Visaptveroša augļa un perinatālā cilvēka augļa šķidruma cilmes šūnu sekrēciju preparātu profilēšana 1. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstract:Mēs iepriekš ziņojām, ka no c-KIT plus htaman amnija šķidruma iegūtās cilmes šūnas, kas iegūtas no rutīnas Ⅱ trimestra pirmsdzemdību diagnostikas (augļa hAFS) atlikušajiem paraugiem, ir apveltītas ar reģeneratīvu parakrīna potenciālu, kas veicina izdzīvošanu, antifibrotisku un proliferatīvu iedarbību. var tikt izolēti arī no III trimestra klīnisko atkritumu paraugiem plānoto C sekciju laikā (perinatālā hAFS), tādējādi piedāvājot vieglāk pieejamu alternatīvu, salīdzinot ar augļa hAFS. Tomēr ir maz zināms par perinatālās hAFS parakrīna profilu. Šeit mēs sniedzam detalizētu hAFS kopējā sekrēcijas (ti, visu šķīstošo parakrīno faktoru, ko šūnas atbrīvo kondicionētā barotnē, hAFS-CM) un ekstracelulāro pūslīšu raksturojumu. hAFS-EV) tajā, no Ⅱ trimestra augļa pret III trimestra perinatālajām šūnām. Augļa un perinatālās hAFS tika raksturotas un pakļautas hipoksiskai sagatavošanai, lai uzlabotu to parakrīno potenciālu. hAFS-CM un hAFS-EV preparāti tika analizēti attiecībā uz olbaltumvielu un kemokīnu / citokīnu saturu, un EV krava tika tālāk pētīta, veicot RNS sekvencēšanu. Augļa un perinatālā hAFS fenotips kopā ar atbilstošajiem sekrēcijas preparātiem pārklājās; tomēr augļa hAFS uzrādīja nenobriedušu oksidatīvās fosforilācijas aktivitāti, salīdzinot ar perinatālajām. Viņu parakrīnas kravas profilēšana atklāja dažas atšķirības atkarībā no gestācijas stadijas un hipoksiskās sagatavošanas. Abi šūnu avoti nodrošināja preparātus, kas bagātināti ar neirotrofiskiem, imūnmodulējošiem, antifibrotiskiem un endotēlija stimulējošiem faktoriem, un nenobriedušu augļa hAFS sekrēciju noteica izteiktāks vaskulogēns, reģeneratīvs, atrisināšanas un pretnovecošanās profils. Neliela RNS profilēšana parādīja mikroRNS bagātināšanos gan augļa, gan perinatālās hAFS-EV kravā ar stabili izteiktu pro-resolving kodolu kā atsauces molekulāro parakstu. Šeit mēs apstiprinām, ka hAFS ir pievilcīgs reģeneratīvo parakrīno faktoru avots; augļa vai perinatālās hAFS sekrēcijas preparātu izvēle turpmākai parakrīnai terapijai ir jāizvērtē, ņemot vērā konkrēto klīnisko scenāriju.

Atslēgvārdi:amnija šķidrums; cilmes šūnas; parakrīna iedarbība; ārpusšūnu pūslīši; šūnu kondicionēta barotne; ķemokīns; citokīni; proteomika; RNS sekvencēšana; mikroRNS

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

1. Ievads

Reģeneratīvā medicīna nesen ir attīstījusies kā jauna joma, kas nodrošina ievainoto audu funkcionālu atjaunošanu, izmantojot vairākas stratēģijas. Tā kā pēdējos gados audu inženierijas pieejas ir ievērojami attīstījušās, cilmes šūnu parakrīna ietekmes izpēte vienlaikus ir kļuvusi arvien intensīvāka. Ir pierādīts, ka transplantēto cilmes šūnu terapeitisko potenciālu galvenokārt nosaka to izdalītie šķīstošie faktori, kas var organizēt pro-reģeneratīvu mikrovidi saimnieka audos, vienlaikus izraisot endogēno funkcionālās atveseļošanās mehānismu aktivizēšanu [1, 2]. Tāpēc vairākos neatkarīgos preklīniskos pētījumos, kas vērsti uz sirds un asinsvadu, neiroloģiskiem un/vai iekaisumiem, cilmes šūnu sekrēcija izdala visas šūnās atbrīvotās parakrīnās trofiskās molekulas, kā arī ar membrānām saistītās ekstracelulārās pūslīši ir arvien vairāk ierosināti kā inovatīvs terapijas līdzeklis. slimība. Attiecīgi cilmes šūnas var uzskatīt par bioloģiskām rūpnīcām to terapeitiskās sekrēcijas izmantošanai, piedāvājot lietošanai gatavu un reģeneratīvu ārstēšanu. Izmantojot šādu uz šūnām balstītu, bet bez šūnām stratēģiju, var pārvarēt daudzus ierobežojošus aspektus, kas saistīti ar kanonisko šūnu terapiju, vienlaikus nodrošinot labvēlīgu ietekmi.kas ir cistancheŠajā perspektīvā mezenhimālās stromas šūnas (MSC) ir plaši pārbaudītas kā iespējamās šūnu kandidātes? Patiešām, MSC un cilmes / cilmes šūnas ir izstrādātas un/vai stimulētas ar dažādām iepriekšējas sagatavošanas stratēģijām, lai uzlabotu to reģeneratīvo spēju un sekrēcijas potenciālu [3, 4], nepārprotami interesējoties par to izdalīto ekstracelulāro pūslīšu (EV) bioloģisko nozīmi.

EV ir nano izmēra daļiņas, kuras norobežo lipīdu divslānis un kuras aktīvi izdala visi šūnu veidi. EV ietver ļoti mazus (<200 nm)="" exosomes,="" medium-sized="" (200-500="" nm)microvesicles="" or="" shedding="" vesicles,="" and="" larger-sized="" apoptotic="" bodies="" (="">500 nm); tie darbojas kā kritiski bioloģiski starpšūnu signālu konveijeri, nogādājot savu molekulāro kravu no vecāku šūnas uz reaģētāju/mērķa šūnu [5,6]. Ņemot vērā to, ka to savdabīgais parakrīnais potenciāls labvēlīgā efektā ir salīdzināms ar to izcelsmes šūnām, cilmes šūnu EV ir radušās kā pievilcīgas terapeitiskās iespējas tādu slimību preklīniskajos modeļos kā išēmija, iekaisums vai traumas, kā plaši apskatīts [{{3 }}]. No translācijas viedokļa papildus šūnu modulācijas potenciālam izolācijas iespējamība un paaugstināta pašatjaunošanās ir galvenie aspekti ideālam terapeitisko EV un šķīstošo faktoru avotam. Šādā scenārijā augļa un perinatālā MSC var piedāvāt interesantu iespēju, ņemot vērā to proliferācijas potenciālu un attīstības ziņā nenobriedušu profilu ar starpposma iezīmēm starp embrionālajiem un pieaugušajiem somatiskajiem priekštečiem [10, 11]. Augļa MSC var izolēt no ārpusembrionālajiem pielikumiem grūsnības laikā kā atlikušo paraugu ņemšanu, kas iegūta pirmsdzemdību skrīninga laikā (ti, horiona bārkstiņas [12-14] un amnija šķidrums [15,16]) vai iegūti kā perinatālie priekšteči dzimšanas brīdī, no klīniskajiem atkritumiem (ti, amnija un placentas membrānām [17-21], nabassaites sastāvdaļām [22-24] un amnija šķidrumam [25,26]).

Cistanche var novērst novecošanos

Jo īpaši cilvēka amnija šķidruma cilmes šūnas (hAFS) ir izceltas kā daudzsološas terapeitiskās stratēģijas reģeneratīvajā medicīnā. un ir pierādīts, ka tie ir plaši multipotenti in vitro un in vivo [16, 27, 28], veicina hematopoētisko ciltsrakstu pēc dzemdes transplantācijas [29] un transplantē ievainotos orgānos, vienlaikus radot imūnmodulējošu iedarbību [26, 30] un aktivizējot. endogēnās reparatīvās atbildes reakcijas, kā vispusīgi aprakstīts [31]. Mūsu komanda un citi ir arī pierādījuši, ka hAFS atbrīvo sekrēciju, kas ir ļoti bagātināta ar bioaktīvām trofiskām molekulām, kas spēj mērķēt uz dažādiem reparatīviem mehānismiem. Ir ziņots, ka hAFS parakrīnie faktori nodrošina izdzīvošanu veicinošus stimulus ar iekaisuma remdēšanu [32], nodrošina kardioaizsardzību pret ilgstošu išēmiju [33.34] un kardiotoksicitāti [35], kā arī stimulē lokālu angioģenēzi ar kardiomiocītu šūnu cikla atkārtotu iekļūšanu [32]. 34,36]. Tā kā ir pierādīts, ka lielākā daļa no šiem efektiem tiek apkopoti, ievadot tikai hAFS-EV, neatkarīgi pētījumi ir vērsti uz to reģeneratīvā profila sadalīšanu dažādos patoloģiskajos apstākļos, ieskaitot skeleta un sirds muskuļu bojājumus, nieru slimības, osteoartrītu, osteoporozi, nekrotizējošo enterokolītu un neirodeģeneratīvus. modeļi [34,37-44].

Lai gan pierādījumi var atbalstīt hAFS-EV klīnisko pārveidošanu turpmākai parakrīnai terapijai, ir svarīgi ņemt vērā, ka lielākā daļa no šiem pētījumiem galvenokārt ir pētījuši augļa hAFS modulācijas potenciālu, kas iegūts Ⅱ trimestra pirmsdzemdību skrīninga laikā. Patiešām, pilnīgs sekrēcijas profils no perinatālais līdzinieks (ti, no III trimestra c-sekcijām) vēl nav detalizēti izpētīts. Trešā trimestra perinatālās hAFS ir uzrādījušas atšķirīgas imūnsistēmas regulējošas īpašības, salīdzinot ar pirmās un otrā trimestra tiem [26], vienlaikus saglabājot atbilstošu endotēlija reģenerācijas potenciālu [25].cik daudz cistanche jāņemJāatzīmē, ka nesenais ziņojums par augļa hAFS neviendabīgo morfoloģiju[45] ir sniedzis jaunu ieskatu to cilmes un gēnu ekspresijas profilā.bioflavonoīdiTas kopumā ir radījis jaunu gaismu hAFS dažādu šūnu frakciju reģeneratīvajai vērtībai[46]. Tādējādi dažādu hAFS apakšpopulāciju visaptverošs raksturojums piesaista arvien lielāku uzmanību. Mēs iepriekš ziņojām, ka 24 stundu hipoksiska un bez seruma stimulācija ir efektīva stratēģija, lai palielinātu Ⅱ trimestra augļa hAFS parakrīno potenciālu [34, 35, 37]. Tā kā par sekrēcijas sastāvu no III trimestra hAFS ir maz zināms, šeit mēs sniedzam visaptverošu Ⅱ un Ⅲ trimestra hAFS un to sekrēcijas frakciju (ieskaitot cepures-EV) salīdzinājumu, lai risinātu gestācijas stadijas un hipoksiskās šūnas ietekmi. šūnu un sekrēcijas īpašību sagatavošana.

2. Rezultāti

2.1. Perinatālais hAFS piedāvā ciešu fenotipisko atbilstību auglim

Netika novērtēta statistiski nozīmīga atšķirība donora vecumā starp augļa Il trimestra un perinatālā III trimestra amnija šķidruma paraugiem. Augļa c-KIT* hAFS (f-hAFS no II trimestra amnija šķidruma paraugiem) un perinatālais c-KIT* hAFS (p-hAFS no III trimestra amnija šķidruma klīniskajiem atkritumiem) apstiprināja līdzīgas pazīmes ar fibroblastiem līdzīgu un ovālu apaļu morfoloģiju (attēls 1A) un mezenhimālais stromas fenotips (dati nav parādīti), kā ziņots iepriekš [16, 25]. Gan f-hAFS, gan p-hAFS, kas kultivētas in vitro līdz 5. pārejai, uzrādīja nenozīmīgu novecošanās līmeni, ko izraisīja ar novecošanos saistītās - -galaktozidāzes (SA- -Gal) aktivācija aptuveni 4 procentos šūnu (1.B attēls). . Gan f-hAFS, gan p-hAFS uzrādīja augstu mezenhimālo marķieru CD107a un CD146 koekspresijas līmeni, par kuriem nesen ziņots, ka tie definē ļoti sekretoru fenotipu [47]. CD107at CD146* šūnas pārstāvēja lielāko daļu f-hAFS populācijas (apmēram 64 procenti,*p<0.05), while="" p-hafs="" showed="" a="" lower="" enrichment="" for="" this="" subpopulation,="" approximately="" 52%="" of="" total="" cells,="" yet="" this="" disparity="" was="" not="" statistically="" significant="" (figure="">

1. attēls. Auglim ir un perinatāli ir fenotipa novērtējums. (A) Augļa hAFS (f-hAFS, kreisais panelis) un perinatālā hAFS (p-hAFS, labais panelis) reprezentatīvi attēli, kas kultivēti in vitro standarta apstākļos; mēroga josla: 200 um. (B) Novecojošā marķiera beta-galaktozidāzes (SA- -Gal, zilā krāsā) analīze, izmantojot citoķīmisko krāsošanu uz f-hAFS un p-hAFS pēc 5 pasāžām kultūrā; reprezentatīvie attēli tiek rādīti kreisajā panelī, mēroga josla: 200 um. Atbilstošā -Gal pozitīvo šūnu/lauka procentuālā daļa ir parādīta diagrammā labajā panelī (f-hAFS: 4,12±0,58 procenti un p-hAFS: 3,88±2,10 procenti ;p=0,1424,n{ {24}} eksperimenti).(C) HAFS imūnfenotips, kas ekspresē CD146 un CD107a mezenhimālos marķierus. Reprezentatīvi f-hAFS un p-hAFS plūsmas citometrijas diagrammi (kreisais panelis) un atbilstošās vērtības, kas attiecas uz dubultpozitīvām CD107a plus CD146 plus šūnām; CD107a plus CD146* f-hAFS: 63,68±5,82 procenti ,*p=0,016salīdzinot ar atlikušo f-hAFS (cits); CD107at CD146 plus p-hAFS: 52,07±6,76 procenti ar atlikušajiem 47,76 procentiem. 93±56,76 procenti p-hAFS (cits); CD107a plus CD146 plus f-hAFS pret CD107a plus CD146 plus p-hAFS p=0.2403,n=4 eksperimenti. Cits: kopējais atlikušo CD107a-CD146~hAFS, CD107a~CD146*hAFS un CD107at CD146-hAFS daudzums. Visas vērtības ir izteiktas kā neatkarīgu eksperimentu vidējais ± sem. SA- -Gal: ar novecošanos saistītā- -galaktozidāze.

2.2. Augļa hAFS uzrāda atšķirīgu metabolismu no perinatālā hAFS

Lai novērtētu, vai gestācijas stadija var ietekmēt mitohondriju metabolismu, f-hAFS un p-hAFS tika analizēti standarta in vitro kultivēšanas apstākļos, izmantojot bioķīmiskās analīzes. Aerobā metabolisma novērtējums parādīja, ka f-hAFS skābekļa patēriņa ātrums (OCR) un ATP sintēze bija zemāki attiecībā pret p-hAFS, gan stimulējot ar piruvātu plus malātu (P/M;***p).<0.001 for="" ocr,="" and=""><0001, for="" atp="" synthesis),="" and="" with=""><0.01 for="" ocr="" and="" atp="" synthesis,="" figure="" 2a).="" moreover,="" f-has="" displayed="" a="" lower="" oxidative="" phosphorylation="" efficiency="" when="" compared="" to="" p-hafs,="" as="" shown="" by="" thep/o=""><0.001 for="" p/m="" and=""><0001 for="" succinate).="" values="" for="" f-hafs="" were="" lower="" than="" those="" reported="" in="" the="" literature[48],="" and="" suggest="" uncoupling="" between="" oxygen="" consumption="" and="" atp="" production="" (figure="" 2a).="" by="" evaluating="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation,="" and="" glucose="" in="" oxidative="" phosphorylation="" (oxphos)metabolism,="" we="" noticed="" that="" f-hafs="" were="" sensitive="" to="" the="" addition="" of="" bptes="" (glutaminase="" inhibitor,**="">< 0.01)="" and="" etomoxir(carnitine="" palmitoyl-transferase="" 1a="" inhibitor,=""><0.01), but="" not="" to="" uk5099="" (mitochondrial="" pyruvate="" carrier="" inhibitor).="" by=""><0.0001)and><0.001),but not="" etomoxir,inhibited="" the="" metabolism="" of="" p-hafs="" (figure="" 2b,="" upper="" panel).="" this="" observation="" was="" confirmed="" by="" the="" inhibition="" percentage="" of="" the="" single="" inhibitor="" (figure="" 2b,="" lower="" panel).="" therefore,="" both="" cell="" types="" similarly="" rely="" on="" glutamine="" as="" a="" respiratory="" substrate;="" yet,="" f-hafs="" prefer="" fatty="" acids="" as="" a="" second="" substrate,="" while="" p-hafs="" are="" sustained="" by="" glucose.="" interestingly,="" f-hafs="" showed="" a="" higher="" increment="" of="" glucose="" consumption="" and="" lactate="" release="" when="" compared="" to="" p-hafs=""><0.05><0.001 respectively,="" figure="" 2c),="" which="" indicates="" the="" attempt="" to="" balance="" inefficient="" aerobic="" metabolism="" by="" lactate="" fermentation.="" this="" difference="" could="" also="" explain="" the="" reaction="" of="" f-hafs="" to="" the="" addition="" of="" etomoxir="" and="" uk5099.="" since="" f-has="" favor="" the="" use="" of="" glucose="" during="" anaerobic="" glycolysis(*=""><0.05), they="" are="" likely="" forced="" to="" use="" fatty="" acids="" and="" glutamine="" to="" supply="" the="" aerobic="">

2.3. Hipoksiskā sagatavošanās neietekmē augļa un perinatālo dzīvotspēju un uztur to sekrēcijas darbību

Lai definētu hAFS sekrēcijas preparātus, šūnas tika kultivētas apstākļos, kas nesatur serumu, lai izvairītos no FBS piesārņojuma. Mēs iepriekš parādījām, ka 24 stundu bez seruma (SF) un 1 procenta O2 hipoksiskās kultivēšanas apstākļi būtiski nemainīja Ⅱ trimestra augļa hAFS (f-cerība) dzīvotspēju, kamēr tie atbalstīja reģeneratīvo parakrīno faktoru izdalīšanos šūnu kondicionētā vidē. (hAFS-CM) un ārpusšūnu pūslīšos (hAFS. EVs)[34,35,37,49]. Šeit papildus p-hAFS sekrēcijas frakciju profilēšanai pirmo reizi mēs novērtējām, vai p- ir bijusi līdzīga uzvedība tajā pašā sagatavošanas režīmā, izmantojot normoksiskās kultūras stāvokli kā kontroli. f-hAFS un p-hAFS dzīvotspēja tika analizēta pēc 24 stundām šādos iestatījumos: normoksisks (20 procenti O2) stāvoklis pilnīgas kontroles (Ctrl) barotnē (Ctrlf-hAFSnormo un Ctrl p-hAFSnormo), normoksisks stāvoklis SF barotnē. (SF f-hAFSnormo un SF p-hAFSnormo), hipoksisks (1 procents O2) stāvoklis pilnā kontroles vidē (Ctrlf-ir hipo un Ctrl p-hAFSnypo) un hipoksisks stāvoklis SF barotnē (SF f-ir hipo un SF p -ir hipoglikēmija, 3.A attēls). Mēs apstiprinājām, ka f-ir dzīvotspēja nemainījās gan Ctrl, gan SF apstākļos, kā arī hipoksiskas stimulācijas laikā, un vairāk nekā 80 procenti (līdz gandrīz 88 procentiem) no kopējām šūnām netika ietekmēti. Agrīnās un vēlīnās apoptotiskās šūnas svārstījās no apm. 13–18 procenti SF apstākļos bez statistiski nozīmīgas nozīmes. Tāpat perinatālā dzīvotspēja bija 80-92 procentu robežās, un agrīnās un vēlīnās apoptotiskās šūnas veidoja līdz 18 procentiem SF apstākļos. p-hAFS tika nedaudz ietekmēti tikai kombinētajos hipoksijas un SF apstākļos; patiešām, lai gan iepriekšēja sagatavošana neietekmēja šūnu izdzīvošanu, kad p-hAFS tika kultivētas pilnā barotnē, atbilstošais SF stāvoklis uzrādīja pieaugumu par aptuveni. 4-fold (* lpp<0.05) of="" late="" apoptotic="" cells(figure="">

2. attēls. Augļa un perinatālās AFS metaboliskais raksturojums. (A) Skābekļa patēriņa ātrums (OCR), ATP sintēze ar F1-F.ATP sintāzes palīdzību un P/O attiecība f-have un-have piruvāta un malāta (P/M) vai sukcināta klātbūtnē. (Succ);***p=0.0005,**p=0.0012,****p<><0.0001.(b)ocr and="" atp="" synthesis="" in="" presence="" of="" bptes,="" etomoxir,="" and="" uk5099(upper="" panel)="" was="" sequentially="" added="" during="" the="" experiments="" to="" evaluate="" the="" relative="" contributions="" of="" glutamine,="" long-chain="" fatty="" acid="" oxidation="" and="" glucose="" in="" oxphos="" metabolism="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.for="" ocr="" experiments:="" f-hafs+bptes**p="0.0014;for" f-hafs="" +="" etomoxir**p="0.0088;for" p-hafs=""><0.0001;for><0.0001. for="" atp="" experiments:="" f-hafs="" +="" bptes****=""><0.0001; for="" f-hafs＋etomoxir**p="0.0013;for"><0.0001;for p-hafs="" +="" uk5099="" **=""><0.0001).>cistanche AustrālijaIepriekš norādīto inhibitoru izraisītās OCR un ATP sintēzes procentuālās daļas salīdzinājums f-un-hAFS dēļ ir norādīts apakšējā panelī B. OCR eksperimentiem: hAFS plus Etomoxir**** p.<0.0001; for="" hafs="" +="" uk5099="" ****=""><0.0001. for="" atp="" experiments:=""><0.0001;for hafs="" +uk5099="" ****=""><0.0001).(c) glucose="" consumption,lactate="" release="" and="" anaerobic="" glycolysis="" yield,="" used="" as="" markers="" of="" the="" anaerobic="" glycolysis,="" in="" f-hafs="" and="" p-hafs.="" all="" values="" are="" expressed="" as="" mean="" ±="" use.m="" of="" n="4" independent="" experiments;*p="">

Pēc tam mēs novērtējām sekrēcijas frakciju iznākumu, kas iegūts no f-hAFS, salīdzinot ar p-hAFS, pamatojoties uz olbaltumvielu bagātināšanu. Kopā ir sekrēcija, jo šūnu izdalīto parakrīno faktoru kopums šeit ir attēlots ar hAFS-CM. F-hAFS-CM un p-hAFS-CM proteīna koncentrācija SF barotnē pēc hipoksisku šūnu sagatavošanas pret normoksisko stāvokli kā bāzes līnija (proti, f-hAFS-CMnormo, f-hAFS-CMNypo, P has-CMnormo un p -hAFS-CMHypo,) tika novērtēts ar BCA testu un mērīts atbilstoši 10§ šūnām.cistančsIegūtie rezultāti liecināja, ka f-has-CM un p-hAFS-CM uzrādīja vienādu pozitīvu tendenci proteīnu bagātināšanā pēc hipoksiskas ievadīšanas (f-hAFS-CMnypo'166.10±22.13 ug/10 pakāpes šūnas; p-hAFS-CMNypo∶182,30±29,71 ug/10 grādu šūnas) salīdzinājumā ar normoksiskiem ekvivalentiem (f-hAFS-CMnormo: 105,50±19,89 ug/10 grādu šūnas; p- hAFS-CMhypoi 91,12±24,39 ug/10 grādu šūnās. Tāpat hAFS-EV virsmas proteīna koncentrācija tika mērīta f-have-EVSnormo, f-hAFS-EVShypo, p-hAFS-EVSnormo un p-hAFS-EVShypo EV uzrādīja salīdzināmu ražu, ja tos ieguva no f-hAFS vai p-hAFS. Kas attiecas uz hAFS-CM preparātiem, pozitīva tendence palielināt proteīnu saturu f-hAFS-EV un p-hAFS. EV tika novērtēti pēc hipoksiskas stimulācijas laika periodā. atbilstošs normoksisks stāvoklis (f-hAFS-EVSHypo∶2,03±0,67 ug/10 grādu šūnas un p-hAFS-EVSHypo∶1,85±0,47 ug/10 grādu šūnas; f-have-EVsnormo∶1,28±0,36 ug/10 grādu šūnas -hAFS-EVsnormo∶1,19±0,31 ug/10 grādu šūnās, 3.C attēls).

2.4. Augļa un perinatālās hAFS atbrīvošanas EV ar analoģisku morfoloģiju un izmēru sadalījumu

Morfoloģiskā analīze ar transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM) palielināja gan f-hAFS, gan p-hAFS augsto EV sekrēcijas izplatību (4. attēls). Mēs tālāk pētījām f-hAFS-EV un p-hAFS-EV lielumu un laukumu (4.B attēls) pēc hipoksiskās sagatavošanas, salīdzinot ar normoksisko sākotnējo stāvokli. Augļa un perinatālā periodā ir izdalīti neviendabīga izmēra EVS 40-250 nm diapazonā, tādējādi ietverot gan eksosomas/mazas EV, gan mikrovezikulas/izdalošās pūslīšus. Vidējais EV lielums/lauks dažādās grupās bija salīdzināms, augļa hAFS-EV mērīts 90-100 nm (f-hAFS-EVsnormo:104.00 ±3.00 nm;f -have-EVSHvpo: 97,10±10,10 nm) un perinatālajiem izmērītajiem 70-114 nm (p-hAFS-EVsnormo: 94,60±19,53 nm; p-hAFS-EVShypo: 76,43±4.{37}} nm, attēls 4B, kreisais panelis). Runājot par ražu, hipoksijas apstākļos stimulētais hAFS uzrādīja pozitīvu tendenci mazu EV daudzuma pieaugumam, lai gan šis pieaugums nebija statistiski nozīmīgs. f-hAFS-EVStypo izmērīja 40-70 nm, kas bija gandrīz divas reizes vairāk nekā to normoksisko ekvivalentu. Perinatālais-has-EVSHypo, kas izmērīja 40-70 nm, 70-100 nm un 100-130 nm, bija gandrīz trīskāršs nekā normoksiskā kultūrā iegūtais daudzums (4.B attēls).

Nanodaļiņu izsekošanas analīze (NTA) parādīja paaugstinātu daļiņu skaitu gan f-hAFS-EV, gan p-hAFS-EV preparātos un apstiprināja EV palielināšanos hipoksiskajos paraugos, kā arī tika novērots no iepriekšējām analīzēm (f-hAFS- EVsnormo: 182±0.10'daļiņas/10 grādu šūnas; f-have-EVshypo: 3,30±0,22 × 10 grādu daļiņas/10 grādu šūnas ;p-hAFS-EVsnormo:2,43±0,80×10 grādu daļiņas/10 grādu šūnas;p-hAFS-EVshypo:3,05±0,62×10 grādu daļiņas/10 grādu šūnas, 4.C attēls.

4. attēls. Augļa un perinatālās EV morfoloģiskais raksturojums. (A) f-hAFS un p-hAFS transmisijas elektronu mikroskopijas (TEM) reprezentatīvi attēli (attiecīgi augšējais un apakšējais kreisais panelis ar melnām bultiņām, kas norāda intracitoplazmatiskus daudzvezikulārus ķermeņus ar maziem EV / eksosomām tajos) un f -hAFS-EV un p-hAFS-EV (attiecīgi augšējais un apakšējais labais panelis), kas izlaistas bez seruma apstākļos un normoksiskā un hipoksiskā priekškondicionācijā (f-hAFS-EVSnormo; f-have-EVSHypoi p-hAFS-EVSnormo; un f-hAFS-EVshypo, attiecīgi), mēroga joslas: 200 nm. (B) Kreisais panelis: hAFS-EV izmēra sadalījuma TEM analīze; labais panelis: tika ņemts vērā f-hAFS-EV un p-hAFS-EV skaita sadalījums pa lauka lieluma intervāliem no 40 nm līdz 250 nm; vērtības tiek izteiktas kā n=3 neatkarīgu eksperimentu vidējās ± sem. (C) Nanodaļiņu izsekošanas analīze hAFS izmēram un sadalījumam. Kreisais panelis: grafiskās izvades reprezentatīvs attēls; labais panelis: hAFS-EVs koncentrācija mērīta kā 10 grādu daļiņas uz 10 grādu sekrēcijas šūnām; nm: nanometrs; ml: mililitrs.

2.5. Augļa un perinatālās hAFS proteomiskais raksturojums izceļ atšķirības to sekrēcijas sastāvā atkarībā no gestācijas vecuma un hipoksijas priekškondicionēšanas

Gan f-hAFS, gan p-hAFS sekrēcijas preparātu proteomiskais raksturojums tika veikts, izmantojot platformu bez bises etiķetēm, pamatojoties uz nano šķidruma hromatogrāfijas un augstas izšķirtspējas masas spektrometrijas (nLC-HRMS) savienojumu. Četrdesmit astoņi proteomiskie profili tika iegūti, dublēti analizējot trīs hAFS-CM un have-EV bioloģiskos replikātus no f-hAFS un p-hAFS, kuriem tika veikta hipoksiska šūnu priekškondicija, salīdzinot ar normoksisko stāvokli kā kontroli. Kopumā tika identificētas 4179 atšķirīgas olbaltumvielu grupas ar vismaz vienu unikālu peptīdu un ar molekulmasu no 2 līdz 3900 kDa un izoelektriskajiem punktiem no 3,6 līdz 13. Tika novērota augstāka vidējā olbaltumvielu ekspresija hAFS-EVs, salīdzinot ar hAFS-CM. . Visu iegūto olbaltumvielu sarakstu saskaņošana tika veikta, pamatojoties uz identificētajiem proteīniem. Katram eksperimentālajam stāvoklim tika izveidots unikāls saraksts, normalizējot un vidēji nosakot [50] proteīniem piešķirtās peptīdu spektra atbilstības vērtības (PSM), kas atspoguļo katram piešķirto masas spektru skaitu un netieši atspoguļo to pārpilnību paraugos. Pilns hAFS-CM un have-EV preparātos identificēto proteīnu saraksts ir sniegts S1 tabulā.

Lineārās diskriminējošās analīzes (LDA[51]) izmantošana šajā galvenajā sarakstā ļāva iegūt statistiski nozīmīgus proteīnus (fratio, kas ir lielāks vai vienāds ar 4,5 un** p<0.001)to be="" processed="" by="" hierarchical="" clustering.="" figure="" sla="" shows="" a="" clear="" separation="" and="" different="" behavior="" between="" hafs-cm="" and="" have-ev="" fractions="" generating="" two="" main="" branches,="" as="" highlighted="" by="" the="" heatmap="" color="" code.="" a="" further="" subgrouping="" was="" also="" observed="" according="" to="" the="" gestational="" age="" and="" the="" hypoxic="" preconditioning="" adopted.="" the="" fact="" that="" each="" analyzed="" condition="" presented="" a="" unique="" identity="" is="" confirmed="" by="" the="" venn="" diagrams="" (figures="" 5a="" and="" 6a,="" tables="" s1-s3)="" that="" report="" the="" distribution="" of="" proteins="" identified="" with="" a="" frequency="">1 hAFS-CM un have-EV sastāvos, kas tiek aplūkoti atsevišķi. Lai gan aptuveni 69,5 procenti un 69,9 procenti olbaltumvielu tika sadalīti attiecīgi starp hAFS-EV un hAFS-CM nosacījumiem, pārējais saturs bija ekskluzīvs dažādās proporcijās, sākot no 3,7 procentiem līdz 13,4 procentiem starp preparātiem.

Lai kvantitatīvi pārbaudītu proteomiskās izmaiņas, tika veikta diferenciālā analīze bez etiķetēm, izmantojot mājās gatavotu MAProMa programmatūru un izmantojot divus algoritmus, DAve (diferenciālais vidējais) un DCI (diferenciālās pārliecības indekss), kas atspoguļo attiecību un diferenciālās izteiksmes pārliecību. attiecīgi), uz katra atsevišķa proteīna PSM starp diviem salīdzinātajiem terminiem. Izmantojot stingrus filtrus DAve un DCI, lai palielinātu identifikācijas ticamību un ņemtu vērā proteīnus, kuru variācijas ir lielākas par 1,5 reizes izmaiņām, f-hAFS-CM un p-hAFS-CM un f-hAFS-EVs salīdzinājumi pa pāriem. p-hAFS-EV tika izgatavoti atbilstoši šūnu gestācijas stadijai. Kopā tika konstatēti 58 un 109 proteīni, kas ir atšķirīgi izteikti iepriekšminētajos has-CM un have-EV nodalījumos, attiecīgi (attēls S1B, C atlasītai informācijai un S2-S3 tabulas paplašinātā formā). No tiem 30 proteīniem tika paaugstināts regulējums f-hAFS-CM un 28 tika paaugstināti regulēti p-hAFS-CM (attēls S1B); tāpat 44 atšķirīgi proteīni izraisīja f-have-EV pārregulēšanu un 65 tika paaugstināti regulēti p-hAFS-EV (attēls S1C). Proti, proteīni, kuru rezultātā f-have tika regulēti, ir jāuzskata par samazinātiem p-has un otrādi.

tiek ziņots par vērtībām; pilnu sarakstu un detalizētus ziņoto proteīnu parametrus skatiet S2 tabulā. (C) Proteīnu bioloģisko procesu bagātināšanas analīze, kas identificēta ar vismaz 2 biežumu augļa hAFS-CM (kreisajā panelī) un perinatālā have-CM (labajā panelī) saskaņā ar šūnu hipoksisko sagatavošanu. Pamatojoties uz FunRich rīku, gēnu ontoloģijas termini tiek parādīti joslu diagrammās, kas norāda katrai kategorijai bagātināto gēnu procentuālo daudzumu (rozā joslas for-have-CMnormo, purpursarkanas joslas f-hAFS-CMhypor gaiši zilas joslas p-hAFS-CMnormo, un zilās bumbiņas p-hAFS-CMhypo).nopirkt cistancheTikai gēnu ontoloģijas termini ar Bonferroni koriģēti ar *p<0.05 are="">

Šis raksts ir izvilkts no Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms