Skaidra nieru attēlveidošana un kvantitatīva noteikšana 3D formātā

edmund.chen@wecistanche.com

Gadu desmitiem, mērījumi nonieresmikroanatomija, izmantojot 2-dimensiju sadaļas, ir sniegusi mums detalizētas zināšanas par nieres morfoloģija fizioloģiskos un patoloģiskos apstākļos. Tomēr straujā audu attīrīšanas metožu attīstība pēdējos gados kopā ar jaunu 3-dimensiju attēlveidošanas metožu attīstību ir sniegusi jaunu ieskatunieresstruktūra un funkcija. Šajā pārskata rakstā ir aprakstīta virkne jaunu ieskatunieresattīstība un slimības, kas nesen iegūtas, izmantojot šīs jaunās metodoloģiskās pieejas. Piemēram, jaunattīstībasnieresšīs pieejas ir sniegušas jaunas izpratnes par urīnizvadkanāla atzarojuma morfoģenēzi, nefrona cilmes šūnu proliferāciju un saistību, mijiedarbību starp urīnizvadkanāla galu šūnām un nefrona cilmes šūnām un nefronu segmentācijas izveidi. Veselai pieaugušai peleinieres, audu attīrīšana apvienojumā ar gaismas lokšņu mikroskopiju var attēlot un kvantificēt kopējo glomerulu skaitu, kas ir būtisks sasniegums šajā jomā. Līdzīgas pieejas ir sniegušas jaunu ieskatu nieru asinsvadu struktūrā un inervācijā, tubulointersticiālā remodelācijā, podocītu zudumā un hipertrofijā, cistu veidošanā, šūnu pusmēness evolūcijā un glomerulārās filtrācijas barjeras struktūrā. Daudz vairāk sasniegumu izpratnēnieresvar sagaidīt bioloģiju un patoloģiju, jo vairāk pētnieku izstrādā un pieņem papildu klīringa un attēlveidošanas metodes.

Atslēgvārdi:3D attēlveidošana; glomeruls; nieru attīstība; nefropatoloģija; audu attīrīšana; kanāliņi; nieru

CISTANCHE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU

Kopējais nefronu skaits katrā normālā cilvēkānieressvārstās no aptuveni 200,000 līdz vairāk nekā 2 miljoniem, 1 vidēji aptuveni 1 miljons. Šie nefroni, kā arī citas sastāvdaļasnierestostarp savākšanas kanāli, asinsvadi, intersticiācijas un nervu šķiedras ir sakārtotas ar izsmalcinātu mikroanatomisku precizitāti. 2 Šis precīzais raksts ir normas pamatānieru darbībaun veselība, kas var tikt nopietni traucēta, ja audu arhitektūra tiek mainīta glomerulārās vai tubulārās hipertrofijas vai saraušanās, nefronu zuduma, iedzimtu anomāliju, asinsvadu retināšanas un intersticiālas fibrozes dēļ. Vairākas attēlveidošanas pieejas ir veicinājušas mūsu visaptverošo izpratni parnieresmikroanatomija attīstības laikā un veseliem un slimiem pieaugušajiemnieres. Lielākoties šī izpratne ir iegūta, analizējot 2-dimensiju (2D) sekcijas neatkarīgi no tā, vai tās ir gaismas vai elektronu mikroskopiskas fizikālas sekcijas vai konfokālas optiskas sekcijas. Šīs mikroanatomijas kvantitatīvā noteikšana galvenokārt ir bijusi atkarīga no sekciju stereoloģiskajām analīzēm, kas ir sniegušas glomerulu, kanāliņu, asinsvadu, intersticiju un to šūnu komponentu skaita, garuma, virsmas laukumu un tilpumu aplēses. 3,4 Vēl nesen 3D vizualizācijanieresmikrostruktūra lielā mērā aprobežojās ar konfokālo mikroskopiju, kas ļauj veikt optisku griezumu un 3D rekonstrukciju līdz 50 līdz 80 m m dziļumam. Diemžēl proteīnu un lipīdu komponentu refrakcijas īpašības audos izkliedē gaismu un dramatiski samazina attēla kvalitāti, palielinoties dziļumam. Pēdējos gados ir izstrādāta virkne tīrīšanas metožu, lai noņemtu lipīdu un pigmenta saturu audos un saskaņotu audu un montāžas materiālu refrakcijas īpašības, lai padarītu audus caurspīdīgus. 5 Tīrīšanas metodes ir dažādas sarežģītības, sākot no audu inkubācijas dažādos šķīdumos stundu laikā līdz ilgstošām procedūrām, kas ietver pielāgotu elektroķīmisko aprīkojumu. Mēs novirzām lasītājus uz jaunākajiem pārskatiem 5,6, lai iegūtu detalizētu pārskatu par pašreizējām metodēm, un šeit citētajiem dokumentiem par konkrētām metodēm un lietošanas gadījumiem.

Subcelulāras struktūras un veselas šūnu populācijas var izdalīt veselos orgānos vai biezās daļās. Lai iegūtu precīzas attēlveidošanas funkcijas notīrītos audos, ir nepieciešami specializēti mikroskopi un attēlu apstrāde, lai iegūtu un rekonstruētu tilpuma datus no paraugiem, kuru izmērs var būt no simtiem mikronu līdz centimetriem. Punktu skenēšanas un griežamā diska konfokālie mikroskopi ir efektīvi izmantoti, lai attēlotu funkcijas notīrītajā zonānieresaudi, bet cieš no samazinātas izšķirtspējas Z asī un pakāpeniskas fluorescences intensitātes samazināšanās dziļumā vienas apgaismojuma un attēlveidošanas ass dēļ. Gaismas lokšņu mikroskopijas metodes ir īpaši piemērotas notīrītu audu attēlveidošanai, jo tās ļauj ātri iegūt lielus 3D apjomus un var ietvert vairāku leņķu apgaismojumu un attēlveidošanu. Optiskās projekcijas tomogrāfija ir vēl viena pieeja, kas ietver vairāku leņķu attēlveidošanu un digitālo rekonstrukciju, lai iegūtu datus, kuros katra vokseļa X, Y un Z asis ir vienādas izšķirtspējas. Neatkarīgi no konkrētās pieejas audu attīrīšana un visa attēlveidošana sniedz jaunu iespēju izpētīt neatklātas šūnu mikrovides un augstākas kārtas audu struktūru. Šajā pārskatā mēs izceļam dažus jaunus ieskatusnieresattīstība, pieaugušaisnieresstruktūra un patoloģija, kas radusies audu attīrīšanas rezultātā, kam seko 3D kvantitatīvā analīze.

Jauni ieskati nieru attīstībāGadu desmitiem gēnu ekspresijas profilēšanas un izslēgšanas pētījumi ir devuši detalizētu izpratni par šūnu veidiem, gēnu regulēšanas tīkliem un signalizācijas ceļiem, kas kontrolē zīdītājus.nieresattīstību. Šīs zināšanas palīdzēja diagnosticēt iedzimtas slimības un ļāva ražotnieresšūnu tipi no pluripotentām cilmes šūnām. 7 Tomēr izstrādes lielums, necaurredzamība un sarežģītībanieresradīja būtisku šķērsli, lai precīzi izmērītu šī orgāna morfoģenēzi un šūnu un olbaltumvielu 3D sadalījumu tajā. Audu attīrīšanas un daudzpakāpju attēlveidošanas pielietošananieresir ļāvusi vizualizēt un kvantitatīvi analīzi par urīnizvadkanāla atzarojuma morfoģenēzi, cilmes šūnu populācijām un nefronu bagātību neskartos orgānos (1. attēls). 8 Šīs pieejas ir pamatā jaunai precīzai fenotipu noteikšanai un atvērtiem ceļiem, lai analizētu šūnu un molekulāros virzītājspēkus.nieresattīstība un iedzimtas slimības.

Attēlveidošana un atzarojuma morfoģenēzes analīze 3D formātā.Urētera koka izveidošanās ir noteicošā pazīmenieresattīstību un ir plaši pētīts, izmantojot peles ģenētiku un saplacinātsniereseksplantācijas kultūras. Tomēr, lai saprastu, kā atsevišķi gēni veicina šīs sazarotās epitēlija kanāla struktūras augšanu, formu un modelēšanu in vivo, bija nepieciešama spēja attēlot un analizēt šo sarežģīto tīklu plašā paraugu lieluma diapazonā. Short et al. 8 risināja šos jautājumus, izmantojot visa stiprinājuma imunofluorescenci, uz šķīdinātāju balstītu tīrīšanu (benzilspirta benzilbenzoātu) un veselu orgānu attēlveidošanu ar optiskās projekcijas tomogrāfiju. Izmantojot šo pieeju, lai uzņemtu 3D momentuzņēmumus no sākuma līdz vidumnieresizstrāde, komanda izstrādāja pielāgotu analīzes programmatūru, lai iegūtu nepieredzētu informāciju par urīnizvadkanāla koku, ieskaitot galu skaitu, zaru leņķus un garumu, zaru apjomu un zarojuma paaudžu skaitu no neskartiem urīnvada kokiem (1.c un d attēls). 8 Sākotnēji izmantoja, lai raksturotu un identificētu jaunus nieru atzarojuma aspektus, 9,10 notiekošie centieni cenšas definēt principus un galvenos regulatorus, kas regulē zaru veidošanu in vivo. 1

Priekšteču dinamikas sasaiste ar orgānu morfoģenēzi ar daudzpakāpju attēlveidošanu.Molekulārajai mijiedarbībai starp urēteriktipu šūnām un nefrona cilmes šūnām ir liela nozīme, veidojot nefronu komplementu, kas veicinanieru darbībapieaugušo dzīvē. Neinducēti nefronu priekšteči rada faktorus, kas veicinanieresaugšana caur urētera atzarojumu, kamēr telpiski ierobežotas norādes urētera galā gan uztur nefrona priekšteču stāvokli, gan inducē šo priekšteču apakškopu diferencēties par agrīnu nefronu. Šīs mijiedarbības virza sazarošanās un nefronu indukcijas ciklu, kas beidzas dzimšanas laikā, kad atlikušie nefrona priekšteči diferencējas. Pirms audu attīrīšanas metodēm mūsu izpratne par dinamikunieresmorfoģenēze un cilmes šūnu populāciju relatīvais daudzums laika gaitā bija stipri ierobežots. Tas mainījās, attīstot daudzpakāpju attēlveidošanas metodes, izmantojot paplašinātus imunofluorescences protokolus, audu attīrīšanu un attēlveidošanas metodes, lai noteiktu kvantitatīvos rādītājus.nieresattīstība šūnu (konfokālā) un visa orgāna līmenī (optiskās projekcijas tomogrāfija, gaismas loksne). 9,10 Kļuva skaidrs, ka likmesnieresaugšana krasi atšķiras ar sākotnēji strauju sazarojumu un proliferācijas ātrumu, kas samazinās fāzēs, kas korelē ar cilmes šūnu skaita samazināšanos nefrogēnajā nišā. 10 Notīrīta visa cilvēka augļa trīsdimensiju konfokālā attēlveidošananieres(11. nedēļa) vai paraugus nonieresgaroza (11.–23. nedēļa) apstiprina, ka šis nišas lieluma samazinājums saglabājas visās sugās. 12 Cilvēka un peles nefrogēnās nišas papildu salīdzinošā analīze attīrītos audos noveda pie jauna, uz laiku balstīta nefronu veidošanās vervēšanas modeļa, kurā cilmes šūnas tiek pakāpeniski pievienotas agrīnam nefronam un pieņem segmenta identitāti atbilstoši to ierašanās secībai. . 13 Citā pētījumā, kurā galvenā uzmanība tika pievērsta nefrona priekšteču piesaistei, tika izmantota uz hidrogēlu balstīta audu attīrīšanas metode (pasīvā, ar skaidru lipīdu apmainīta akrilamīda hibridizēta cietā attēlveidošana/imūnkrāsošana/ar in situ hibridizāciju saderīgs audu hidrogels [CLARITY] 14 ). spēja saglabāt endogēnā tdTomato reportiera fluorescenci. TdTomato marķējuma analīze attīrītajos audos parādīja, ka šūnas agrīnā nefronā var atgriezties cilmes stāvoklī, kur iepriekšējie rezultāti liecināja, ka saistība bija vienvirziena. 15 Tādējādi audu attīrīšana ir uzlabojusi mūsu izpratni par dinamiskiem attīstības procesiem dažādās mērogos un sugās.

Precīza fenotipēšana. Sasniegumi audu attīrīšanā un kvantitatīvā analīzē ir nodrošinājuši jaunas iespējas precīzai fenotipu noteikšanai. Peļu modeļos ar smalkiem fenotipiem, piemēram, Ret þ/? un Six2 þ/? pelēm (2. attēls), kuras iepriekš tika klasificētas kā "normālas". 10,16 Notīrīta Wnt11 ?/? augstas izšķirtspējas konfokālā attēlveidošananieresidentificēja jaunu šūnu fenotipu, kurā nefronu priekšteči šķiet neorganizēti, jo nespēj veidot stabilus šūnu savienojumus ar urīnvada galu un priekšlaicīgi diferencēties. 17 Šīs metodes ir izmantotas arī, lai kvantitatīvi noteiktu, kā jaunie nefrona cilmes šūnu stāvokļa regulatori, piemēram, DNS metiltransferāze 1, mikroRNS Lin28 un Let7 un TSC1 ietekmē.nieresattīstība un nefronu skaits. 18–20 Precīza fenotipu noteikšana, visticamāk, kļūs par svarīgu instrumentu mūsu centienos izprast ģenētisko un vides faktoru aditīvo ietekmi, kas veicina zemu nefronu skaitu un noslieci uz hroniskām slimībām.nieru slimība.

Matemātiskā modelēšananieresmorfoģenēze. Dati tiek ražoti no notīrītās izstrādesnieresveicina uz attēliem balstītas matemātiskās modelēšanas vilni, kas mēģina noskaidrot, kā audu makroskopiskā forma un funkcija rodas no molekulārās mijiedarbības starp cilmes šūnu populācijām. 11,21–23 Turpmāka visu orgānu attēlveidošanas pielietošana attīrītos audos būs ļoti svarīga, lai izprastu 3D audu modelēšanas molekulāros un šūnu virzītājspēkus, un tas var būt galvenais, lai uzlabotu cilmes šūnu modeļu struktūru un precizitāti.nieres.

Pieauguša nieru 3D morfoloģija un patoloģijaPieaugušā cilvēka sarežģītā morfoloģijanieresierobežo 2D morfoloģisko rīku izmantošanu, jo tie var sniegt nepilnīgu vai maldinošu priekšstatu par 3D struktūru. Šeit mēs apspriežam dažus svarīgus metodoloģiskos sasniegumus pēdējos gados, kas tagad ļauj veikt spēcīgu pieaugušo struktūru 3D analīzi.nieres, sākot no neskartaniereslīdz pat glomerulārās filtrācijas barjeras sastāvdaļām (3. attēls). 2

CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru mazspēju

Nefrona skaits un izmērs.Cilvēksnieresuzrāda augstu nefronu skaita un tilpuma mainīgumu starp subjektiem un starp subjektiem, kas aprakstīts autopsijas pētījumos no subjektiem bez atklātasnieru slimības1,30,31, un tas ir saistīts ar attīstības traucējumiem. Gadu desmitiem zelta standarta instruments, lai kvantitatīvi noteiktu nefronu skaitu eksperimentālajos un cilvēku paraugos, ir bijusi disektora/frakcionēšanas metode, uz dizainu balstīta stereoloģiska metode. 3,4 Lai gan šī pieeja ir precīza un precīza, tā ir arī praktiska, laikietilpīga un prasa ievērojamu apmācību. Šī iemesla dēļ ir ierosinātas alternatīvas pieejas, lai izstrādātu efektīvas metodes, kas var nodrošināt augstas kvalitātes beigu punktus: 32 piemēram, optisko attīrīšanas metožu kombinācijas, tostarp hidrofobas (iepriekš zināmas kā uz šķīdinātāju bāzes), hidrofilas vai hidrogēla bāzes, ar uzlabotām metodēm. gaismas mikroskopija (piemēram, konfokāla, daudzfotonu vai gaismas loksne).

Cik mums zināms, pirmo ziņojumu, kurā tika apvienota optiskā klīringa un gaismas loksnes mikroskopija nefronu skaita un izmēra analīzei, publicēja Klingbergs et al. 24 nozīmīgā dokumentā, kurā bija vairāki svarīgi sasniegumi. Pirmkārt, šajā ziņojumā tika ieviests etilcinnamāts, nebīstams šķīdinātājs, kas varētu aizstāt toksiskas ķīmiskas vielas, piemēram, benzilspirtu – benzilbenzoātu, ko līdz tam regulāri izmantoja hidrofobos tīrīšanas protokolos. Otrkārt, pētnieki veica nefronu skaitīšanu neskartā pelēnieres in agresīvs un progresīvs imūnsistēmas modelisnieru slimība, identificējot nefronu zudumu slimības gaitā. Turklāt tika ieviesti nozīmīgi soļi ceļā uz attēlu segmentācijas algoritmu datorizētu automatizāciju, nodrošinot ceļu uz būtiskiem efektivitātes uzlabojumiem. Nesen Østergaard et al. 25 iepazīstināja ar līdzīgu hidrofobu attīrīšanas metodi, kas apvienota ar gaismas lokšņu mikroskopiju un automatizētu attēla segmentāciju, kas nodrošina gan kopējo nefronu skaitu, gan vienu glomerulāro tilpumu diabētiskās nefropātijas peles modelī. Turklāt šis pētījums parādīja elegantu proksimālo kanāliņu funkcionālo marķēšanu, izmantojot in vivo albumīna injekciju, lai vizualizētu glomerulāro tubulāro savienojumu un vienkāršu protokolu korelatīvai histopatoloģijai tajos pašos optiski notīrītajos paraugos. Šis ziņojums parāda šo protokolu elastību, kas kļūst par daudzslāņu cauruļvadiem visaptverošai audu profilēšanai.

Nieru asinsvadu sistēma un inervācija.Sekojot sazarotu asinsvadu vai nervu šķiedru pēdām pieaugušam cilvēkamnieres2D parastajā histoloģijā ir gandrīz neiespējami, jo orgāna lielums un strukturālā sadalījuma sarežģītība prasa plašu un ekspertu sērijveida sadalīšanu. Nesen Huang et al. 33 ziņoja par katjonu tuvu infrasarkano staru fluorescējošu krāsu (MHI148-PEI), lai īpaši marķētu asinsvadus, ko var kombinēt ar modificētu un paātrinātu attīrīšanas protokolu, kura pamatā ir etilcinnamāts, lai saīsinātu audu apstrādes laiku. Šī pieeja paver jaunus ceļus asinsvadu pētījumiemnieres,īpaši, ja nepieciešama augstas izšķirtspējas attēlveidošana 3D formātā. Līdzīgi Hasegawa et al. 26 izmantoja skaidrus netraucētus smadzeņu/ķermeņa attēlveidošanas kokteiļus un skaitļošanas analīzi (CUBIC) kopā ar īpaši izveidotu gaismas lokšņu mikroskopijas sistēmu, lai noteiktu simpātiskās inervācijas izplatību neskartā peles nierē. Simpātiskie nervi galvenokārt tika izplatīti ap artērijām. Pēc 10 dienu ilgas išēmijas vai reperfūzijas traumas simpātiskās inervācijas blīvums bija ievērojami samazināts, korelē ar samazinātu norepinefrīna līmeninieru audi. Šīs izmaiņas daļēji saglabājās 28 dienas pēc sākotnējās traumas, kas liecina, ka hroniskas slimības progresēšanas laikā var konstatēt nepārtrauktas simpātiskas izmaiņas.nieru slimība.

Tubulointersticiāla pārveidošana.Nieru kanāliņu sistēmu ir īpaši grūti analizēt 3D formātā. Sarežģītā un sarežģītā morfoloģija rada vairākas problēmas tradicionālajām metodēm, kuru pamatā ir sērijveida sadalīšana un standarta gaismas mikroskopija. Tomēr optiskā attīrīšana ļauj analizēt neskartus kanāliņus un to apkārtējo mikrovidi. Saritas et al. 34 veica hidrogēla bāzes un hidrofobiskas optiskās attīrīšanas kombināciju, kam sekoja uzlabota gaismas mikroskopija un pusautomātiska 3D analīze, lai raksturotu distālo cauruļveida remodelāciju uztura kālija trūkuma dēļ. Pētnieki kvantitatīvi noteica tubulāro hiperplāziju un atklāja proliferējošo šūnu palielināšanos tubulointerstitijā. Šajā pētījumā tika izmantota gan optiskā klīringa daudzpusība, gan

3. attēls| Trīsdimensiju (3D) morfometrija pieaugušo nierēs. a ) Nefronu skaitīšana veselās nierēs, izmantojot endotēlija šūnu CD31 marķēšanu. Panelī ir redzama 3D rekonstrukcija (pa kreisi), optiskā sadaļa divdimensiju (2D) skatā (vidū) un īpaši apgabali, kuros redzami atsevišķi glomeruli, salīdzinot gaismas lokšņu mikroskopiju (LSFM) un konfokālo un 2- fotonu (2P) mikroskopija. Pielāgots ar Amerikas Nefroloģijas biedrības atļauju, no Amerikas Nefroloģijas biedrības žurnāla, Pilnībā automatizēts kopējā glomerulārā skaita un kapilāru pušķu lieluma novērtējums nefrīta nierēs, izmantojot gaismas lapas mikroskopiju, Klingbergs A, Hasenbergs A, Ludvigs-Portugalls I u.c. ., 28. sējums, 2., 2. izdevums017; 24. b) Glomeruli izmēru noteikšana ar telpisko reģistrāciju — krāsu kodēšana atspoguļo glomerulu izmēru, kur sarkanais ir lielākais objekts, bet rozā - mazākais. Pielāgots ar Amerikas Nefroloģijas biedrības atļauju no Kidney360, Automated Image Analyzes of Glomerulary Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., 6. sējums, 6. izdevums , 2020; 25. c) Asinsvadu izsekošana un inervācija, kas ietver neskartas nieres 3D rekonstrukciju ar simpātisko nervu (zaļa), asinsvadu (fuksīna) un sapludināto (pa kreisi) imūnmarķējumu. Adaptēts no Kidney International, 96. sējums, 1. izdevums, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T u.c., Visaptveroša trīsdimensiju analīze (CUBIC-kidney) vizualizē patoloģiskus nieru simpātiskos nervus pēc išēmijas/reperfūzijas traumas, 129.–138. lpp. Autortiesības ª 2019, ar Starptautiskās nefroloģijas biedrības atļauju. 26 (d) Podocītu morfometrija atsevišķos glomerulos, izmantojot podocītu specifiskā marķiera p57 (zaļā krāsā) un DNS marķiera 4 0,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) imūnmarķējumu. Paneļi parāda (pa kreisi) 3D rekonstrukciju un (pa labi) renderētās virsmas. Pielāgots ar Amerikas Nefroloģijas biedrības atļauju, no Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., 27.sējums, 2016.gada 10.izdevums; 27. e) Šūnu dinamika, izmantojot ciltsrakstu izsekošanu, parādot podocītus (tālā pa kreisi), parietālās epitēlija šūnas (PEC), kas veido šūnu pusmēness 3D formātā (vidū ​​pa kreisi), 2D skats par iebrūkošajiem PEC glomerulārā puse ar asinsvadu traumu (vidū ​​pa labi) un cauruļveida izejas 2D vizualizācija (labajā pusē). Adaptēts no Kidney International, 96. sējums, 2. izdevums, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Jaunā 3D analīze, izmantojot optisko audu attīrīšanu, dokumentē peļu strauji progresējoša glomerulonefrīta attīstību, 505.–516. lpp., Autortiesības ª 2019, International Nefroloģijas biedrība saskaņā ar CC BY-NC-ND licenci (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Šķēluma diafragmas vizualizācija, palielinot palielinājumu no kreisās puses uz labo. Pielāgots no Kidney International, 99. sējums, 4. izdevums, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Ātrs un vienkāršs tīrīšanas un pietūkuma protokols nieru 3D in situ attēlveidošanai pāri skalām, 1010.–1020. lpp. , Autortiesības ª 2021, International Society of Nephrology, saskaņā ar CC BY-NC-ND licenci (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnēwww.kidney-international.org.

gaismas mikroskopija, lai veiktu cauruļveida analīzi neskartās nierēs, izmantojot hidrogēla iegulšanu un gaismas loksnes mikroskopiju, kā arī vienas šūnas kvantitatīvu noteikšanu nieru šķēlēs, izmantojot hidrofobu tīrīšanu un konfokālo mikroskopiju, jo katra kombinācija bija labāk piemērota konkrētajam pētījuma jautājumam. Optiskās klīringa un uzlabotas gaismas mikroskopijas kombinācijas izmantoja Tahaei et al. 35, kas raksturoja seksuālo dimorfismu distālā vītņotā kanāliņa garumā, kas var noteikt tā spēju pielāgoties fizioloģiskajam stresam, un Schuh et al. 36, kuri atklāja aksiālās atšķirības proksimālo kanāliņu ligandu uzņemšanā un endolizosomālajā funkcijā, uzsverot, ka S1 segments ir ļoti specializēts, lai reabsorbētu proteīnus, izmantojot receptoru mediētu endocitozi. Nesenā pētījumā Blanc et al. 2 analizēja cistu veidošanās modeli, parādot, ka cistas attīstījās tikai specifiskos nefronu segmentos, kas noteica to formu un atradās blakus normālām nedilatētajām kanāliņām. Kopumā mums tagad ir vairāki piemēri tiešai optiskā klīringa pielietošanai tubulointersticiālā nodalījuma sistemātiskai analīzei.

Podocītu zudums un hipertrofija.Glomeruls ir unikāls piemērs neskartu funkcionālo vienību analīzei orgānā. Jo īpaši podocītu izsīkuma izpēte ir guvusi tiešu labumu no šiem tehnoloģiskajiem sasniegumiem, jo ​​zelta standarta uz dizainu balstītās metodoloģijas prasa ievērojamus laika un resursu ieguldījumus. 37 Pirmais rīks neskartu peles glomerulu kombinētās imūnmarķēšanas 3D podocītu morfometriskajai analīzeinieresšķēles, izmantojot modificētu netiešās imūnfluoresces, hidrofobās optiskās attīrīšanas un konfokālās mikroskopijas protokolu, kas atviegloja kopējā podocītu skaita kvantitatīvo noteikšanu veselos atsevišķos zināma tilpuma glomerulos. Mēs uzskatām, ka šī pieeja ir ideāli piemērota tādu procesu izpētei, kas ietekmē noteiktu struktūru apakškopu (piemēram, podocītu zudums, kas izraisa fokālo un segmentālo glomerulosklerozi). 27 Tas pats paņēmiens vēlāk tika izmantots, lai raksturotu podocītu hipertrofijas lomu kā kompensējošu reakciju pēc podocītu zuduma, kas ir mehānisms, ko mediē rapamicīna signālu ceļa zīdītāju mērķis. 38 Lai gan šie 2 pētījumi bija vērsti uz glomerulāro podocītu analīzi, šo cauruļvadu, kas balstīts uz parasto imūno marķēšanu, var izmantot, lai raksturotu jebkura šūnu tipa morfoloģiskās izmaiņas ar augstu telpisko izšķirtspēju.

Šūnu pusmēness evolūcija.Vēl viens svarīgs rīks, kas bija veiksmīgi jāintegrē 3D rīku komplektānieresmorfometrija ir ģenētiskās līnijas izsekošana. Lielākajai daļai optisko attīrīšanas metožu ir tendence izraisīt noteiktu fluorescences slāpēšanas pakāpi (kas mainās no vieglas līdz smagai). 6 Mēs nesen iepazīstinājām ar protokolu, kas apvieno līnijas izsekošanu, optisko klīringu un daudzfotonu mikroskopiju, lai visaptveroši analizētu podocītu zudumu un parietālo epitēlija šūnu aktivāciju. 28 Šajā pētījumā podocītu zudums tika identificēts kā eksperimentālā pusmēness nefrīta iezīme, izmantojot podocītu metabolisma marķēšanu ar pastiprinātu zaļo fluorescējošo proteīnu. Šūnu pusmēness evolūcija tika vizualizēta un kvantitatīvi noteikta, pamatojoties uz parietālo epitēlija šūnu proliferāciju un migrāciju, kuras arī iezīmēja pastiprināts zaļais fluorescējošais proteīns un tika izsekotas pusmēness nefrīta eksperimentālā modeļa laikā. Neskartu glomerulu analīze ļāva identificēt fokusa podocītu zudumu un bojājumu veidošanos, kas progresēja līdz cauruļveida oklūzijai ar parietālās epitēlija šūnām, izraisot atubulāru glomerulu veidošanos. Šis pētījums paver ceļu turpmākiem pētījumiem par sarežģītu imūno epitēlija mijiedarbību neskartā vidēnieres.

CISTANCHE UZLABOS NIeru/NIeru DIALĪZI

Glomerulārās filtrācijas barjera.Svarīgs diagnostikas instruments glomerulāro slimību regulārai novērtēšanai ir nieru biopsiju ultrastrukturālā analīze ar elektronu mikroskopiju. Alternatīvu elektronu mikroskopijai var atrast izplešanās mikroskopijas jomā, kuras mērķis pēc definīcijas ir palielināt optisko izšķirtspēju, palielinot audu izmērus. Gadu gaitā Unnersjo-Jess et al. 39,40 ir nodrošinājuši vairākus protokolus nanomēroga struktūru vizualizācijainieres.Nesen šie pētnieki ziņoja par ātru un vienkāršu procedūru 3D vizualizācijainieresmorfoloģija, apvienojot optiskās attīrīšanas un audu paplašināšanas koncepcijas, lai atrisinātu nanomēroga struktūras, izmantojot parasto konfokālo mikroskopiju. 29 Šis protokols tika izmantots, lai vizualizētu un kvantitatīvi noteiktu vairākas patoloģiskas pazīmes pelēm un cilvēkiemnieresbiopsijas, tostarp pēdas procesa izsvīdums, glomerulārās bazālās membrānas izmaiņas, spraugas diafragmas garums, IgG nogulsnes un klasiskās patoloģijas pazīmes (piemēram, glomeruloskleroze, tubulointersticiāla fibroze un tubulārā atrofija). Kopumā šī metode ļauj vizualizēt un kvantitatīvi noteikt nieru patoloģiju, izmantojot vienkāršu metodi un pieejamus attēlu analīzes rīkus. Šīs pieejas mērogojamību un ieviešanu klīniskajā praksē, visticamāk, noteiks nepieciešamība pēc uzlabotas gaismas mikroskopijas iekārtas un automatizētu attēlu analīzes rīku izstrāde.

Secinājums

Pašreizējais audu attīrīšanas metožu spektrs ietver vienkāršas metodes, kuras var ieviest lielākajā daļā laboratoriju, lai uzlabotu 3D attēlveidošanu plaši pieejamos mikroskopos. Tā kā šo jauno pieeju sniegtās iespējas kļūst acīmredzamas, mēs paredzam specializētu mikroskopijas sistēmu plašāku ieviešanu, lai efektīvi attēlotu notīrītus audus ar augstu izšķirtspēju, kā arī izstrādātu pielāgotu pētījumu un klīniskās darbplūsmas konkrētu jautājumu risināšanai. Neirozinātnes joma ir kalpojusi par izmēģināto audu attēlveidošanas metožu un lietojumu testēšanas vietu. Šajā kontekstā ir izstrādāta automatizēta attēlu analīze, jaunas pieejas šūnu savienojamības pētīšanai un audu mēroga gēnu un olbaltumvielu ekspresijas atlanta projekti. Iespējams, ka līdzīgas pieejas sniegs jaunu ieskatu šūnu anatomijā un šūnu populāciju savstarpējā atkarībā jaunattīstības un pieaugušā vecumā.nieres.

Šo sasniegumu praktiskie ierobežojumi ietver attēlveidošanas aparatūras izmaksas un grūtības ar lielu datu kopu apstrādi, uzglabāšanu un analīzi. Citi ierobežojumi rodas tāpēc, ka krāsojums nav reproducējams ar audiem, kurus dažādi ietekmē fiksācijas apstākļi un antivielu marķējums. Tā rezultātā ir nepieciešams kritiski novērtēt jaunas 3D analīzes un salīdzināt tās ar iedibinātajām metodēm. Neskatoties uz iespaidīgajiem sasniegumiem novērtēšanānieresattīstībai un pieaugušajamnieresstruktūra un slimība, kas izcelta šajā pārskatā, mēs uzskatām, ka vislabākā audu attīrīšana un 3D attēlveidošana vēl tikai priekšā un, visticamāk, būs aizraujoša izaugsmes jomanierespētniecība nākamajiem gadu desmitiem.