Cistanosīds A ir starpnieks P38/MAPK ceļā, lai kavētu osteooklastu aktivitāti

Abstrakts

PRIEKŠVĒSTS:Cistanosīds Airpretiekaisuma iedarbība, antioksidācija,mazina nieru bojājumus un novērš osteoporozi, bet tā ietekme uzosteoklastu diferenciācija, funkcija un pamatā esošie molekulārie mehānismi paliek neskaidri. MĒRĶIS: Izpētīt ietekmiCistanosīds Aieslēgtsosteoklastudiferenciācija unkaulu rezorbcijako inducē kodolfaktora kappa-B liganda (RANKL) receptoru aktivators in vitro un tā mehānisms.

METODES. Kaulu smadzeņu makrofāgi tika iegūti no 4-6-nedēļu vecu C57BL/6 peļu augšstilba kaula un stilba kaula. Cistanosīda A (5, 10, 20, 40, 80 un 160 μmol/L) citotoksiskā ietekme uz kaulu smadzeņu makrofāgu dzīvotspēju tika pārbaudīta, izmantojot šūnu skaitīšanas komplekta{10}} testa komplektu. Tika veikta pret tartrātu rezistenta skābes fosfatāzes krāsošana, lai novērotu dažādu koncentrāciju ietekmiCistanosīds Apar osteoblastu diferenciāciju un tika noteikta tās efektīvā intervences koncentrācija. Bija pozitīva kontroles grupa, Cistanoside A zemas, vidējas un lielas devas grupas (40, 80 un 160 μmol/L). Pēc šūnu pievienošanas tika pievienots 50 ng / ml RANKL, lai izraisītu osteoblastu diferenciāciju, un atbilstošā Cistanoside A deva tika pievienota attiecīgi Cistanoside A zemas, vidējas un lielas devas grupām. Lai noteiktuCistanoside A iedarbībauzosteoklastu veidošanās. Lai novērotu Cistanoside A ietekmi uz osteoklastu kaulu rezorbcijas funkciju, tika izmantota kaulu nobrāzuma šķēlumu krāsošana ar toluidīna zilo krāsu. JNK / MAPK ceļa augšup un lejup vērsto proteīnu ekspresija tika noteikta ar Western blot. Gēnu, kas saistīti ar osteoklastu diferenciāciju un kaulu rezorbcijas funkciju, piemēram, tartrātu rezistentās skābās fosfatāzes, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk un c-Fos, ekspresija tika noteikta ar RTqPCR. REZULTĀTI UN SECINĀJUMI: pret tartrātu rezistenta skābes fosfatāzes krāsošana, F-aktīna gredzena krāsošana un rezorbcijas bedres tests parādīja, ka Cistanoside A ievērojamiinhibēja RANKL izraisītu osteoklastu diferenciācijuunkaulu rezorbcijano devas atkarīgā veidā, salīdzinot ar pozitīvās kontroles grupu. RT-qPCR rezultāti parādīja, ka, salīdzinot ar pozitīvās kontroles grupu, gan lielas, gan mazas Cistanoside A devas grupas var ievērojami pazemināt tartrātu rezistentās skābes fosfatāzes, DC-STAMP, Nfatc-1, Ctsk un mRNS ekspresiju. c-Fos no devas atkarīgā veidā. Western blot testa rezultāti parādīja, ka lielas Cistanoside A devas grupa būtiski inhibēja p-JNK proteīna ekspresiju 10, 20, 30 un 60 minūšu laikā; salīdzinot ar pozitīvās kontroles grupu, Cistanoside A būtiski inhibēja Nfatc1 un c-Fos proteīnu ekspresiju atkarībā no devas. Noslēgumā jāsaka, ka Cistanosīds A varētu kavēt osteoklastu veidošanos un kaulu rezorbciju, samazinot p-JNK proteīna līmeni, kavējot MAPK ceļa aktivāciju un galveno gēnu ekspresiju osteoklastos.

Atslēgvārdi: Cistanosīds A; osteoklastu; MAPK; JNK; RANKL; RANK;osteoporoze; feniletanoīdu glikozīdi

CISTANCHE STRĀDĀ, LAI NOVĒRTĒTU OSTEOKLASTU DARBĪBU

0 Ievads Ievads

Epidemioloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka, pasaules iedzīvotāju skaitam pieaugot un novecojot, osteolītisko slimību, piemēram, osteoporozes un osteoartrīta, sastopamība turpinās pieaugt [1]. Pašreizējie pētījumi liecina, ka osteolītisko slimību patoģenēzē kaulu rezorbcijas un kaulu rekonstrukcijas nelīdzsvarotība, ko izraisa pārmērīga osteoklastu funkcijas aktivizēšanās, izraisīs ievērojamu kaulu tilpuma, kaulu blīvuma un kaulu mikrostruktūras samazināšanos. Kaitīga stāvokļa pasliktināšanās, palielina kaulu trauslumu un palielina lūzumu risku [2-3]. Tāpēc osteoklasti ir galvenais šūnu mērķis, lai identificētu un izstrādātu efektīvus līdzekļus osteoporozes ārstēšanai. Tomēr pašlaik plaši lietotajām zālēm, kas inhibē osteoklastus, piemēram, denosumabu (anti-RANKL antivielu), bisfosfonātus utt., ir tādas nevēlamas reakcijas kā nefrotoksicitāte, osteonekroze, endometrija vēža risks un žokļa osteonekroze [4-5 ]. Tāpēc ir ļoti klīniski svarīgi atrast jaunas zāles, kas var kavēt osteoklastu aktivitāti.

Osteoklastu diferenciācijas un kaulu rezorbcijas funkciju galvenokārt regulē divas signalizācijas molekulas, makrofāgu koloniju stimulējošais faktors un kodolfaktora κB liganda (RANKL) receptoru aktivators [6]. Koloniju stimulējošā faktora 1 receptors (c-fms) uz osteoklastu prekursoru šūnu membrānas saistās ar makrofāgu koloniju stimulējošu faktoru un veicina kodolfaktora kappa B (RANK) receptoru aktivatora ekspresiju. RANKL un RANK saistīšanās uz šūnas virsmas aktivizē tādus transkripcijas faktorus kā kodolfaktors κB, JNK, p38 un JNK, kas savukārt aktivizē transkripcijas faktoru c-Fos, aktivēto T šūnu kodolfaktoru c1 (Nfatc1) utt. kodols, aktivizējot kaulu prekursoru šūnu iznīcināšanu, veidojas daudzkodolu šūnas un galu galā diferencējas par osteoklastiem [7-9].

Cistanche deserticolair viens no klīniskajā praksē visbiežāk izmantotajiem ķīniešu medicīnas materiāliem. Tas ir Orobanchiaceae auga Cistanche deserticola vai Cistanche tuberosum kaltēts gaļīgs kāts ar zvīņainām lapām [10]. Tradicionālā medicīna uzskata, ka Cistanche deserticola pēc būtības ir silta, pēc garšas salda un sāļa, un tā atgriežas nierēs un resnās zarnas meridiānos. Tas baro nieres jaņ, papildina esenci un asinis, mitrina zarnas un caureju, un to lieto, lai ārstētu impotenci, neauglību, muskuļus un kaulus, ko izraisa nepietiekams nieru jaņ un esences un asins trūkums. Tādas slimības kā nespēks atbilst aknu un nieru tonizējošām ārstēšanas metodēm, ko tradicionālajā medicīnā izmanto osteolītisko slimību ārstēšanā. Farmakoloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka Cistanche deserticola galvenā aktīvā sastāvdaļa ir feniletanoīdu glikozīdi, kam ir laba drošība un plašas ārstnieciskas funkcijas [11]. Cistanosīds A (molekulārā formula: C36H48O20) ir dabisks feniletanola glikozīda savienojums, kas izolēts un attīrīts no tradicionālās ķīniešu medicīnas Cistanche deserticola. Tam ir pretiekaisuma, antioksidanta un pretaudzēju iedarbība [12-14]. Pētījumi liecina, ka Cistanche deserticola A var samazināt c-Fos līmeni peļu primārajās šūnās ar etanola izraisītu akūtu aknu bojājumu [15]. Citi pētījumi ir parādījuši, ka Cistanche A var uzlabot trabekulāro kaulu strukturālos parametrus pelēm ar olnīcu izņemšanu ar osteoporozi, izmantojot ar RANKL/TNF receptoriem saistītā 6. faktora (TRAF6) ceļu [16]. Tomēr trūkst turpmāku pētījumu par Cistancheside A ietekmi uz osteoklastu diferenciāciju un potenciālajiem molekulārajiem mehānismiem. Šī pētījuma mērķis ir izpētīt Cistancheside A ietekmi uz osteoklastu diferenciāciju un kaulu rezorbcijas funkciju in vitro un iespējamos molekulāros mehānismus, lai noskaidrotu jaunas potenciālās zāles osteoklastu diferenciācijas inhibēšanai.

1 Materiāli un metodes Materiāli un metodes

1.1 Dizains

In vitro šūnu eksperimentiem tika veikts t-tests un vienvirziena ANOVA.

1.2. Laiks un vieta

Pabeigts no 2022. gada decembra līdz 2023. gada decembrim Šaņsji Medicīnas universitātes otrās slimnīcas Kaulu un mīksto audu traumu labošanas laboratorijā.

1.3 Materiāli

1.3.1. Izmēģinājuma dzīvnieki

SPF pakāpes 4-nedēļu vecas C57BL/6 peles, tēviņi vai mātītes, tika iegādātas no Šaņsji Medicīnas universitātes Eksperimentālo dzīvnieku centra, ražošanas licences numurs: SCXK (Jin) 2019-0004. Eksperimentālās peles tika turētas standarta vidē: istabas temperatūra 26 grādi, mitrums aptuveni 55%, gaismas iedarbība 12 stundas dienā, brīva kustība un patstāvīga ēšana. Eksperimentālo protokolu apstiprināja Šaņsji Medicīnas universitātes otrās slimnīcas Eksperimentālo dzīvnieku labturības un ētikas komiteja (apstiprinājuma Nr.: DW2023031).

1.3.2. Reaģenti un zāles

Cistancheside A (tīrības pakāpe 98%, CAS 93236-42-1) tika iegādāta no Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; liellopu augļa serums un MEM barotne ar augstu glikozes saturu tika iegādāta no ASV uzņēmuma HyClone Company; tripsīna-EDTA gremošanas šķīdums 0,25%, sarkano asins šūnu līzes šķīdums, 1 × PBS, penicilīna-streptomicīna maisījums (x 100), toluidīna zilās krāsošanas šķīdums (1/100, borāta metode), ar rodamīnu iezīmēts faloidīns gredzens

Peptīds (kat. Nr. CA1610) un DAPI traips (gatavs lietošanai) tika iegādāts no Beijing Solebao Technology Co., Ltd., un peles rekombinantais makrofāgu koloniju stimulējošais faktors un peles rekombinantā audzēja nekrozes faktora ligandu virsģimene RANKL tika iegādāta no uzņēmuma. Beijing Ze Xiyuan Biotechnology Co., Ltd.; CCK-8 komplekts tika iegādāts no MCE Company of the United States, tartarte rezistents skābās fosfatāzes (TRAP) krāsošanas komplekts tika iegādāts no Sigma-Aldrich Company of United States, RNAiso Plus, Premiksa tipa reversās transkripcijas reaģenti, TB Green®. Ātra qPCR sajaukšana,

Prime Script TM RT Master Mix un Trizol tika iegādāti no Takara Company Amerikas Savienotajās Valstīs; dendritisko šūnu specifiskās transmembrānas olbaltumvielas (DC-STAMP), TRAP, CTSK, c-Fos, NFATc-1 specifiskie PCR grunti tika iegādāti no Sangon Bioengineering (Shanghai) Co., Ltd.; -aktīna antiviela, c-Fos antiviela, Nfatc1 antiviela, JNK antiviela un p-JNK antiviela, m-IgG Fc BP-HRP tika iegādātas no Santakrusas, ASV.

Biotehnoloģiju korporācija.

1.4.6. Kaulu rezorbcijas eksperiments, lai pārbaudītu osteoklastu kaulu rezorbcijas spēju

Kaulu smadzeņu makrofāgi tika iesēti 96-iedobes plāksnē ar iepriekš ievietotām sterilizētām liellopu kaulu šķēlītēm ar blīvumu 7 × 103 iedobē. Katrai iedobei pievienoja 100 μL barotnes un sadalīja pozitīvās kontroles grupā un Cistanche A mazās devās. grupai (40 μmol/L) un Cistancheside A lielas devas grupai (160 μmol/L), katra grupa bija aprīkota ar 5 vairākiem caurumiem, no kuriem 3 caurumi tika ievietoti ar liellopu kaulu šķēlēm, bet pārējās 2 vairākas atveres tika izmantotas. novērot kaulu smadzeņu makrofāgu ekspresiju. Adhezīvu un osteoklastu veidošanās. Pēc šūnu pielipšanas pozitīvās kontroles grupa un cistancēs

Visām grupām tika pievienots RANKL ar 50 ng/ml, lai izraisītu osteoklastu diferenciāciju. Cistancheside A zemas un lielas devas grupām tika pievienotas attiecīgi 40 μmol/L vai 160 μmol/L Cistancheside A intervencei, un barotne tika mainīta ik pēc 48 stundām. Pēc 14 dienu kultivēšanas izņemiet liellopu kaulu šķēles, divas reizes nomazgājiet kaulu šķēles ar PBS, pievienojiet 70% izopropilspirtu un 15 minūtes ar jaudīgu ultraskaņas tīrīšanu, lai nomazgātu atlikušās šūnas, pievienojiet toluidīna zilo (1%, izšķīdinātu). ūdenī) krāsvielu šķīdumā un krāsojiet istabas temperatūrā 2 sekundes. Pēc 1 minūtes noskalojiet kaulu fragmentus ar divreiz destilētu ūdeni, lai noņemtu atlikušās krāsas. Krāsotās kaulu šķēles tika novērotas un fotografētas, izmantojot stereomikroskopu, un kaulu rezorbcijas spraugu laukums tika skaitīts, izmantojot Image J programmatūru.

1.4.7. RT-PCR

Lai noteiktu intracelulāro kaulu rezorbcijas funkciju un ar osteoklastiem saistītu gēnu ekspresiju, kaulu smadzeņu makrofāgi tika iesēti 6-iedobes plāksnē 1,5 × 105/iedobē, un katrai iedobei pievienoja 100 μL barotnes. sadalīta pozitīvās kontroles grupā, Cistanche A mazo devu grupā (40 μmol/L) un Cistancheside A lielas devas grupā (160 μmol/L). Gan pozitīvās kontroles grupai, gan Cistancheside A grupai tika pievienots 50 ng/ml RANKL induktors.

Lai izraisītu osteoklastu diferenciāciju, 40 μmol / l vai 160 μmol / l Cistancheside A tika pievienots attiecīgi zemas un lielas Cistancheside A devas grupām intervencei. Barotne tika mainīta ik pēc 48 stundām. Novērošana tika veikta apgrieztā mikroskopā trīs vai četras dienas pēc indukcijas. Mikroskopā tika novērots, ka kaulu smadzeņu makrofāgi tikko bija saplūduši. Pievienojiet TRIzol, lai lizētu šūnas, pievienojiet hloroformu, novietojiet uz ledus 10 minūtes un izvelciet maisījumu.

1,5 ml EP mēģenēs pievienojiet 200 μL hloroforma katrai mēģenei, krata 15 s, pēc tam ļaujiet nostāvēties uz ledus 15 minūtes, centrifugējiet 4 grādos, 12 000 apgr./min 10 min., paņemiet supernatantu, pievienojiet vienādu daudzumu izopropilspirta un novieto uz ledus. Ļaujiet nostāvēties 10 minūtes, izmetiet supernatantu, centrifugējiet 4 grādos pie 120, 000 apgr./min, mazgājiet ar 75% etanola šķīdumu ar tilpuma daļu sterila fermentu nesaturoša ūdens un žāvējiet gaisā, lai iegūtu kopējā RNS. Izmantojiet Prime ScriptTMRT Master mix reversās transkripcijas komplektu, lai konfigurētu 20 μL sistēmu reversajai transkripcijai, lai sintezētu cDNS. Pēc tam konfigurējiet PCR darba sistēmu saskaņā ar komplekta instrukcijām un veiciet noteikšanu fluorescences kvantitatīvā PCR instrumentā. PCR reakcijas apstākļi bija šādi: iepriekšēja denaturācija 95 grādu temperatūrā 5 minūtes; denaturēšana 95 grādos 10 sekundes, atkausēšana un pagarināšana 60 grādos 30 sekundes, kopā 40 cikli. Praimeru secība ir parādīta 1. tabulā.

Pēc vienkāršās -MEN barotnes pievienošanas un badošanās 3 stundas, Cistancheside A grupa tika pievienota arī ar 160 μmol/L Cistancheside A intervencei. Pēc bada beigām katrai grupai stimulēšanai pievienoja 100 ng/ml RANKL. Stimulācijas laiki bija attiecīgi 0, 10, 20, 30 un 60 minūtes. Pēc stimulācijas laika beigām barotne tika izmesta un trīs reizes mazgāta ar iepriekš atdzesētu 1 × PBS. Ekstrahētie proteīni tika izmantoti, lai noteiktu p-JNK, JNK un -aktīna proteīnu ekspresiju.

Kad proteīna ekstrakcija ir pabeigta, izmantojiet gēla elektroforēzi, lai atdalītu proteīnu un pārnestu to uz PVDF membrānu. Pievienojiet 5% liellopu seruma albumīna (BSA), lai bloķētu 4 grādu temperatūrā 1 stundu. Izmetiet bloķējošo šķīdumu, 3 reizes mazgājiet membrānu ar TBST buferšķīdumu un pievienojiet primāro antivielu. (Nfatc1 antiviela 1: 1000, c-Fos antiviela 1: 1000, p-JNK antiviela 1: 1000, JNK antiviela 1: 1000, -aktīna antiviela 1: 1000), inkubēt 4 grādu temperatūrā 14-16 h, mazgāt membrānu 3 reizes ar TBST buferšķīdumu, pievieno sekundāro antivielu (m-IgG Fc BP-HRP, atšķaidīšanas attiecība 1:5000), inkubē istabas temperatūrā 2 stundas, pievieno fluorescējošu šķīdumu pēc mazgāšanas un attīsta zem gēla attēlveidošanas sistēmas, Image Lab Programmatūra analizē iegūto joslu pelēko vērtību un izmanto -actin kā iekšējo atsauci, lai aprēķinātu mērķa proteīna relatīvo ekspresiju.

1.5. Galvenie novērojumu rādītāji

① RANKL izraisītas osteoklastu diferenciācijas rezultāti pēc Cistanhesīda A iejaukšanās; ② Aktīna gredzenu veidošanās uz osteoklastu virsmas un izmaiņas osteoklastu kaulu rezorbcijas funkcijā pēc Cistancheside A iejaukšanās; ③ Osteoklastu atslēga pēc Cistanhesīda A iejaukšanās Gēnu ekspresija; ④ JNK / mitogēnu aktivētās proteīna kināzes (MAPK) ceļa un p-JNK proteīna pakārtoto proteīnu ekspresija pēc Cistancheside A iejaukšanās.

1.6. Statistiskā analīze

GraphPad Prism 9 programmatūra tika izmantota statistikas analīzei un zīmēšanai. Visi dati tika izteikti kā x-±s. Salīdzināšanai starp grupām tika izvēlēts t tests un vienvirziena dispersijas analīze. P < 0.05 tika definēta kā būtiska atšķirība. Šī raksta statistikas metodes ir izstrādājis Shanxi Medicīnas universitātes Statistikas departaments.

Mājas apskats.