Cistanche Tubulosa aizsargā dopamīnerģiskos neironus, regulējot apoptozi un no glia šūnām iegūto neirotrofisko faktoru: in vivo un in vitro-Ⅰ

IEVADS

Parkinsona slimība (PD) ir izplatīta neirodeģeneratīva slimība, kas rodas gados vecākiem cilvēkiem ar patoloģiskām izpausmēm, kas saistītas ar dopamīnerģisko neironu zudumu melnajā pamatnē (SN) deģenerācijas dēļ. Slimības smagums ir saistīts ar dopamīna (DA) neironu šūnu zudumu SN, kas atbilst viedoklim, ka neirodeģeneratīvais process progresē daudzus gadus, pirms parādās jebkādi simptomi (Zēls un Maijers, 1993). Slimības progresējošais raksturs liecina par interesantām terapeitiskās iejaukšanās iespējām, bloķējot pamatā esošo neirodeģeneratīvo procesu. Tāpēc ir ļoti svarīgi meklēt terapijas izraisītu spēcīgu un specifisku neirotrofisko faktoru iedarbību uz DA neironu izdzīvošanu.

NATURAL CISTANHE TUBULOSA DOPAMINERGIC NEIRONU AIZSARGĀŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Neirotrofiskie faktori ir būtiski proteīni, tostarp nervu augšanas faktors (NGF), smadzenēs iegūtais neirotrofiskais faktors (BDNF) un glia šūnu izcelsmes neirotrofiskais faktors (GDNF), kas veicina nervu augšanu, neiroloģisko attīstību, aksonu vadību un neironu darbību. No visiem neirotrofiskajiem faktoriem, kas aizsargā un veicina dopamīnerģisko neironu atjaunošanos, GDNF ir visspēcīgākā ietekme (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Ir pierādīts, ka GDNF piemīt spēcīga neirotrofiska iedarbība uz DA neironiem in vitro (Lin et al., 1993), un tam ir neiroprotektīva iedarbība in vivo. Ir pierādīts, ka GDNF izglābj nigrālos DA neironus no bojājumu izraisītas šūnu nāves pēc ķirurģiskas vai toksīnu izraisītas aksotomijas žurkām (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) un daļēji arī pēc tam. sistēmiska administrēšanaN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridīns (MPTP)pelēm (Tomac et al., 1995). Dopamīnerģisko neironu deģenerācijas pamatā ir palielināts neironu apoptozes biežums un neirotrofisko faktoru samazinātā aizsargājošā iedarbība, ko potenciāli izraisa dažādi patoloģiski faktori (Holden et al., 2006).

C. tubulosa ir augu izcelsmes zāles, kas iegūtas no vairākiem Cistanche ģints augiem. Tā ir galvenā nieru deficīta sindroma terapeitiskā iespēja, kas ir cieši saistīta ar androgēnu hormoniem tradicionālajā ķīniešu medicīnā (TCM). Līdz šim daudzi klīniskie un fundamentālie pētījumi par C. tubulosa ir parādījuši neirodeģeneratīvo slimību aktivitātes. Tādējādi TCM nieru tonizējošu recepšu identificēšana PD ārstēšanā var nodrošināt alternatīvu PD klīnisku ārstēšanu.ehinakozīds (ECH)ir galvenā bioaktīva sastāvdaļa, kas atrodama ārstniecības augā C. tubulosa. Pētījumi ir parādījuši Cistanche un ECH glikozīdu terapeitisko iedarbību,verbascoside(VER) un icariin (ICA) par Alcheimera slimību (AD), PD un citiem vaskulāras demences pacientiem (Urano un Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) ierosināja, ka C. tubulosa ekstrakti, kas satur pietiekami daudz ECH un akteozīda, uzlaboja A -42 izraisīto kognitīvo disfunkciju, bloķējot amiloīda nogulsnēšanos un mainot holīnerģisko un hipokampu dopamīnerģisko neironu funkciju. Tao et al. (2015) atklāja, kafeniletanoīdu glikozīdino C. tubulosa (Ph Gs-Ct) novērsa augstkalnu smadzeņu tūsku, samazinot AQP4 proteīna un mRNS ekspresiju žurku modeļu smadzeņu audos.

NATURAL CISTANHE TUBULOSA EXTRACT UZNAKAS UZLABO ATMIŅU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Iepriekšējie pētījumi liecina, ka Ķīnas augu savienojumi, tostarp trīs C. tubulosa, epimedium un rhizoma polygonati sastāvdaļas, mazināja dopamīnerģisko neironu bojājumus un paaugstināja dopamīna līmeni, regulējot neirotrofisko faktoru ekspresiju (Wu et al., 2013). Tādējādi vēl nav zināms, vai C. tubulosa izraisītā neiroprotektīvā iedarbība ir ilgstoša un cik lielā mērā nigrālo DA neironu glābšana, ievadot GDNF, var nodrošināt ievērojamu motoriskās uzvedības saglabāšanu, kas ir svarīga PD dzīvnieku simptomatoloģijai. Šajā pētījumā tika izmantota TCM nieru tonizējoša recepte, C. tubulosa nanopulveris, kas ir saņēmis nacionālo patentu (patenta numurs: 2011103028541) Ķīnā un iepriekš uzrādījis noteiktu terapeitisko efektu PD. Tāpēc šis pētījums tika izstrādāts, lai izpētītu C. tubulosa ārstēšanas neiroprotektīvo un reģeneratīvo iedarbību un izpētītu apoptozi uz MES23.5 šūnām un galīgajām žurkām, kā arī GDNF regulējumu, ko mēra ar mērķa testu kopumu. .

MATERIĀLI UN METODES

Materiāli, reaģenti un aprīkojums

C. tubulosa tika iegādāts no Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Pekina, Ķīna. ECH, VER un ICA nāk no Nacionālajiem pārtikas un zāļu kontroles institūtiem Ķīnā. MES23.5 dopamīnerģisko neironu šūnu līniju dāvināja Pekinas, Ķīnas galvaspilsētas Medicīnas universitātes Neirobioloģijas laboratorijas profesors Biao Čens. Piecdesmit C57BL/6 peļu tēviņi (katra sver 20–25 g) tika iegādāti no Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (licences numurs: SCXK2012-0002), Šanhajā, Ķīnā.

MPP+, MTT un glutamīns tika iegādāti no Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ASV); DMEM/F12 barotne un liellopu augļa serums tika iegādāti no Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, ASV); un MPTP, DA standarts un homovanilskābes (HVA) standarts tika iegādāti no Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ASV). -aktīns, Bax, Bcl2, GDNF, GDNF saimes receptoru alfa (GFR 1) un Ret antivielas tika iegādātas no Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, ASV); 3,3'-diaminobenzidīna (DAB) krāsošanas reaģenta komplekts tika iegādāts no Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Ķīna); un SDS-PAGE gēla paraugu sagatavošanas komplekts, ultrasensitīvas uzlabotas ķīmijluminiscences (ECL) noteikšanas komplekts un bicinhonīnskābes (BCA) tests tika iegādāti no Beyotime Biotehnoloģijas institūta (Pekina, Ķīna).

Šajā pētījumā tika izmantoti šādi instrumenti: ELX800 mikroplašu lasītājs (Bio Tek Winooski, VT, ASV); CO2 inkubators (Heraeus, Hanau, Vācija); Gel DOC 2000 gēla attēlveidošanas analīzes sistēma, elektroforēzes šūna un elektroforēzes tvertne (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV); DU-650 olbaltumvielu analizators (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, ASV); 5417R ātrgaitas atdzesēta centrifūga (Eppendorf, Hamburga, Vācija); SXQM divu planētu lodīšu dzirnavas (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Ķīna); MM400 maisītāja dzirnavas (Retsch GmbH, Hāna, Vācija); Agilent 1200 augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV); PowerPac Basic elektroforēze, PowerPac Basic transmembrānas pārneses sistēma, Universal Hood II hemiluminiscences attēlveidotājs, S1000 Thermal Cycler RNS reversās transkripcijas sistēma (Bio-Rad); Motic Med 6.0 audu un šūnu attēlu analīzes sistēma (Motic China Group, Co., Ltd, Sjameņa, Ķīna).

SagatavošanaC. tubulosaNanopulveris

C. tubulosa tika nosvērts, pēc tam attīrīts un dehidrēts. Pēc parastās pulverizēšanas C. tubulosa smalkais pulveris tika izlaists caur 200-sietu un liofilizēts. C. tubulosa nanopulvera pagatavošanai tika izmantotas kontrolētas temperatūras vakuuma un augstas enerģijas lodīšu dzirnavas. Pirmkārt, neapstrādāts C. tubulosa nanopulveris tika ievietots vakuuma lodīšu frēzēšanas tvertnē, kurā tika ievietotas karbīda slīpēšanas lodes. Attiecība starp slīpēšanas bumbiņām un C. tubulosa nanopulveri bija no 15:1 līdz 5:1. Lai iegūtu smalku pulveri, augstas enerģijas lodīšu dzirnavu ātrums un ilgums tika iestatīts attiecīgi uz 300 apgr./min un 20 min. Smalkais pulveris tika nosvērts nanomēroga materiālu apstrādei un apstrādāts miksera dzirnavās ar frekvenci 25/s un svārstībām 20s trīs atkārtojumos. PBS tika izmantots, lai izšķīdinātu un sagatavotu 25 mg/ml izejas šķīdumu, kam sekoja 30 minūšu ultraskaņa, autoklāvēšana un visbeidzot uzglabāšana –20 ◦C.

Aktīvo komponentu kvalitātes kontroleC. tubulosaizmantojot HPLC

ECH un VER saturēja gradienta eluēšanu ar oktadecilsilāna savienojumu silīcija dioksīdu kā pildvielu, metanolu kā kustīgo fāzi A un 0,1% skudrskābes šķīdumu kā kustīgo fāzi B. Noteikšanas viļņa garums bija 330 nm. ICA saturēja gradienta eluēšanu ar oktadecilsilānu saistītu silīcija dioksīdu kā pildvielu un acetonitrila-ūdeni (30:70) kā kustīgo fāzi. Noteikšanas viļņa garums bija 270 nm. Testam paraugam, kontrolei un negatīvajai kontrolei tika mērīti 10 µL katrs.

Šūnu kultūra un MTT tests MPP dzīvotspējas noteikšanai+- Apstrādātas šūnas

MES23.5 šūnas tika inokulētas ar 5% teļa augļa serumu, 1% glutamīnu, 2% 50 × Sato šķīdumu un DMEM/F12 barotni ar 2% penicilīna/streptomicīna. Tos inkubēja 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 inkubatorā ar piesātinātu mitrumu. Šūnas tika izolētas un pasētas ar 0, 25% tripsīnu, un šūnu suspensija tika novākta logaritmiskās augšanas fāzē. Izolētas šūnas ar blīvumu 1 × 105 tika iesētas ar polilizīnu pārklātās 96-iedobumu plāksnēs, pēc tam pievienojot dažādas galīgās koncentrācijas (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 un 800 µmol/L). ) no MPP+ multivides. MES23.5 šūnas, kas tika inkubētas ar normālu barotni 24 stundas un 48 stundas, tika izmantotas kā negatīvas kontroles in vitro eksperimentos. Šūnas no dažādām apstrādes grupām tika inkubētas ar MTT reaģentu 4 stundas. Pēc tam iedobēs esošais šķīdums tika izmests un tika pievienots 150 µL DMSO un svārstījās 10 minūtes. Katra parauga absorbcija pie viļņa garuma 570 nm tika mērīta, izmantojot automātisko mikroplašu lasītāju. Šūnu dzīvotspējas procentuālā daļa (%)=vidējā absorbcija eksperimentālajā grupā/vidējā absorbcija negatīvās kontroles grupā × 100%.

Attiecīgās MPP+ barotnes koncentrācijas tika pievienotas 24-stundu apstrādei MES23.5 šūnās, izmantojot to pašu pieeju kā in vitro kultūrai. Pēc apstrādes iedobē esošais šķīdums tika izmests. Barotnes, kas satur dažādas koncentrācijas (10, 50, 100, 200, 250, 500 un 1000 µg/mL) C. tubulosa nanopulvera, pievienoja MES23.5 šūnām dažādās iedobēs un atstāja inkubēties 24 stundas un 48 stundas. MES23.5 šūnas, kas tika inkubētas ar normālu barotni 24 stundas un 48 stundas, tika izmantotas kā negatīvas kontroles. Kā nesējs tika izmantotas MES23.5 šūnas, kas tika inkubētas ar MPP+ barotni. Mērījumi tika veikti trīs eksemplāros katram paraugam. Tika izmērīta atbilstošo apstrādes un kontroles grupu absorbcija, lai aprēķinātu šūnu dzīvotspēju.

DABĪGS CISTANČES TUBULOZAS EKSTRAKTS PREIZ NOguruma PHGS75% ECH 30% ACT 12%

TH ekspresija, ko mēra ar imūncitoķīmiju

Kad C. tubulosa nanopulvera saturs bija 100, 200 un 250 µg/ml, šūnu izdzīvošanas rādītājs ievērojami palielinājās (2.G attēls). Tādējādi turpmākajos eksperimentos mēs pārbaudījām trīs koncentrācijas: zemas devas, vidējas devas un lielas devas grupas. Katrai no C. tubulosa grupām tika pārbaudītas trīs replikācijas. Sterilizēti, ar polilizīnu pārklāti segstikliņi tika ievietoti 6-iedobju plāksnēs. Pēc tam katrā iedobē tika iesētas 5 × 104 šūnas un inkubētas 24 stundas. Parastā svaigā barotne tika aizstāta parastajā kontroles grupā, un atlikušajās apstrādes grupās tika aizstāta ar galīgo koncentrāciju 100 µmol/L MPP+ barotne, lai inkubētu 24 stundas. Pēc tam parastā svaigā barotne tika aizstāta parastajās kontroles un nesēja grupās, un C. tubulosa nanopulvera galīgās koncentrācijas 100, 200 un 250 µg/ml tika inkubētas ar šūnām 24 stundas zemās, mērenās un lielās devās. C. tubulosa ārstēšanas grupām, attiecīgi. MES23.5 šūnas dažādās grupās tika mazgātas trīs reizes PBS, lai noņemtu supernatantu, un tālāk fiksētas 4% paraformaldehīdā 15 minūtes. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas 30 minūtes inkubēja ar peroksidāzes blokatoru 37 ° C temperatūrā un pēc tam vēlreiz mazgāja ar PBS. Šūnu caurlaidībai 10 minūtes tika izmantots 0,2% Triton X-100 šķīdums, kam sekoja mazgāšana ar PBS. Katram paraugam tika pievienots parasts kazas serums un inkubēts istabas temperatūrā 30 minūtes. Pēc tam tika noņemts parastais kazas serums, katram paraugam tika pievienota primārā antiviela, kas atšķaidīta 1:400 ar PBS, un inkubēta 4 ° C temperatūrā nakti. Negatīvās kontroles grupas šūnas nakti inkubēja ar PBS 4 ◦ C temperatūrā. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas 20 minūtes inkubēja ar biotīnu iezīmētām sekundārajām antivielām mitruma kamerā 37 ◦ C temperatūrā. Pēc tam katrs paraugs tika mazgāts PBS un marķēts ar mārrutku peroksidāzes-streptavidīna konjugātiem (darba šķīdums C) 37 ◦ C temperatūrā 20 minūtes. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas tika iekrāsotas ar DAB reaģentu tumsā apmēram 1–10 minūtes, un brūnas krāsas attīstība tika uzraudzīta gaismas mikroskopijā. Pēc tam katru paraugu divreiz mazgā destilētā ūdenī 1–2 minūtes, un kodoli tika iekrāsoti ar hematoksilīna šķīdumu 0, 5–1 min. Pēc katra parauga rūpīgas skalošanas ūdenī šūnas tika iegremdētas 1% sālsskābes spirtā diferenciācijai un 1% amonjaka ūdens šķīdumā, kam sekoja šūnu rūpīga mazgāšana ūdenī. Pēc tam šūnas no katra parauga tika dehidrētas 70% etanolā 2 minūtes, 80% etanolā 2 minūtes, 90% etanolā 2 minūtes divas reizes, 95% etanolā 2 minūtes divas reizes un 100% etanolā 2 minūtes divas reizes. Pēc tam šūnas divas reizes iegremdēja ksilola šķīdumā uz 2 minūtēm un uzmontēja uz stikla priekšmetstikliņa ar neitrāliem sveķiem. Gaismas mikroskopijā katram paraugam tika veikta attēlu uzņemšana un nejauša 5–10 efektīvu redzes lauku atlase, lai noteiktu izvēlēto proteīnu ekspresiju dopamīnerģiskajos neironos, ko norāda brūno daļiņu intensitāte, un daļēji kvantitatīvi noteiktu olbaltumvielu saturu pēc tā vidējās pelēkās vērtības. .

MES23.5 šūnu apoptozes ātrums, ko mēra ar plūsmas citometriju

Pielipušās šūnas vienu reizi tika mazgātas ar PBS. Šūnu izolēšanai istabas temperatūrā pievienoja atbilstošu daudzumu EDTA nesaturoša tripsīna šķīduma un šķīdumu viegli pipetē, lai ļautu atdalīties pielipušajām šūnām. Pēc tam tika pievienota šūnu kultūras barotne, lai apturētu tripsinizāciju. Maisījumu pārnesa uz jaunu centrifūgas mēģeni un pēc tam centrifugēja 5 minūtes ar ātrumu 1500 apgr./min, lai savāktu izolētās šūnas. Pēc supernatanta izmešanas šūnu granula tika viegli atkārtoti suspendēta, izmantojot PBS, un šūnas tika skaitītas. Aptuveni 1 × 105 līdz 5 × 105 atkārtoti suspendētas šūnas tika centrifugētas 5 minūtes ar ātrumu 1500 apgr./min, un supernatants tika izmests. Šūnu granulai tika pievienoti pieci mikrolitri aneksīna V-FITC saistošā šķīduma, lai viegli atkārtoti suspendētu šūnas. Pievienoja vēl 5 µL aneksīna V-FITC un rūpīgi samaisa. Šūnu krāsošanai tika izmantoti pieci mikrolitri propīdija jodīda šķīduma, inkubējot istabas temperatūrā 10 minūtes neilgi pirms plūsmas citometrijas.

Western Blot analīzein vitro

Šūnas tika sadalītas normālā grupā, MPP+ ārstēšanas grupā, mazās devāsC. tubulosaārstēšanas grupa, vidējas devas C. tubulosa terapijas grupa un lielas devas C. tubulosa ārstēšanas grupa. Katrā tika mērīta Bcl2 un Bax ekspresija. Kopā 1 × 105 šūnas katrā 6-iedobes plāksnes iedobē tika izmantotas modelēšanai un apstrādei katrā grupā pirms šūnu savākšanas. Tika pievienots jaukts lizāts, kas satur RIPA buferi, proteāzes inhibitoru un fosfatāzes inhibitoru, lai šūnas lizētu uz ledus 30 minūtes. Pēc centrifugēšanas supernatants tika izmantots olbaltumvielu analīzei. Kopējais proteīna daudzums tika noteikts, izmantojot BCA testu, un atdalīts ar 10% SDS-PAGE. Atdalītās olbaltumvielas tika pārnestas uz membrānu un inkubētas ar 5% vājpiena bloķējošo buferšķīdumu istabas temperatūrā 2 stundas. Pēc tam membrānu inkubēja primārajā antivielā (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, atšķaidījums 1:200) 4°C uz nakti. Pēc mazgāšanas posma membrāna tika inkubēta sekundārajā antivielā (0, 5 mg / ml, 1: 5000 atšķaidījums) 4 ° C temperatūrā 1 stundu un pēc tam ECL attīstītājā 2 minūtes parastajai izstrādei. Quantity One programmatūra tika izmantota proteīna ekspresijas daļēji kvantitatīvai analīzei.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA FOR PRET FATIGUE PROTECT AKNAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimentālā dzīvnieku modelēšana un zāļu pārvalde

Piecdesmit no specifiskiem patogēniem brīvu 8-nedēļu vecu peļu tēviņi tika nejauši sadalīti piecās grupās: normāla grupa, MPTP terapijas grupa (transportlīdzeklis), mazas devas C. tubulosa terapijas grupa, vidējas devas C. tubulosa terapija grupā un lielu devu C. tubulosa ārstēšanas grupā. Dzīvnieki tika izmitināti 20–22 ◦C ar brīvu piekļuvi barībai un ūdenim. Parastās grupas pelēm septiņas dienas pēc kārtas intraperitoneāli injicēja vienādu daudzumu parastā fizioloģiskā šķīduma. Pelēm citās ārstēšanas grupās intraperitoneāli injicēja MPTP (30 mg/kg/d) septiņas dienas pēc kārtas, lai izveidotu nesējus.

PD modelēšanas laikā pelēm, kas saņēma mazas, vidējas devas un lielas devas C. tubulosa terapijas grupās, intragastriski tika ievadīti ekvivalenti klīniskie tilpumi 4 g/kg/d, 8 g/kg/d un 16 g/d. kg/dC. tubulosa nanopulveris, attiecīgi, 14 dienas pēc kārtas. Pelēm kontroles un nesēja grupās 14 dienas pēc kārtas intragastrāli ievadīja līdzvērtīgu daudzumu parastā fizioloģiskā šķīduma. Visas eksperimentālās procedūras apstiprināja TCM Fudzjaņas universitātes Ētikas komiteja, un tās tika veiktas saskaņā ar starptautiski pieņemtajiem laboratorijas dzīvnieku lietošanas un kopšanas principiem. Šajā pētījumā tika pieliktas visas pūles, lai samazinātu dzīvnieku ciešanas.