanai, un tiem ir prebiotiska iedarbība. Gremošanas traktā polisaharīdi un daži mazi molekulāri savienojumi neizbēgami ietekmē bioloģiskās aktivitātes [4]. Tā kā viena no galvenajām aktīvajām sastāvdaļām Panax žeņšeņā, kas ir plaši izmantota tūkstošiem gadu, polisaharīdi ir bijuši labi.uzlabošanuiekšzarnuvielmaiņaunabsorbcijanoginsenosīdiin vivo [5]. Codonopsis pilosula polisaharīdi parādīja saponīnu uzsūkšanās veicinošo efektu pelēm ar dekstrāna sulfāta nātrija izraisītu kolītu [6]. Tika atklāts, ka Ganoderma lucidum polisaharīdi, īpaši lielas molekulmasas frakcija, saturprebiotikasfunkcijasaugsta tauku satura diētas izraisītas zarnu disbiozes peļu modeļos [7]. Longana polisaharīdi regulēja zarnu mikrobiotu un zarnu metabolītus (palielinot piruvāta un butanoāta saturu), lai radītu imūnmodulējošas aktivitātes [8].

Cistanche deserticola kā tradicionālā ķīniešu medicīna ir plaši izmantota kā uztura bagātinātājs Ķīnā. Farmakoloģiskie pētījumi parādīja, ka tas ir izstādītsneiroprotektīvs, imūnmodulējoša, hormonālasbalansēšana, anti-nogurums, anti-iekaisuma, aknu aizsardzība,anti-oksidatīvs, anti-baktēriju, anti-vīrusu, unanti-audzējsefekti [9]. Ķīmiskā analīze parādīja, ka galvenās aktīvās sastāvdaļas bija feniletanoīdu glikozīdi un polisaharīdi. Ehinakozīds, galvenais feniletanoīda glikozīds C. deserticola, ir uzrādījis plašu farmakoloģisku iedarbību, tomēr tā ārstnieciskība ir ierobežota sliktās biopieejamības, ātra un plaša metabolisma in vivo dēļ. Pētījumi ir apstiprinājuši, ka ehinakozīdu in vitro var metabolizēt zarnu mikrobiota [10, 11]. Tomēr pierādījumi in vivo nav izmeklēti. Kā zināms, zarnu mikrobiotai bija nozīmīga loma augu izcelsmes zāļu metabolizējošās bioaktivitātes starpniecībā. Tāpēc šī darba galvenais mērķis bija izpētīt ietekmicistanche polisaharīdiuz zarnu mikrobiotu un ietekmi uz ehinakozīda metabolismu.

2. Materiāli un metodes

2.1. Materiāli un ķīmiskās vielas

Cistanche deserticola YC Ma tika iegūts no Alashanas, Iekšējās Mongolijas Mandela smilšu rūpniecības attīstības Co., LTD, Ķīna. To autentiskumu apstiprināja profesors Lijuans Džans (Tjaņdzjiņas tradicionālās ķīniešu medicīnas universitāte). Kupona paraugs tika deponēts mūsu laboratorijā. Standarta viela, piemēram, ehinakozīds, akteozīds un hlorogēnskābe, tika iegūta no Nacionālā farmaceitisko un bioloģisko produktu kontroles institūta (Pekina, Ķīna). Katra standarta tīrība bija lielāka vai vienāda ar 98 procentiem. Acetonitrils un hromatogrāfijas pakāpes metanols tika iegādāti no Fisher Scientific (Pitts burgh, PA). Skudrskābe tika iegādāta no Anaqua Chemical Supply Inc. (Vilmingtona, ASV). Pārējie ķīmiskie reaģenti bija analītiskas kvalitātes un tika iegādāti no Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna).

Sprague-Dawley žurku tēviņus (200–220 g) piegādāja Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Pekina, Ķīna, licences Nr. SCXK (Jing) 2014- 0004). Visi dzīvnieki tika audzēti un izmitināti SPF apstākļos dzīvnieku novietnē. Eksperiments tika veikts saskaņā ar dzīvnieku aprūpes vadlīnijām, un tajā tika izmantota TJUTCM komiteja, un tas atbilst laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatai, ko publicēja ASV Nacionālais veselības institūts (NIH publikācijas numurs 85–23, pārskatīts 1996. ). Pēc 1 nedēļas aklimatizācijas perioda žurkas tika nejauši sadalītas četrās grupās: kontroles grupa, kopējā polisaharīdu grupa, augstas molekulārās polisaharīdu grupa un zemas molekulārās polisaharīdu grupa. Katrā grupā bija 6 žurkas, kuras tika audzētas vienā būrī.

2.2. Cistanche polisaharīdu preparāts

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma tika iztīrīti un žāvēti 40 grādu temperatūrā gaisa žāvēšanas krāsnī, pēc tam sasmalcināti rupjā pulverī. Sausais rupjais pulveris tika ekstrahēts ar 85% etanola ūdens šķīdumu (v/v) 60 grādos divas reizes un 2 stundas katrā reizē. Cietā un šķidruma attiecība bija attiecīgi 1:12 un 1:10. Augu atliekas ekstrahēja ar ūdeni 100 grādu temperatūrā vēl divas reizes, ekstrahēšanas laiks un cietā šķidruma attiecība bija vienāda ar 85% etanolu. Ūdens šķīdums tika apvienots un koncentrēts pazeminātā spiedienā un pēc tam nogulsnēts 80% etanolā, 24 stundas stāvot zem 4 grādiem. Nogulsnes tika izolētas, centrifugējot ar ātrumu 8000 apgr./min 10 minūtes 4 grādos un pēc tam liofilizētas, lai iegūtu kopējos polisaharīdus (ZT). Pēc tam ZT tika izšķīdināts dejonizētā ūdenī un filtrēts uz 100 kDa dobu šķiedru ultrafiltrācijas membrānas, tika savākti retentīvie infiltrāta lielmolekulārie polisaharīdi (HM). Caurspīlētais filtrāts tika filtrēts ar 6 kDa ultrafiltrācijas membrānu. Tika iegūti retentīvie filtrāta vidējie molekulārie polisaharīdi (MM) un caurstrāvotie zemmolekulārie polisaharīdi (LM).

2.3. Cistanche polisaharīdu primārais raksturojums

Polisaharīda saturs tika noteikts ar sērskābes fenola metodi, kā standartu izmantojot glikozi [12]. Kopējais olbaltumvielu saturs tika noteikts ar BCA metodi [13]. Monosaharīdu sastāva analīze tika veikta ar HPLC (UltiMate 3000 sistēma), kas aprīkota ar SinoPak C18 kolonnu (5 μm, 150 mm × 4,6 mm) un diožu masīva detektoru (VWD-3000). PMP (1-fenil-3- metil-5-pirazolona) pirmskolonnas atvasinājumu hromatogrāfiskā atdalīšana tika veikta, izmantojot 100 mM fosfāta buferšķīdumu un acetonitrilu attiecībā 82:18 (v/v). , procenti ) kā kustīgā fāze ar plūsmas ātrumu 1,0 ml/min. Tika ievadīts 10 μL katra parauga un tika izmantots 30 minūšu analīzes laiks ar noteikšanu pie 245 nm. Datu iegūšana un apstrāde tika veikta, izmantojot Chromeleon Software 7.1 (Dionex, Sunnyvale, CA, ASV).

Molekulmasa (Mw) tika noteikta ar augstas veiktspējas izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 sistēma), kas aprīkota ar TSK gel G3000 PWXL. (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japāna) un TSK gēla GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japāna) kolonnu un RefractoMax521 refrakcijas indeksa detektoru (RID). Paraugi tika eluēti ar 0,1 mol/l Na2SO4 ar plūsmas ātrumu 0,5 ml/min. Kolonnas temperatūra tika uzturēta 35 grādu līmenī. Dekstrānu kā standartu un standarta līkni uzzīmēja atbilstoši eluēšanas laikam, kas attēlots pret molekulmasas logaritmu.

2.4. Farmakokinētiskais pētījums

Asins paraugi tika paņemti no iekšējā kantusa {{0}} h, 0.083 h, 0,167 h, 0,25 h, 0,5 h, 0,75 h, 1.0 h, 2.0 h, 3.{{20}} h, 4.0 h, 6.0 h, 8.0 h, 10 h, 12 h un 24 h pēc ehinakozīda (100 mg/kg) ievadīšanas. Plazmas paraugus ieguva, centrifugējot 10 minūtes pie 7500 pm. 100 μL plazmas parauga pievienoja 10 μL IS (hlorogēnskābes) šķīduma un 500 μL metanola. Pēc tam maisījumu maisīja vorteksā 3 minūtes un centrifugēja ar ātrumu 14, 000 apgr./min 10 minūtes. Supernatants tika savākts un žāvēts slāpeklī istabas temperatūrā. Pēc tam atlikumu izšķīdināja 100 μL 50% metanola ūdens šķīdumā, centrifugējot pie 14, 000 apgr./min 10 minūtes vēlreiz. Visbeidzot, 3 μL supernatanta tika ievadīts LC-MS/MS sistēmā analīzei. Paraugi tika analizēti, izmantojot metodi saskaņā ar iepriekš ziņoto. Kustīgā fāze sastāvēja no CH3CN (šķīdinātājs A) un H2O (satur 0,1 procentu HCOOH; šķīdinātājs B), izmantojot šādu gradientu: 0–1 min, 10 procenti A; 1–8 min, 10–90 procenti A; 8–9 min, 90–10 procenti A; 9–11 min: 10 procenti A. Paraugs tika atdalīts kolonnā ACQUITY HSS T3 (1,8 μm, 100 mm × 2,1 mm id). Plūsmas ātrums bija 0,3 ml/min, un kolonnas temperatūra tika iestatīta uz 35 grādiem. MS analīzē tika izmantots negatīvās jonizācijas režīms ar šādiem optimizētiem parametriem: kapilārais spriegums, 2,5 kV; desolvatācijas temperatūra, 450 grādi. Slāpeklis tika izmantots kā desolvatācijas un konusa gāze ar plūsmas ātrumu attiecīgi 900 l/h un 150 l/h. Tādējādi kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot MRM pāreju m/z 785,29 → 623,26 ehinakozīdam, m/z 353,06 → 191,07 hlogēnskābei (IS), m/z 623,24 → 161,09 akteozīdam. Konusa spriegums ehinakozīdam, IS un akteozīdam bija 100 V, 32 V un 74 V; sadursmes enerģija, 32 V, 14 V un 30 V.

2.5. Īso ķēžu taukskābju (SCFA) pētījums

Sprague-Dawley žurku tēviņiem 3 nedēļas iekšķīgi ievadīja ZT, HM un LM. SCFA (etiķskābes, propionskābes, izosviestskābes, sviestskābes, izovalerīnskābes, valerīnskābes un heksānskābes) noteikšana ar gāzu hromatogrāfiju (GC) tika veikta, kā aprakstīts iepriekš ar dažām modifikācijām [14]. Īsumā, 0,5 g fekāliju parauga tika disperģēti 2,5 ml Milli-Q ūdens, maisīja vorteksā 10 min un 7,5 ml 1% HCl/etanola šķīdumā, kas satur iekšējos standartus (sviestskābe 24,0 ug). /mL un 2- etilheksānskābe 1,32 ug/mL kā iekšējie standarti). Maisījumus homogenizēja 5 minūtes un centrifugēja pie 14, 000 apgr./min 10 minūtes 4 grādu temperatūrā. Pieci mikrolitri supernatanta tika injicēti sadalītā režīmā ar attiecību 30:1. Nesējgāze bija N2 (99,999 procenti) ar ātrumu 1 ml/min. Papildu gāze (N2) bija 25 ml/min. H2 un gaisa plūsmas ātrums bija attiecīgi 30 ml/min un 300 ml/min. Fekāliju paraugi tika savākti šī pētījuma 20. dienā un nekavējoties uzglabāti -80 grādu temperatūrā.

2.6. Izkārnījumu savākšana, DNS ekstrakcija un 16S rRNS gēnu sekvencēšana

Aptuveni 200 mg svaiga fekāliju parauga tika savākti 1,5 ml sterilā Ependorfa mēģenē no katras žurkas un uzglabāti –80 grādu temperatūrā vēlākai DNS sagatavošanai. DNS tika ekstrahēta no izkārnījumiem, izmantojot QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN). DNS daudzums tika noteikts, izmantojot NanoDrop spektrofotometru (Thermo Electron Corporation); integritāti un izmēru pārbaudīja ar 1,0% agarozes gēla elektroforēzi. Saskaņā ar koncentrāciju DNS tika atšķaidīta līdz 1 ng / μL, izmantojot sterilu ūdeni.

16S rRNS tika pastiprināta, izmantojot īpašu praimeru (V4: 515F-806R) ar svītrkodu. Visas PCR reakcijas tika veiktas ar Phusion® High Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs). Sajauciet vienādu tilpumu 1x ielādes buferšķīduma (satur SYB zaļu) ar PCR produktiem un veiciet elektroforēzi ar 2 procentu agarozes gēlu noteikšanai. Turpmākajiem eksperimentiem tika izvēlētas spilgtās galvenās joslas no 400 līdz 450 bp. PCR produkti tika sajaukti ES blīvuma attiecībās. Pēc tam PCR produktu maisījums tika attīrīts ar Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Vācija).

Sekvencēšanas bibliotēkas tika izveidotas, izmantojot TruSeq® DNS PCR bezmaksas paraugu sagatavošanas komplektu (Illumina, ASV), ievērojot ražotāja ieteikumus un tika pievienoti indeksu kodi. Bibliotēkas kvalitāte tika novērtēta ar Qubit® 2.{1}} Fluorometer (Thermo Scientific) un Agilent Bioanalyzer 2100 sistēmu. Bibliotēka tika sekvencēta uz Illumina HiSeq 2500 platformas un tika ģenerēti 250 bp pāra gala nolasījumi.

2.7. Bioinformātikas analīze

Svītrkoda un primer secības nogriešana, secības montāža un datu filtrēšana saskaņā ar QIIME (V 1.7.0). Secības, kuru līdzība ir lielāka vai vienāda ar 97 procentiem, tika piešķirtas tiem pašiem OTU. OTU ir anotēti kā SILVA etiķetes. Alfa daudzveidības indeksi, kas novērtē zarnu mikrobu kopienas bagātību (ACE un Chao1 metrika) un kopienas daudzveidību (Šenonas un Simpsona metrika), tika aprēķināti, izmantojot Qiime (versija 1.9.1). Beta daudzveidības analīze tika izmantota, lai izpētītu mikrobu kopienu strukturālās variācijas, izmantojot UniFrac attālumu. Atšķirības starp visām grupām tika pārbaudītas ar Tukey testu un Wilcox testu. Galvenā koordinātu analīze (PCoA) tika izmantota, lai izskaidrotu sastāva atšķirības starp četrām grupām, izmantojot R paketes. Lineārās diskriminējošās analīzes efekta lieluma (LEfSe) metode ir īpaši izstrādāta biomarķieru atklāšanas un skaidrojuma sekvencēšanas datiem. Un lineārā diskriminējošā analīze (LDA) tika izmantota, lai aprēķinātu katra atšķirīgi zarnu mikroba iedarbības lielumu un īpašības, kas saistītas ar katru žurku grupu. Korelācijas analīze tika realizēta, izmantojot R pakotnes gcorrplot (versija 1.1.463).

SCFA dati tika analizēti, izmantojot SPSS 22 ANOVA.0.

3. Rezultāti un diskusijas

3.1. Cistanču polisaharīdu sagatavošana un ķīmiskā analīze

Cistanches Herba Ķīnā izmanto gan kā pārtiku, gan kā zāles. No tā izolētie polisaharīdi ir piesaistījuši lielu uzmanību to nozīmīgo aktivitāšu dēļ. Šajā pētījumā četras cistanche polisaharīdu daļas (ZT, HM, MM un LM) tika iegūtas ar ūdens ekstrakcijas, spirta izgulsnēšanas un ultrafiltrācijas metodi. Četru polisaharīdu daļu ķīmiskie sastāvi ir parādīti 1. tabulā.

Kopējais cukura saturs paraugos, izmantojot glikozes standarta līkni. Rezultāts parādīja, ka HM un LM raža bija augstāka nekā MM. Polisaharīdiem bija dažādas farmakoloģiskās īpašības, īpaši imūnsistēma. Pētījumi liecina, ka polisaharīdu aktivitātēs liela nozīme ir monosaharīdu saturam un veidam, molekulmasai, aizvietotāju grupas veidam [15]. Dažādās cistanche polisaharīdu monosaharīdu sastāva daļas bija līdzīgas, un galvenie monosaharīdi bija manoze (Man), galakturonskābe (GalUA), glikoze (Glc), galaktoze (Gal) un arabinoze (Ara).

Tomēr saturs četrās daļās bija atšķirīgs. ZT un HM galvenās sastāvdaļas bija glikoze un arabinoze, savukārt LM galvenā cukura vienība bija glikoze, turklāt šajās frakcijās tika konstatēts arī maz ramnozes un glikuronskābes (GlcUA).

Paraugu relatīvās molekulmasas tika pētītas ar augstas veiktspējas izmēru izslēgšanas hromatogrāfiju (HPSEC). Saskaņā ar dekstrānu standarta līkni un aiztures laiku kolonnās galvenās maksimālās molekulmasas ZT tika novērotas pie 1,68 × 106 Da un 1,70 × 104 Da, HM tika noteiktas kā 1,54 × 106, 2,06 × 105 un 4,81 × 104 MM un LM tika noteikti attiecīgi 1,09 × 104 un 2,05 × 104. To ražība bija norādīta 1. tabulā, un MM raža bija zema un nebija pietiekama eksperimentam ar dzīvniekiem. Iepriekšējie pētījumi liecina par cistanche polisaharīdu struktūras atkarīgo ietekmi uz dažādām bioaktivitātēm [16]. Joprojām ir nepieciešami turpmāki eksperimenti, īpaši attīrīšana. Struktūras-aktivitātes pētījumam jāpiemēro fifine strukturālā analīze

3.2. Farmakokinētikas pētījums

Ehinakozīda farmakokinētika tika pētīta ar īpaši augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas trīskāršās kvadrupola masas spektrometriju (UPLC un Xevo TQ-S) pēc ehinakozīda perorālas lietošanas. Ehinakozīda vidējās koncentrācijas-laika profili plazmā ir parādīti 1. attēlā. Saskaņā ar zāļu un statistikas programmatūru (DAS, versija 2.0), ehinakozīda farmakokinētika atbilst viena nodalījuma modelim, bet otram. parametri ZT, HM un LM grupās tika apkopoti 2. tabulā, ieskaitot laiku līdz maksimālās koncentrācijas sasniegšanai (Tmax), maksimālo koncentrāciju (Cmax), laukumu zem koncentrācijas-laika līknes (AUC) un vidējo uzturēšanās laiku (MTR). ). Farmakokinētiskais pētījums parādīja, ka ehinakozīda vidējā Cmax ZT, HM un LM grupās bija 646,4 ng/ml, 732.{13}} ng/ml un 898,4 ng/ml, kas bija 1,6, 1,8 un 2,2. reizes, salīdzinot ar kontroles grupu (406,8 ng/ml). Iepriekš apstrādājot ar polisaharīdiem, ehinakozīda AUC(0-24 h) palielinājās attiecīgi par 6,6 procentiem, 36,7 procentiem un 63,6 procentiem ZT, HM un LM grupās, salīdzinot ar kontroles grupu, kas pierādīja, ka polisaharīdi uzrādīja mazas molekulas uzsūkšanās veicināšanas darbība. Šie rezultāti bija diezgan līdzīgi tam, ka hitoligosaharīdi uzlaboja feniletanoīdu glikozīdu biopieejamību Fructus Forsythia ekstraktā [17], un Polygonum multiflorum polisaharīdi uzlaboja 2, 3, 5, 4′-tetrahidroksi- 2-benēna biofarmaceitiskās īpašības. O- -D-glikozīds normālām Sprague-Dawley žurkām [18]. Zarnu mikrobiota satur dažādus ar zāļu metabolismu saistītus enzīmus, un mikrobiomu formas zāļu farmakokinētikas un farmakodinamikas mehānismi joprojām nav zināmi [19]. Polisaharīdi var barot zarnu mikrobiotu, palielinot imūnsistēmu, absorbējot barības vielas un samazinot patogēnu augšanu [20, 21]. Lai gan literatūrā ziņots, ka cistanche polisaharīdi var palielināt ehinakozīda metabolītu (piemēram, akteozīda) daudzumu in vitro, mēs neatradām, ka līdzāspastāvošie polisaharīdi būtu guvuši labumu ehinakozīda pārvēršanai akteozīdā in vivo [10,11].

3.3. SCFA saturs žurku izkārnījumos

Zarnu mikrobiota fermentēti polisaharīdi, kas ražo dažādus bioaktīvus polimērus un metabolītus, piemēram, SCFA [3]. Kā galvenie polisaharīdu metabolīti, SCFA tika analizēti izkārnījumos. Ir ziņots, ka SCFA, tostarp etiķskābe, propionskābe un butirāts, labvēlīgi ietekmē glikozes, holesterīna un lipīdu metabolismu. Acetāts ir galvenais SCFA resnajā zarnā un ir svarīgs substrāts holesterīna sintēzei, propionāts ir substrāts glikoneoģenēzei aknās, un butirāts ir vēlamais kolonocītu enerģijas substrāts, un tam ir pretiekaisuma līdzeklis zarnās [22, 23].

Mūsu rezultāti parādīja, ka acetāts bija galvenie SCFA, kas veidojas izkārnījumos visās grupās, kam sekoja butirāts un propionāts, savukārt valerāta un sazaroto SCFA (izosviestskābes un izovalērīnskābes) koncentrācija bija zemāka. Ir pierādīts, ka acetāts palielina enzīmu aktivitāti aknu audos, tādējādi uzlabojot cukura līmeni asinīs [24]. 20.dienā (2. att.) LM grupā bija ievērojami augstāks acetāta līmenis (pb 0,05), propionāta īpatsvaram bija tendence samazināties, bet butirāta īpatsvaram bija tendence palielināties, lai gan izkārnījumos izmaiņas bija nenozīmīgas, salīdzinot ar kontroles grupu.

Tomēr HM grupā butirāta īpatsvars bija ievērojami mazāks nekā kontroles grupā (pb 0.05). Kopējo SCFA saturs starp LM un HM bija pretējs tendence, salīdzinot ar kontroles grupu, un tikai LM grupai bija būtiska atšķirība.

SCFA līmeni izkārnījumos ietekmē daudzi faktori, tostarp zarnu mikrobiotas sastāvs un daudzums, uztura avots un laiks, kas nepieciešams, lai pārtika izietu cauri gremošanas traktam [22]. Uzkrājošie pētījumi liecina, ka polisaharīdu struktūra, ieskaitot monosaharīdu atlieku sastāvu, polimerizācijas pakāpi, var ietekmēt fermentācijas īpašības un SCFA veidošanos [25]. No mūsu rezultātiem mēs varam secināt, ka cistanche polisaharīdi modulē SCFA ražošanu un dažādu struktūru polisaharīdiem ir atšķirīga ietekme.

3.4. Cistanche polisaharīdi izraisīja galvenās izmaiņas zarnu mikrobiotas sastāvā un daudzveidībā

Fekāliju paraugu (n=4) baktēriju sastāvs tika pārbaudīts, izmantojot Illumina augstas caurlaidības sekvencēšanas paņēmienu. Bibliotēka tika sekvencēta uz Illumina HiSeq2500 platformas, un tika izveidoti 250 bp pāra gala nolasījumi. Tie tika apstrādāti taksonomiskai identifikācijai un daudzveidības analīzei. Retināšanas līknes (3.a att.) parādīja, ka katram paraugam baktēriju sugu bagātība izlīdzinājās, palielinoties paraugu ņemšanas dziļumam, norādot, ka sekvencēšanas centieni bija pietiekami un ka kopējā daudzveidība paraugā tika fiksēta. Šenona līkne (3.b att.) parādīja, ka unikālo baktēriju sugu skaits palielinājās, palielinoties identificēto secību skaitam. Šenona līkņu piesātinājums nozīmē, ka sekvencēšanas dati bija pietiekami, lai aptvertu visas baktēriju sugas.

Alfa daudzveidības analīze tiek izmantota, lai izmērītu daudzveidību paraugā. Chao1, ACE, Shannon un Simpson dažādības indeksi tika aprēķināti ar Tukey testu, lai aprakstītu alfa daudzveidību. Daudzveidības analīze, kas balstīta uz ACE un Chao 1 indeksiem, atklāja zarnu mikrobiotas kopienas bagātību OTU līmenī. ACE un Chao 1 indeksi bija ievērojami zemāki LM grupas fekāliju paraugos, salīdzinot ar kontroles grupu (pb 0.05) (4.a, b att.), kas nozīmē, ka zarnu mikrobiotas sugu bagātība ir samazinājusies. ar LM barošanu. Daudzveidības analīze, kas balstīta uz Šenonas un Simpsona indeksiem, atklāja zarnu mikrobiotas kopienas daudzveidību. Apstrādājot ar cistanche polisaharīdiem, salīdzinot ar kontroles grupu, Šenona un Simpsona daudzveidības indeksos nebija acīmredzamu izmaiņu.

Cistanche polisaharīdi izraisīja lielas izmaiņas taksonos. Turklāt četrās grupās N98 procenti OTU bija saistīti ar phyla Bacteroidetes, Firmicutes un Proteobacteria. Pārsvarā dominēja Bacteroidetes, kas veidoja 55.09 procentus, 57,89 procentus, 52,72 procentus un 69.{{20}}4 procentus no fekāliju mikrobiotas kontroles, ZT, HM un Attiecīgi LM grupas, kam seko Firmicutes, veidojot attiecīgi 41,39 procentus , 38.{26}}3 procentus , 42,15 procentus un 28,15 procentus (5.a, b attēls). Salīdzinot ar kontroles grupu, tika pierādīts, ka ZT grupai ir vāja ietekme uz galvenās filas relatīvo daudzumu, izņemot to, ka aktinobaktēriju zemais daudzums bija ievērojami palielināts (MetaStat, pb 0, 05). HM grupā proteobaktērijas bija ievērojami palielinātas (pb 0, 01). Tas norādīja, ka HM Cistanche polisaharīds var veicināt proteobaktēriju bagātināšanu, lai ietekmētu vielu metabolismu žurkām. LM grupā Bacteroidetes, kuru galvenie veicinātāji bija Prevotellaceae un Prevotellaceae_UCG-001, skaits ievērojami palielinājās (pb 0,05), un Firmicutes, tostarp Peptococcaceae, daudzums ievērojami samazinājās. (p) . Prevotella un Bacteroides locekļi iepriekš tika aprakstīti kā uztura šķiedrvielu noārdītāji [26], kas ražo vielmaiņas galaproduktus, piemēram, sukcinātu un acetātu [27]. Šādi atklājumi apstiprināja iepriekšējos pētījumus, kas liecina, ka daži Prevotella spp. var noārdīt kompleksos augu polisaharīdus. Iepriekšējie ziņojumi arī parādīja, ka divas dominējošās baktēriju nodaļas, palielināta phyla Firmicutes / Bacteroidetes attiecība ir saistīta ar aptaukošanos [28]. Mazāks pirmo un augstāko pārpilnība LM grupā liecināja, ka LM varētu palīdzēt atbrīvoties no mārciņām.

No 72 atklātajām ģimenēm taksoni top10 tika izolēti un analizēti (5.c, d. att.). Lachnospiraceae un Ruminococcaceae ir divas no visizplatītākajām ģimenēm, kas sastopamas zīdītāju zarnu vidē, un tās ir saistītas ar zarnu veselības uzturēšanu [29]. Pašreizējā pētījumā ģimenes Bacteroidales _S24-7_ (39,11 ± 6,04 procenti, 36,88 ± 4,44 procenti, 28,37 ± 4,01 procenti, 35,81 ± 7,91 procenti), Prevotellaceae (10, 3,5 ± 4,5 procenti 10,4 ± 5,5). Procents, 19,65 ± 8,97 procenti, 21,05 ± 8,39 procenti), lachnospiraceae (18,21 ± 5,20 procenti, 15,09 ± 3,29 procenti, 12,13 ± 7,14 procenti, 13,12 ± 6,82 procenti) un reminokocaceae (9,64 ± 0,88 procenti, 10,44 ± 2,45 procenti, 11,64 ± 0,88 procenti, 10,44 ± 2,45 procenti, 11,277777. Procenti, 10,44 ± 2,45 procenti, 11,27 ± 0,88 procenti, 10,44 ± 2,45 procenti, 11,27 ± 0,88 procenti, 10,44 ± 2,45 procenti, 11,27 ± 0,88 procenti, 10,44 ± 2,45 procenti, 11,277. ± 4,70 procenti, 8,19 ± 1,72 procenti) dominēja katrā grupā. Ir ziņots, ka S24-7 saime satur lielu daudzumu ogļhidrātus noārdošu enzīmu [30]. Prevotellaceae uzrādīja pieaugumu un Lachnospiraceae uzrādīja samazināšanās tendenci polisaharīdu grupā, salīdzinot ar kontroles grupu [31]. Tika pieņemts, ka Bacteroidales_S24-7_ un Lachnospiraceae grupā nebija atbilstošu cistanche polisaharīdu aktīvo enzīmu vai baktēriju ogļhidrātus saistošo moduļu pie polisaharīdiem. Ir ziņots par Prevotella ģintīm saistībā ar polisaharīdu izmantošanas lokusiem un ogļhidrātu aktīviem enzīmiem [32]. Lai atrastu saistību starp baktērijām un SCFA, tika izmantota Spīrmena korelācijas analīze. Dažām ģintīm, piemēram, Bacteroides, Prevotella un Lactobacillus zarnu mikrobiotā, ir svarīga loma polisaharīdu hidrolizācijā par SCFA [33]. Mūsu rezultāti arī parādīja, ka Bacteroidaceae korelēja pozitīvi un dominēja mikrobiota, kas ražoja vairāk butirāta [34], savukārt Prevotellaceae korelēja pozitīvi un dominējošā mikrobiota ražoja vairāk acetāta. Lactobacilaceae un Ruminococcaceae dominējošā mikrobiota ražoja vairāk propionātu (6. att.).

Beta daudzveidības analīze tika izmantota, lai izpētītu zarnu mikrobiotas strukturālās variācijas visos paraugos, izmantojot UniFrac attāluma metriku. Atšķirības Unifrac attālumos tika analizētas ar Tukey un Wilcox testu (7. att.). Izmantojot uniFrac nesvērto analīzi, mēs noskaidrojām, ka LM barojas peles, kas atrodas prom no citām grupām. Kontroles, ZT, HM un LM grupām tika identificēts acīmredzams klasterizācijas modelis.

Šo mikrobu pārpilnība tika diferencēti modulēta ar polisaharīdu apstrādi. Lai identificētu specifiskos baktēriju taksonus katrā grupā, mikrobiotas sastāvs no kontroles, ZT, HM un LM grupām tika salīdzināts ar lineārās diskriminējošās analīzes efekta lieluma (LEfSe) metodi. Lineāro diskriminācijas analīzi (LDA) izmanto, lai aprēķinātu katras diferenciāli bagātīgas pazīmes ietekmes lielumu. LDA punktu slieksnis ir augstāks nekā 4 bija saraksts, kas norāda uz lielāku relatīvo kopienas pārpilnību attiecīgajā grupā nekā citās grupās. Izmantojot šo metodi, mēs atklājām, ka 19 OTU visās grupās bija ievērojami atšķirīgi, proti, 6 OTU kontroles grupā bija augstāki, tikai 1 OTU ZT grupā bija augstāki, 10 OTU HM grupā bija augstāki. un 2 OTUS LM grupā bija augstāki nekā citās grupās (8. att.). G_Prevotellaceae_ UCG_001 daudzums LM tika ievērojami palielināts (8,47 ± 1,9 procenti LM, 0,40 ± {{21 }}.09 procenti kontroles grupā, pb 0,01). Rezultāts atbilda ziņojumam, ka Porphyra haitanensis un Ulva prolifera polisaharīdi acīmredzami varētu veicināt Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) un Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Secinājumi

Ir skaidrs, ka pastāv saistība starp TCM ķīmiskajām sastāvdaļām, zarnu mikrobiotu un dažiem metabolītiem, kas rodas zarnu mikrobu rezultātā. Mūsu pašreizējie atklājumi nodrošināja metodi ehinakozīdu metabolisma sinerģijas pētīšanai ar dažāda veida polisaharīdiem, pamatojoties uz zarnu mikrobiotu. Zarnu mikrobiota var metabolizēt TCM, un TCM var ietekmēt zarnu mikrobiotas augšanu. No vienas puses, pēc polisaharīdu perorālas ievadīšanas zarnās dažāda zarnu mikrobiota kodē vielmaiņas enzīmus, kam ir svarīga loma polisaharīdu sadalīšanā un bioaktīvo metabolītu ražošanā. No otras puses, polisaharīdu ieguldījums šajā procesā zināmā mērā ietekmē zarnu mikrovides līdzsvaru. Salīdzinot ar polisaharīdiem vai bez tiem, mēs noskaidrojām, ka polisaharīdi, kaut arī saimnieks sagremots tieši, potenciāli darbojās kā prebiotikas, izraisot labvēlīgas izmaiņas zarnu mikrobiotā, veicinot probiotiku augšanu. Cistanche polisaharīdi regulēja zarnu mikrobiotas daudzveidību, palielināja labvēlīgās baktērijas un īpaši zemas molekulas polisaharīdi uzlaboja Prevotella spp. Turklāt uzlabotā zarnu mikrobiota uzlaboja ehinakozīda uzsūkšanos Cistanche deserticola. Bet iemesls nav pilnībā skaidrs, tas var būt zarnu mikrobiotas, SCFA un imunitātes kombinēto defektu rezultāts, un slimības modelim ir nepieciešami turpmāki pētījumi. Ir grūti pierādīt prebiotiku ietekmi veselos dzīvnieku modeļos, kuru mikrobiotas kopiena ir stabila un izturīga. Cistanche deserticola polisaharīdus var izstrādāt kā probiotiskos produktus, lai regulētu zarnu mikrobiotu, un nākotnē tos var izmantot mazu molekulu sinerģiskajam metabolismam. Šie dati palīdzēs mums izstrādāt pasākumus, lai neļautu neaizsargātām cilvēku grupām uzlabot savu veselību.

Konkurējošo interešu deklarācija

Autori paziņo, ka saistībā ar šī darba publicēšanu nav interešu konflikta.

Pateicības

Autori pateicas Ķīnas Nacionālajam dabaszinātņu fondam (granta Nr. 81830112 un 81904058)

Atsauces
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Potential prebiotikas un to pārnešanas mehānismi: jaunākās pieejas, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, zarnu mikrobiota, saimniekorganisma veselība un polisaharīdi, Biotechnol. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, Polisaharīdu kritiskā loma zarnu mikrobu ekoloģijā un fizioloģijā, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, Pētījumi par trīs polisaharīdu saistīšanās īpašībām ar atšķirīgu molekulmasu un flavonoīdiem no kukurūzas zīda (Maydis stigma), Carbohyd. Polim. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Džou, J. Sju, H. Džu, J. Vu, J. D. Sju, R. Jaņs, XJ Li, HH Liu, SM Duans, Z. Vans, HB Čens, H. Šens, SL Li, zarnu mikrobiota -iesaistīti mehānismi, kas uzlabo ginsenozīdu sistēmisko iedarbību, izmantojot līdzāspastāvošus polisaharīdus žeņšeņa novārījumā, Sci. 6. rep. (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Codonopsis pilosula saponīnu uzsūkšanās ar līdzāspastāvošiem polisaharīdiem atvieglo zarnu mikrobu disbiozi ar nātrija dekstrānu. -inducēts kolīts paraugpelēm, Biomed. Res. Int. 2018 (2018), 1781036 (18 lpp.).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum samazina aptaukošanos pelēm, modulējot zarnu mikrobiotas sastāvu, Nat. Commun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, zarnu mikrobiota ir iesaistīti longan polisaharīda, Mol, imūnmodulējošajās aktivitātēs. Nutr. Food Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": pārskats, Am. J. Čins. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, ehinakozīda metabolītu identificēšana, ko ražo cilvēka zarnu baktērijas, izmantojot ultraperformance šķidrumu
hromatogrāfija–kvadrupola lidojuma laika masas spektrometrija, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Cistanches Herba ūdens ekstrakta metabolisms cilvēka kuņģa-zarnu traktā in vitro: vielmaiņas profila noskaidrošana, pamatojoties uz visaptverošu metabolītu identifikāciju kuņģa sulā, zarnu sulā, cilvēka zarnās baktērijas un zarnu mikrosoma, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Kolorimetriskā metode cukuru un radniecīgo vielu noteikšanai, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Jaunā gļotādas imunizācija ar polisaharīda-proteīna konjugātiem, kas iesprostoti algināta mikrosfērās, J. Control. Release 53 (1-3) (1998) 215-224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Sensitīva un vienkāršota antibiotiku ietekmes noteikšana uz fekāliju īstermiņa dinamiskajām un daudzpusīgajām izmaiņām -ķēdes taukskābes, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Polisaharīdu molekulārā modifikācija un iegūtās bioaktivitātes , Compr. Rev. Food. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: pārskats par tās ķīmijas, farmakoloģijas un farmakokinētikas īpašībām, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Hitooligosaharīdu ietekme uz
feniletanoīdu glikozīdu uzsūkšanās zarnās Fructus Forsythia ekstraktā, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Ophiopogon japonicus polisaharīdu ietekme uz 2,3,5,4′-tetrahidroksi-stilbēnu-2- Z. Fu et al. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glikozīds par biofarmaceitiskajām īpašībām in vitro un farmakokinētiku in vivo, Int. J. Biol. Macromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Precīzijas medicīna ir mikroskopiska: mikrobioma izstrāde, lai uzlabotu zāļu rezultātus, Cell Host Microbe 26 (1) (2019), 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Prebiotiku izpēte, novatoriskas novērtēšanas metodes un to pielietojumi veselības jomā: pārskats, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibsons, R. Hatkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimers, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Starptautiskā probiotiku zinātniskā asociācija un prebiotikas (ISAPP) vienprātības paziņojums par prebiotiku definīciju un darbības jomu, Nat. Gastro kundze. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Resnās zarnas veselība: fermentācija un īsās ķēdes taukskābes, J. Clin. Gastroenterols. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, Pārskata raksts: Īsās ķēdes taukskābes veselībā un slimībās, Aliment. Pharm. Tur. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Improvement of obesity and glucose tolerance by acetate in 2 Type diabetic Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) žurkas, Biosci. Biotehnoloģija. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, In vitro fermentability of xylooligosaccharides and Xylo-polysaccharide fractions with different molekulmasas ar cilvēka fekāliju baktērijām, Carbohyd. Polim. 179 (2018) 50.–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Šķiedru izmantošanas spēja atšķiras Prevotella un Bacteroides dominējošā zarnu mikrobiotā, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii ir agrāks Bacteroides chinchilla heterotipisks sinonīms, un tam ir prioritāte, Int. J. Syst. Evol. Mikrofons 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Ar aptaukošanos saistīts zarnu mikrobioms ar palielinātu enerģijas ieguves spēju, Nature 444 (7122) (2006) 1027–1131.
[29] LF Gomes-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Savienojumi starp zarnu mikrobiomu un vielmaiņas hormoniem grūtniecības sākumā sievietēm ar lieko svaru un aptaukošanos, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
30 nekulturēta Bacteroidales dzimta S24-7, kas apdzīvo homeotermisku dzīvnieku zarnas, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Butirātu ražojošo Lachnospiraceae labvēlīgā ietekme uz stresa izraisītu viscerālo hipersensitivitāti žurkām, J. Gastro. Hepatols. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Spurekļa un aizmugurējās zarnas daudzveidīgie un plašie augu polisaharīdu degradācijas aparāti. Prevotella sugas: to visuresamības faktors? Sist. Appl. Microbiol. 42 (2) (2019) 107.–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Ogļhidrātu loma cūku zarnu veselībā, Anim. Barība. Sci. Tehn. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Understanding the prebiotic potential of different dietary fibers using a in vitro nepārtrauktas pieaugušo fermentācijas modelis (PolyFermS), Sci. Rep. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Divu jūras aļģu polisaharīdu ietekme uz zarnu mikrobiotu pelēm, kas novērtēta ar Illumina PE250 sekvencēšanu, Int. J. Biol. Macromol. 112 (2018) 796–802.