Bletilla Striata potenciālo anti-melanogēno aktīvo sastāvdaļu atklāšana un identificēšana

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Huan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 un Hongjiang Chen1,2*

Abstrakts

Fons:Bletilla striata ir daudzu ādas balināšanas klasisko formulu galvenās zāles tradicionālajā ķīniešu medicīnā (TCM), un pēdējā laikā to plaši izmanto kosmētikas rūpniecībā. Tomēr tā aktīvās sastāvdaļas joprojām ir neskaidras, un tās šķiedrainās saknes netiek izmantotas efektīvi. Šī pētījuma mērķis ir atklāt un identificēt tā potenciālās anti-melanogēnās aktīvās sastāvdaļas, izmantojot zebrafish modeli un molekulāro dokstaciju.

Metodes:Theantioksidantsaktivitātes tika novērtētas pēc 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) radikāļu attīrīšanas aktivitātes, 2,2′-azino-bis-(3-etilbentiazolīna-6-sulfonskābes) (ABTS) ) radikālas attīrīšanas aktivitāte un dzelzs samazināšanaantioksidantsjaudas (FRAP) tests. Anti-melanogēno aktivitāti novērtēja artirozināzeinhibējošsaktivitātein vitro un melanīnu inhibējošs zebrafish. Ķīmiskie profili tika veikti ar īpaši augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju apvienojumā ar kvadrupola lidojuma laika tandēma masas spektrometriju (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Tikmēr potenciālās anti-melanogēnās aktīvās sastāvdaļas tika īslaicīgi identificētas ar molekulāro dokstaciju.

Rezultāti:B. striata šķiedru sakņu (EFB) 95% etanola ekstraktam bija visspēcīgākās DPPH, ABTS, FRAP un tirozināzes inhibējošās aktivitātes ar IC50 5,94 mg/L, 11,69 mg/L, 6,92 mmol FeSO4/g, un attiecīgi 58,92 mg/l. Turklāt EFB un 95% etanola ekstrakts no B. striata bumbuļiem (ETB) būtiski samazināja melanīna sintēzi zebrafishembryos atkarībā no devas. No EFB un ETB provizoriski tika identificēti 39 ķīmiskie sastāvi, tostarp 24 stilbenoīdi. Molekulārā dokošana norādīja, ka 83 (tostarp 60 stilbenoīdus) un 85 (tostarp 70 stilbenoīdus) savienojumi uzrādīja spēcīgāku saistīšanās afinitāti pret tirozināzi un adenilāta ciklāzi.

Secinājums:Šie atklājumi apstiprināja pamatojumu EFB un ETB izmantošanai kā dabiskus ādas balināšanas līdzekļus farmācijas un kosmētikas rūpniecībā.

Atslēgvārdi: Bletilla striata, Antioksidants, Anti-melanogēna aktivitāte, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafish, Molekulārā doka

Noklikšķiniet, lai uzzinātu par blakusparādībām un antioksidantu ieguvumiem

Fons

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. ir daudzgadīgs zālaugu augs, kas plaši izplatīts Āzijā, piemēram, Ķīnā, Korejā un Japānā [1]. Žāvēti B. striata bumbuļi, kas pazīstami arī kā Baiji, pirmo reizi ierakstīti Shennong's Classic of Materia Medica, ir plaši izmantoti kā tradicionālā ķīniešu medicīna (TCM) tūkstošiem gadu Ķīnā. Ķīniešu farmakopejās teikts, ka tai piemīt savelkoša spēja hemostāzē un pretsāpju gadījumā, tāpēc to plaši izmantoja hematemēzes, hemoptīzes, traumatiskas asiņošanas, čūlu, pietūkuma un sasprēgājušas ādas ārstēšanai [2, 3]. Farmakoloģiskie pētījumi parādīja, ka B. striata piemīt plašs bioloģisko aktivitāšu spektrs, piemēram, brūču dzīšana [4, 5], pretčūlu [6, 7], hemostatiska [8],anti-iekaisums[9], antioksidants[10], antibakteriāls [11], pretgripas vīruss [12] un pretnovecošanās līdzeklis [13]. Tajā pašā laikā B. striata satur dažādas ķīmisko sastāvu klases, t.skpolisaharīdi[14], bibenzili, fenantrēni, antrahinoni,flavonoīdi, un 2-izobutilmalāti [3, 15] utt.

B. striata ir galvenās zāles daudzām ādas balināšanas klasiskajām formulām TCM [16], un pēdējā laikā to plaši izmanto kosmētikas rūpniecībā [17]. Tomēr tā aktīvās sastāvdaļas joprojām ir neskaidras, un pat daži pētījumu rezultāti bija pretrunīgi. Piemēram, Chenet al. norādīja, ka 95 procentiem B. striata etanola ekstrakta bija augstāka tirozināzes inhibējošā aktivitāte nekā tā ūdens ekstraktam ar inhibīcijas līmeni 68,36 procenti in vitro[18], savukārt Huang et al. parādīja, ka B. striata ūdens ekstrakta inhibējošā aktivitāte pret tirozināzi bija spēcīgāka nekā 95% etanola ekstrakta inhibīcijas līmenis 62% in vitro [19]. Luetal[20] un Linghuetal[21] pētījuma rezultāti parādīja, ka gan ūdens, gan 95% B. striata etanola ekstrakts, īpaši tā hloroforma frakcionēšana, var kavēt B16 šūnu augšanu un izraisīt to apoptozi atkarībā no koncentrācijas.

Tā kā tirozināzes inhibīcijas un melanomas šūnu līniju in vitro testi neietvēra sarežģītus fizioloģiskos in vivo apstākļus un testa parauga uzsūkšanos, metabolismu, izplatību un izdalīšanos, daudziem paraugiem bija nozīmīga inhibējoša aktivitāte pret tirozināzes un melanomas šūnu līnijām. tomēr in vitro bija vāji efektīva vai pat neefektīva in vivo [22,23]. Glabridīnam bija ievērojama tirozināzes inhibējošā aktivitāte ar IC50 0,43 μmol/L, kas bija 176 reizes spēcīgāka nekā kojskābei. Tomēr tā in vivo neietekmēja zebrafish pigmentāciju[24].

Tikmēr B. striata šķiedru saknes (FB) bija blakusprodukti, kas radās B. striatatuber (TB) apstrādes laikā. Mūsdienu pētījumi liecina, ka FB satur līdzīgus savienojumus ar tuberkulozi un ar lielāku fenola saturu [25]. Turklāt FB ekstrakta antibakteriālās [26], antioksidanta un antitirozināzes aktivitātes bija spēcīgākas nekā TB ekstraktam [25]. Tomēr FB resursi netika efektīvi izmantoti un tika pamesti lauksaimniecības zemē, kas noveda pie FB resursu izšķērdēšanas un vides piesārņojuma [27].

Zebrafish (Danio rerio), maza tropu saldūdens zivs, ir jauns dzīvnieku modelis farmakoloģijā

un toksikoloģijas pētījumi in vivo, ar daudzām priekšrocībām, tostarp zemām izmaksām, īsu dzīves ciklu, augstu caurspīdīgumu, viegli kopjamu, augstu auglību un mazāk testējamo paraugu [28, 29]. Turklāt zebrazivs virspusē ir melanīna pigmenti, kas ļauj vienkārši novērot pigmentācijas procesu, un to plaši izmantoja anti-melanogēnajā pētījumā [28, 30].

Šajā pētījumā mēs salīdzinājām TB un FB neapstrādāta polisaharīda un 95% etanola ekstrakta antioksidantu un tirozināzes inhibējošās aktivitātes in vitro un anti-melanogēnās aktivitātes zebrafish modelī. Tikmēr potenciālās anti-melanogēnās aktīvās sastāvdaļas tika īslaicīgi identificētas ar molekulāro dokstaciju. Mēs atklājām, ka 95 procentiem TB (ETB) un FB (EFB) etanola ekstrakta piemīt ievērojamas antioksidanta un antitirozināzes aktivitātes, un tas var samazināt melanīna sintēzi zebrafish embrijos atkarībā no devas. Tādējādi ETB un EFB var izmantot kā dabīgus ādas balināšanas līdzekļus farmācijas un kosmētikas rūpniecībā.

Metodes

Ķīmiskās vielas un reaģenti

Tirozināze, 3-(3,4-dihidroksifenil)-L-alanīns (L-DOPA) un arbutīns tika iegādāti no Aladdin reaģentu uzņēmuma (Šanhaja, Ķīna).2,2-difenils{{8 }}pikrilhidrazils (DPPH), 2,2′-azinobis-(3-etilbentiazolīns-6-sulfonskābe) (ABTS), 6-hidroksi-2,5,7 ,8-tetrametilhromāna-2-karbonskābe (Trolox) un 2,4,6-tris(2-piridil)-s-triazīns (TPTZ) tika iegādāti no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV). Acetonitrils un metanols (HPLC pakāpe) tika iegādāti no Tedia (Fairfield, OH, ASV). Dejonizēto ūdeni sagatavoja Milli-Q ūdens sistēma (18, 2 MΩ, Millipore, ASV).

Augu savākšanas un ekstrakcijas procedūra

B. striata tika savākta no Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Kudžou, Džedzjana, Ķīna). Vaučeru paraugi tika deponēti Džedzjanas Farmācijas koledžas herbārijā (piekļuves numurs 190615). Viss augs tika sadalīts bumbuļos un šķiedrainās saknēs. Pēc tam tie tika sagriezti mazos gabaliņos un attiecīgi žāvēti ar vakuuma žāvēšanu.

Žāvētos un pulverveida paraugus (TB un FB) trīs reizes ekstrahēja ar 95% etanolu (katru reizi 1,5 stundas). Ekstrakts tika filtrēts, izmantojot What man filtrpapīru (Nr.1). Filtrāts tika koncentrēts līdz sausumam rotācijas iztvaicētājā (Hei-VAP, Heidolph, Vācija) 50 grādos un pēc tam tika žāvēts ar vakuuma saldēšanas žāvētāju. TB (ETB) un FB (EFB) ekstrakcija ar etanolu bija attiecīgi 5,21 un 6,53 procenti. Thedregs tika izmantoti, lai ekstrahētu neapstrādātu polisaharīdu, disperģējot 80 grādu ūdenī 4 stundas un izgulsnējot ar etanolu [31]. TB (PTB) un FB (PFB) polisaharīdu iznākums bija attiecīgi 14,75 un 6,45 procenti.

cistanche ekstrakts

Ķīmiskā analīze

Ķīmiskā analīze tika veikta, izmantojot īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju, kas apvienota ar kvadrupola lidojuma laika tandēma masas spektrometriju (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Hromatogrāfiskā atdalīšana tika veikta ar Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, ASV) ar WatersBEH Shield RP C18 kolonnu (100×2,1 mm, 1,7 μm) pie 3{ {43}} grāds . Kustīgā fāze sastāvēja no 0,1 procenta skudrskābes ūdenī (A) un acetonitrila (B), ar lineāru gradientu: 0–3 minūtes, 5–16 procenti B; 3–8 minūtes, 16–30 procenti B; 8–10 min, 30–35 procenti B; 10–15 min, 35–55 procenti B; 15–18 min, 55–80 procenti B;18–19 min, 80–5 procenti B; 19–20 min, 5 procenti B. Plūsmas ātrums bija 0,3 ml/min, un injekcijas tilpums bija 2 μL.

TOF-MS/MS eksperimenti tika veikti, izmantojot AB SCEIX Triple TOF 5600 masas spektrometriju (AB SCIEX, Foster City, CA, ASV), kas aprīkots ar aneelektrosmidzināšanas jonizāciju (ESI). MS noteikšana tika veikta ar negatīvās jonizācijas metodi. Parametri tika iestatīti šādi: avota un desolvatācijas temperatūra bija attiecīgi 100 grādi un 450 grādi; desolvatācijas gāzes plūsmas ātrums bija 900L/h; kapilārais spriegums bija 2kV; konusa spriegums bija 40 V; sadursmes enerģija bija 22 eV; un pilnie skenēšanas spektri bija no 100 līdz 2000 Da.

Antioksidantu testi DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitāte

DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika noteikta saskaņā ar Ali et al. ar nelielām modifikācijām [32]. Īsumā, 50 μL testa parauga šķīduma tika sajaukti ar 150 μLDPPH etanola šķīdumu (0,2 mM) 96-iedobju plāksnēs un tika turēti tumsā 30 minūtes. . Maisījuma absorbcija pie 517 nm (A1) tika novērtēta ar mikroplates spektrofotometru (Thermo Fisher Scientific, Amerika). Tukšais šķīdums bez testa parauga, kas sajaukts ar DPPH etanola šķīdumu, tika iestatīts kā pozitīvā grupa (A0). Tukšais šķīdums bez DPPH, kas sajaukts ar testa parauga šķīdumu, tika iestatīts kā tukšā grupa (A2). Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. DPPH radikāļu attīrīšanas ātrums tika aprēķināts, izmantojot šādu formulu:

DPPH radikāļu noņemšanas ātrums (procentos) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 procenti.

ABTS radikālas attīrīšanas darbība

ABTS radikāļu attīrīšanas spēja tika mērīta, izmantojot metodi, ko aprakstīja Ali et al. [32]. Īsumā, 7mMABST ūdens šķīdums tika sajaukts ar 2, 45 mM kālija persulfātu proporcijā 1: 1 (v / v) un inkubēts istabas temperatūrā tumsā 16 stundas, lai iegūtu ABST plus izejas šķīdumu. Izejas šķīdums tika atšķaidīts ar fosfātu buferšķīdumu (PBS), lai pielāgotu absorbciju (0,72±0.2) pie 734 nm. 20 μL testa paraugi dažādās koncentrācijās tika rūpīgi sajaukti ar 180 μL ABTS plus šķīdumu. Reaktīvie maisījumi tika turēti tumsā 5 minūtes un pēc tam mērīja absorbciju (B1) pie 734 nm. Maisījumu absorbcija bez testa parauga un ABST plus tika iestatīta attiecīgi kā B un B . Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. ABTS radikāļu attīrīšanas ātrums tika aprēķināts pēc šādas formulas:

ABTS radikālas noņemšanas ātrums (procenti ) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 procenti .

Dzelzs reducējošo antioksidantu jaudas tests (FRAP)

Dzelzs dzelzs reducējošā aktivitāte tika noteikta saskaņā ar Kosakowska et al. [33]. 300 mM acetāta buferšķīdums, 10 mM TPTZ (2,4, 6-tris (2-piridil)-s-triazīns) un 20 mM FeCl3 tika sajaukti pie (v/v/v) attiecība 10:1:1, lai sagatavotu darba reaģentu. 100 μL katra testa parauga šķīduma tika sajaukti ar 100 μL TPTZ darba reaģentu, inkubēti 37 grādu temperatūrā 20 minūtes un absorbcija tika noteikta pie 593 nm. Tikmēr kalibrēšanas līknes sagatavošanai tika izmantota virkne FeSO4 standartšķīdumu koncentrācijas diapazonā no 0 līdz 1000 ug / ml. Dzelzs reducējošās spējas tika aprēķinātas, veidojot intensīvu Fe2 plus -TPTZ zilo kompleksu. Rezultāti tika izteikti kā Fe2 plus antioksidanta kapacitāte (mmol FeSO4/g ekstrakta).

Tirozināzes inhibējošā aktivitāte

Tirozināzes inhibējošās aktivitātes tika noteiktas ar spektrofotometrisko metodi, izmantojot L-DOPA kā substrātu [34]. Īsumā, 50 μL parauga šķīdumi dažādās koncentrācijās tika sajaukti ar 50 μL tirozināzes (200 vienības/ml, šķīdinātāja pH 6,8 fosfāta buferis) 96-iedobē. plāksnes un inkubē 15 minūtes 25 grādu temperatūrā. Pēc tam reakcija tika uzsākta, pievienojot L-DOPA (50 μL). Pēc 30 minūšu inkubācijas 25 grādu temperatūrā absorbcija pie 490 nm (Aa) tika noteikta, izmantojot multiskan debess mikroplates spektrofotometru (ThermoFisher Scientific, Amerika). Līdzīgi, vienlaikus tika konstatēta absorbcija šīm parauga iedobēm bez tirozināzes (Ab) un kontroles iedobēm ar enzīmu, bet bez parauga (Ab). Tirozināzes inhibējošā aktivitāte tika aprēķināta pēc vienādojuma, kā norādīts zemāk:

Tirozināzes inhibīcijas līmenis (procentos)=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 procenti.

IC50 tika aprēķināts, izmantojot GraphPad Prism vienādojumu, kā norādīts tālāk:

Y=min plus (maks. − min)/1 plus 10(x−logIC50) × kalna slīpums

X ir inhibitora koncentrācija; Y atspoguļoja inhibīcijas datus (procentos) kopā ar to minimālo (min) un maksimālo (maksimālo) vērtībām; Kalna slīpums ir slīpuma faktors.

Cistanche inhibē tirozināzes aktivitāti.

Melanīna inhibitors zebrazivīm

Savvaļas tipa AB līnijas zebrafish (nodrošina Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Džedzjanas provincē) tika izmitinātas zivju ūdenī (0,2 procenti tūlītēja okeāna sāls dejonizētā ūdenī, pH 6,9–7,2, vadītspēja 48{). {18}}–510 mS/cm un cietība 53,7–71,6 mg/l CaCO3) 14/10 h gaismas/tumsas fotoperiodā nemainīgā temperatūrā 28±0,5 grādi un divas reizes dienā barojot ar dzīvām sālījumā esošām garnelēm. Zebrafishembryos tika iegūti no dabiskā nārsta un savākti 30 minūšu laikā. Zebrafish testu akreditēja Laboratorijas dzīvnieku aprūpes novērtēšanas un akreditācijas asociācija (AAALAC). Šo pētījumu apstiprināja IACUC (Institucionālā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja) Hunter Biotechnology, Inc., un IACUC apstiprinājuma numurs bija 001458.

Embrijus 6 h pēc apaugļošanas (hpf) stadijā katru ekstraktu apstrādāja sešās koncentrācijās (10, 30, 62,5, 125, 250 un 500 mg/l) 72 stundas, lai novērtētu maksimālo neleālo koncentrāciju (MNLC). ). Rezultātā visa ekstrakta MNLC bija vairāk nekā 62,50 mg/l. 10 embriji tika ievietoti 6-iedobē un tika pakļauti pārbaudītajiem paraugiem 10 un 30 mg/l koncentrācijā no 6 hpf līdz 54 hpf (48 stundu iedarbība ). DMSO (0,05 procenti, tilpums) andarbutīns (10 un 30 mg/l) tika izmantots attiecīgi kā parastā un pozitīvā kontrole.

Sinhronizētie embriji tika savākti un novēroti stereomikroskopā (SZX7, Olympus, Japāna), kas aprīkots ar digitālo kameru (VertA1, Ķīna). Melanīna uzkrāšanās, kas ir tieši saistīta ar zebrafish pigmentācijas apgabaliem, tika aprēķināta, izmantojot GNUImage manipulācijas programmu (GIMP versija 2.10.2), un izteikta procentos attiecībā pret negatīvo kontroli (melanīna uzkrāšanās 100 procenti) [28, 30].

Molekulārās dokstacijas pētījums

Literatūrā no B. striata izdalīti 158 savienojumi[2], tostarp 19 glikozīdi, 28 bibenzili, 19 fenāntrēni, 18 bifenantrēni, 23 dihidrofenantrēni, 5 antocianīni, 11 steroīdi, 8 triterpenoīdi, ponīnskābes, 51 kvinīns. un 10 citi savienojumi tika izmantoti kā ligandi. 3D struktūras uzzīmēja ar ChemBio3D un tika optimizētas, izmantojot MM2 un Autodock Tools. Tirozināzes (PDBID: 5M8N) un adenilāta ciklāzes (PDB ID: 5IV3) 3D kristāla struktūra tika iegūta no RCSB proteīnu datu bankas (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Visas ūdens molekulas un heteroatomi tika noņemti no kristāla struktūrām, izmantojot Chimera un MGL rīkus. Visbeidzot, Autodock

Vina tika izmantota, lai savienotu receptoru proteīnu ar mazo molekulu ligandiem. Receptoru proteīna dokstacijas vietas parametri tika iestatīti attiecīgi kā –36.700, 7.034, –19.104 un – 17.467, – 22.807, 2.786 saskaņā ar sākotnējo ligandu mimozīnu un LRE1 [35]. Lai sasniegtu augstāku skaitļošanas precizitāti, katram receptoram tika ģenerēti 20 izsmeļoši parametri, un konformācija ar augstāko afinitāti tika izvēlēta kā galīgā dokstacijas konformācija un vizualizēta Pymol2.3. Tikmēr sākotnējie ligandi mimozīns un LRE1 tika uzskatīti par pozitīvo kontroli [36].

In silico ADMET prognoze

Trīs labākajiem B. striata trāpījumiem bija labāka saistīšanās afinitāte ar tirozināzi un adenilāta ciklāzi, un tiem tika veikta ADMET analīze. QikProp programmā Schrodingersuite tika izmantots, lai aprēķinātu to fizikālās īpašības un ar zālēm saistītās īpašības, tostarp molekulmasu (MW), paredzamo oktanola/ūdens sadalījuma koeficientu (QPlogPo/w), paredzamo šķīdību ūdenī (QPlogS), paredzamo šķietamo Caco-2 šūnu. zarnu-asins barjeras (QPPCaco) caurlaidība, paredzamais smadzeņu/asins sadalījuma koeficients (QPlogBB), paredzamā ādas caurlaidība (QPlogKp), paredzamā IC50 HERGK plus kanālu bloķēšanai (QPlog HERG) un paredzamā cilvēka oralabsorbcija. Īpašības tika novērtētas, pamatojoties uz Lipin-ski pieci likumu un literatūru [37, 38].

Molekulārās dinamikas simulācija

Lai pārbaudītu ligandu-olbaltumvielu kompleksa stabilitāti un dinamiskās svārstības simulētā bioloģiskajā vidē un tālāk apstiprinātu dokstacijas rezultātus, savienojumi blestrīns D (75) tika izvēlēti par ligandu molekulārās dinamikas (MD) simulācijas pētījumam, pamatojoties uz molekulārās dokstacijas rezultāts. Blestrīna D kompleksam ar tirozināzi un adenilāta ciklāzi tika veiktas MD simulācijas un darbojās 100 ns, izmantojot TIP3P ūdens režīmu. Tika aprēķinātas olbaltumvielu mugurkaula atomu vidējās kvadrātiskās novirzes (RMSD) vērtības attiecībā pret sākotnējo struktūru, lai pārbaudītu proteīna stabilitāti simulācijas perioda laikā [39].

Rezultāti

Ķīmiskais sastāvs

Tipiskās ETB un EFB bāzes pīķa hromatogrammas ir parādītas 1. attēlā. Sastāvdaļu identificēšanai tika izmantota programmatūra PeakView. Molekulārā formula tika precīzi piešķirta ar masas kļūdu 10 ppm. Precīza molekulmasa un fragmenti tika izmantoti, lai identificētu komponentus saskaņā ar literatūru un bezmaksas ķīmisko struktūru datubāzi, piemēram, ChemSpider un Massbank. Rezultātā no EFB un ETB provizoriski tika identificētas 39 ķīmiskās kompozīcijas, tostarp 24 stilbenoīdi (bibenzili, fenantrēni un to atvasinājumi), 6 glikozīdi, 4 fenolskābes, 3 hinoni, 1 steroīds un 1 cits savienojums. Tajā pašā laikā tika veikta to relatīvā daļēji kvantitatīva noteikšana, mērot katra savienojuma pīķu laukumus MS režīmā, izmantojot ekstrahētās jonu hromatogrammas [40]. Detalizēta informācija par identifikāciju un to relatīvais saturs (siltuma kartes izcēlumi, jo tumšāka krāsa, jo augstāka koncentrācija) tika apkopoti 1. tabulā.

Antioksidanta spēja

Ir labi zināms, ka ultravioletā A (UVA) apstarošana var izraisīt reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos un veicināt pārmērīgu melanoģenēzi ādas šūnās. Dabīgais polifenols bija ROS veidošanās inhibitors un varētu būt atbildīgs par augu ekstraktu anti-melanogēno aktivitāti [41]. , 42]. Tādējādi šajā pētījumā antioksidantu spēja tika novērtēta, izmantojot DPPH, ABTS radikāļu attīrīšanas aktivitāti un FRAPassay. Rezultāti (2. tabula un 2. att.) parādīja, ka EFB (IC50=5.94mg/L) piemīt spēcīgākā DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitāte in vitro, salīdzinot ar PTB(IC50=548.24 mg/L). , PFB (IC50=285.81 mg/L) un ETB(IC50=65.25 mg/L). Līdzīga tendence tika novērota ABTS un FRAP testā. 95% TB un PB etanola ekstraktiem in vitro bija spēcīgāka antioksidācijas aktivitāte nekā to neapstrādātajiem polisaharīdiem. Turklāt EFB uzrāda spēcīgāku antioksidācijas aktivitāti nekā ETB, kas atbilst iepriekšējo pētījumu rezultātiem [25].

Tirozināzes inhibējošā aktivitāte

Tirozināze bija galvenais ātrumu ierobežojošais enzīms melanīna biosintēzes ceļā, un to plaši izmantoja, lai identificētu dabisko produktu potenciālu ar anti-melanoģenēzes efektu [43]. Rezultāti (3. att.) parādīja, ka ETB un EPB bija spēcīgāka tirozināzes inhibējošā aktivitāte nekā PTB un PPB in vitro, kas atbilst iepriekšējo pētījumu rezultātiem [25]. EFB uzrādīja spēcīgāku tirozināzes inhibīcijas aktivitāti atkarībā no devas (no 20 līdz 200 mg/L) ar IC50=58,92 mg/L nekā ETB(IC50=75,44 mg/L) un pozitīvajam savienojumam arbutīnam(IC{). {11}},02 mg/l).

Melanīna inhibitors zebrazivīm

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), norādot, ka nesēja 0,05 procenti DMSO neietekmēja melanīna veidošanos zebrafijas embrijos. Tomēr pēc 48 stundu ilgas ekspozīcijas ar pārbaudītajiem paraugiem un arbutīnu zebrafijas embrijiem bija dažādas pakāpes melanīna nogulsnēšanās (3.B, 4. att.), izņemot PFB 10 mg/L grupu. Jāatzīmē, ka relatīvais melanīna saturs ETB 10 mg/l (78,38 procenti) un 30 mg/l (64,72 procenti) grupās bija ievērojami zemāks nekā PTB 10 mg/l (93,06 procenti) un 30 mg/l (82,02 procenti) grupās (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Molekulārā dokstacija

Tirozināze ir ātrumu ierobežojošs enzīms melanīna biosintēzē: tirozīna hidroksilācijā par 3,4-dihidroksifenilalanīnu (DOPA) un DOPA todopahinona oksidēšanā. Tāpēc tirozināze tika uzskatīta par kritisku mērķi melanoģenēzes inhibitoru attīstībai [44]. Turklāt adenilateciklāze ir galvenais cAMP inducētās melanoģenēzes enzīms. Melanotropīna alfa polipeptīda (-MSH) saistīšanās ar MC1R receptoriem izraisīja adenilāta ciklāzes aktivāciju, cAMP līmeņa paaugstināšanos, tirozināzes gēna ekspresijas regulēšanu un pēc tam melanīna sintēzes palielināšanos [45]. Tāpēc mēs veicām 158 iepriekš no B. striata izolētu savienojumu molekulāro izpēti [2] ar tirozināzi un adenilāta ciklāzi. Pētīto ligandu saistīšanās enerģijas ar tirozināzi un adenilateciklāzi tika apkopotas S1 tabulā. 83 (tostarp 60 stilbenoīdus) un 85 (tostarp 70 stilbenoīdus) savienojumi uzrādīja spēcīgāku saistīšanās afinitāti pret tirozināzi un adenilāta ciklāzi, salīdzinot ar sākotnējo ligandu mimozīnu (- 6,4 kcal/1cal (-mol)). /mol). 1,8-bis(p-hidroksibenzil)-4-metoksifenantrēns-2, 7-diols (56), blestrīns D (75) un 2,7-dihidroksi -1,6-bis(p-hidroksibenzils)-4-metoksi-9,10-dihidrofenantrēns (93) bija trīs galvenie ligandi, kas vērsti pret tirozināzi ar saistīšanās enerģiju. -10,2, 10,0 un 9,7 kcal/mol, attiecīgi. Savukārt blestrīns D(75), blestrīns B (73) un 3,3′-dihidroksi-5-metoksi-2,5′,6-tris(p-hidroksibenzil)bibenzils (42) bija trīs galvenie ligandi pret adenilāta ciklāzi ar saistīšanas enerģiju attiecīgi – 12,1, – 11,9 un – 11,6 kcal/mol. To teorētiskā saistīšanās afinitāte un ligandu-aminoskābju mijiedarbība ir apkopota 3. tabulā.

Bija vērts atzīmēt, ka blestrīns D (75), bifenantrēna savienojums, iekļuva tirozināzes un adenilāta ciklāzes saistošajā kabatā (5. att.) un uzrādīja ievērojamu saistīšanās afinitāti gan pret tirozināzi, gan adenilāta ciklāzi. Van der Walls mijiedarbība veicina kopējo enerģijas mijiedarbības vērtību, savukārt hidroksilgrupa veido ūdeņraža saites ar attiecīgi aminoskābju atlikumiem Glu 451, tirozināzes Arg114 un adenilāta ciklāzes Val 167 (3. tabula un S1 attēls). pret tirozināzi, veidojot 6 ūdeņraža saites ar aminoskābju atlikumiem Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 un Gln236.

In silico ADMET prognoze

Vairāku svarīgu parametru prognozētās vērtības kopā ar to pieņemamo diapazonu ir apkopotas 4. tabulā. Izņemot QPlogS 3,3′, 5-trimetoksibibenzils, blestrīns B un blestrīns D un QPlogBBof 3,3′,{{6} }trimetoksibibenzils, visas pārējās trīs lielāko trāpījumu aprēķinātās ADMET īpašības bija paredzētajos diapazonos, tikmēr visu trīs labāko trāpījumu QPlog HERG bija mazāks par –5, kas liecina, ka tie ir medikamentu potenciāls lietošanai cilvēkiem. QPlog Kp no visiem trim galvenajiem trāpījumiem gan tirozināzei, gan adenilateciklāzei, izņemot 3,3′,5-trimetoksibibenzilu, bija labvēlīgā diapazonā, norādot, ka šie savienojumi var viegli iekļūt ādā.

Molekulārā dinamiskā simulācija

RMSD diagramma parādīja, ka proteīna-ligandu kompleksa RMSD vērtības visā simulācijas periodā būtiski nesvārstījās. Blestrīna D ar tirozināzi un adenilāta ciklāzes kompleksu RMSD vērtības (6.A att.) tika noteiktas attiecīgi diapazonā no 1,5 līdz 2,8Å un no 2.0 līdz 3,6Å. TheRMSF vērtība, kas atspoguļo katras atlikuma simulācijas elastību. Atlikumi ar augstākām RMSF vērtībām atklāja, ka tie ir elastīgāki (6.B att.). Tika konstatēts, ka aminoskābju atlieku RMSF vērtības cilpas reģionos ļoti svārstās. Kamēr aktīvās vietas atlikumi saglabāja nelielu RMSF vērtību (mazāku par 1.{13}}Å), piemēram, Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 un Arg230in tirozināzē un Val167, Leu102, Phe45, Lys95 un Leu166 a,denylate norādot, ka iesiešanas kabatas tika turētas stabilas. Blestrīna D molekulārā mijiedarbība ar tirozināzi un adenilātciklāzi tika parādīta 7. attēlā.

Saistošās brīvās enerģijas tika aprēķinātas ar molekulārās mehānikas ģeneralizēto dzimušās virsmas laukumu (MM-GBSA) metodi [39]. Paredzamā blestrīna D saistīšanās brīvā enerģija ar tirozināzi un adenilateciklāzi bija attiecīgi –96,94 kcal/mol un –139,69 kcal/mol, kas nozīmē, ka saistīšanās mijiedarbība bija spontāna (5. tabula). Turklāt ieguldījums, kas veicināja ligandu saistīšanos, bija nepolāras solvācijas mijiedarbība, van der Vāls un elektrostatiskā mijiedarbība.

Bija vērts atzīmēt, ka EFB ķīmisko komponentu veidi un saturs bija vairāk nekā ETB. Visu identificēto savienojumu pīķu laukumi EFB bija aptuveni divas reizes lielāki nekā ETB. Militarīns bija visizplatītākais savienojums gan EFB, gan ETB, kam bija nozīmīgas antioksidanta, pretiekaisuma un neiroprotekcijas aktivitātes, un tas tika izvēlēts kā ķīmiskie marķieri B. striata kvalitātes kontrolei Ķīnas farmakopejas 2020. gada izdevumā [46]. Militārā pīķa relatīvais laukums EFB (38,39 × 106) bija nedaudz lielāks nekā ETB (30,48 × 106). Gastrodīns ir plaši pazīstams daudzu ķīniešu augu izcelsmes zāļu savienojums, piemēram, Gastrodia elata, kam ir ievērojama tirozināzes inhibējoša un radikāļu attīrīšanas iedarbība [30]. Gastrodīna relatīvais pīķa laukums EFB (1, 43 × 106) bija nedaudz zemāks nekā ETB (2, 17 × 106).

95% TB un PB etanola ekstraktiem in vitro bija spēcīgāka antioksidācijas aktivitāte nekā to neapstrādātiem polisaharīdiem. Turklāt EFB uzrāda spēcīgāku antioksidācijas aktivitāti nekā ETB, kas atbilda iepriekšējo pētījumu rezultātiem [25]. Šo parādību var saistīt ar to, ka EFB satur augstāku antioksidantu savienojumu līmeni, piemēram, militarīnu un stilbenoīdus (dabisko augu polifenoli). Piemēram, relatīvais pīķa laukums 4,8,4',8'-tetrametoksi-[1,1'-bifenantrēnam]-2,7,2',7'-tetrolam, bifenantrēnam ar četrām fenola hidroksilgrupām, bija 9,15 × 106 FB, bet tas bija 0,01 × 106 TB.

Šajā pētījumā PPB un PTB uzrādīja nelielu tirozināzes inhibīcijas aktivitāti atkarībā no devas. Tomēr tas parādīja, ka PB (satur PPB) ūdens ekstraktā aktivitāte netika konstatēta [25]. Šī parādība var būt saistīta ar atšķirīgu paraugu sagatavošanu. PB ūdens ekstrakts tika izmantots, lai novērtētu tirozināzi inhibējošo aktivitāti Jiang eksperimentā [25], savukārt šajā pētījumā ūdens ekstrakts tika nogulsnēts ar etanolu, lai iegūtu neapstrādātu polisaharīdu.

Nesen zebrafish modelis tika plaši izmantots anti-melanoģenēzes efekta novērtēšanā in vivo [47, 48]. Arbu-tin, hidrohinona glikozīda savienojums, kas sastāv no dažādiem augiem, kas ir komerciāli izmantots kosmētikas rūpniecībā, tika noteikts kā pozitīva kontrole. ETB un EFB anti-melanoģenēzes aktivitātes bija spēcīgākas nekā arbutīnam, norādot, ka ETB un EFB var izmantot kā ādu balinošos līdzekļus kosmētikas rūpniecībā.

Relatīvais blestrīna D pīķa laukums EFB (1,91 × 106) ir aptuveni četras reizes lielāks nekā ETB (0,46 × 10). Savienojuma 56 (8,73 × 106) un 93 (0,64 × 106) relatīvais pīķa laukums EFB ir arī ievērojami lielāks nekā ETB (mazāks par 0,01 × 106 un 0,10 × 106). Tas var būt viens no iemesliem, kāpēc EFB piemīt spēcīgāka anti-melanogēna iedarbība nekā ETB. Interesanti atzīmēt, ka trīs galvenie ligandi pret tirozināzi un adenilātciklāzi pieder pie stilbenoīdiem (bibenziliem, fenantrēniem un to atvasinājumiem). Stilbenoīdi ir dabiskie augu polifenoli, kas pēdējos gados ir izraisījuši lielu interesi to ievērojamās bioaktivitātes dēļ, piemēram, pretiekaisuma, pretmikrobu un antioksidantu aktivitāte [49].Resveratrols ir visizplatītākais stilbenoīds. Iepriekšējie pētījumi norādīja, ka resveratrols un tā atvasinājumi var ievērojami kavēt tirozināzes katalītisko aktivitāti, gēnu ekspresiju un pēctranslācijas modifikācijas. Tādējādi tie izrādījās potenciāli noderīgi kā ādu apgaismojoši un pretnovecošanās līdzekļi kosmētikā [41, 50].

Cistanche izrādījās potenciāli noderīgs kā ādas balināšanas un pretnovecošanās līdzeklis kosmētikā.

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, noklikšķiniet uz attēla.

Secinājumi

Šajā pētījumā tika sistemātiski pētīta B. striatatuber (PTB) un šķiedru sakņu (FPB) neapstrādāta polisaharīda un 95% B. striata bumbuļu (ETB) un šķiedru sakņu (EFB) etanola ekstrakta antioksidanta un anti-melanogēnā aktivitāte. . Rezultāti parādīja, ka EFB bija spēcīgākā DPPH, ABTS radikāļu attīrīšanas un dzelzs dzelzs samazināšanas aktivitāte. Turklāt ETB un EFB var ievērojami samazināt tirozināzes aktivitāti in vitro un melanīna sintēzi zebrafijas embrijum atkarībā no devas. Molekulārā dokstacija liecināja, ka pastāv liels skaits savienojumu, kas galvenokārt piederēja stilbenoīdiem un kuriem ir spēcīgāka saistīšanās afinitāte pret tirozināzi un adenilāta ciklāzi, salīdzinot ar sākotnējā liganda saistīšanās afinitāti. Šie atklājumi apstiprināja ETB un EFB kā dabisko ādas balināšanas līdzekļu izmantošanu farmācijas un kosmētikas rūpniecībā.