Atšķirīgie nodevām līdzīgi receptori Gēnu ekspresija un gliāla reakcija dažādos dabiskā skrepi slimības smadzeņu reģionos 2. daļa

2.2. Neiropatoloģiskās pazīmes aitu hipokampā, kas dabiski inficētas ar Serapie

Ar skrepi inficētajām aitām un kontroles aitām tika sīkāk pārbaudītas četras šādas hipokampu zonas, lai noteiktu visus patoloģiskos marķierus: piramīdas šūnu slāņi CA1, CA3 un CA4 un SLM (3. attēls).

Jaunākie pētījumi liecina, ka piramīdveida šūnu slānim ir svarīga loma atmiņā. Piramīdveida šūnu slānis ir neironāls smadzenēs, kas galvenokārt ir atbildīgs par ārējās vides uztveri un atmiņas uzglabāšanu.

Mācīšanās un atmiņas laikā piramīdas šūnu slānis atbrīvo dažus neirotransmiterus, kas var stimulēt saziņu starp neironiem, tādējādi uzlabojot atmiņas uzglabāšanu un izguvi. Turklāt piramīdveida šūnu slānis var arī pārmeklēt un integrēt informāciju mācīšanās un atmiņas procesā, palīdzot mums ātri apgūt jaunas zināšanas un prasmes.

Pētījumi arī atklāja, ka piramīdveida šūnu slāņa funkcijai un veselībai ir liela ietekme uz atmiņas veiktspēju. Ja piramīdveida šūnu slānis ir bojāts vai ļoti noslogots, atmiņa var tikt ievērojami ietekmēta. Tāpēc mums ir jāpievērš uzmanība piramīdveida šūnu slāņa veselībai un uzturēšanai, lai saglabātu labas mācīšanās un atmiņas spējas.

Ieteikumi piramīdveida šūnu slāņa veselībai un uzturēšanai ietver diētu, vingrinājumus un miegu. Piemēram, ar taukskābēm un antioksidantiem bagāta diēta var palīdzēt veicināt piramīdveida šūnu slāņa veselību; regulāra fiziskā slodze var uzlabot nervu sistēmas darbību un noturību; un labi miega ieradumi var palīdzēt samazināt stresu uz piramīdveida šūnu slāni un veicināt atmiņas nostiprināšanos un atgūšanu.

Īsāk sakot, piramīdveida šūnu slānim ir svarīga loma mācībās un atmiņā. Mums vajadzētu pievērst uzmanību piramīdveida šūnu slāņa veselībai un uzturēšanai, lai uzlabotu mūsu mācīšanās un atmiņas spējas.

Noklikšķiniet uz Zināt īstermiņa atmiņu, kā uzlabot

Tajā pašā laikā mums vajadzētu izvairīties no pārmērīga noguruma un stresa, nodrošināt smadzenēm atbilstošu atpūtas un atveseļošanās laiku, kā arī ļaut mūsu atmiņai nepārtraukti uzlabot un pilnveidot.

Var redzēt, ka mums jāuzlabo atmiņa. Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo tai piemīt antioksidanta, pretiekaisuma un pretnovecošanās iedarbība, kas var palīdzēt samazināt oksidācijas un iekaisuma reakcijas smadzenēs, tādējādi aizsargājot nervu sistēmas veselību. Turklāt Cistanche var arī veicināt nervu šūnu augšanu un atjaunošanos, tādējādi uzlabojot neironu tīkla savienojamību un darbību.

Šie efekti var palīdzēt uzlabot atmiņu, mācīšanās spējas un domāšanas ātrumu, kā arī var novērst kognitīvo disfunkciju un neirodeģeneratīvo slimību rašanos.

3. attēls. Neiropatoloģisku bojājumu (HE), PrPSc nogulsnēšanās, astrogliozes (GFAP) un mikrogliozes (Iba1) izplatība četros dažādos hipokampu reģionos ar skrepi inficētām un kontroles aitām: piramīdas šūnu slāņi CornuAmmonis (CA) 1, 3 un 4 , un stratum lacunosum-moleculare (SLM).

Diagrammas attēlo katra analizētā parametra daļēji kvantitatīvās novērtējuma vērtības. (A) Vieglas sūkļveida izmaiņas tika novērotas visos analizētajos hipokampu reģionos. (B) Intraneironāls PrPSc modelis (L42) CA1, CA3 un CA4 un plaši izplatīts smalki granulēts PrPSc modelis SLM. (C) Paaugstināta Iba1 iekrāsošanās ar skrepi slimām aitām, salīdzinot ar kontroles aitām.

Palielināti attēli parāda dažas novērotās morfoloģiskās atšķirības. (D) Vidēji smagas reaktīvās astrogliozes pazīmes skrepi inficētām aitām salīdzinājumā ar kontrolēm. Rezultāti svārstās no 0 (negatīvs) līdz 5 (maksimālā intensitāte).

Būtiskas atšķirības tika noteiktas, izmantojot Stjudenta t-testu vai Mann-Whitney U testu attiecīgi normāli un neparasti sadalītiem datiem. * p < 0.05, ** p < 0,01. Mēroga josla=200 µm.

Spongioze hipokampā bija ļoti viegla, un neregulāri tika novēroti vakuoli CA1, CA3 un CA4, kā arī SLM (3.A attēls). Šis ierobežotais neironu zudums kontrastēja ar retu, bet fokāli intensīvu PrPSc nogulsnēšanos CA1 un CA3 (3.B attēls).

CA4 un SLM tika novērota ļoti viegla PrPSc krāsošanās. Šajos smadzeņu apgabalos tika novēroti atšķirīgi PrPSc modeļi (S2 attēls). Lai gan CA1 un CA3 dominēja intraneironālie un ar neiropili saistīti PrPSc modeļi, SLM novērotais galvenais morfoloģiskais modelis bija intragliālā nogulsnēšanās.

Viegli intraneironāli un ar neiropili saistīti PrPSc modeļi tika konsekventi novēroti CA4, lai gan intensitāte bija zemāka nekā CA1 un CA3 novērotā. Iba1 bija konstitutīvi izteikts un reti izplatīts kontroles paraugos. Pēc kontrasta izteikta mikroglioze tika novērota CA1, CA3 un CA4 un SLM ar skrepi slimām aitām.

Tomēr mikroglia morfoloģiskās pazīmes šajos smadzeņu reģionos ievērojami atšķīrās. CA1 piramīdas slānī lielākajā daļā mikrogliju šūnu bija īsi procesi ar palielinātiem šūnu ķermeņiem, kas raksturīgi hipertrofiskajai morfoloģijai.

InCA4 arī mikroglia šūnas bija hipertrofiskas, bet tām bija garāki un plānāki zari nekā CA1 mikroglia šūnas. Tikmēr SLM hipertrofiskā mikroglija parādīja īsus un plānus procesus ar pietūkušiem šūnu ķermeņiem. Turpretim CA3 mēs novērojām iepriekš minēto stieņu-mikrogliju morfoloģiju [42].

Šīm mikroglia šūnām bija iegareni šūnu ķermeņi ar garu paralēlu primāro procesu, kas orientēts perpendikulāri CA3 piramīdšūnu slānim, un palīgzariem, kas bija īsāki par garajiem primārajiem procesiem.

GFAP imūnkrāsojums bija ievērojami palielināts CA1 un CA3 piramīdšūnu slāņos no skrepi inficētām aitām, salīdzinot ar kontroles aitām. Interesanti, ka PrPSc rādītāji bija visaugstākie CA1 un CA3. CA4 piramīdas šūnu slānī vai SLM atšķirības netika novērotas.

2.3. Ar skrepi inficētu tg338 peļu neiropatoloģija

Tie paši spongiozes, PrPSc nogulsnēšanās, mikrogliozes un astrogliozes neiropatoloģiskie marķieri, kas analizēti aitām, tika pārbaudīti klīniski skarto tg338 peļu talāmā, kuras bija intracerebrāli inficētas ar skrepi slimību (4. attēls).

Salīdzinot ar kontroli, ievērojamas atšķirības (p < 0.05) spongiozē tika novērotas ar skrepi inficētām pelēm, kurās vakuoli bija ierobežoti līdz neiropilam.

PrPSc nogulsnes bija plaši izplatītas citoplazmas un neiropila līmenī. Gliozes novērtējums atklāja būtiskas atšķirības Iba1 un GFAP imūno krāsošanā starp skrepi inficētajām un kontroles pelēm, gan astrocītiem, gan mikroglijām bija hipertrofiskas morfoloģijas.

PrPres uzkrāšanos novērtēja arī WB visās ar skrepi slimās pelēs, atklājot nemainīgu 19 kDa joslu modeli (5. attēls). PrPres signāla intensitāte tg338 pelēm bija viendabīgāka starp indivīdiem nekā aitām, kā tas bija paredzēts eksperimentālai infekcijai, kurā tika kontrolēta deva, inokulācijas vecums un nogalināšanas laiks.

Kontroles pelēm, kas inokulētas ar normālu smadzeņu homogenātu, signāls netika atklāts, kas neatbilst negatīvajiem IHC rezultātiem.

4. attēls. Talamusa sekcijas no skrepi inficētām (intracerebrālā inokulācija) un atbilstošā vecuma tg338 kontroles pelēm, kas imūnkrāsotas, lai novērtētu spongiozi (hematoksilīns-eozīns), PrPSc nogulsnēšanos (R486 antiviela), astrocītus (glia fibrilla acidic protein; GFAP) un kalcija mikrogliju. -saistīšanas adaptera molekula-1; (A, E) Smagi sūkļveida bojājumi, kas galvenokārt atrodas skrepi inficētu un kontroles peļu neiropilī. (B, F) Vairāki PrPSc pozitīvi neironi ir redzami ar skrepi inficētām pelēm, bet kontroles grupās to nav. (C, G) Aktivētas mikroglijas, kurām ir intensīvāka imūnkrāsošana un biezi procesi ar skrepi inficētām pelēm, salīdzinot ar kontrolēm. (D, H) Paaugstināta astroglioze ar hipertrofiskiem šūnu ķermeņiem un procesiem ar skrepi inficētām pelēm, salīdzinot ar kontrolēm. Rezultāti svārstās no 0(negatīvs) līdz 5 (maksimālā intensitāte).

Būtiskas atšķirības tika noteiktas, izmantojot Studenta t-testora Mann-Whitney U testu attiecīgi normāli un nenormāli sadalītiem datiem. * p < 0.05,** p < 0,01. Mēroga josla=200 µm.

5. attēls. Western blot noteikšana PrPres uzkrāšanās CNS klīniski skartām tg338 pelēm, kas intracerebrāli inokulētas ar skrepi slimību, salīdzinot ar atbilstošām kontrolēm.

Adekvātam salīdzinājumam tika ielādēti līdzvērtīgi proteīnu daudzumi, un imūnbloti tika veikti, izmantojot SHA31 monoklonālo ķermeni. Molekulārās masas marķieri (kDa) ir norādīti imūnblota kreisajā pusē.

Iepriekš tika ziņots par TLR ekspresijas regulēšanu, reaģējot uz Prpsc eksperimentālos in vivo un in vitro apstākļos, tāpēc, raksturojot galveno prionu izraisīto neiropatoloģisko izmaiņu klātbūtni CNS dabiskās un eksperimentālās slimības kontekstā, mēs pētījām. vai šīs izmaiņas korelē ar izmaiņām TLR gēnu ekspresijā.

Šim nolūkam mēs veicām qPCR, izmantojot paraugus no četriem aitu smadzeņu reģioniem, lai novērtētu MyD8g un Trif, divu galveno adaptera proteīnu, kas saistīti ar TLR signalizāciju, ekspresiju; CD36, savācējs receptors, kas sadarbojas ar TLR; un TLR mRNS.

Turklāt mēs izmērījām četru pro- un anti- līmeni. iekaisuma citokīnus aitu talāmā un hipokampā, lai tālāk novērtētu iekaisuma reakciju. Tg338 pelēm mēs izmērījām MyD88 un TLR1-9 mRNS līmeni talāmā.

Gēni, kuriem tika novērotas būtiskas atšķirības attiecībā uz kontrolēm, un atbilstošās krokas izmaiņas, ir parādīti tabulā $l, un ACt vērtības no kontroles un skrepi inficētām aitām ir attēlotas 3. attēlā.

Izmainīto gēnu skaits samazinājās astes-rostrālā virzienā. Ar skrepi slimu aitu iegarenās smadzenes bija reģions, kurā tika novērotas vislielākās izmaiņas TLR gēna ekspresijā (6. attēls). Šajā reģionā TLR2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 un CD36 ekspresija bija ievērojami augstāka (p < 0,01) ar skrepi slimiem dzīvniekiem, salīdzinot ar kontroles dzīvniekiem.
Talāmā TLR6, MyD88 un CD36 bija ievērojami paaugstināti ar skrepi inficētajā grupā (p < 0.05), savukārt TLR2 un TLR3 uzrādīja tendenci uz augšupregulāciju (p < {{12} }.1). Frontālajā garozā (vistālākajā zonā) TLR4 un CD36 bija vienīgie pārmērīgi ekspresētie gēni (p < 0,05).

Jāatzīmē, ka ar skrepi slimību inficēto aitu hipokampā tika konstatēti kontrastējoši izteiksmes modeļi, kuros TLR2 un MyD88 bija pazemināti (p < 0.01) un TLR1 uzrādīja pazeminātu regulējumu (p < 0,1). .

Turklāt hipokamps bija vienīgais apgabals, kurā CD36 ekspresija netika palielināta. Kopumā TLR4 bija gēns, kas bija visvairāk regulēts ar skrepi inficētajām aitām, salīdzinot ar kontroles aitām visos četros smadzeņu reģionos, lai gan talāmā vai hipokampā netika novērotas būtiskas atšķirības individuālās atšķirības dēļ.

Citokīnu līmeņa analīze atklāja TGF-, IL-10 un IL-6 pārmērīgu ekspresiju ar skrepi inficēto un kontroles aitu talāmā, bet hipokampā izmaiņas netika konstatētas (7. attēls).

6. attēls. TLR 1-10, MyD88, Trif un CD36 gēnu ekspresija kontroles un ar skrepi slimu aitu iegarenajā smadzenē (A), talāmā (B), frontālajā garozā (C) un hipokampā (D). .

Dati ir attēloti kā vidējā reize ± SEM pieaugums attiecībā uz kontroles aitām (izteikts kā 1). Vidējie rādītāji tika salīdzināti, izmantojot Stjudenta t-testu vai Manna-Vitnija U testu attiecīgi normāli un neparasti sadalītiem datiem. # p < 0.1, * p < 0.05, ** p < 0,01.

7. attēls. Pretiekaisuma citokīnu TGF- un IL-10, kā arī proinflammatorisko citokīnu TNF- un IL-6 gēnu ekspresija kontroles un dabiskās skrepi slimības talāmā (A) un hipokampā (B) - inficētas aitas.

Dati ir attēloti kā vidējās ± SEM reizes izmaiņas attiecībā uz kontrolēm (izteiktas kā 1). Vidējie rādītāji tika salīdzināti, izmantojot Stjudenta t-testu vai Mann-Whitney U testu attiecīgi normāli un neparasti sadalītiem datiem. * p < 0.

Lai pārbaudītu, vai izmaiņas TLR ekspresijā CNS dabiskās slimības gadījumā ir salīdzināmas ar tām, kas tika izraisītas tg338 peles modelī pēc intracerebrālās infekcijas ar skrepi slimību, TLR un MyD88 transkripcijas līmeņi tika novērtēti talāmu oftg338 pelēm (8. attēls). TLR1 un TLR2 mRNS līmenis bija ievērojami paaugstināts (p < 0.01), salīdzinot ar kontrolēm, un bija tendence uz TLR7 augšupregulāciju (p< 0.1). The levels of TLR8 expression were undetected.

8. attēls. TLR1-7, TLR9 un MyD88 gēnu ekspresija talamusā klīniski skartām tg338 pelēm, kas intracerebrāli inokulētas ar skrepi slimību pozitīvu inokulātu, salīdzinot ar kontrolēm (skrepi-negatīvais inokulāts). Rezultāti ir izteikti kā vidējās ± SEM reizes izmaiņas attiecībā uz kontrolēm (izteiktas kā 1). Vidējie rādītāji tika salīdzināti, izmantojot Stjudenta t-testu vai Manna-Vitnija U testu attiecīgi normāli un neparasti sadalītiem datiem. # p < {{10}}.1, ** p < 0,01.

2.5. TLR4 proteīna līmeņa novērtējums apstiprina qPCR konstatēto pārregulēšanu ar skrepi inficētām aitām

Lai apstiprinātu, ka novērotais TLR4 mRNS pieaugums nozīmē olbaltumvielu līmeņa izmaiņas, TLR4 tika novērtēts ar WB četru ar skrepi inficētu aitu un četru kontroles aitu smadzeņu garozā, talāmā, hipokampā un frontālajā garozā (9. attēls).

Saskaņā ar qPCR rezultātiem TLR4 proteīna līmenis bija ievērojami paaugstināts (p < 0,05) visos četros ar skrepi slimo aitu smadzeņu reģionos.

9. attēls. TLR4 proteīna ekspresija ar skrepi inficētu aitu garozā smadzenē (Mo), talāmā (Th), hipokampā (Hc) un frontālajā garozā (Fc) pret kontroles aitām (n=4 katrā grupā). Aktīns tika izmantots kā slodzes kontrole.

Diagrammā ir attēlotas densitometrijas vērtības un norādīts uz ievērojamu TLR4 ekspresijas pieaugumu visos reģionos ar skrepi inficētām aitām, salīdzinot ar kontroles aitām. Dati ir izteikti kā tēma ± SEM. Vidējie rādītāji tika salīdzināti, izmantojot Stjudenta t-testu. * p < 0.05.

3. Diskusija

Pēdējos gados pētījums par neiroinflammatorisko reakciju prionu slimībās ir ļāvis labāk izprast pamatā esošos mehānismus un sekas.

Neiroiekaisums ietver reaktīvo mikrogliozi un astrogliozi [43], kuras abas var konstatēt pirms klīnisko pazīmju parādīšanās un ir pirms spongiozes un neironu zuduma [7, 8, 18].

Tas, vai mikroglia aktivācija prionu slimībās ir labvēlīga vai kaitīga, joprojām ir diskusiju jautājums. Daži autori apgalvo, ka mikroglia aktivācija un proliferācija veicina neiroiekaisuma procesu un no tā izrietošo neirodeģenerāciju [8, 18, 44].

Tomēr citi norāda uz mikroglijas vispārējo aizsargājošo lomu, un in vitro pētījumi liecina, ka mikroglija var internalizēt un noārdīt PrPSc [27, 45]. Saskaņā ar šiem atklājumiem in vivo eksperimenti ir parādījuši, ka mikroglia izsīkums samazina izdzīvošanas periodu, iespējams, samazināta PrPSc klīrensa dēļ [46, 47].

Tāpēc ir ticams, ka slimības procesa laikā pastāv vairāki reaktīvi mikroglia fenotipi, kuriem ir neiroprotektīva iedarbība agrīnās slimības stadijās un, slimībai progresējot, kļūst par proinflammatorisku fenotipu, kas izraisa kaitīgu ietekmi [9, 10]. Viena hipotēze liecina, ka TLR signalizācija veicina glia šūnu aktivāciju prionu slimībās.

Ir zināms, ka amiloido šķiedru mikrogliju uzņemšanu Alcheimera slimībā veicina TLR aktivācija [48, 49]. Tādējādi, lai gan TLR aktivizēšanai uz glia šūnām var būt nozīme agregētu vai patoloģisku proteīnu (piemēram, prionu proteīna) klīrensā, hroniska aktivācija var kaitēt saimniekam, izraisot neirotoksicitāti un neironu šūnu nāvi [50].

Līdz šim dati par TLR lomu prionu patoģenēzē ir ļoti ierobežoti. Dažos pētījumos ir izmērītas izmaiņas TLR ekspresijā CNS peļu modeļos, un viens ir ziņojis par TLR ekspresijas izmaiņām jēru asinīs, visos gadījumos izmantojot dzīvniekus, kas eksperimentāli inficēti ar prionu slimību [22, 26, 30].

For more information:1950477648nn@gmail.com