Atšķirīgi nodevām līdzīgi receptori Gēnu ekspresija un gliāla reakcija dažādos dabiskā skrepi slimības smadzeņu reģionos 3. daļa

Mēs pētījām iespējamās korelācijas starp prionu slimības neiropatoloģiskajām pazīmēm un TLR gēna ekspresiju četros dažādos ar skrepi slimību dabiski inficētu aitu smadzeņu reģionos. Visās četrās smadzeņu zonās mēs novērojām būtiskas atšķirības PrPSc nogulsnēšanā, spongiozē, astrogliozē un mikrogliozē dabiski inficētām un kontroles aitām.

Prionu slimība, kas pazīstama arī kā tempļu slimība, vaska ēšanas slimība utt., ir akūta vīrusu infekcija, ko izraisa prioni. Slimību galvenokārt pārnēsā, ēdot termiski neapstrādātu pārtiku, kas satur prionus. Kad tas ir inficēts ar prioniem, tas var izraisīt smadzeņu iekaisumu un nervu sistēmas bojājumus, kā arī var parādīties tādi simptomi kā galvassāpes, vemšana un drudzis.

Tomēr, saskaroties ar šādu situāciju, mēs nevaram zaudēt pārliecību par savu atmiņu, jo pastāv prionu slimība. Lielākā daļa inficēto cilvēku pēc ārstēšanas var atgūties un atjaunot atmiņu.

Protams, no profilaktiskā viedokļa mēs varam mēģināt ēst vairāk termiski apstrādātu ēdienu, lai izvairītos no prionu infekcijas. Tajā pašā laikā, ja jūtat simptomus, pēc iespējas ātrāk jādodas pie ārsta, lai novērstu slimības saasināšanos.

Ikdienā mēs varam izmēģināt dažus vienkāršus atmiņas treniņus, piemēram, lasīt, sastādīt sarakstus, organizēt pasākumus un informāciju utt., lai uzlabotu savu atmiņu. Šīs apmācības neprasa daudz laika un enerģijas, taču tās ir ļoti svarīgas veselīgu smadzeņu un efektīvas atmiņas funkcijas uzturēšanai.

Īsāk sakot, saskaroties ar tādām slimībām kā prionu slimība, mums vajadzētu pret to izturēties pozitīvi, meklēt profesionālu medicīnisko palīdzību un profilakses pasākumus, kā arī pievērst uzmanību ikdienas atmiņas vingrinājumiem, lai nodrošinātu savu fizisko veselību un efektīvu darbu. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo tā var arī regulēt neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni, kas ir ļoti svarīgi atmiņai un mācībām. Turklāt Cistanche var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekamu uzturu un enerģiju, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz zināt veidus, kā uzlabot smadzeņu darbību

Šīs atšķirības bija visredzamākās smadzenēs, kas ir vislielākā kaudala zona. Turpretim visvieglākie bojājumi tika novēroti frontālajā garozā, vislielākajā rostralārijā. Šis secīgais modelis saskan ar prionu neiroinvāzijas un izplatīšanās ceļu visā CNS, sākot no ieejas vietām muguras smadzenēs un obex un beidzot sasniedzot frontālo garozu [1, 5, 51].

Negaidīti, ņemot vērā to anatomisko tuvumu, mēs novērojām krasu PrPSc nogulsnēšanās un vakuolizācijas samazināšanos un ievērojamu astrogliozes samazināšanos, pārejot no talāma uz hipokampu, neievērojot patoloģijas pakāpenisku caudo-rostral progresēšanu.

Īpaša mikrogliamorfoloģija, kas pazīstama kā stieņu mikroglija, tika novērota piramīdveida šūnu neironu tuvumā CA3, bet tās nebija visos citos pētītajos neiroanatomiskajos reģionos.

Cik zināms, šis mikroglia profils līdz šim nav bijis saistīts ar prionu izraisītu neiroiekaisumu, lai gan nesen veikts pētījums ziņoja par nūjiņas formas mikrogliju klātbūtni cilvēku ar KJD smadzenītēs [52].

Lai gan ir maz pētīta kopš pirmajiem aprakstiem 1900. gados, nesen ziņots par stieņu mikrogliju neiroloģiskiem traucējumiem, piemēram, epilepsiju, Lūija ķermeņa demenci, Hantingtona slimību un AD, īpaši vidēji bojātos smadzeņu garozas un hipokampa apgabalos [40, 41, 53]. Stieņu mikroglia fenotipiskā izpausme un funkcijas vēl nav skaidras.

Tomēr fakts, ka šī morfoloģiskā iezīme parasti sakrīt ar neironu elementu klātbūtni, kas ir bojāti vai neaizsargāti pret bojājumiem, liecina par neiroprotektīvu lomu [42, 54, 55].

Tiek uzskatīts, ka stieņu mikroglija nav saistīta ar smagiem bojājumiem, jo ​​šajos apstākļos ir sagaidāma progresēšana uz ameboīdu morfoloģiju [56]. Rodmikroglijas klātbūtne ar skrepi inficētu aitu hipokampā, bet ne citos smadzeņu reģionos, var liecināt par neiroprotektīvu vidi, kas labi atbilst ierobežotajam neironu zudumam, kas novērots šajā apgabalā.

Mūsu veiktā TLR ekspresijas analīze atklāj tiešu korelāciju starp bojājuma smagumu un TLR gēna pārmērīgu ekspresiju, kas sakrīt ar iepriekš minēto prionu neiropatoloģijas kaudo-rostrālo progresēšanu.

Un otrādi, TLR4 bija līdzīgi pārmērīgi izteikts visās jomās neatkarīgi no bojājuma smaguma pakāpes. TLR4 pārmērīga ekspresija apgabalos ar vieglākiem neironu bojājumiem (ti, hipokampā un frontālajā garozā) var atspoguļot aneuroprotektīvo lomu, kā iepriekš aprakstīts fagocītiskajām šūnām, piemēram, makrofāgiem un mikroglijām [23,57]. Par TLR7 regulēšanu iepriekš ziņots peļu modeļos prionslimības un cilvēku pacienti [22,26,31].

Mēs novērojām tikai TLR7 regulēšanu iegarenajā smadzenē, kas ir visvairāk bojātais apgabals, kurā tika konstatēts visaugstākais spongiozes un PrPSc nogulsnēšanās līmenis.

Neironu nāve apoptozes rezultātā iepriekš ir bijusi saistīta ar TLR7 stimulāciju [58, 59], un tās pārmērīga ekspresija iegarenajā smadzenē var būt saistīta ar šo mehānismu [60]. Lai gan TLR1 loma neirodeģeneratīvās slimībās vēl nav skaidra, TLR2 iesaistīšanās mikroglia aktivācijā arvien vairāk tiek pierādīta amiotrofiskās laterālās sklerozes, MS un AD gadījumā [61,62].

Lai gan TLR2 loma prionu slimībās nav pilnībā izprotama, ir ierosināta labvēlīga ietekme: izdzīvošanas laiks ir samazināts pelēm, kuras neizpauž TLR2 pēc intracerebrālās inokulācijas ar skrepi [22].

TLR2 un MyD88 pārmērīga ekspresija var arī liecināt par proinflammatorisku mikroglijas fenotipu, kas varētu izskaidrot TNF- un IL-6 pieaugumu, ko novērojām talāmā [8,63].

Interesanti, ka eksperimenti, kuros izmantoja EOC 13.31 šūnas, iemūžinātu mikroglijām līdzīgu peles šūnu līniju, ir parādījuši iekaisuma reakcijas ceļa disregulāciju, reaģējot uz TLR2 aktivāciju, un ierosināja saikni starp TLR2 ekspresiju un mikrogliju uzkrāšanos stāvoklī, kas nav optimāls fagocitozei [26]. .

Tāpēc TLR2 pārmērīga ekspresija iegarenajā smadzenē un talāmā, kas ir visvairāk bojātās vietas, kurās tika konstatēts arī pārmērīgs fagocītu mikrogliju līmenis, liecina, ka PrPSc disfunkcionāls klīrenss var izraisīt ilgstošu PrPSc uzkrāšanos un neironu bojājumus [9, 17].

Mūsu atklājumi ar skrepi inficētu aitu hipokampā atklāj pretēju modeli, salīdzinot ar citiem analizētajiem smadzeņu apgabaliem, ar pazeminātu TLR1, TLR2 un MyD88 regulējumu un bez citokīnu izmaiņām.

Tas var norādīt, ka mikroglijas hipokampā reaģē atšķirīgi; patiešām, ir pierādīts, ka TLR2 deficīts primāro mikrogliju šūnu kultūrās, kas iegūtas no jaundzimušo pelēm (0–3 dienas vecas) un stimulētas ar neirotoksisku peptīdu PrP106-126, pārceļ mikroglia aktivāciju no neirotoksiskas uz neiroprotektīvu fenotipu [63 ].

Tomēr PrP106-126 peptīda nozīme prionu patoloģijā ir apšaubīta [64]. CD36 ir cita veida modeļa atpazīšanas receptors, kas spēj atpazīt endogēni atvasinātus ligandus, piemēram, amiloīdu veidojošos peptīdus, kam ir noteikta loma šo komponentu endocītiskajā uzņemšanā [65, 66]. Šis receptors ir saistīts ar proinflammatorisku mikroglia stāvokli [67].

In vitro BV-2 šūnu, iemūžinātu mikroglia šūnu veida, stimulēšana ar PrP106-126 izraisa CD36 augšupregulāciju, palielinot proinflammatoriskus citokīnus un iNOS un NO veidošanos [68, 69].

Turklāt -amiloīda peptīda atpazīšana ar CD36 palīdzību izraisa jauna heterotrimēra kompleksa CD36-TLR4-TLR6 salikšanu, kas aktivizē iedzimto imūnreakciju [70,71].

Mūsu pētījumā visos reģionos bija ievērojama CD36 regulēšana, izņemot hipokampu. CD36, TLR4 un TLR6 regulēšana visvairāk bojātajos apgabalos, iegarenās smadzenēs un obex, liecina par šīs triādes iesaistīšanos pro-iekaisuma mikroglia statusa izraisīšanā, reaģējot uz prionu infekciju.

Un otrādi, CD36 un TLR6 pārmērīgas ekspresijas trūkums hipokampā liecina, ka šis heterotrimērs nav izveidots, kas atkal liecina par aneuroprotektīvo vidi šajā smadzeņu reģionā.

Joprojām ir jāpaskaidro, kāpēc mikroglijas šajā smadzeņu reģionā reaģē atšķirīgi. Lai gan prionu celmam specifisks šūnu tropisms var noteikt mikrogliozes un astrogliozes modeli, jaunākie atklājumi liecina, ka abas reakcijas galvenokārt ietekmē smadzeņu reģions [18,72].

Ne mikroglija, ne astroglija nereaģē vienādi visā CNS, un šī reģionam specifiskā reakcija var izraisīt dažu smadzeņu reģionu selektīvu ievainojamību prionu slimībās [16, 18].

Šajā sakarā ir apgalvots, ka mikrogliju iekaisuma reakciju uz prionu infekciju regulē PrPSc sialilācija [14,73–75] un ka PrPSc sialilācija ir atkarīga no smadzeņu reģiona [18]. Konkrēti, augstāks PrPSc sialilācijas līmenis ir konstatēts hipokampā un garozā nekā talāmā un smadzeņu stumbrā, kas liecina par iespējamu lomu šo smadzeņu reģionu selektīvā ievainojamībā [18, 73, 75].

Augstais PrPSc sialilācijas līmenis hipokampā var būt saistīts ar palēninātu prionu replikāciju, izraisot atšķirīgu prionu izraisītu mikroglia aktivāciju šajā reģionā, kas atbilst šī reģiona samazinātajai jutībai, ko paredz mūsu atklājumi.

Interesanti, ka iepriekšējie atklājumi liecina, ka dabiskās KJD infekcijas gadījumā hipokampu var pasargāt no prionu neirotoksicitātes [76, 77], un detalizētos KJD gadījumu neiropatoloģiskajos pētījumos ir ziņots par vieglākiem bojājumiem hipokampā nekā citos smadzeņu reģionos [76].

Konkrēti, arhikortekss, kas galvenokārt ietver hipokampu, šķiet salīdzinoši saudzēts salīdzinājumā ar citiem garozas reģioniem KJS [77]. Šī vieglā hipokampu iesaistīšanās, kas aprakstīta dabiskās KJS gadījumā, atbilst pašreizējiem konstatējumiem aitām, kas dabiski inficētas ar skrepi slimību.

Interesanti, ka šī daļēja aizsardzība pret vismaz divām dabīgām prionu slimībām notiek hipokampā, kas ir filoģenētiski vecākais smadzeņu garozas reģions un sastāv no visvienkāršākā kortikālā audu veida.

Būs nepieciešami turpmāki pētījumi, lai izpētītu šīs korelācijas nozīmīgumu. Rezumējot, mūsu rezultāti atklāj īpaši vieglu neiropatoloģiju dabisko skrepi inficētu aitu hipokampā, kam raksturīgs zemāks spongiozes, PrPSc nogulsnēšanās un astrogliozes līmenis, nekā gaidīts, ņemot vērā kaudālo-to. -skrepielēzijas rostrālā izplatība.

Turklāt ekskluzīvas mikroglijas morfoloģijas, stieņu mikroglijas klātbūtne hipokampā, kam var būt neiroprotektīva loma [54], kopā ar atšķirīgu modeļa atpazīšanas receptoru (TLR gēni un CD36) gēnu ekspresijas profilu, vēl vairāk atšķir šo smadzeņu reģionu no cita neiroanatomiskā reģiona. ar skrepi slimām aitām.

Šie atklājumi liecina par neiroaizsardzības pakāpi pret dabisko prionu infekciju hipokampā, kas ir pelnījusi turpmāku izmeklēšanu. Neirodeģeneratīvas slimības, ko izraisa nepareiza proteīna locīšana, ietver iekaisuma apburto loku, kas sastāv no nepareizi salocīta proteīna uzkrāšanās, glia aktivācijas un glia iekaisuma mediatoru atbrīvošanās, kas pastiprina olbaltumvielu nogulsnēšanos un neiroiekaisums.

Šī apburtā cikla pārtraukšana, mērķējot uz mikroglia aktivāciju, izmantojot specifiskus TLR inhibitorus noteiktā slimības stadijā, var būt daudzsološa pieeja turpmāka neiroiekaisuma ierobežošanai. Mūsu atklājumi izceļ TLR2 pazeminātu regulēšanu kā potenciālu šādas pieejas mērķi, jo tas var izraisīt mikrogliju maiņu no neirotoksiskā uz aneuroprotektīvo fenotipu [63].

Visbeidzot, lai gan ir panākts liels progress glialfenotipu daudzveidības raksturošanā, izmantojot neirodeģeneratīvo slimību peļu modeļus, tas, vai peļu modeļi uzticīgi atspoguļo galvenos prionu slimību aspektus, ir diskusiju jautājums [78, 79].

Mūsu rezultāti tg338 transgēnajā modelī atkārtoja prionu infekcijas kopējās patoloģiskās pazīmes, tostarp izteiktu PrPSc nogulsnēšanos, neiropilu spongiozi, astrogliozi un mikrogliozi.

Tomēr inficētām pelēm bija ievērojama TLR1 un TLR2 pārmērīga ekspresija un tendence uz TLR7 pārmērīgu ekspresiju. Lai gan šo gēnu regulēšana iepriekš tika aprakstīta citos peļu modeļos, kas inficēti ar skrepi slimību [22, 26], šis modelis ir pretrunā ar mūsu atklājumiem aitu smadzenēs. Jāatzīmē, ka peles smadzenēs mēs nenovērojām nekādas izmaiņas TLR4 ekspresijā, gēns, kuram aitu paraugos tika novērotas vislielākās ekspresijas izmaiņas.

Šie pretrunīgie atklājumi var būt dažādu infekcijas ceļu un/vai prionu proteīna ekspresijas līmeņu sekas tg338 pelēm [80,81]. Neskatoties uz to, mūsu rezultāti galu galā norāda, ka skrepi intracerebralinokulācija liela izmēra tg338 pelēm neatkārto imūnreakciju, kas novērota dabiskā skrepi infekcijas gadījumā.

4. Materiāli un metodes

4.1. Ar skrepi slimību inficētās un kontroles aitas

Šajā pētījumā tika iekļauta divdesmit viena Rasa Aragonesa mātīte (vecumā no 2 līdz 6 gadiem). Visi tika genotipizēti PRNP polimorfismiem, kā ziņots iepriekš [82], un tika konstatēts, ka tiem ir ARQ / ARQ genotips. Kontroles dzīvnieki (n=8) tika atlasīti no ganāmpulka, kurā nebija ziņots par skrepi slimības gadījumiem.

Ar skrepi slimību inficētie dzīvnieki (n=13) tika iegūti no skrepi slimības skartajiem ganāmpulkiem, un tiem tika diagnosticēta taisnās zarnas gļotādas biopsiju imūnhistoķīmija (IHC). Infekcija tika apstiprināta ar PrPSc pēcnāves imūndetekcijas palīdzību obex pēc publicētiem kritērijiem [83].

Dzīvnieki tika nonāvēti ar intravenozu barbiturātu pārdozēšanu un atasiņošanu.

Eitanāzijas laikā visām ar skrepi inficētajām aitām bija dažādas smaguma pakāpes klīniskas pazīmes: dažiem dzīvniekiem pēc digitālās stimulācijas un vieglas ķermeņa stāvokļa pasliktināšanās parādījās tādas sākumposma pazīmes kā muguras un sānu nieze, savukārt citiem bija progresējošas klīniskas pazīmes, piemēram, spontāna skrāpējumi. astes sakne, jostasvieta un ekstremitātes, neiroloģiskas pazīmes, tostarp ataksija un galvas trīce, kā arī zobu griešana, vilnas zudums un intensīvs svara zudums [84].

4.2. Tg338 peles infekcija

Lai novērtētu TLR gēnu ekspresiju skrepi slimības peļu modeļa smadzenēs, desmit nedēļas vecas tg338 peles (n=8) (pārmērīgi ekspresē aitu VRQ/VRQ PrPC 8-, lai 10-saliektu [ 85]) tika inokulēti ar smadzeņu baseinu no dabiski ar skrepi slimību inficētas Rasa Aragonesa aitas, kas tika upurētas klīniskajā stadijā.

Peles tika inokulētas ar 20 ul skrepi slimības inokulātu (atšķaidīts 2% w/v PBS) labajā smadzeņu puslodē izoflurāna anestēzijā. Intracerebrālās injekcijas tika veiktas, izmantojot 50 µL šļirci un 25G adatu. Pēc inokulācijas tēmām tika ievadīta subkutāna buprenorfīna injekcija (0, 3 mg / kg), lai izraisītu analgēziju.

Kā kontroles tg338 peles (n=8) tika inokulētas ar smadzeņu homogenātu no skrepi negatīvas aitas, ievērojot to pašu procedūru, kas aprakstīta iepriekš. Pelēm tika uzraudzīta klīnisko pazīmju attīstība un eitanāzija ar dzemdes kakla izmežģījumu, kad parādījās tādas slimības beigu pazīmes kā smaga ataksija un nespēja barot.

Pelēm, kas inficētas ar skrepi pozitīvo inokulātu, vidējais izdzīvošanas laiks bija 187 ± 26 dpi.

4.3. Audu kolekcija

Paraugi no CNS tika savākti un sadalīti sagittāli divās daļās; viens tika fiksēts 10% neitrāli buferētā formalīnā histopatoloģiskai un imūnhistoķīmiskai analīzei, bet otrs tika tieši sasaldēts un uzturēts -80 ◦C temperatūrā proteīnu analīzei vai stabilizēts RNAlaterTM šķīdumā (InvitrogenTM, Waltham, MA, ASV) RNS ekstrakcijai un pēc tam sasaldēts un uzglabāts. -80 ◦C temperatūrā.

4.4. PRNP secība

DNS tika iegūta no asins paraugiem ar Speedtools Tissue DNS ekstrakcijas komplektu (Biotools, Madride, Spānija) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. PCR amplifikācija un sekvencēšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [82].

4.5. Imūnhistoķīmija

Ar formalīnu fiksētie audi tika apstrādāti saskaņā ar standarta histopatoloģiskajām procedūrām. Audu sekcijas tika iestrādātas parafīnā, sagrieztas 4 µm biezās daļās un iekrāsotas ar hematoksilīna-eozīnu (HE), lai novērtētu vakuolāciju un neiropilu spongiozi.

IHC PrPSc noteikšanai tika veikts, izmantojot peles monoklonālo primāro antivielu L42 aitām (1:500 atšķaidījums istabas temperatūrā 30 minūtes) (R-Biopharm, Darmštate, Vācija) un trušu poliklonālo antivielu R486 pelēm (1: 8000 atšķaidījums, nakti 4 ◦C temperatūrā (R. Džekmens, nepublicēts), kā aprakstīts iepriekš [86,87].

Sekcijas tika pakļautas arī tradicionālajai imūnkrāsošanai astrocītu marķiera glia fibrilārā skābā proteīna (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Dānija) un mikroglia marķiera jonizētā kalcija saistošā adaptera molekula 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond). , VA, ASV), saskaņā ar publicētajiem protokoliem [88].Visus histoloģiskos un IHC novērtējumus veica divi veterinārie patologi, kas bija akli pret klīniskajiem datiem.

Spongiozes un PrPSc iekrāsošanās intensitātes novērtējumi tika veikti daļēji kvantitatīvi un pielāgoti, ievērojot iepriekšējos pētījumos aprakstītos kritērijus: neiropila un perikarijas vakuolācija tika novērtēta no 0 (nav) līdz 5 (ļoti daudz un saplūst) [51], PrPSc signāls tika kvantitatīvi noteikts, pamatojoties uz imūnās iekrāsošanās pakāpi no 0 (bez marķējuma) līdz 5 (intensīva viendabīga marķēšana), kā ziņots iepriekš [89], un GFAP un Iba1 imūnmarķēšanas apjoms tika novērtēts skalā no {{ 8}} līdz 5 (0=vāja iekrāsošanās; 5=būtiska imūnmarķējums visā reģionā), kā aprakstīts [88]. Tika novērtēti četri smadzeņu reģioni: frontālā garoza (Fc) talāms (Th), hipokampu veidošanās (Hc) un iegarenās smadzenes (Mo), un katrs apgabals tika globāli analizēts, lai iegūtu punktu skaitu un grafiski attēlots kā vidējā ± standarta kļūda.

4.6. Rietumu Blot

100 mg smadzeņu audu katrā smadzeņu zonā (Fc, Th, Hc un Mo) no 13 ar skrepi slimību inficētām aitām, no kurām 8 ar progresējošām klīniskām pazīmēm un 5 aitām ar sācošām klīniskām pazīmēm, tika homogenizētas 1 ml līzes buferšķīduma.

8 inficēto un 8 kontroles peļu hemiencefaloni tika homogenizēti 10% (w/v) līzes buferšķīdumā. Audu paraugi tika homogenizēti slīpēšanas caurulēs (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV), izmantojot homogenizatoru TeSeEPrecess 48 TM (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV), un olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta, izmantojot PierceTM BCA Protein Assay komplektu (ThermoScientificTM, Waltham, MA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

PrPres analīzei vienādi proteīnu daudzumi no audu homogenātiem tika inkubēti 10 minūtes 37 ◦C ar proteināzes K šķīdumu, kā aprakstīts iepriekš [90].

Iegūtie paraugi tika pakļauti elektroforēzei 12% CriterionTM XT Bis-Tris proteīna gēlā (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV) un pārnesti uz PVDF membrānām, kuras 1 stundu bloķēja ar 2% beztauku sausu pienu TBST (Tris- buferēts sāls šķīdums ar 0.1% Tween20).

Imunoblotēšanai membrānas nakti inkubēja 4 °C temperatūrā ar Sha31 primāro antivielu (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Francija) koncentrācijā 1 µg/ml, kam sekoja 1 stundu ilga inkubācija istabas temperatūrā (RT) ar mārrutku peroksidāzi. konjugētā anti-peles IgG sekundārā antiviela (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dalasa, Teksasa, ASV).

Imunoreaktivitāte tika noteikta, izmantojot ķīmiski luminiscējošu substrātu ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmštate, Vācija). TLR4 proteīna ekspresija tika analizēta no audu homogenātiem, kas sajaukti ar 2 × Laemmli parauga buferšķīdumu (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. .

Katrā iedobē tika ievietoti četrdesmit mikrogrami kopējā proteīna, iedarbināti 7,5%CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV) un pārnesti uz PVDF membrānām, kuras pēc tam 2 stundas bloķēja ar 4% liellopu seruma albumīna. (BSA) (Merck, Darmštate, Vācija) TBST pie RT. Membrānas inkubēja nakti 4 ◦C ar trušu poliklonālo anti-TLR4 antivielu (Novus Biological, Mineapolis, MN, ASV) koncentrācijā 0,5 µg/mL, pēc tam mazgāja un inkubēja ar kazas anti-trušu IgG ( H + L) HRP sekundārā antiviela (ThermoScientificTM, Waltham, MA, ASV) 1:20, 000 1 stundu RT.

Bloti tika vizualizēti, kā aprakstīts iepriekš. Pēc tam membrānas tika noņemtas ar RestoreTM Western Blot noņemšanas buferi (ThermoScientificTM, Waltham, MA, ASV) 15 minūtes 37 ◦C temperatūrā, mazgātas un vēlreiz bloķētas.

Pēc tam membrānas nakti inkubēja 4 ◦C temperatūrā ar peles monoklonālo aktīna primāro antivielu (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, ASV) 1:1000, nomazgāja un inkubēja ar anti-peles m-IgGкBP-HRP sekundāro antivielu (Santa Cruz). Biotechnology, Dalasa, Teksasa, ASV) 1 stundu. Pēc mazgāšanas bloti tika izstrādāti, kā aprakstīts iepriekš.

Densitometrijas tika veiktas ar ImageJ programmatūru, un vērtības tika normalizētas, izmantojot aktīnu. Normalizētās vērtības tika attēlotas ar GraphPad Prism 6.0 (Sandiego, CA, ASV).

Statistiskās analīzes, lai salīdzinātu inficētās un kontroles grupas, tika veiktas ar Stjudenta t-testu, un dispersiju vienādību noteica Levene'stest, izmantojot SPSS programmatūru (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, ASV).Atšķirības starp grupām tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām pie * p<0.05.

4.7. RNS ekstrakcija, cDNS sintēze un gēnu ekspresija

Aitu kopējā RNS tika iegūta no 90 mg audu paraugiem no frontālās garozas, talāma, hipokampa un iegarenās smadzenes. Peļu smadzenes tika sadalītas viduslīnijā, un no tām tika iegūta kopējā RNS<90 mg obtained from the thalamic area. 

Audi tika homogenizēti, izmantojot TeSeEPrecess 48TM homogenizatoru (Bio-Rad) ar RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vācija) apvienojumā ar TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, ASV), lai noņemtu iespējamo genoma DNS piesārņojumu. RNS koncentrācija tika noteikta spektrofotometriski ar NanoDrop spektrofotometru (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV), un katram paraugam tika analizētas attiecības 260/280 un 260/230, lai pārbaudītu parauga tīrību.

Viens mikrograms komplementārās DNS (cDNS) tika sintezēts, izmantojot qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Turklāt DNāzes ārstēšanas efektivitāte tika novērtēta RT negatīvos paraugos. Pēc reversās transkripcijas tā pati atšķaidītā cDNS partija tika pakļauta qPCR, lai pastiprinātu TLR.

Lai normalizētu mērķa gēnu ekspresiju, tika atlasīti divi plaši izmantotie mājturības (HK) gēni: gliceraldehīda-3-fosfāta dehidrogenāze (GAPDH) un aktīnbeta (ACT) [91]. Šī HK gēna stabilitāte tika pārbaudīta mūsu eksperimentālajos apstākļos. Messenger RNS (mRNS) ekspresija tika noteikta ar qPCR 1 līdz 10 aitu TLR gēniem, 1 līdz 9 peles TLR gēniem un MyD88 gēnam abām sugām.

Aitu talāmā un hipokampā tika pētīti arī divi pretiekaisuma (TNF- un IL-6) un divi pretiekaisuma (IL-10 un TGF-) citokīni. Primeru secības un efektivitāte bija iepriekš publicēta vai izstrādāta, izmantojot rīku Primer3Plus [92] (2. tabula).

Mēs pārbaudījām katra gēna efektivitāti, ģenerējot standarta līkni, pastiprinot kontroles cDNS sērijas atšķaidījumus 1:2 un pēc tam pārbaudot linearitāti starp sākotnējās šablona koncentrāciju un cikla sliekšņa (Ct) vērtībām. Visi gēni uzrādīja korelācijas koeficientu starp 0.9 un 0.99 ar standarta līkņu slīpuma vērtību diapazonā no –3,2 līdz –3,5 un qPCR efektivitāti 90–110%.

qPCR reakcijas tika veiktas, izmantojot Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR sistēmu, 96-labi ar universāliem amplifikācijas apstākļiem: sākotnējā aktivizēšana un cDNS denaturācijas solis 10 min 95 ◦C, kam sekoja 40 cikli 3 s pie 95 ◦C. un 30 sestdiena 60 ◦C.

Lai identificētu nespecifisku PCR amplikonu klātbūtni vai augstu primerdimēru līmeni, pēc katras qPCR reakcijas mēs veicām disociācijas līknes protokolu. Katrs paraugs tika analizēts trīs eksemplāros ar kopējo reakcijas tilpumu 10 µL, kas sastāvēja no 15 ng cDNS, 5 µL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un vajadzīgā daudzuma uz priekšu un atpakaļgaitu. grunti (2. tabula).

Nukleāzes nesaturošs ūdens tika pievienots līdz galīgajam tilpumam 10 µL. Gēnu ekspresijas līmeņi tika noteikti, izmantojot salīdzinošo Ct metodi. Rezultāti tika attēloti kā izmaiņas, un gēnu ekspresijas atšķirības attiecībā pret kontroles grupas vidējo līmeni tika mērogotas līdz 1.

4.8. Datu analīze un statistika

Visi savāktie kvantitatīvie dati tika pārbaudīti, lai noteiktu normu ar Shapiro-Wilk Wtest. Histoloģiskās un imūnhistoķīmiskās atšķirības starp inficētajām un kontroles grupām tika novērtētas, izmantojot Studenta t-testu vai Manna – Vitnija U testu atkarībā no parametriskā vai neparametriskā datu sadalījuma.

Statistiskās atšķirības starp četriem dažādiem smadzeņu reģioniem skrepi inficētām aitām tika noteiktas, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Bonferroni post hoc tests vai Kruskal-Wallis tests, atkarībā no parametriskā vai neparametriskā datu sadalījuma. qPCR datu statistiskā analīze tika veikta, izmantojot katra gēna vidējās ∆Ct vērtības.

Inficēto un kontroles grupu statistiskam salīdzinājumam atkarībā no katra gēna normālā sadalījuma tika veikts Studenta t-tests vai Manna-Vitnija U tests, un dispersiju vienlīdzība tika noteikta ar Levēna testu. Izteiksmes atšķirības tika uzskatītas par būtiskām pie p < 0.05.

P-vērtību apzīmēšanai skaitļos tika izmantoti šādi apzīmējumi: * p < 0.05; ** p Mazāks vai vienāds ar 0.01; # p < 0.1. Statistiskajām analīzēm tika izmantota SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, USA) programmatūra. Grafiki tika ģenerēti ar GraphPad Prism 6.0 (Sandjego, CA, ASV), un attēlos parādītie dati atspoguļo vidējo un standarta kļūdu (vidējais ± SEM).

5. Secinājumi

Cik mums zināms, šis pētījums ir pirmais, kas apraksta TLRgēnu ekspresijas līmeņus dažādos ar skrepi slimu aitu un liela izmēra tg338 peles, kas eksperimentāli inficētas ar skrepi slimību, smadzeņu reģionos.

Mūsu pētījums skaidri parāda, ka TLR un jo īpaši TLR4 aitām un TLR1 un TLR2 pelēm ir iesaistīti skrepi slimības patoģenēzē. Turklāt atšķirībā no visiem citiem pētītajiem reģioniem TLR gēnu ekspresijas atšķirīgais profils kopā ar unikālo mikroglia morfoloģiju. un viegla neiropatoloģija, kas novērota hipokampā, liecina par smadzeņu reģionam specifisku imūnreakciju dabas skrepi infekcijas gadījumā.

Tomēr būs nepieciešami turpmāki pētījumi, lai raksturotu TLR ekspresiju mikroglijā, astroglijā un neironos skrepi infekcijas gadījumā, lai saprastu katra šūnu veida precīzu ietekmi uz neiroiekaisumu. Turklāt vēl ir jānosaka, vai TLR aktivācija ir tieša reakcija uz prionu toksicitāti vai notiek sekundāri citiem iekaisuma mehānismiem.

TLR ir daudzsološs mērķis toprionu slimību terapeitiskajām pieejām, un tāpēc, lai nodrošinātu turpmāku progresu šajā jomā, būs nepieciešama labāka izpratne par TLR regulētajām neiroinflammatoriskajām atbildēm.

Papildu materiāli: šādi ir pieejami tiešsaistē vietnēhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Autora ieguldījums: konceptualizācija, izpēte un datu apkopošana, MCG un LMC; rakstīšanas-oriģināla uzmetuma sagatavošana, MG-M., MCG un LMC; eksperimentālā metodoloģija, MG-M.; rakstīšana-recenzija un rediģēšana, MG-M., MCG, LMC un AO; in vivo metodoloģija, MB; finansējuma iegūšana, RB un JJB; molekulārā metodoloģija, BS-P.; uzraudzība, MCG un JJB Visi autori ir izlasījuši manuskripta publicēto versiju un piekrituši tai.

Finansējums: šo pētījumu finansēja "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Aragonas valdība), izmantojot projektu "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Institucionālās pārskatīšanas padomes paziņojums: visas procedūras, kas saistītas ar dzīvniekiem, atbilst Spānijas Dzīvnieku aizsardzības likumā RD53/2013 un Eiropas Savienības Direktīvā 2010/63 iekļautajām vadlīnijām par izmēģinājumos izmantojamo dzīvnieku aizsardzību. Protokolu apstiprināja Saragosas Universitātes Eksperimentu ar dzīvniekiem ētikas komiteja (atļaujas numurs: PI38/159, 2015. gada oktobris un PI19/14 11 2014. gada aprīlis).

Paziņojums par informētu piekrišanu: Nav piemērojams.

Paziņojums par datu pieejamību: šajā pētījumā sniegtie dati ir pieejami raksta tekstā, attēlos un papildu materiālos.

Pateicības: mēs pateicamies Olivjē Andreoleti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) un Vincentam Beringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Parīzes-Saclay universitāte) par laipno tg338 peles nodrošināšanu šajos eksperimentos.

Interešu konflikti: autori paziņo, ka nav interešu konflikta. Finansētājiem nebija nekādas nozīmes pētījuma izstrādē; datu vākšanā, analīzē vai interpretācijā; rokraksta rakstīšanā vai lēmumā par rezultātu publicēšanu. Šajā manuskriptā esošie attēli un attēli ir oriģinālie dati.

Atsauces

1. Andreoleti, O.; Bertons, P.; Mārcis, D.; Sarradins, P.; Grosclaude, J.; van Keulens, L.; Šelhers, F.; Elsens, JM; Lantier, F. PrP(Sc) agrīna uzkrāšanās ar zarnām saistītos limfoīdos un nervu audos uzņēmīgām aitām no Romanova ganāmpulka ar naturalscrapie. J. ģenerālis Virols. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prion slimības un GSE krīze. Zinātne 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. Makbraids, PA; Šulcs-Šēfers, WJ; Donaldsons, M.; Brūss, M.; Diringers, H.; Krečmara, HA; Beekes, M. Agrīna skrepi izplatīšanās no kuņģa-zarnu trakta uz centrālo nervu sistēmu ir saistīta ar splanchnic un klejotājnervu veģetatīvās šķiedras.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [CrossRef]

4. Mabots, NA; Makfersons, GG prioni un viņu letālais ceļojums uz smadzenēm. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 201–211. [CrossRef]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Vrēde, A.; Wemheuer, WE; Brenigs, B.; Bratbergs, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc izplatīšanās modeļi aitu smadzenēs, kas saistīti ar dažādiem prionu veidiem. Vet. Res. 2011, 42, 32. [CrossRef]

6. Betmuni, S.; Perijs, VH; Gordon, JL Pierādījumi par agrīnu iekaisuma reakciju centrālajā nervu sistēmā pelēm ar skrepi slimību. Neuroscience 1996, 74, 1–5. [CrossRef]

7. Sandbergs, MK; Al-Dudžeilijs, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Šmits, C.; Ričards-Lonts, A.; Laials, S.; Linehans, Dž. M.; Brandner, S.; Vadsvorta, Dž.D. et al. Prionu neiropatoloģija seko alternatīvu prionu proteīna izoformu uzkrāšanai pēc tam, kad infekcijas titrs ir sasniedzis maksimumu. Nat. Commun. 2014, 5, 4347. [CrossRef]

8. Vincenti, JE; Mērfijs, L.; Grāberts, K.; McColl, BW; Kančeloti, E.; Frīmens, TC; Mensons, JC Mikroglijas definēšana, reaģējot uz hroniskas neirodeģenerācijas laika gaitu. J. Virols. 2015, 90, 3003–3017. [CrossRef]

9. Aguci, A.; Zhu, C. Microglia in prion slimības. Dž.Klins. Izpētīt. 2017, 127, 3230–3239. [CrossRef]

10. Obst, J.; Saimons, E.; Mankuso, R.; Gomez-Nicola, D. The Role of Microglia in Prion Diseases: A Paradigm of Functional Diversity.Front. Novecošanās neiroķi. 2017, 9., 207. [CrossRef]

11. Lawson, LJ; Perijs, VH; Dri, P.; Gordon, S. Neviendabīgums mikrogliju sadalījumā un morfoloģijā normālos pieaugušo peles smadzenēs. Neuroscience 1990, 39, 151–170. [CrossRef]

12. Matjašs, V.; Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res. Rev. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com