Jaunu termostabilu himērisko vakcīnu kandidātu izveide Ņūkāslas slimības vīrusa VII genotipam

Abstrakts: Ņūkāslas slimības vīrusa VII genotips (NDV) ir izraisījis pandēmiju daudzās valstīs un parasti izraisa letālas sekas inficētiem cāļiem. Lai gan pašreizējās komerciālās novājinātās NDV vakcīnas var nodrošināt ideālu aizsardzību pret VII genotipa NDV, tās nevar pilnībā novērst infekciju un vīrusu izplatīšanos, un dažu vakcīnas celmu genotips nevar atbilst izplatītajam celmam. Šajā pētījumā, lai izveidotu termostabilu un VII genotipam atbilstošu dzīvu novājinātu vakcīnu, mēs izmantojām termostabilu VIII genotipa virulento HR09 celmu kā mugurkaulu un aizstājām tā F gēnu ar VII genotipa DT-2014 celmu. Tikmēr DT-2014 F gēna šķelšanās vieta tika attiecīgi mutēta uz IF klases proteīna un avirulentās II klases F proteīna šķelšanās vietu. Rezultāti parādīja, ka diviem himēriskajiem vīrusiem, kas apzīmēti ar rcHR09-CI un rcHR09-CII, bija līdzīga augšanas kinētika un termostabilitāte ar to vecāku HR09 celmu. Vidējais nāves laiks (MDT) un intracerebrālās patogenitātes indeksa (ICPI) testi parādīja, ka abi himēriskie vīrusi bija ļoti novājināti. Lai gan gan himēriskie NDV, gan La Sota vakcīnas celms varētu nodrošināt pilnīgu aizsardzību imunizētiem cāļiem pret virulento VII genotipa ZJ1 celmu, abi himēriskie NDV varētu izraisīt augstāku antivielu atbildes reakciju pret ZJ1 celmu un varētu ievērojami samazināt vīrusu izplatīšanos, salīdzinot ar La Sota vakcīnas celms. Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījumā tika izveidoti divi kimēriski termostabilie VII genotipam atbilstošie NDV vakcīnas kandidāti, kas nodrošināja pilnīgu aizsardzību pret virulentā VII genotipa NDV izaicinājumu.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Atslēgvārdi: Ņūkāslas slimības vīruss; termostabilitāte; VII genotipam atbilstošs himēriskais vīruss; F proteīns; aizsardzības efektivitāte; vīrusu izplatība

1. Ievads

Ņūkāslas slimības vīruss (NDV), Ņūkāslas slimības (ND) izraisītājs, pieder pie Paramyxoviridae dzimtas Avulavirinae apakšdzimtas Orthoavulavirus ģints [1]. NDV ir negatīvas sajūtas vienpavedienu RNS genoms, kas kodē nukleoproteīnu (N), fosfoproteīnu (P), matricas proteīnu (M), saplūsmes proteīnu (F), hemaglutinīna-neiraminidāzes proteīnu (HN) un lielo proteīnu (L). ) [2]. Pamatojoties uz NDV celmu attīstību, NDV var iedalīt divās klasēs: viena ir I klases vīrusi, kuru genoma izmērs ir 15 198 nukleotīdi; vēl viens ir II klases vīrusi, kuru genoma lielums ir 15 186 vai 15 192 [3]. Pamatojoties uz tā patogenitāti, NDV ir iedalīts trīs patotipos: lentogēns, mezogēns un velogēns [4]. NDV var iedalīt divās klasēs, viena ir I klases NDV, kas galvenokārt ir izolēta no savvaļas putniem un vienmēr ir avirulenta cāļiem. Otrs ir II klases NDV, kas ir konstatēts mājas un savvaļas putniem, tostarp gan virulentiem, gan avirulentiem celmiem [1,5,6]. NDV F proteīns vispirms tiek sintezēts kā neaktīvs prekursors F0, ko saimniekšūnu proteāze tālāk sadala divās aktīvās F1 un F2 apakšvienībās [7]. Aktīvais F proteīns var būt starpnieks vīrusu un šūnu membrānu saplūšanā [8]. Pētnieki ir atklājuši, ka F proteīna šķelšanās vietas motīvs ir arī NDV virulences rādītājs. Tika ziņots, ka virulences celmam cāļiem bija šķelšanās vietas motīvs 112R/KR-QK/RR↓F 117, savukārt zemas virulences NDV tajā pašā reģionā ir 112G/EK/R-QG/ER↓L 117 motīvs. [9,10]. Tāpēc F proteīna šķelšanās vietas motīva maiņa ir efektīvs veids, kā vājināt virulento NDV [11, 12]. Neskatoties uz nozīmīgo lomu NDV virulentē, F proteīns ir arī galvenais genotipam atbilstošu vakcīnu aizsargājošās imunitātes veicinātājs [13]. Termostabila vīrusa vakcīna var atvieglot tās uzglabāšanu un transportēšanu, īpaši dažos attālos rajonos, kur aukstās ķēdes transportēšana nav pieejama. Iepriekš mūsu laboratorijā tika izolēts dabisks termostabils NDV celms, kas apzīmēts ar HR09, un 56 ◦C temperatūrā tas varēja saglabāties infekciozs vairāk nekā vienu stundu [14]. Pēc tam, izmantojot apgriezto ģenētisko sistēmu, tika konstatēts, ka 315. un 369. atlikumi HN proteīnā ir atbildīgi par tā karstumizturības spēju [15]. Tā kā HR09 ir virulents celms, mēs mutējām tā F proteīna šķelšanās vietu no 112RRQKR↓F 117 uz avirulentu motīvu 112GRQGR↓L 117, izmantojot reverso ģenētisko sistēmu, un atklājām, ka rekombinantais vīruss rHR09 varētu nodrošināt pilnīgu aizsardzību pret VII genotipa izaicinājumu. NDV virulentais celms [16]. Turklāt novājinātais HR09 tika tālāk izmantots kā vakcīnas vektors, lai ekspresētu H9N2 apakštipa putnu gripas vīrusa (AIV) HA gēnu, kas arī nodrošināja ideālu aizsardzību pret H9N2 AIV infekciju [17]. Šajā pētījumā, lai izveidotu termostabilu un VII genotipam atbilstošu NDV novājinātu vakcīnu, mēs izmantojām termostabilu VIII genotipa NDV virulento HR09 celmu kā mugurkaulu un aizstājām tā F gēnu ar VII genotipa DT-2014 celmu. Tikmēr DT-2014 F gēna šķelšanās vieta tika attiecīgi mutēta uz I klases NDV F proteīna un avirulentās II klases NDV F proteīna šķelšanās vietu. Rezultāti parādīja, ka abiem himēriskajiem vīrusiem bija līdzīga augšanas kinētika un termostabilitāte ar HR09. Turklāt vidējā nāves laika (MDT) un intracerebrālās patogenitātes indeksa (ICPI) testi parādīja, ka abi himēriskie vīrusi piederēja avirulentam celmam. Abas no tām varētu izraisīt augsta līmeņa antivielu atbildes reakciju pret sevi un VII genotipa ZJ1 celmu imunizētiem cāļiem, varētu ievērojami samazināt vīrusu izplatīšanos un nodrošināt pilnīgu aizsardzību pret inficēto ar ZJ1 celmu. Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījums sniedz divus himēriskus termostabilas vakcīnas kandidātus VII genotipa NDV.

Citanche tubulosa priekšrocības- stiprināt imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Materiāli un metodes

2.1. Šūnas un vīrusi

BSR-T7/5 šūnas, selektīvā šūnu līnija no BHK šūnām, kas var ekspresēt T7 RNS polimerāzi, tiek kultivētas ar Dulbecco modificēto Eagle barotni (DMEM, Gibco), kas papildināta ar 15% liellopu augļa serumu (Pan Biotech, Vācija) un 1% penicilīns-streptomicīns (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ASV) 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 inkubatorā. Specifiskas bezpatogēnu (SPF) embrionētas vistu olas, kuras var izmantot NDV pavairošanai, tiek iegādātas no Beijing Boehringer Ingelheim Vital Biotechnology Co., Ltd. Termostabils VIII genotipa NDV HR09 celms (MF285077.1) un VII genotipa ZJ1 celms. tiek glabāti mūsu laboratorijā.

2.2. Plazmīdu konstrukcija

Plazmīda ar nosaukumu pNDV/rHR09 tika izveidota, klonējot VIII genotipa HR09 pilna garuma genoma secību ar mutāciju F proteīnā TVT7R (0.0) vektorā [16]. VII genotipa DT-2014 celma F gēns, kam bija liela līdzība ar izplatītajiem VII genotipa NDV celmiem, tika pastiprināts, un tā šķelšanās vietu mutācijas tika ģenerētas, izmantojot uz vietni vērstu mutaģenēzi. Pēc tam pNDV/rHR09 F gēns tika aizstāts ar mutācijas DT-2014 F gēnu. Visas pētījumā izmantotās primeru sekvences ir pieejamas pēc pieprasījuma.

2.3. Rekombinantā vīrusa glābšana

Šajā pētījumā divi himeriskās NDV vakcīnas kandidāti tika izglābti, kā aprakstīts iepriekš [18]. Galvenās procedūras ir aprakstītas zemāk: pirmkārt, pilna garuma NDV plazmīdas, kas satur šķelšanās vietas ar mutāciju NDV DT-2014 F gēnu, apzīmētas ar pNDV/rcHR09-CI un pNDV/rcHR{{4}. }CII tika transficēti ar trim palīgplazmīdām pCI-NP, pCI-P un pCI-L, izmantojot Lipofectamine 3000 reaģentu (Thermo Fisher Scientific, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Otrkārt, alantoīda šķidrumi no SPF embrionētām vistu olām tika pievienoti attiecīgi 12 stundas un 36 stundas pēc transfekcijas. Treškārt, visi šūnu lizāti tika savākti 72 stundas pēc transfekcijas un trīs reizes sasaldēti / atkausēti. Visbeidzot, šūnu lizāti tika injicēti 10-dienu vecās SPF embrionētās vistu olās 3–5 dienas, un alantoju šķidrumi tika savākti un pakļauti HA pārbaudei, lai noteiktu izglābto himērisko NDV.

2.4. RT-PCR un QRT-PCR

RNS tika ekstrahēta, izmantojot TRIzol reaģentu (Merck, Darmštate, Vācija) no alantojas šķidrumiem, kas savākti no inficētām embrionētām vistu olām, un pēc tam reversā transkribēta cDNS, izmantojot PrimeScript™ 1st Strand cDNS sintēzes komplektu (Takara, Pekina, Ķīna). Pilns izglābtās NDV genoma sekvences garums tika pastiprināts, izmantojot 10-pair primers (pieejams pēc pieprasījuma). Vīrusu izdalīšanās līmenis tika kvantitatīvi noteikts ar absolūtu kvantitatīvu reāllaika RT-PCR, izmantojot Life Technology instrumentu. Īsi sakot, kloākas uztriepes un trahejas uztriepes paraugi tika savākti 3- un 5- dienas pēc provokācijas (dpc), pēc tam RNS tika ekstrahēta, reversā transkribēta uz cDNS un pakļauta kvantitatīvai reāllaika PCR. (QRT-PCR) vīrusu izplatības kvantitatīvai noteikšanai. Vīrusu izdalīšanās daudzums tika aprēķināts kā vidējais ± SD no visu savākto tamponu mRNS līmeņa. Primer un Probe sekvences, ko izmanto vīrusu izplatīšanās noteikšanā, ir pieejamas pēc pieprasījuma.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

2.5. Vīrusu augšanas līkne

Dažādu NDV augšanas kinētika tika mērīta 10-dienu vecām embrionētām vistu olām. Īsumā, NDV tika atšķaidīti un injicēti 10-dienu vecās embrionētās vistu olās, inokulējot alantoīdu. Alantoīda šķidrums tika savākts 24-, 48-, 72- un 96-h pēc inficēšanās. Katra parauga EID50 tika aprēķināts, izmantojot Rīda un Muenča metodi [19].

2.6. Termostabilitātes tests

Katra vīrusa termostabilitāte tika mērīta, kā aprakstīts iepriekš [18]. Īsumā, katrs vīruss ar 108 EID50 titru 0,1 ml flakonā tika pakļauts ūdens vannai ar 56 ◦C, pēc tam paraugi tika savākti 10-, 20-, {{ 8}}, 40-,50- un 60-min pēc inkubācijas. Visbeidzot, vīrusa titrs tika mērīts, izmantojot EID50 metodi.

2.7. Virulences un stabilitātes noteikšana

Katra vīrusa virulence tika novērtēta, piemērojot vidējā nāves laika (MDT) testu 10-dienu vecām SPF embrionētām vistu olām, kā aprakstīts iepriekš [20,21]. Īsumā, katra himēriskā NDV celma savāktais alantoiskais šķidrums tika atšķaidīts no 10–6 līdz 10–9 10-kārtīgās sērijās un injicēts 10-dienu vecās SPF embrionētās vistu olās ar 5 katrai grupai. ar 100 l katra atšķaidījuma. Pēc tam inficētās embrionētās vistu olas inkubēja 37 ◦C un svecēja kopumā 7 dienas. Tika reģistrēta katras grupas nāve un aprēķināta MDT vērtība. Turklāt tika mērīts arī ICPI tests 1-dienu veciem SPF cāļiem, lai pārbaudītu himēriskā vīrusa virulenci. Īsumā, himēriskais vīruss tika atšķaidīts 10-locīšanas sērijā, izmantojot PBS, un ievadīts 1-dienu vecās SPF embrionētās vistu olās. Inkubētās olas tika apdedzinātas kopumā 8 dienas, un tika aprēķināta ICPI vērtība. Lai novērtētu divu himērisko NDV stabilitāti, tie tika pavairoti 10-dienu vecās SPF embrionētās vistu olās, inokulējot ar alantoju kopumā 20 pasāžās, pēc tam tika mērītas atlasīto pasāžu MDT un ICPI vērtības.

2.8. Vistas imunizācija un izaicinājums

Kopā 48 8-dienu veci SPF cāļi tika nejauši sadalīti četrās grupās, un trīs grupas tika inokulētas ar 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII un La Sota celmu. 100 µL DMEM, izmantojot okulonālo ceļu, attiecīgi. Kontroles grupas cāļiem injicēja 100 µL DMEM. Imunizēto cāļu serums tika savākts 7-, 14- un 21 dienu pēc imunizācijas (dpi), lai noteiktu antivielu titru. Pie 21 dpi cāļi tika inficēti ar 105 EID50 NDV genotipa VII ZJ1 celmu, izmantojot okulozonālo ceļu. Kloākas un mutes un rīkles uztriepes tika savāktas 3- un 5-dienā pēc inficēšanās (dpc), lai turpmāk noteiktu vīrusu izplatīšanos. Klīniskās pazīmes un nāve tika reģistrēta katru dienu līdz 14 dpc.

2.9. Seruma antivielu titra noteikšana

Antivielu titru pret NDV noteica ar hemaglutinācijas inhibīcijas (HI) metodi, kā aprakstīts iepriekš [22].

2.10. Ētikas paziņojums

Vistu imunizāciju un apstrādi apstiprināja Jandžou Universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (Nr. YZUDWLL-201904-002; datums: 2019. gada 4. februāris).

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

2.11. Statistiskā analīze

Dati ir parādīti kā vidējie ± standarta novirzes (SD), un tie tika iegūti no trim atkārtojumiem. Statistiskā nozīmība starp dažādām grupām tika analizēta ar Studenta t-testa metodi, izmantojot GraphPad Prism 7.{2}} programmatūru (La Jolla, CA, ASV). (* p < 0.05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

3. Rezultāti

3.1. Divu himēru NDV uzbūves shēma

VII genotips NDV ir izplatīts visā pasaulē un bieži izraisa letālas sekas vistām un citiem uzņēmīgiem putniem [23]. Iepriekš mēs izolējām termostabilu VIII genotipa NDV HR09 celmu, kas var saglabāt infekciozitāti vairāk nekā 60 minūtes, inkubējot 56 ◦C [14]. Šajā pētījumā, lai radītu termostabilu novājinātu vakcīnas kandidātu pret NDV VII genotipu, mēs izmantojām HR09 kā mugurkaulu un aizstājām F gēnu ar VII DT-2014 celma gēnu; tikmēr šķelšanās vietas tika mutētas no 112RRQRR↓F 117 uz I klases NDV F proteīna šķelšanās vietām 112ERQER↓L 117 un II klases NDV F proteīna šķelšanās vietu avirulento celmu 112GRQGR↓, kas satur pilna garuma L 117 plazmīdu. HR09 genoms ar mutētu F proteīnu tika apzīmētas attiecīgi kā prcHR09-CI un prcHR09-CII (1. attēls).

1. attēls. Divu himērisko NDV konstruēšanas shematiskā stratēģija. VIII genotipa termostabilā HR09 celma F gēns tika aizstāts ar VII genotipa DT-2014 celma mutēto F gēnu.

3.2. Himēriskā NDV rcHR09-CΙ un rcHR09-CⅡ izveide

Lai izveidotu himēriskos vīrusus, plazmīdas prcHR09-CI vai prcHR09-CII tika kotransfekētas ar trim palīgplazmīdām pCI-NP, pCI-P un pCI-L BSR-T7/5 šūnās. , kas var ekspresēt T7 RNS polimerāzi. 72 stundas vēlāk tika savākts viss šūnu lizāts un ievadīts 10-dienu vecās SPF embrionētās olās, un 4 dienas pēc inkubācijas tika savākti alanta šķidrumi. Lai pārbaudītu divu izglābto himērisko vīrusu šķelšanās vietas, tika veikts F gēna PCR eksperiments un produkti tika pakļauti sekvencēšanai; rezultāti parādīja, ka šķelšanās vietas tika veiksmīgi mutētas līdz 112ERQER↓L 117 rcHR09-CI (2.A attēls) un 112GRQGR↓L 117 rcHR09-CII (2.B attēls). Visbeidzot, divu termostabilu himērisko NDV pilna garuma genoms tika pastiprināts, izmantojot 10 praimeru pārus, un rezultāti parādīja, ka satur gan rcHR09-CI (2.C attēls), gan rcHR09-CII (2.D attēls). NDV pilna garuma genoms. Kopumā šie dati parādīja, ka divi termostabilie himēriskie vīrusi tika veiksmīgi izveidoti.

2. attēls. Himērisko NDV rcHR09-CI un rcHR09-CII izveide un validācija. Kopējā izglābto vīrusu RNS tika ekstrahēta un reversi transkribēta cDNS, rcHR09-CI (A) un rcHR09-CII (B) F gēns tika pastiprināts un iestatīts uz sekvencēšanu. Himērisko NDV rcHR09-CI (C) un rcHR09-CII (D) pilns garums tika pastiprināts, izmantojot 10 praimeru pārus, un S1–S10 ir to attēlojums.

3.3. Himēriskās NDV rcHR09-CI un rcHR09-CII bioloģiskās īpašības

Lai pārbaudītu, vai F gēna aizstāšana ietekmē NDV replikāciju, 10-dienu vecām embrionētām vistu olām tika veikta augšanas kinētika, mērot to EID50. NDV tika atšķaidīti un inkubēti 10-dienu vecās embrionētās vistu olās, un alantoīda šķidrums tika savākts 24-, 48-, 72- un 96-. h pēcinkubācijas. EID50 rezultāti parādīja, ka gan izglābtajam himēriskajam rcHR09-CI, gan rcHR09-CII bija līdzīga augšanas kinētika ar to vecāku HR09 celmu (3.A attēls), kas parādīja, ka F gēna aizstāšanai nebija nekādas ietekmes. par HR09 replikāciju.

3. attēls. Himēriskā NDV rcHR09-CI un rcHR09-CII bioloģiskās īpašības. (A) Diviem himēriskajiem NDV rcHR09-CI un rcHR09-CII ir līdzīga augšanas kinētika ar to mātes celmu HR09. Abu himērisko vīrusu un to mātes celma HR09 augšanas līkne tika mērīta ar EID50 metodi 10-dienu vecām SPF embrionētām vistu olām. (B) Diviem himēriskajiem NDV rcHR09-CI un rcHR09-CII ir kopīga termostabilitāte ar HR09. Kopā 108 EID50 no NDV rcHR09-CI, rcHR09-CII, HR09 un La Sota celmiem tika inkubēti 56 ◦C temperatūrā 10-, 20-, {{21 }}, 40-, 50- un 60-min, attiecīgi. Pēc tam četru NDV titri tika mērīti, izmantojot EID50 metodi.

Tā kā HR09 celms bija termostabils NDV celms, tika pētīts arī tas, vai F proteīna aizstāšana ietekmēja tā termostabilitāti. Katrs himēriskais vīruss un HR09 ar vienādu vīrusa titru (108 EID5{{50}}) tika ārstēti ar 10-, 20- , 30-, 40-, 50- un 60-min zem 56 ◦C. Pēc tam vīrusa titru noteica, veicot EID50 testu. Rezultāti parādīja, ka divi himēriskie vīrusi un to vecāku celms HR09 varēja palikt infekciozi vairāk nekā 60 minūtes, savukārt netermostabilais La Sota celms vienkārši palika infekciozs ne ilgāk kā 20 minūtes (3.B attēls). Šie dati liecināja, ka himēriskie vīrusi rcHR09-CI un rcHR09- 218 CII joprojām bija termostabili. Šajā pētījumā VIII HR09 F gēns tika aizstāts ar VII DT - 2014 mutācijas F gēnu, lai iegūtu divus novājinātus himēriskus NDV. Lai novērtētu himērisko rcHR09-CI un rcHR09-CII virulenci, tika noteiktas MDT un ICPI vērtības. Rezultāti parādīja, ka visu divu himērisko NDV MDT vērtība bija lielāka par 120 stundām. Kontrolei viņu vecāku HR09 celma MDT vērtība bija 57, 6 stundas. rcHR09-CI un rcHR09-CII ICPI vērtības bija nulle, kā kontrolei HR09 ICPI bija 1,8 (1. tabula). NDV virulence, pamatojoties uz MDT vērtību, ir klasificēta trīs grupās: velogēna (līdz 60 stundām), mezogēna (60–90 h) un lentogēna (vairāk nekā 90 stundas). Tikmēr ICPI vērtība ir arī izplatīts NDV virulences noteikšanas kritērijs: velogēns (līdz 60 h), mezogēns (60–90 h) un lentogēns (vairāk nekā 90 h): velogēns (1,5–2,0), mezogēns (0,7). –1,5) un lentogēnu (0,0–0,7) [24]. Kopumā šie dati parāda, ka gan izglābtais himēriskais rcHR09-CI, gan rcHR09-CII bija ļoti novājināts, mainot F proteīna šķelšanās vietas.

1. tabula. Divu himērisko NDV (kopā 20 pasāžas) patogenitātes un stabilitātes novērtējums.

Turklāt divu himērisko NDV stabilitāte tika noteikta, inkubējot 20 pasāžas 10-dienu vecās embrionētās vistu olās, un MDT un ICPI vērtību mērīšanai tika izvēlēti 10. un 20. fragmenti. Rezultāti parādīja, ka 10. un 20. fragmenta MDT vērtības bija lielākas par 120 stundām, un 10. un 20. fragmenta ICPI vērtības bija nulle (1. tabula). Šie dati parādīja, ka pēc 20 pasāžām ar 10-dienu vecām embrionētām vistu olām divu himērisko NDV MDT un ICPI vērtībām nebija būtiskas atšķirības, kas parādīja, ka abi izglābtie himēriskie NDV bija salīdzinoši stabili.

3.4. Augsts HI antivielu titrs tika izraisīts pēc himerisko NDV imunizācijas

Lai pārbaudītu, vai izglābto himērisko NDV imunizācija varētu izraisīt antivielu reakciju cāļiem, 48 8-dienu veci SPF cāļi tika sadalīti četrās grupās. Dažādas grupas tika inokulētas attiecīgi ar 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII, La Sota celmu vai 100 µL DMEM, izmantojot okulonālo ceļu. Imunizēto cāļu serums tika savākts 7-, 14- un 21 dienu pēc imunizācijas (dpi), lai noteiktu HI antivielu titru. Savāktā seruma HI antiviela pret imunizēto NDV celmu parādīja, ka rcHR09-CI, rcHR09-CII un La Sota serumā 7 dpi nebija būtiskas atšķirības. Turklāt, laikam ejot, HI antivielu titrs serumā pieauga par 14 un 21 dpi, un starp trim grupām nebija būtiskas atšķirības (4.A attēls).

4. attēls. Himēriskie vīrusi izraisīja augstu antivielu atbildes reakciju. SPF cāļi tika imunizēti attiecīgi ar 106 EID50 rcHR09-CI, rcHR09-CII un komerciālās vakcīnas La Sota celmu, izmantojot okulozonālo ceļu. Serums tika savākts 1-, 2- un 3 nedēļas pēc imunizācijas, antivielu titru noteica, izmantojot HI metodi pret viņiem pašiem (A) un krustenisko HI antivielu titru pret ZJ1 (B). (ns: nav būtiskas atšķirības; * p < 0,05; ** p < 0,01).

Turklāt tika atklāts krusteniski reaģējošais HI antivielu titrs pret ZJ1 celmu, lai paaugstinātu himērisko NDV imunizācijas efektu pret VII genotipa NDV. Rezultāti parādīja, ka nebija būtiskas atšķirības starp trim NDV imunizētajām grupām 7 dpi, un HI antivielu titrs laika gaitā pieauga. Atšķirībā no HI antivielu titra pret imunizēto celmu, HI antivielu titri pret ZJ1 celmu rcHR09-CI- un rcHR09-CII imunizētajās grupās bija ievērojami augstāki nekā La Sota vakcinācijas grupā un rcHR. 09-CI grupa izraisīja augstāko HI antivielu titru starp šīm trim grupām (4.B attēls).

3.5. Vīrusu izplatība tika samazināta, kad imunizētās cāļi tika pakļauti virulentajam VII genotipa ZJ1 celmam

Šajā pētījumā imunizētie SPF cāļi tika pakļauti VII genotipa ZJ1 celmam, lai novērtētu himērisko vīrusu aizsargājošo iedarbību pret VII genotipa NDV. Pie 21 dpi imunizētie cāļi tika inficēti ar 105 EID50 ZJ1 celmu, un kloākas un mutes un rīkles uztriepes no visām inficētajām cāļiem katrā grupā tika savākti 3- un 5-dienās pēc inficēšanās (dpc ) vīrusu izplatības noteikšanai. Rezultāti parādīja, ka rcHR09-CI, rcHR09-CII un La Sota grupu imunizācija var samazināt vīrusu izdalīšanos kloākas uztriepēs (5A, C attēls) un mutes un rīkles iztriepes {{11} } un 5-dpc (5.B, D attēls), salīdzinot ar kontroles grupu. Salīdzinot ar La Sota grupu, vīrusu izdalīšanās divos himēriskajos NDV bija ievērojami zemāka nekā La Sota imunizētajās grupās, kas parādīja, ka diviem himēriskajiem NDV bija labāka aizsardzības efektivitāte nekā La Sota celmam pret VII genotipa NDV infekciju.

5. attēls. QRT-PCR kvantitatīvā noteikšana NDV ZJ1 izdalīšanai inficētiem cāļiem. Cāļi tika inficēti ar 1{{10}}6 EID50 NDV genotipa VII ZJ1 celmu 21 dienu pēc imunizācijas. Kloākas uztriepju paraugi (A, C) un mutes un rīkles uztriepes (B, D) tika savākti 3- un 5-dienās pēc inficēšanās, un NDV ZJ vīrusa izplatīšanās līmenis tika kvantitatīvi noteikts, izmantojot QRT- PCR. Vērtības tika parādītas kā vidējās vērtības ± standarta novirze (vidējais ± SD) katrā grupā. (ns: nav būtiskas atšķirības; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).

3.6. Divi himēriskie NDV nodrošināja pilnīgu aizsardzību pret VII genotipa ZJ1 celma izaicinājumu

Tā kā VII genotipa ZJ1 celma inficēšanās var izraisīt letālas sekas, izņemot vīrusa izplatīšanās noteikšanu, inficēto cāļu nāve tika reģistrēta arī katru dienu līdz 14 dienām. Rezultāti parādīja, ka visiem kontroles grupas cāļiem bija garīgas depresijas, elpošanas traucējumu, caurejas klīniskas pazīmes un tās nomira no 5- līdz 6-dpc, un nebija klīnisku pazīmju un nebija mirušu cāļu rcHR{ {4}}CI, rcHR09-CII un La Sota grupas līdz 14 dpc (6. attēls), kas parādīja, ka visi himēriskie NDV un La Sota vakcīnas celms var nodrošināt pilnīgu aizsardzību pret VII genotipa NDV infekciju.

6. attēls. Himēriskais NDV rcHR09-CI un rcHR09-CII nodrošina pilnīgu aizsardzību pret ZJ1 izaicinājumu. 3 nedēļas pēc imunizācijas cāļi tika inficēti ar 106 EID50 ZJ1 celmiem. Izdzīvošanas statuss tika uzraudzīts kopumā 14 dienas.

4. Diskusija

Neskatoties uz to, ka pasaulē tiek izmantotas dažādu veidu NDV vakcīnas, ND joprojām notiek daudzās pasaules vietās. Viena problēma varētu būt, ka vakcīnas celma genotips neatbilst izplatītajam celmam. Šīs vakcīnas, kas neatbilst genotipam, var nodrošināt zināmu aizsardzību pret virulentu NDV infekciju; tomēr tie nevar aizsargāt cāļus no infekcijas un nevar efektīvi samazināt vīrusu izplatīšanos [25,26]. II klases VII genotips NDV ir galvenais genotips, kas izplatīts Tuvo Austrumu, Āfrikas un Āzijas reģionos; tomēr šajās vietās izmantotās vakcīnas parasti ir II genotipa La Sota un B1 celmi, kas nav tas pats genotips ar izplatītajiem celmiem [27–29]. Šajā pētījumā, lai radītu termostabilu VII genotipam atbilstošu vakcīnas kandidātu, par pamatu tika izmantots termostabils VIII genotipa HR09 celms, un tika konstruēti divi kimēriski VII genotipam atbilstošie vakcīnas kandidāti, lai apmierinātu vajadzību pēc VII genotipa vakcīnas. Līdz šim ir izstrādāti vairāki termostabilas NDV vakcīnas kandidāti. Pirmais termostabils NDV V4 tika izolēts no cāļu proventriculus 1966. gadā [30]. V4 bija dabisks lentogēns celms, un filoģenētiskās analīzes rezultāti parādīja, ka tas pieder pie II genotipa NDV. Atšķirībā no V4 mūsu pētījumā izmantotais termostabilais celms HR09 piederēja virulentam celmam [14]. Ja mēs vēlamies to nodot klīniskai lietošanai, vispirms ir jānosaka, kā to padarīt par avirulentu celmu. Pateicoties reversās ģenētiskās sistēmas attīstībai, avirulentu genotipam atbilstošu NDV vakcīnu kandidātu konstruēšana ir sasniegusi ievērojamu progresu. Tā kā ir pierādīts, ka F proteīna šķelšanās vieta ir galvenais NDV virulences noteicējs [31], vienkāršs veids, kā radīt novājinātu NDV, ir aizstāt F proteīna šķelšanās vietu virulentajā celmā ar avirulentā celma šķelšanās vietu. Tikmēr ir ziņots, ka F proteīns ir svarīgs imunoģenētisks proteīns, kas var izraisīt neitralizācijas antivielu, lai aizsargātu imunizētos cāļus pret virulentu NDV [32–34]. Turklāt tika ziņots, ka NDV šķelšanās vieta var ietekmēt imūnreakciju imunizētiem cāļiem [11]. Šajā pētījumā termostabilā HR09 F gēnu aizstājām ar NDV VII genotipa virulentā DT-2014 celma F gēnu; tikmēr DT-2014 šķelšanās vietas arī tika mutētas pret avirulentajiem I un II klases NDV celmiem (1. attēls).

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Kā gaidīts, virulences noteikšanas rezultāti parādīja, ka abi himēriski termostabilie NDV ir ļoti novājināti (1. Tikmēr tika arī konstatēts, ka abiem himēriskajiem NDV bija līdzīga augšanas kinētika kā viņu vecāku HR09 celmam (3.A attēls). Tā kā HN proteīns bija galvenais proteīns, kas bija atbildīgs par HR09 termostabilitāti, abi himēriskie NDV joprojām saglabāja termostabilitāti tāpat kā viņu vecāku HR09 celms (3.B attēls). Vairākos pētījumos ir ziņots, ka genotipam atbilstoša NDV vakcīna var izraisīt augstāku humorālās imunitātes reakcijas līmeni un ir efektīvāka vīrusu izplatības samazināšanā nekā heterologa vakcīna, neskatoties uz to, ka gan genotipam atbilstoša, gan heterologā vakcīna var aizsargāt inficētos cāļus no acīmredzamām klīniskām pazīmēm un nāve [35-37]. Šajā pētījumā HI antivielu titrs tika mērīts pie 7-, 14- un 21-dpi, antivielu titra rezultāti pret imunizēto vilcienu liecināja, ka nav būtiskas atšķirības starp rcHR{ {13}}CI, rcHR09-CII un La Sota celmi (4.A attēls), savukārt HI antiviela pret VII genotipa ZJ1 celmu parādīja, ka divi termostabilie himēriskie NDV inducēja ievērojami augstāku līmeni nekā La Sota celms, un starp visiem trim imunizētajiem NDV rcHR09-CI izraisīja augstāko HI antivielu līmeni (4.B attēls). Šis rezultāts atbilda iepriekšējiem ziņojumiem, ka F proteīna šķelšanās vieta var ietekmēt vakcīnas kandidātu imunitātes reakciju cāļiem. VII genotipa ZJ1 izaicinājuma eksperiments parādīja, ka visas trīs imunizētās grupas uzrādīja būtisku vīrusu izdalīšanās samazināšanos, salīdzinot ar kontroles grupu, un divi himēriski termostabilie NDV varētu samazināt vīrusa izplatību efektīvāk nekā La Sota celms (5. attēls). Izdzīvošanas līkne parādīja, ka visi rcHR09-CI, rcHR09-CII un La Sota celmi var nodrošināt pilnīgu aizsardzību pret ZJ1 celma izraisītu iedarbību (6. attēls). Apvienojumā šie dati parādīja, ka divi šajā pētījumā izveidotie VII genotipa saskaņotie himēriskie NDV varētu nodrošināt efektīvu aizsardzību pret VII genotipa ZJ1 celma izaicinājumu un varētu samazināt vīrusa izplatīšanos efektīvāk nekā La Sota celms. Rezumējot, šajā pētījumā tika izveidotas divas termostabilas himēriskas NDV vakcīnas kandidātes, kas izmanto termostabilo VIII genotipa NDV virulento HR09 celmu kā mugurkaulu un aizstāja tā F gēnu ar VII genotipa DT-2014 celmu. Tikmēr DT-2014 F proteīna šķelšanās vieta tika attiecīgi mutēta no 112RRQRR↓F 117 uz 112ERQER↓L 117 un 112GRQGR↓L 117. Abi himēriskie NDV saglabā HR09 termostabilitāti, un MDT un ICPI virulences testi liecina, ka tie ir veiksmīgi novājināti. Abi himēriskie NDV varētu izraisīt augstu antivielu atbildes reakciju, ievērojami samazināt vīrusu izplatīšanos un nodrošināt pilnīgu aizsardzību pret virulentā VII genotipa ZJ1 celma izaicinājumu.

Atsauces

1. Dimitrovs, KM; Ābolņiks, C.; Afonso, CL; Albīna, E.; Bāls, J.; Bergs, M.; Briand, FX; Brauns, IH; Čoi, KS; Čvala, I.; un citi. Atjaunināta vienotā filoģenētiskās klasifikācijas sistēma un pārskatīta Ņūkāslas slimības vīrusa nomenklatūra. Inficējiet. Genet. Evol. 2019, 74, 103917. [CrossRef] [PubMed]

2. de Lēvs, O.; Peeters, B. Ņūkāslas slimības vīrusa pilnīga nukleotīdu secība: pierādījumi par jaunas ģints esamību Paramyxovirinae apakšdzimtā. J. ģenerālis Virols. 1999, 80 Pt 1, 131–136. [CrossRef]

3. Czeglédi, A.; Ujvári, D.; Somogyi, E.; Vemans, E.; Verners, O.; Lomniczi, B. Putnu paramiksovīrusa 1. serotipa (Ņūkāslas slimības vīrusa) trešā genoma izmēra kategorija un evolūcijas sekas. Virus Res. 2006, 120, 36–48. [CrossRef]

4. Ganārs, K.; Das, M.; Sinha, S.; Kumar, S. Ņūkāslas slimības vīruss: pašreizējais stāvoklis un mūsu izpratne. Virus Res. 2014, 184., 71.–81. [CrossRef]

5. Kabilovs, MR; Alikina, TY; Jurčenko, KS; Gluščenko, AV; Gunbins, KV; Šestopalovs, AM; Gubanova, NV pilnīgas genoma sekvences diviem Ņūkāslas slimības vīrusa celmiem, kas izolēti no savvaļas pīles un baloža Krievijā. Genoms Nonounc. 2016, 4, e01348-16. [CrossRef]

6. Ren, S.; Xie, X.; Van, Y.; Tongs, L.; Gao, X.; Jia, Y.; Van, H.; Fans, M.; Džans, S.; Sjao, S.; un citi. I klases Ņūkāslas slimības vīrusa celma molekulārais raksturojums, kas izolēts no baloža Ķīnā. Putnu Pathols. 2016, 45, 408–417. [CrossRef]

7. Morisons, TG Paramiksovīrusa saplūsmes proteīna struktūra un funkcija. Biochim. Biofizija. Acta 2003, 1614, 73–84. [CrossRef]

8. Bossarts, KN; Fusko, DL; Broder, CC Paramiksovīrusa ieraksts. Adv. Exp. Med. Biol. 2013, 790, 95–127. [CrossRef]

9. Kolinss, MS; Baširudins, JB; Aleksandrs, dīdžejs Secinātas aminoskābju sekvences Ņūkāslas slimības vīrusu saplūšanas proteīna šķelšanās vietā, kas parāda antigenitātes un patogenitātes atšķirības. Arch. Virol. 1993, 128, 363–370. [CrossRef]

10. Panda, A.; Huangs, Z.; Elankumaran, S.; Rokmans, DD; Samal, SK Sapludinātā proteīna šķelšanās vietas loma Ņūkāslas slimības vīrusa virulentē. Microb. Patogs. 2004, 36, 1.–10. [CrossRef]

11. Kima, SH; Čens, Z.; Jošida, A.; Paldurai, A.; Sjao, S.; Samal, SK Ņūkāslas slimības vīrusa saplūšanas olbaltumvielu šķelšanās vietu sekvenču novērtējums genotipam atbilstošās vakcīnās. PLoS ONE 2017, 12, e0173965. [CrossRef] [PubMed]

12. Manoharan, VK; Varghese, BP; Paldurai, A.; Samal, SK Fūzijas proteīna šķelšanās vietas sekvences ietekme uz VII genotipa Ņūkāslas slimības vīrusa vakcīnas ģenerēšanu. PLoS ONE 2018, 13, e0197253. [CrossRef] [PubMed]

13. Kumar, S.; Najaks, B.; Kolinss, PL; Samal, SK Ņūkāslas slimības vīrusa F un HN proteīnu novērtējums aizsargājošā imunitātē, izmantojot rekombinanto putnu paramiksovīrusa 3. tipa vektoru cāļiem. J. Virols. 2011, 85, 6521–6534. [CrossRef] [PubMed]

14. Cao, Y.; Liu, Q.; Džans, X.; Hu, H.; Wu, Y. Karstumizturīgā Ņūkāslas slimības vīrusa celma HR09 pilnīga genoma secība. Genoms Nonounc. 2017, 5, e01149-17. [CrossRef] [PubMed]

15. Ruāns, B.; Džans, X.; Džans, C.; Du, P.; Mengs, C.; Guo, M.; Vu, Y.; Cao, Y. 315. un 369. atlikumi HN proteīnā veicina Ņūkāslas slimības vīrusa termostabilitāti. Priekšpuse. Microbiol. 2020, 11, 560482. [CrossRef] [PubMed]

16. Ruāns, B.; Liu, Q.; Čens, Y.; Niu, X.; Vangs, X.; Džans, C.; Guo, M.; Džans, X.; Cao, Y.; Wu, Y. Vājināta un karstumizturīga VIII genotipa Ņūkāslas slimības vīrusa vakcīnas kandidāta ģenerēšana un novērtēšana. Poults. Sci. 2020, 99, 3437–3444. [CrossRef]

17. Džans, X.; Bo, Z.; Mengs, C.; Čens, Y.; Džans, C.; Cao, Y.; Wu, Y. Rekombinantā termostabilā Ņūkāslas slimības vīrusa ģenerēšana un novērtēšana, kas izsaka H9N2 putnu gripas vīrusa HA. Vīrusi 2021, 13, 1606. [CrossRef]

18. Veņs, G.; Čens, C.; Guo, J.; Džans, Z.; Šans, Y.; Šao, H.; Luo, Q.; Jans, Dž.; Van, H.; Van, H.; un citi. Jauna termostabila Ņūkāslas slimības vīrusa vakcīnas vektora izstrāde heterologa gēna ekspresijai. J. ģenerālis Virols. 2015, 96, 1219–1228. [CrossRef]

19. LaBarre, DD; Lowy, RJ Vīrusa titra aprēķinu metožu uzlabojumi no TCID50 un aplikuma testiem. J. Virols. Methods 2001, 96, 107–126. [CrossRef]

20. Aleksandrs, DJ Ņūkāslas slimība un citi putnu paramiksovīrusi. Rev. Sci. Tehn. Int. Izslēgts. Epizoot. 2000, 19, 443–462. [CrossRef]

21. Yu, XH; Čens, JL; Sjue, Dž.; Jin, JH; Dziesma, Y.; Džao, Dž.; Džans, GZ ar polimerāzi saistīto proteīnu gēnu lomas Ņūkāslas slimības vīrusa virulencei. Priekšpuse. Microbiol. 2017, 8, 161. [CrossRef] [PubMed]

22. Maamary, J.; Masīvs, F.; Gao, Q.; Garsija-Sastre, A.; Steinman, RM; Palese, P.; Nchinda, G. Ņūkāslas slimības vīruss, kas ekspresē dendritisko šūnu HIV gag proteīnu, izraisa spēcīgu gag specifisku imūnreakciju pelēm. J. Virols. 2011, 85, 2235–2246. [CrossRef] [PubMed]

23. Eid, AAM; Huseins, A.; Hasaņins, O.; Elbakrejs, RM; Daines, R.; Sadejens, J.-R.; Abdien, HMF; Chrzastek, K.; Iqbal, M. Ņūkāslas slimības VII genotipa izplatība mājputnu un savvaļas putnu vidū Ēģiptē. Vīrusi 2022, 14, 2244. [CrossRef] [PubMed]

25. Hejazi, Z.; Tabatabaeizadeh, SE; Torogi, R.; Farzins, H.; Saffarian, P. Pirmā Ņūkāslas slimības vīrusa XIII.2.1 apakšgenotipa noteikšana un raksturojums, kas izolēts no piemājas cāļiem Irānā. Veterinārs. Med. Sci. 2022, 8, 2521–2531. [CrossRef] [PubMed]

25. Tsai, HJ; Čangs, KH; Tseng, CH; Frost, KM; Menvels, RJ; Aleksandrs, dīdžejs Taivānā no 1969. līdz 1996. gadam izolētu Ņūkāslas slimības vīrusu antigēns un genotipiskais raksturojums. Vet. Microbiol. 2004, 104, 19.–30. [CrossRef]

26. Kapčinskis, DR; King, DJ Cāļu aizsardzība pret atklātu klīnisku slimību un vīrusu izplatības noteikšana pēc vakcinācijas ar komerciāli pieejamām Ņūkāslas slimības vīrusa vakcīnām, inficējot ar ļoti virulentu vīrusu no Kalifornijas 2002. gada eksotiskās Ņūkāslas slimības uzliesmojuma. Vakcīna 2005, 23, 3424–3433. [CrossRef] [PubMed]

27. Čo, SH; Kims, SJ; Kwon, HJ Korejā izolēta Ņūkāslas slimības vīrusa antigēna varianta genomiskā secība. Virus Genes 2007, 35, 293–302. [CrossRef]

28. Khan, TA; Rue, Kalifornija; Rehmani, SF; Ahmeds, A.; Vasiļenko, JL; Millers, PJ; Afonso, CL Ņūkāslas slimības vīrusa izolātu no Pakistānas filoģenētiskais un bioloģiskais raksturojums. Dž.Klins. Microbiol. 2010, 48, 1892–1894. [CrossRef]

29. Liu, Y.; Saule, C.; Čī, M.; Veņs, H.; Džao, L.; Dziesma, Y.; Liu, N.; Wang, Z. Ņūkāslas slimības vīrusa no Ķīnas ģenētiskais raksturojums un filoģenētiskā analīze. Inficējiet. Genet. Evol. 2019, 75, 103958. [CrossRef]

30. Simmons, GC Ņūkāslas slimības vīrusa izolēšana Kvīnslendā. Aust. Veterinārs. J. 1967, 43, 29–30. [CrossRef]

31. Tojoda, T.; Sakaguči, T.; Imai, K.; Inocencio, NM; Gotoh, B.; Hamaguči, M.; Nagai, Y. Sapludinātā glikoproteīna šķelšanās aktivācijas vietas strukturālais salīdzinājums starp virulentiem un avirulentiem Ņūkāslas slimības vīrusa celmiem. Virusoloģija 1987, 158, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

32. Dings, L.; Čens, P.; Bao, X.; Li, A.; Dzjans, Y.; Hu, Y.; Ge, J.; Džao, Y.; Vangs, B.; Liu, J.; un citi. Rekombinantie pīļu enterīta vīrusi, kas ekspresē Ņūkāslas slimības vīrusa (NDV) F gēnu, aizsargā cāļus no letālas NDV infekcijas. Veterinārs. Microbiol. 2019., 232., 146.–150. [CrossRef] [PubMed]

33. Jia, W.; Džans, X.; Van, H.; Tengs, K.; Sjue, Dž.; Džans, G. Rekombinantā tītara herpesvīrusa vakcīnas celma, kas ekspresē VII genotipa Ņūkāslas slimības vīrusa saplūšanas proteīnu, uzbūve un imūnā efektivitāte. Veterinārs. Microbiol. 2022, 268, 109429. [CrossRef] [PubMed]

34. Šao, Y.; Saule, J.; Han, Z.; Liu, S. Rekombinantā infekciozā laringotraheīta vīruss, kas ekspresē Ņūkāslas slimības vīrusa F proteīnu, aizsargā cāļus pret infekciozo laringotraheīta vīrusu un Ņūkāslas slimības vīrusa izaicinājumu. Vakcīna 2018, 36, 7975–7986. [CrossRef]

35. Millers, PJ; Karalis, dīdžejs; Afonso, CL; Suarez, DL Antigēnās atšķirības starp dažādu genotipu Ņūkāslas slimības vīrusu celmiem, ko izmanto vakcīnas formulēšanā, ietekmē vīrusu izplatīšanos pēc virulentas iedarbības. Vakcīna 2007, 25, 7238–7246. [CrossRef]

36. Mohameds, MH; Abdelazizs, AM; Kumar, S.; Al-Habib, MA; Megahed, MM Velogēnās Ņūkāslas slimības vīrusa izaicinājuma filoģenētiskās daudzveidības ietekme uz vīrusa izplatīšanos pēc homologās un heterologās DNS vakcinācijas cāļiem. Putnu Pathols. 2016, 45, 228–234. [CrossRef]

37. Vadžids, A.; Bašarats, A.; Bibi, T.; Rehmani, SF Aizsardzības un vīrusu izplatīšanās salīdzinājums pēc vakcinācijas ar dažādu genotipu Ņūkāslas slimības vīrusa celmiem, ko izmanto vakcīnas formulēšanā. Trop. Anim. Health Prod. 2018, 50, 1645–1651. [CrossRef]