lvValoda
Mājas / Zināšanas / Saturs

Zināšanas

DNS vakcinācijas izraisīta aizsargājoša imunitāte pret SARS CoV{0}} infekciju kāmjiem

Nov 17, 2023

Abstrakts

Efektīvu vakcīnu izstrāde pret COVID{0}} ir neatliekama vajadzība pasaules sabiedrības veselībai. Smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa 2 (SARS-CoV-2) smaileņu proteīns ir galvenais COVID-19 vakcīnas mērķis. Lai ātri reaģētu uz SARS-CoV-2 pandēmijas uzliesmojumu, uz nukleīnskābēm balstīta vakcīna ir jauns risinājums, kas pārsniedz tradicionālo inaktivēto vīrusu vakcīnu vai rekombinanto proteīnu vakcīnu. Šeit mēs ziņojam par DNS vakcīnu, kas satur smailes gēnu piegādei ar elektroporācijas palīdzību. SARS-CoV un SARS-CoV-2 smailes gēni tika optimizēti zīdītāju šūnu ekspresijai un pēc tam klonēti zīdītāju šūnu ekspresijas vektoros, ko attiecīgi sauca par pSARS-S un pSARS2-S. Spike proteīna ekspresija tika apstiprināta ar imūnblotēšanu pēc pārejošas ekspresijas HEK293T šūnās. Pēc imunizācijas tika savākti serumi, lai veiktu antigēnu specifisko antivielu un neitralizējošu antivielu titru analīzi. Mēs atklājām, ka gan pSARS-S, gan pSARS2-S imunizācija izraisīja līdzīgu antivielu līmeni pret SARS-CoV-2 S2. Turpretim tikai pSARS2-S imunizācija izraisīja antivielas pret SARS-CoV-2 receptorus saistošo domēnu. Mēs arī atklājām, ka pSARS2-S imunizācija, bet ne pSARS-S imunizācija, var izraisīt ļoti augstus neitralizējošu antivielu titrus pret SARS-CoV-2. Mēs tālāk analizējām SARS-CoV-2 S proteīnam specifiskās T-šūnu atbildes un atklājām, ka imūnās atbildes bija novirzītas uz Th1. Svarīgi, ka pSARS2-S imunizācija kāmjiem var izraisīt aizsargājošu imunitāti pret SARS-CoV-2 infekciju in vivo. Šie dati liecina, ka DNS vakcinācija varētu būt daudzsološa pieeja aizsardzībai pret Covid-19.


Desert ginseng—Improve immunity (23)

cistanche ieguvumi - stiprina imūnsistēmu

Autora kopsavilkums

SARS-CoV-2 turpina apdraudēt veselību visā pasaulē, un SARS-CoV-2 vakcīnas izstrāde ir steidzama prioritāte, lai apturētu COVID-19 epidēmiju. Šeit mēs izstrādājām DNS vakcīnas, kas satur smailes gēnu no SARS-CoV-2 un tika piegādātas ar elektroporācijas palīdzību. Mēs novērojām, ka DNS vakcīna izraisīja ilgstošu humorālu reakciju pret SARS-CoV-2, un radītās seruma antivielas efektīvi bloķēja SARS-CoV-2 RBD saistīšanos ar tā ievadreceptoru (ACE2). Svarīgi, ka DNS vakcīna izraisīja spēcīgu Th{13}}neobjektīvu imūnās atbildes reakciju pret SARS-CoV-2, kas varētu nodrošināt aizsargājošu efektu ar nelielām blakusparādībām. Visbeidzot, mēs parādījām, ka SARS-CoV-2 DNS vakcīna nodrošināja aizsardzības efektivitāti pret SARS-CoV-2 infekciju Sīrijas kāmjiem. Mūsu atklājumi liecina, ka DNS vakcinācija varētu būt noderīga pieeja COVID{20}} pandēmijas kontrolei tuvākajā nākotnē.

Ievads

Jaunajai infekcijas slimībai COVID{0}}, ko izraisa smags akūtu respiratoro sindromu saistīts koronavīruss 2 (SARS-CoV-2), ir bijusi nozīmīga ekonomiska ietekme valstīs, kuras skārusi slimības uzliesmojums 2019.–2020. gadā [1]. Visā pasaulē līdz 2021. gada martam ir reģistrēti vairāk nekā 118 miljoni apstiprinātu Covid gadījumu-19, un vairāk nekā 2,6 miljoni cilvēku nomira no COVID-19.2]. Pasaulē mirstības līmenis ir aptuveni 2,2%. Lai gan mirstības līmenis no SARS-CoV-2 ir zemāks nekā no MERS-CoV un SARS-CoV infekcijas, tā pārnešanas iespēja ir augstāka. 2020. gada decembrī ir apstiprinātas vairākas Covid-19 vakcīnas, taču COVID{8}} pandēmija joprojām ir starptautisks drauds šī raksta tapšanas brīdī.

Desert ginseng—Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Spike (S) proteīns ir koronavīrusa virsmas proteīns, kas ir atbildīgs par vīrusa piesaistes procesiem saimniekreceptoru angiotenzīnu konvertējošajam enzīmam 2 (ACE2), iekļūšanu šūnās un vīrusa šūnu membrānas saplūšanu, lai atbrīvotu vīrusa RNS saimniekšūnās. Starp SARS-CoV strukturālajiem proteīniem smaileņu proteīns ir dominējošais antigēns, kas inducē neitralizējošas antivielas [3]. Pamatojoties uz iepriekšējiem SARS un MERS pētījumiem, ir pierādīts, ka uz S proteīnu balstītas vakcīnas izraisa neitralizējošas antivielas un T šūnu imūnreakciju pret koronavīrusiem un aizsargā dzīvniekus no vīrusa iedarbības.4, 5]. Tā kā S proteīnam ir augsta imunogenitāte, tas varētu būt potenciāls SARS-CoV-2 vakcīnas izstrādes mērķis [5–7]. Covid{0}} vakcīnas kandidātus var izstrādāt, izmantojot inaktivētu vīrusu, rekombinantos vai sintētiskos vīrusu komponentus, rekombinanto vīrusu vai vīrusa mRNS vai DNS. Pēdējā pieeja ir īpaši pievilcīga, jo vīrusu DNS var ātri un viegli piegādāt visā pasaulē bez aukstās ķēdes sistēmas. Turklāt pilnībā sintētiska DNS, kas iegūta no sekvences, kas kodē vīrusa proteīnu, var izraisīt gan humorālu, gan šūnu mediētu imūnreakciju pret patogēniem.8, 9].

DNS vakcīna ir ideāla vakcīnas platforma ar vairākām priekšrocībām, tostarp vieglu dizainu un ražošanu, stabilitāti dažādās temperatūrās un zemas ražošanas izmaksas. Tādējādi DNS vakcīnas platforma ir piemērota ātrai un liela mēroga ražošanai infekcijas slimību uzliesmojumu laikā. Iepriekšējie pētījumi ir ziņojuši, ka DNS vakcīnas var efektīvi stimulēt šūnu un humorālās reakcijas pret patogēniem izaicinājumu modeļos [10]. Turklāt nesenie klīniskie pētījumi liecina, ka DNS vakcīnas ir drošas un efektīvas infekcijas slimību, piemēram, HIV{0}}, Zikas vīrusa, Ebolas vīrusa, MERS-CoV un gripas vīrusu, ārstēšanai vai profilaksei [11]. Tā kā COVID{0}} pandēmija ir izplatījusies visā pasaulē un smagi, jaunākie pētījumi ziņoja, ka DNS vakcīnas izraisīja antigēniem specifiskas T-šūnu atbildes reakcijas un neitralizējošas antivielas un vēl vairāk aizsargā dzīvniekus pret SARS-CoV-2 izaicinājumu [12, 13].

Galvenais DNS vakcīnu izaicinājums ir vājā DNS ievadīšanas efektivitāte šūnās antigēnu ekspresijai un līdz ar to arī vājā vakcīnu efektivitāte. Lai palielinātu DNS piegādes efektivitāti, var izmantot fizikālās vai ķīmiskās metodes. Fizikālās metodes ietver augstspiediena gaisa plūsmu (ti, Bioojector), ar zelta daļiņām pārklātu DNS piegādi ar gēnu pistoli, mikroadatu masīvu un elektroporāciju (EP). Ķīmiskās metodes ietver liposomas, virosomas, nanodaļiņas un peptīdus, kas iekļūst šūnās.14]. Zikas vīrusa uzliesmojuma gadījumā 2015. gadā Zikas DNS vakcīna, kas tika piegādāta ar elektroporācijas palīdzību, tika izstrādāta 1. fāzes klīniskajā pētījumā 7 mēnešu laikā [15]. EP kombinācijā ar DNS vakcināciju ievērojami palielina DNS vakcīnu efektivitāti [16–18]. Pateicoties veiksmīgajiem eksperimentu rezultātiem ar dzīvniekiem pēc DNS vakcinācijas ar EP, ir izstrādātas daudzas dažādas elektroporācijas ierīces cilvēkiem, tostarp Cellectra® (Inovio Inc., ASV) un TriGrid® (Ichor Medical Systems, ASV).

Šajā pētījumā ir aprakstīta DNS vakcinācija ar EP, kas var izraisīt neitralizējošas antivielas un Th{0}}neobjektīvas imūnās atbildes. Kāmji, kas imunizēti ar šo metodi, radīja neitralizējošas antivielas pret SARS-CoV-2. Turklāt imunizētajiem kāmjiem bija aizsargājoša imunitāte pret SARS-CoV-2 vīrusu.

Metodes

Ētikas paziņojums

Visus dzīvnieku eksperimentu protokolus apstiprināja NHRI Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (IACUC) (protokola Nr.: NHRI-IACUC-109077-A).

Šūnu līnijas

Cilvēka embrija nieru šūnu līnija HEK293T tika kultivēta Dulbecco modificētajā Ērgļa barotnē (DMEM, GIBCO), kas papildināta ar 10% termiski inaktivētu liellopu augļa serumu (FBS, HyClone), 100 V/mL penicilīna/streptomicīna (GIBCO) un 2 mM L-glutamīnu. (GIBCO). Vero šūnas tika kultivētas M199 barotnē (GIBCO) ar 5% FBS 37 grādos.

Vīrusu titrēšana

SARS-CoV-2 varianti (hCoV-19/Taiwan/4/2020 un hCoV-19/Taiwan/78/2020 (D614G variants)) tika iegūti no Slimību kontroles centra (CDC). ) Taivānā. Vīruss tika pastiprināts Vero šūnās, kas audzētas M199 barotnē, kas papildināta ar 2 ug/ml TPCK-tripsīna (Sigma) 37 grādu temperatūrā. Vīrusa titru noteica 50% audu kultūras infekciozās devas (TCID50) izteiksmē, izmantojot standarta metodi [19]. Īsi sakot, Vero šūnas tika iesētas (2,4 × 104 šūnas uz iedobi) 96-iedobju plāksnēs un kultivētas M199 barotnē ar 5% FBS 37 grādu temperatūrā 24 stundas, lai izveidotu vienslāni. Nākamajā dienā tika sagatavoti sērijveida 10-kārtīgi atšķaidījumi, un atšķaidīts vīruss (100 μL/iedobē) tika pievienots Vero šūnu monoslāņiem ar astoņiem atkārtojumiem katrā atšķaidījumā. Pēc 4 dienu inkubācijas 37 grādu temperatūrā katrā iedobē tika reģistrēti vīrusa izraisītie citopātiskie efekti (CPE), un rezultāti ir izteikti kā TCID50/ml saskaņā ar Rīda un Muenča metodi. Visi eksperimenti ar SARS-CoV-2 tika veikti 3. bioloģiskās drošības līmeņa (BSL-3) laboratorijā, un tos apstiprināja Taivānas CDC.

Desert ginseng—Improve immunity (10)

cistanche ieguvumi - stiprina imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Plazmīdu uzbūve un raksturojums

DNS sekvences, kas kodē pilna garuma SARS-Spike (GenBank piekļuves numurs DQ412574) un SARS-CoV-2 smaiļu gēnus (GenBank piekļuves numurs: MN908947), tika optimizētas peles kodona lietošanai un sintezētas GenScript Biotech. Arī dažādi S fragmenti (tRBD, tRBDTM, tSARS2-S, tSdTM) tika konstruēti un amplificēti atsevišķi ar PCR. Visi gēni tika subklonēti klīniski izmantotajā vektorā pVAX1 ar Kozaka secību, kas iekļauta gēnu 5' galā. Plazmīda tika pārveidota DH5 E. coli plazmīdas amplifikācijai. Plazmīdas ekstrahēja un attīrīja, izmantojot endotoksīnu nesaturošu Qiagen kolonnu sistēmu (EndoFree Plasmid Mega Kit).

Pārejoša izteiksme un Western Blot

HEK293T šūnas tika transficētas ar norādītajām DNS plazmīdām, izmantojot PolyJet™ reaģentu (SignaGen Laboratories), ievērojot ražotāja protokolu. 24 stundas pēc transfekcijas šūnu lizāti tika savākti un pakļauti elektroforēzei ar 8% SDS-PAGE. Pēc tam olbaltumvielas tika pārnestas uz PVDF membrānām un nosusinātas ar trušu pretsmailes poliklonālo antivielu (40592-T62, Sino Biological). Kā sekundārā antiviela tika izmantotas ar mārrutku peroksidāzes (HRP) konjugētas anti-trušu antivielas. Specifiskas olbaltumvielas uz membrānas tika vizualizētas ar ECL reaģentu (Thermo Scientific).

Dzīvnieku imunizācija

BALB/c, C57BL/6 peles un Sīrijas kāmji tika iegūti no Nacionālā laboratorijas dzīvnieku audzēšanas un pētniecības centra (Taipeja, Taivāna). Peles vai kāmji tika izmantoti vecumā no 6 līdz 12 nedēļām. Anestēzētas peles vai kāmji tika vakcinēti ar 100 μL šķīduma, kas satur norādīto DNS 3-nedēļas intervālā, kam sekoja elektroporācija ar BTX elektroporatoru (ECM830), izmantojot divu adatu masīva elektrodus (5- mm diametrā ( BTX 45–0121)). Intramuskulāra elektroporācija tika veikta pie 75 V konstanta sprieguma ar 10 impulsiem ar 50 ms/impulsu un 100 ms intervālu starp impulsiem. Peļu un kāmju asins paraugi tika savākti ar submandibulāru vai retroorbitālu asins paraugu ņemšanu attiecīgi. Visi dzīvnieki tika izmitināti Nacionālo veselības pētījumu institūtu (NHRI) laboratorijas dzīvnieku centrā un uzturēti saskaņā ar institucionālajiem dzīvnieku aprūpes protokoliem.

Imūntests

S-specifisko antivielu klātbūtne serumos tika noteikta ar ELISA. Īsumā, 50 μL 4 ug/mL rekombinantā proteīna (Sino Biological) 0,1 M karbonāta buferšķīdumā (pH 9,5) tika pārklāti uz 96-iedobes mikroplatēm, inkubējot nakti 4 °C temperatūrā. grāds . Pārklātās plāksnes divas reizes mazgāja ar 0, 05% Tween 20 PBS un pēc tam istabas temperatūrā 2 stundas bloķēja ar 3% BSA PBS. Imunizēto dzīvnieku atšķaidīti serumi tika uzklāti uz iedobēm istabas temperatūrā 2 stundas. Pēc HRP konjugētā kazas anti-peles IgG (Thermo Scientific) vai HRP konjugētā kazas anti-peles IgG (Arigo Biolaboratorie) pievienošanas tests tika izstrādāts, izmantojot SureBlue TMB 1-komponentu peroksidāzes substrātu (KPL). Absorbcija tika mērīta, izmantojot ELISA lasītāju pie 450 nm.

SARS-CoV-2 vīrusu infekcijas neitralizācija

Vero šūnas tika iesētas (2,4 × 104 šūnas/iedobē) 96-iedobju plāksnēs 24 stundas, lai izveidotu monoslāni. Pirmsimūnie serumi un antiserumi pret SARS-CoV-2 S proteīnu tika iepriekš apstrādāti 56 grādu temperatūrā 30 minūtes, lai iznīcinātu karstumlabīlas nespecifiskas vīrusu inhibējošās vielas. Serumus atšķaidīja līdz sākotnējam atšķaidījumam 1/20 ar M199 barotni, pievienoja iedobē, kurā bija 200 TCID50 SARS-CoV-2 vīrusa 0,2 ml tilpumā, un pēc tam inkubēja 37 grādu temperatūrā 2 stundas. Pēc tam vīrusa-seruma maisījumu inokulēja uz Vero šūnu monoslāņiem un inkubēja 37 grādu temperatūrā. Katram seruma atšķaidījumam tika sagatavoti četri eksemplāri. CPE raksturlielumi katrā iedobē tika reģistrēti pēc 4–5 dienu inkubācijas. Neitralizācijas titrs bija proporcionāls lielākajam seruma atšķaidījumam, kas novērsa infekciju 50% no četrām inokulācijām.

ACE2 sacensību ELISA

ACE2 konkurences ELISA tika veikta, izmantojot Anti-SARS-CoV-2 neitralizējošo antivielu titra seroloģiskā testa komplektu (ACROBiosystems) saskaņā ar ieteikto protokolu. Īsumā, 96-iedobju plāksnes tika pārklātas ar 0,5 ug/mL SARS-CoV-2-S RBD proteīnu nakti 4 grādu temperatūrā. Plāksne tika mazgāta un bloķēta ar bloķējošu buferi 37 grādu temperatūrā 1,5 stundas. Pēc trīs mazgāšanas iedobēm tika pievienots biotinilēts cilvēka ACE2 (0,12 ug/mL), kam sekoja seruma paraugu atšķaidīšana un inkubācija 37 grādu temperatūrā 1 stundu. Lai izveidotu standarta līkni, kā atsauce tika izmantota anti-SARS-CoV-2 neitralizējošā antiviela, kas nodrošināta komplektā. Plāksne tika mazgāta un streptavidīna-HRP darba šķīdums tika pievienots katrai iedobei 1 stundu 37 grādu temperatūrā. Pēc tam plāksne tika mazgāta, un tests tika izstrādāts, inkubējot ar TMB substrāta darba šķīdumu 37 grādu temperatūrā 20 minūtes. Reakcija tika apturēta ar apturēšanas šķīdumu. Absorbcija tika mērīta, izmantojot ELISA lasītāju pie 450 nm. Seruma antivielu konkurējošā aktivitāte tika izteikta kā atbilstošs atsauces antivielu līmenis.

Citokīnu ražošanas tests

T-šūnu atbildes reakcijas tika novērtētas, izmantojot citokīnu ELISA. Splenocīti no imunizētām pelēm tika izklāti ar blīvumu 5 × 106 šūnas vienā iedobē 24-iedobju plāksnēs. Šūnas tika stimulētas ar 5 ug/ml rekombinanto SARS-CoV-2 Spike proteīnu (ACROBiosystems) 37 grādu temperatūrā 3 dienas. Supernatants tika novākts un pārbaudīts citokīnu ražošanai. Peles IL-2, IL-5, IL-13 un IFN- tika kvantitatīvi noteiktas ar ELISA, izmantojot atbilstošo antivielu komplektu (Invitrogen) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

Dzīvnieku izaicinājums

Sīrijas kāmji (n=8 katrā grupā) tika intramuskulāri imunizēti ar adatas injekciju ar plazmīdas DNS (100 ug/dzīvniekam), kam sekoja BTX elektroporācija, kā minēts iepriekš. Četras nedēļas pēc pēdējās vakcinācijas kāmji tika intranazāli inficēti ar 105 TCID50 SARS-CoV-2 (hCoV-19/Taiwan/4/2020) 50 μl izoflurāna anestēzijā. Viņu ķermeņa svars (n=4 katrā grupā) tika reģistrēts katru dienu 9 dienas pēc izaicinājuma. Četri kāmji katrā grupā tika nogalināti 3. dienā pēc vīrusa slodzes kvantitatīvas noteikšanas. Lai noteiktu vīrusu slodzi plaušās, kreiso plaušu audus homogenizēja 2 ml PBS, izmantojot gentleMACS® Dissociator (Miltenyi Biotec). Pēc centrifugēšanas pie 600 xg 5 minūtes, dzidrinātais supernatants tika savākts dzīvā vīrusa titrēšanai (TCID50 tests) un vīrusa RNS kvantitatīvai noteikšanai.

Vīrusu RNS slodzes kvantitatīva noteikšana

Vīrusu slodzes noteikšanai tika iegūts notīrīts homogenizētu kreisās puses plaušu audu supernatants no SARS-CoV-2-inficētiem kāmjiem. RNS ekstrakcija tika veikta audu supernatantam, kas lizēts ar TRIzol LS (Ambion), un 10 ng RNS tika izmantots kā veidne RT-qPCR reakcijām. RT-qPCR tika veikta QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR sistēmā (ABI), izmantojot KAPA PROBE FAST universālo vienpakāpju qRT-PCR komplektu (KR1282, Roche) ar SARS-CoV specifiskiem primeriem un zondēm{11}} (E_Sarbeco Forward: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT, E_Sarbeco Reverss: ATATTGCAGCAGTACGCACACA, E_Sarbeco zonde: FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1) [20].

Cistanche deserticola—improve immunity (7)

Cistanche tubulosa priekšrocības- stiprināt imūnsistēmu

Statistiskā analīze

Statistikas dati tika ģenerēti, izmantojot GraphPad Prism programmatūru. Atšķirīgo konstatējumu statistisko nozīmīgumu starp eksperimentālajām grupām noteica ar divu virzienu Mann-Whitney testu. Atšķirības tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām, ja p-vērtība bija mazāka vai vienāda ar 0,05.

Rezultāti

Vakcīnas kandidātu plazmīdu uzbūve un antigēnu ekspresija

Tika ģenerēti pieci SARS-CoV-2 varianti un viena SARS-CoV konstrukcija, kas satur dažādus smailo proteīnu kodējošās DNS fragmentus (1A attēls). Tā kā antigēna ekspresija cieši korelēja ar vakcīnas efektivitāti, mēs izstrādājām dažādus smailes proteīna fragmentus, tostarp RBD (aa{0}}aa541), RBD uz TM (aa319-aa1236) vai smaile ar transmembrānu domēnu (TM). dzēšana (aa13-aa1213) ar cilvēka audu plazminogēna aktivācijas (tPA) līdersekvenci, kas var palielināt antigēnu sekrēciju [21]. RBD uz TM domēnu var saglabāt S2 domēnu, kas ir svarīgs, lai izveidotu sešu spirāles struktūru šūnu saplūšanai [22, 23]. Šīs konstrukcijas bija šādas: pilna garuma S SARS-CoV (pSARS-S) un SARS-CoV-2 (pSARS2-S), pilna garuma smaile ar audu-plazminogēna vadošo secību. aktivators (ptSARS2-S), RBD reģions (ptRBD), RBD uz transmembrānu domēnu (ptRBDTM) un smaile ar transmembrānas domēna (PTSD) dzēšanu. Vektors, pSARS-S un pSARS{10}} tika transfektēti HEK293T šūnās un ekspresēti tajās. Šūnu lizāti tika analizēti ar SDS-PAGE. Pilna garuma S var noteikt ar atbilstošo molekulmasu (1.B attēls). SARS 2-CoV-2 S variants ar audu plazminogēna aktivatora līdersekvenci tika atklāts ar poliklonālo antivielu pret smailēm. Dati parādīja, ka katrs variants tika novērots ar paredzamo molekulmasu (1C attēls). ptSARS2-S, ptRBDTM un ptSdTM variantu ekspresijas līmeņi bija līdzīgi, savukārt ptRBD ekspresija bija augstāka visos variantos.

Fig 1. Design and expression of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. (A) Schematic diagram of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. tPA, leader sequence from tissue-plasminogen activator; TM, transmembrane domain. (B, C) Western blot analysis of spike protein. HEK293T cells were transfected with the indicated plasmids (vector, pSARS-S, pSARS2-S, and S variants fused with the tPA leader sequence). The cell lysates were collected and probed with an anti-spike antibody, and an anti-β-actin antibody was used as an internal control.


1. attēls. SARS-CoV un SARS-CoV-2 smailes konstrukcijas variantu dizains un izteiksme.

(A) SARS-CoV un SARS-CoV-2 smailes konstrukcijas variantu shematiskā diagramma. tPA, vadošā secība no audu plazminogēna aktivatora; TM, transmembrānas domēns. (B, C) Smailes proteīna Western blot analīze. HEK293T šūnas tika transficētas ar norādītajām plazmīdām (vektors, pSARS-S, pSARS2-S un S varianti, kas sapludināti ar tPA līdersekvenci). Šūnu lizāti tika savākti un pārbaudīti ar antivielu pret smailēm, un kā iekšējā kontrole tika izmantota anti- -aktīna antiviela.

Vakcīnas kandidātu imunogenitāte

Lai pārbaudītu dažādu variantu imunogenitāti, BALB/c pelēm divreiz ar 3-nedēļas intervālu intramuskulāri injicēja 100 ug vektora, pSARS-S un pSARS2-S, kam sekoja in vivo elektroporācija (2A attēls). Serumi tika savākti 4. un 6. nedēļā pēc pirmās imunizācijas. Dati parādīja, ka pSARS-S un pSARS2-S imunizēto dzīvnieku serumi varēja atpazīt gan SARS-CoV-2 pilna garuma S, gan S2 reģionus ar līdzīgiem IgG antivielu titriem (2B un 2C attēls). Turpretim serumi no pSARS2-S imunizētiem dzīvniekiem varētu paaugstināt augstu anti-RBD (SARS-CoV-2) antivielu titrus 4. un 6. nedēļā (2.D attēls), salīdzinot ar pSARS-S grupu. Attiecīgi pSARS2-S imunizēto dzīvnieku, bet ne pSARS-S imunizēto dzīvnieku serumi varētu neitralizēt SARS-CoV-2 infekciju (2E attēls). Neitralizējošo antivielu ģeometriskie vidējie titri (log2) pSARS2-S imunizācijas grupā 4. un 6. nedēļā bija attiecīgi 9,3 un 10,3. Šie rezultāti norādīja, ka pSARS-S imunizācija nevar izraisīt krusteniskās neitralizācijas antivielas pret SARS-CoV-2 infekciju. UBA specifiskās antivielas bija ļoti svarīgas, lai neitralizētu aktivitāti pret SARS-CoV-2 infekciju. SARS-CoV-2 pilna garuma S patiešām var izraisīt augstu neitralizējošu antivielu titru līmeni pret SARS-CoV-2 infekciju.

Fig 2. Antibody response in mice after immunization with SARS-CoV and SARS-CoV-2 S DNA vaccines. (A) BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of indicated plasmid, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (B-D, F, G) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein, S2 region, and RBD were evaluated by ELISA. (E, H) Vaccine-induced neutralizing antibody against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

2. attēls. Antivielu atbildes reakcija pelēm pēc imunizācijas ar SARS-CoV un SARS-CoV-2 S DNS vakcīnām.

(A) BALB/c peles (n=4 katrā grupā) tika intramuskulāri imunizētas divas reizes ar 3-nedēļas intervālu ar 100 ug norādītās plazmīdas, kam sekoja elektroporācija. Seruma paraugi tika savākti norādītajos laika punktos pēc pirmās imunizācijas. (BD, F, G) Antivielas pret SARS-CoV-2 pilna garuma smaile proteīnu, S2 reģionu un RBD tika novērtētas ar ELISA palīdzību. (E, H) Vakcīnas izraisītās neitralizējošās antivielas pret SARS-CoV-2 tika novērtētas ar neitralizācijas testu. Antivielu titri ir parādīti kā vidējais ± SEM, un neitralizācijas titri ir izteikti kā ģeometriskais vidējais ar 95% ticamības intervālu. *lpp<0.05 by the Mann-Whitney test.

Lai turpinātu izpētīt, vai līdersekvences aizstāšana var palielināt proteīna sekrēciju, mēs izmantojām līdersekvenci no audu plazminogēna aktivatora, lai sapludinātu dažādus SARS-CoV -2 S proteīna variantus. Visi varianti satur SARS-CoV-2 S proteīna RBD reģionu. Pēc divām DNS imunizācijas devām serumos, kas savākti 4. un 6. nedēļā, tika analizēti IgG antivielu un neitralizējošu antivielu titri. Imunizācija ar ptSARS2-S izraisīja augstākus antivielu titrus pret pilna garuma S proteīnu 4. nedēļā nekā ptRBD, ptRBDTM un ptSdTM imunizācija (S1A att). ptRBD imunizācijas anti-RBD antivielu titri bija augstāki nekā ptSARS2-S imunizācijas titri (1496,2 pret 530,9, p=0,057) 4. nedēļā (S1B att). Tomēr imunizācija pret ptRBD un ptSARS{0}S izraisīja līdzīgu neitralizējošu antivielu līmeni 4. nedēļā (S1C att). Tādi paši rezultāti tika novēroti 6. nedēļas seruma analīzē; ptRBD imunizācija izraisīja augstāku anti-RBD antivielu līmeni, salīdzinot ar ptSARS2-S imunizāciju (12589.3 pret 1000.0, p=0.028), bet tādu pašu neitralizējošu antivielu līmeni (9.3). pret 9,6 (log2)) (2F, 2G un 2H attēls). Tā kā tPA līdersekvences sapludinātie varianti neizraisīja augstākus neitralizējošus antivielu titrus nekā pSARS2-S imunizācija, turpmākai izmeklēšanai izmantojām pSARS2-S.

Seruma antivielu un ACE2 konkurētspējīga saistīšanās ar SARS-CoV-2 URB

Lai pārbaudītu seruma antivielu spēju traucēt ACE{0}}RBD mijiedarbību, mēs veicām konkurējošu SARS-CoV-2 seroloģisko testu. Šajā testā seruma antivielas tika pievienotas ELISA plāksnēm, kas iepriekš bija pārklātas ar SARS-CoV-2 RBD proteīnu, kam sekoja cilvēka ACE2 proteīna pievienošana. Par atsauci tika izmantota specifiska neitralizējoša antiviela pret SARS-CoV-2 RBD. Kā parādīts3. att, seruma antivielas no pSARS2-S imunizētām pelēm, kas saistījās ar RBD un bloķēja ACE2 saistīšanos, kas bija līdzvērtīga aptuveni 353 ug/ml atsauces antivielai, savukārt pSARS-S serumi bija līdzvērtīgi 56 ug/ml atsauces antivielām. Tāpēc mūsu dati liecināja, ka pSARS2-S imunizācija var izraisīt konkurējošas antivielas, kas efektīvi bloķē SARS-CoV-2 RBD saistīšanos ar ACE2 receptoriem. Šis rezultāts atbilda ELISA titram pret SARS-CoV2 RBD (2.D attēls), un to atbalsta pētījums par URB secību atšķirībām starp SARS-CoV un SARS-CoV-2 [24].


Fig 3. Competitive activity of immunized mouse sera against the RBD/ACE2 interaction. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at week 8 after the first immunization. Serum antibodies that compete with ACE2 for RBD binding were evaluated by competitive SARS-CoV-2 serology assay. The competitive activity of the mouse sera is expressed as the equivalent level of anti-RBD (SARS-CoV-2 spike protein) antibody (reference antibody). Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

3. attēls. Imunizēto peļu serumu konkurējošā aktivitāte pret RBD/ACE2 mijiedarbību.

BALB/c peles (n=4 katrā grupā) tika intramuskulāri imunizētas divas reizes ar 3-nedēļas intervālu ar 100 ug vektora, pSARS-S vai pSARS2-S, kam sekoja elektroporācija. Seruma paraugi tika savākti 8. nedēļā pēc pirmās imunizācijas. Seruma antivielas, kas konkurē ar ACE2 par RBD saistīšanos, tika novērtētas ar konkurētspējīgu SARS-CoV-2 seroloģisko testu. Peļu serumu konkurējošā aktivitāte ir izteikta kā līdzvērtīgs anti-RBD (SARS-CoV-2 smaile proteīna) antivielu līmenis (references antiviela). Antivielu titri ir parādīti kā vidējais ± SEM. *lpp<0.05 by the Mann-Whitney test.

SARS-CoV-2 S DNS vakcīnas izraisīta ilgtermiņa humorālā imunitāte un nodrošināta savstarpēja aizsardzība pret SARS-CoV-2 ar D614G mutāciju

Proti, 20 nedēļas pēc pirmās imunizācijas tika novērota ilgstoša IgG antivielu titru uzturēšana pret pilna garuma S.4A attēls). SARS-CoV-2 neitralizējošās antivielas ģeometriskie vidējie titri (log2) sasniedza 10,8 8. nedēļā pēc pSARS2-S imunizācijas, nedaudz samazinoties līdz 9,1 12. nedēļā un līdz 8,8 20. nedēļā (4B attēls). Šie rezultāti liecināja, ka pSARS2-S imunizācija nodrošina ilgstošu humorālu reakciju pret SARS-CoV-2. Turklāt pSARS2-S DNS vakcīna ar genotipu D614 izraisīja neitralizējošu antivielu reakciju pret vīrusu, kas satur D614G mutāciju (4C attēls), kas ir līdzīgs neitralizācijas titriem pret D614 genotipu. Tāpēc pSARS2-S spēj nodrošināt savstarpēju aizsardzību pret visizplatītāko un dominējošo SARS-CoV-2 D614G variantu.

Fig 4. SARS-CoV-2 S DNA vaccine induced long-term humoral immunity and cross-protection against the SARS-CoV-2 with D614G mutation. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized three times at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (A) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (B, C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 with D614 or G614 genotypes was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

4. attēls. SARS-CoV-2 S DNS vakcīna izraisīja ilgstošu humorālo imunitāti un savstarpējo aizsardzību pret SARS-CoV-2 ar D614G mutāciju.

BALB/c peles (n=4 katrā grupā) tika intramuskulāri imunizētas trīs reizes ar 3-nedēļas intervālu ar 100 ug vektora, pSARS-S vai pSARS2-S, kam sekoja elektroporācija. Seruma paraugi tika savākti norādītajos laika punktos pēc pirmās imunizācijas. (A) Antivielas pret SARS-CoV-2 pilna garuma smailes proteīnu tika novērtētas ar ELISA palīdzību. (B, C) Vakcīnas izraisītā neitralizējošā aktivitāte pret SARS-CoV-2 ar D614 vai G614 genotipiem tika novērtēta ar neitralizācijas testu. Antivielu titri ir parādīti kā vidējais ± SEM, un neitralizācijas titri ir izteikti kā ģeometriskais vidējais ar 95% ticamības intervālu. *lpp<0.05 by the Mann-Whitney test.

Neobjektīvu atbilžu{0}} vai2-radīt

Efektora CD4+ T šūnas var iedalīt divās galvenajās funkcionālajās apakšgrupās – Th1 un Th2, pamatojoties uz aktivācijas laikā izdalītajiem citokīniem. Th1 šūnas ražo iekaisuma citokīnus (IFN-) un piedalās šūnu mediētās imūnās atbildes reakcijās pret intracelulārām baktērijām un vīrusiem, savukārt Th2 šūnas galvenokārt palīdz B šūnām ražot antivielas, bet arī veicina eozinofilu mediētu imunitāti (IL-5 un IL{ {9}}), izraisot humorālas vai alerģiskas reakcijas [25, 26]. Turklāt no Th2 šūnām atkarīgie mehānismi var veicināt ar vakcīnu saistītu pastiprinātu elpceļu slimību (VAERD), kā liecina pētījumi par SARS-CoV vakcīnas kandidātiem [27, 28], kas uzsver, ka līdzsvarota T šūnu reakcija ir ļoti svarīga drošai Covid{0}} vakcīnas izstrādei [29]. Lai risinātu šo problēmu, BALB/c un C57BL/6 peles tika imunizētas ar vektoru, pSARS-S un pSARS2-S divas reizes ar 3-nedēļas intervālu. Peles tika nogalinātas 7 dienas pēc otrās imunizācijas, un splenocīti tika stimulēti ar SARS-CoV-2 S proteīnu (5 ug/ml) 3 dienas. BALB/c pelēm (5A–5D attēls), Th1 tipa citokīnu IFN- (19641,3 pg/mL ± 8823,5) un IL-2 (599,5 pg/mL ± 37,7) sekrēcija bija augsta pēc stimulācijas ar S proteīnu pSARS2-S. imunizācijas grupā, bet tika konstatēts ļoti zems Th2 tipa citokīnu IL-5 (18,1 pg/mL ± 11,8) un IL-13 (567,2 pg/mL ± 166,2) līmenis. Līdzīgi rezultāti tika novēroti C57BL/6 pelēm, pSARS2-S imunizācijas grupa izraisīja lielāku IFN- (33918,8 pg/mL ± 11646,1) un IL-2 (800,3 pg/mL ± 109,5) daudzumu. IL-5 (4,6 pg/ml ± 2,9) un IL-13 (545,7 pg/ml ± 117,4) (5E–5H attēls). Šie dati liecināja, ka pSARS2-S var izraisīt Th1-neobjektīvas imūnās atbildes.

Fig 5. T cell response in mice after immunization with pSARS-S and SARS2-S DNA vaccines. BALB/c (A-D) and C57BL/6 (E-H) mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Splenocytes were collected at week 4 after the first immunization, and the levels of secreted IFN-γ (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G), and IL-13 (D, H) were evaluated after restimulation with recombinant SARS-CoV-2 S protein. Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

5. attēls. T šūnu reakcija pelēm pēc imunizācijas ar pSARS-S un SARS2-S DNS vakcīnām.

BALB/c (AD) un C57BL/6 (EH) peles (n=4 katrā grupā) tika intramuskulāri imunizētas divas reizes ar 3-nedēļas intervālu ar 100 ug vektora, pSARS-S vai pSARS{{ 8}}S, kam seko elektroporācija. Splenocīti tika savākti 4. nedēļā pēc pirmās imunizācijas un izdalītā IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G) un IL līmenis. -13 (D, H) tika novērtēti pēc atkārtotas stimulācijas ar rekombinanto SARS-CoV-2 S proteīnu. Antivielu titri ir parādīti kā vidējais ± SEM. *lpp<0.05 by the Mann-Whitney test.

DNS vakcīnu profilaktiskā efektivitāte pret SARS-CoV-2 izaicinājums

Lai izpētītu pSARS{0}}S vakcinācijas aizsardzības efektivitāti, Sīrijas kāmji tika imunizēti divreiz ar 100 ug DNS ar 3-nedēļas intervālu un intranazāli inficēti ar SARS-CoV-2 vīrusu 7. nedēļā. (6A attēls). Pēc imunizācijas 4. un 6. nedēļā tika savākti serumi pretsmailes antivielu (IgG) titra un neitralizējošo antivielu titra analīzei. Imunizācija ar pSARS2-S izraisīja augstāku anti-Spike antivielu titru līmeni nekā ptRBD imunizācija 4. nedēļā (1584,9 pret 50,1) un 6. nedēļā (1995,3 pret 63,1) kāmjiem (6B attēls). Saskaņā ar anti-Spike antivielu titriem pSARS2-S imunizēto kāmju serumi paaugstināja ļoti augstu neitralizējošu antivielu titrus (6,5 4. nedēļā un 6,4 6. nedēļā (log2)), bet vektora vai ptRBD imunizēti kāmji to nedarīja (6C attēls). Pēc inficēšanās ar SARS-CoV-2 kāmja ķermeņa svars tika uzraudzīts katru dienu. Iepriekšējie pētījumi atklāja, ka vīrusa titrs kāmju plaušās sasniedza augstu līmeni 3 dienas pēc inficēšanās [30]. Tāpēc puse no katras grupas kāmjiem tika nogalināti 3. dienā un tika analizēta vīrusu slodze plaušās. Ar vektoru vakcinētu kāmju ķermeņa masa pakāpeniski samazinājās, un 6 dienas pēc inficēšanās zaudētā ķermeņa masa bija 11,1%. Turpretim pSARS2-S imunizācija pasargāja kāmjus no ķermeņa svara zuduma (6D attēls). Turklāt infekciozo vīrusu titri un vīrusa RNS kopiju skaits pSARS2-S grupā uzrādīja 2,29 un 1,37 log10 samazinājumu, salīdzinot ar vektora kontroles grupu (6E un 6F attēls). Šie rezultāti liecināja, ka pSARS{0}}S imunizācija nodrošina aizsardzību pret SARS-CoV-2 infekciju Sīrijas kāmjiem.

Fig 6. Prophylactic efficacy of SARS-CoV-2 S DNA vaccine in SARS-CoV-2-infected hamsters. (A) Time course of DNA vaccination and SARS-CoV-2 challenge. Syrian hamsters were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of control, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected by retroorbital blood sampling at weeks 4 and 6 after the first immunization. At 4 weeks after the second immunization, Syrian hamsters were intranasally challenged with 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. (D) Body weight change (%) of the hamsters was recorded every day after the SARS-CoV-2 challenge. Virus titers (E) and viral RNA copies (F) in the lungs of SARS-CoV-2-infected hamsters at 3 days post-challenge were determined by TCID50 assay and qRT-PCR, respectively. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

6. attēls. SARS-CoV-2S DNS vakcīnas profilaktiskā efektivitāte SARS-CoV-2-inficētiem kāmjiem.

(A) DNS vakcinācijas un SARS-CoV-2 izaicinājuma laiks. Sīrijas kāmji tika intramuskulāri imunizēti divreiz ar 3-nedēļas intervālu ar 100 ug kontroles pSARS-S vai pSARS2-S, kam sekoja elektroporācija. Seruma paraugi tika savākti ar retroorbitālu asins paraugu ņemšanu 4. un 6. nedēļā pēc pirmās imunizācijas. 4 nedēļas pēc otrās imunizācijas Sīrijas kāmji tika intranazāli inficēti ar 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Antivielas pret SARS-CoV-2 pilna garuma smailes proteīnu tika novērtētas ar ELISA. (C) Vakcīnas izraisītā neitralizējošā aktivitāte pret SARS-CoV-2 tika novērtēta ar neitralizācijas testu. (D) Kāmju ķermeņa masas izmaiņas (%) tika reģistrētas katru dienu pēc SARS-CoV-2 inficēšanās. Vīrusa titri (E) un vīrusa RNS kopijas (F) SARS-CoV-2-inficētu kāmju plaušās 3 dienas pēc inficēšanās tika noteikti ar TCID50 testu un qRT-PCR, attiecīgi. Antivielu titri ir parādīti kā vidējais ± SEM, un neitralizācijas titri ir izteikti kā ģeometriskais vidējais ar 95% ticamības intervālu. *lpp<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Diskusija

Ir uzsākti vairāk nekā 80 COVID-19 vakcīnas klīniskie pētījumi, un imunogenitātes un vīrusu izraisītie pētījumi ar dzīvniekiem ir būtiski posmi vakcīnas izstrādes procesos. DNS vakcīnas pret SARS-CoV-2 infekciju ir intensīvi izstrādātas dažādām piegādes metodēm. Elektroporācija ir daudzsološa pieeja, kas var uzlabot DNS piegādi un imunogēnu antigenitāti in vivo . Ir ziņots par diviem DNS vakcīnas pētījumiem, ko izstrādājuši Yu et al. [13] un Smits et al. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3,1 log10 vīrusa slodzes samazinājums bronhoalveolārajā skalošanā pēc provokācijas, salīdzinot ar kontroli. Smits u.c. atklāja, ka peļu un jūrascūciņu imunizācija ar INO-4800 (kodē pilna garuma S proteīnu) ar elektroporāciju var izraisīt neitralizējošas antivielas pret SARS-CoV-2 infekciju un bloķēt S proteīna saistīšanos ar ACE2 receptoriem, taču nesniedz datus par inficēšanos ar dzīvniekiem. Šajā ziņojumā mēs novērtējām dažādus DNS vakcīnas kandidātu variantus un atklājām, ka pilna garuma S proteīns (pSARS2-S) ir vispiemērotākais turpmākiem imunoloģiskiem pētījumiem. Lai gan SARS-CoV un SARS-CoV-2 S proteīniem ir 76% homoloģija [31, 32], pSARS-S imunizācija nevar izraisīt antivielas pret SARS-CoV-2 S proteīna RBD vai neitralizēt antivielu titrus pret SARS-CoV-2 infekciju (2. att). Patiešām, anti-RBD antivielām ir svarīga loma vīrusu infekcijas bloķēšanā. Tomēr imunizācija tikai ar RBD (ptRBD) radīja augstu neitralizējošu antivielu titrus pelēm, bet ne kāmjiem (att.2Hun6C). Mēs domājām, ka šis rezultāts var būt saistīts ar signāla peptīdu (audu plazminogēna aktivatoru), kas nespēj veicināt RBD proteīna sekrēciju kāmjiem. Sīki izstrādātais mehānisms nākotnē prasa papildu izpēti. Mēs arī atzīmējām, ka ptRBDTM (kodē fragmentu no RBD uz S transmembrānu domēnu) imunizācija izraisīja zemākus neitralizējošus antivielu titrus nekā ptRBD imunizācija (att.2HunS1C). Rezultāti var atspoguļot RBD-TM proteīna nestabilo struktūru. Lai turpinātu pētīt Th1/Th2 imūnās atbildes, imunizēto peļu splenocīti tika stimulēti ar SARS-CoV-2 S proteīnu. Mēs noskaidrojām, ka pSARS2-S imunizācija izraisīja spēcīgas Th1-novirzītas imūnās atbildes ar augstāku IFN- -sekrēcijas līmeni pēc stimulācijas (5. att), taču imunizācija ar pSARS-S izraisīja tikai zemu IFN- -sekrēcijas līmeni. Šie dati liecināja, ka T šūnu reakciju krusteniskā reaktivitāte starp SARS-CoV smaile proteīnu un SARS-CoV-2 nav augsta (5. att). Turklāt IFN-ELISPOT tests atklāja, ka tika konstatēts mazāk T šūnu reakciju pret S1 reģionu C57BL/6 un BALB/c pelēm, kas imunizētas ar pSARS-S (S2 att), ko atbalsta arī Smita pētījums [12]. Šie dati norādīja, ka SARS vakcīna var nenodrošināt pilnīgu aizsardzību pret SARS-CoV-2 infekciju. DNS vakcīnu izstrāde ir svarīga ātrai reakcijai uz pandēmisko koronavīrusa infekciju. Tādējādi DNS vakcīnas pret SARS-CoV-2 panākumus varētu izmantot arī citām atklātām infekcijas slimībām.

Dažādās SARS-SoV-2 DNS vakcīnās izmantotās konstrukcijas izraisīja dažādus neitralizējošu antivielu titru līmeņus. tPA līdersekvence ir izmantota, lai palielinātu antigēna ekspresiju un sekrēciju DNS vakcīnās [21, 33–35]. Tomēr tPA līdera secība šajā ziņojumā būtiski nepalielināja antivielu titrus. Lai vēl vairāk palielinātu vakcīnas efektivitāti, var izmantot dažādas līdersekvences, lai aizstātu smailes proteīna dabisko līdersekvenci. IgE līdersekvence tika izmantota INO-4800 DNS vakcīnā un MERS-CoV vakcīnā [5, 12]. Turklāt modificētā smaile proteīna secība var arī palielināt vakcīnas imunogenitāti. Stabilizēts smailes proteīns ir izveidots, mutējot furīna vietu un citus reģionus, lai radītu prefūzijas struktūru (S-2P), kas var palielināt smailes proteīna ekspresiju ~10- reizes [36]. Ideālai DNS vakcīnai ir jāoptimizē plazmīdas DNS konstrukcija un piegādes sistēma, lai palielinātu proteīna ekspresijas līmeni.

Desert ginseng—Improve immunity

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Dzīvnieku modeļi ir ļoti svarīgi COVID{0}} vakcīnas izstrādei. Lai novērtētu COVID-19 vakcīnu efektivitāti, ir izmantoti vairāki dzīvnieku modeļi, tostarp pret primātiem, kas nav cilvēkveidīgie primāti [13, 37], cilvēka ACE2 transgēnās peles [38] un Sīrijas kāmji [39]. Sīrijas kāmja ACE2 ir ļoti līdzīgs cilvēka ACE2, un tika prognozēts, ka tā saistīšanās afinitāte ar SARS-CoV-2 S proteīnu ir augstāka nekā peles ACE2 [40]. Tas ir iemesls, kāpēc cilvēka ACE2 transgēnās peles tika izmantotas kā SARS-CoV-2 izaicinājumu modeļi, bet ne savvaļas tipa peles. SARS-CoV-2 pārnešanas pētījumi ir parādījuši, ka vīruss var efektīvi inficēt naivus kāmjus tiešā kontaktā vai ar aerosolu palīdzību [41]. SARS-CoV-2 intranazāla infekcija var vairoties un izraisīt patoģenēzi Sīrijas kāmju plaušās [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>5% samazinājums salīdzinājumā ar sākotnējo līmeni), kas bija saistīts ar ilgāku slimības ilgumu [42]. Šie atklājumi liecina, ka Sīrijas kāmis ir arī piemērots dzīvnieku modelis COVID{0}} vakcīnu novērtēšanai. Pamatojoties uz dzīvnieku modeļu pieejamību, mēs izvēlējāmies kāmjus kā SARS-CoV-2 izaicinājuma modeli, lai novērtētu vakcīnas efektivitāti. Mūsu dati parādīja, ka imunizācija ar pSARS2-S, bet ne ptRBD, var izraisīt augstus anti-Spike IgG antivielu titrus un neitralizējošo antivielu titrus (6B un 6C attēls). Attiecīgi ar pSARS2-S imunizēti kāmji, bet ne ar ptRBD imunizēti kāmji, radīja imūnās atbildes pret SARS-CoV-2 izaicinājumu. Mēs atzīmējām, ka ptRBD imunizācija var izraisīt augstu neitralizējošu antivielu titru līmeni pelēm, bet ne kāmjiem. Pretrunīgie rezultāti var būt tāpēc, ka UBR kāmjos nav stabili izteikts. Kāmja modelis tika izmantots arī adenovīrusa 26. serotipa (Ad26) vektora COVID-19 vakcīnas novērtēšanai. Viena imunizācija ar Ad26 uz vektoru balstītu vakcīnu, kas ekspresē stabilizētu SARS-CoV-2 smaiļu proteīnu, kas izraisīja neitralizējošu antivielu reakciju un aizsargāja pret SARS-CoV-2 infekciju, izraisīja svara zudumu, daļēju mirstību un vīrusa replikāciju. plaušās [39]. Šie rezultāti liecināja, ka kāmja modelis ir piemērots COVID{0}} vakcīnu efektivitātes novērtēšanai.

Daudzi SARS-CoV{1}} vakcīnu izstrādes centieni ir balstīti uz MERS-CoV un SARS-CoV pētījumu pieredzi. 2020. gada decembrī visā pasaulē ir apstiprinātas vairākas Covid-19 vakcīnas, tostarp uz RNS un adenovīrusu vektoriem balstītas COVID-19 vakcīnas. Ir apspriestas dažādu vakcīnu platformu priekšrocības un trūkumi [43]. Adenovīrusu vektora vakcīnas var izraisīt spēcīgāku imūnreakciju nekā DNS un mRNS vakcīnas, taču to vakcīnas efektivitāti var samazināt jau esoša imunitāte pret reklāmu vektoriem [44]. Salīdzinot ar DNS vakcīnu, mRNS vakcīnai uzglabāšanai un transportēšanai nepieciešama īpaši zema temperatūra [45]. Tādējādi DNS vakcīna varētu būt potenciāla vakcīnas platforma, īpaši ārkārtas lietošanas laikā.

Mūsu pētījums liecina par DNS vakcīnas iespējamību lietošanai cilvēkiem. Turpmākajos pētījumos varētu izpētīt šīs DNS vakcīnas, kas tiek piegādāta, izmantojot intradermālu (ID) injekciju, efektivitāti, kas ir ērtāka klīniskai lietošanai, jo IM injekcijas adata cilvēkiem ir aptuveni 18 mm dziļa un ietekmē vairāk audu nekā ID injekcija ar EP. Turklāt vakcīnas efektivitāte ir jāpārbauda vecām pelēm kā paraugs gados vecākiem cilvēkiem, jo ​​šī populācija ir īpaši smagi ietekmēta, ja inficējas ar SARS-CoV-2. Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka Th2 šūnu reakcija ir saistīta ar pastiprinātu elpceļu slimību (VAERD) pēc inaktivētu vīrusu vakcīnu vakcinācijas pret RSV.46], masalu vīruss [47] un SARS-CoV [27, 48]. Turpretim ir ziņots par mazāk smagiem SARS-CoV gadījumiem, ko izraisa Th1 šūnu reakcijas indukcijas [49]. Tāpēc DNS vakcīnas izraisītās spēcīgās Th{0}}neobjektīvās imūnās atbildes liecina, ka blakusparādības, visticamāk, nebūs liela problēma [50]. Turklāt bažas par vakcīnām, kuru pamatā ir olbaltumvielas, ir radījušas alumīnija sāls vai eļļa ūdenī emulsijas tipa adjuvantu izmantošana, kas izraisa Th2-neobjektīvas imūnās atbildes reakcijas un palielina iespējamās blakusparādības [51, 52]. Rezumējot, COVID{0}} DNS vakcīnai tuvākajā nākotnē var būt liela nozīme pandēmijas COVID-19 kontrolē.

Atsauces

  1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. COVID{0}} uzliesmojuma ekonomiskās sekas: vajadzība pēc gatavības epidēmijai. Front Sabiedrības veselība. 2020; 8:241. pmid:325743072. Sistēmu zinātnes un inženierijas centrs (CSSE) [internets]. COVID-19 informācijas panelis. Džona Hopkinsa universitāte. [citēts 2021. gada 11. februārī]. Pieejams no:
  2. 3. Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K u.c. Smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa strukturālo proteīnu ieguldījums aizsargājošā imunitātē. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid:15210961
  3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K u.c. DNS vakcīna inducē SARS koronavīrusa neitralizāciju un aizsargājošu imunitāti pelēm. Daba. 2004;428(6982):561–4. pmid:15024391
  4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO u.c. Sintētiska vienprātīga pretsmailes proteīna DNS vakcīna izraisa aizsargājošu imunitāti pret Tuvo Austrumu respiratorā sindroma koronavīrusu primātiem, kas nav cilvēkveidīgie primāti. Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid:26290414
  5. 6. Krammer F. SARS-CoV-2 vakcīnas izstrādes stadijā. Daba. 2020;586(7830):516–27. pmid:32967006
  6. 7. Khalaj-Hedayati A. Aizsardzības imunitāte pret SARS apakšvienības vakcīnas kandidātiem, pamatojoties uz smailes proteīnu: Nodarbības koronavīrusa vakcīnas izstrādei. J Immunol Res. 2020; 2020: 7201752. pmid:32695833
  7. 8. Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z u.c. Humorālās un šūnu imūnās atbildes, ko izraisa 3a DNS vakcīnas pret smagu akūtu respiratoro sindromu (SARS) vai SARS līdzīgu koronavīrusu pelēm. Clin Vaccine Immunol. 2009;16(1):73–7. pmid:18987164
  8. 9. Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Neitralizējošo antivielu radīšana ar DNS vakcīnām, kas ekspresē šķīstošus stabilizētus cilvēka imūndeficīta vīrusa 1. tipa apvalka glikoproteīna trimerus, kas konjugēti ar C3d. Dž Virols. 2004; 78(9): 4710–9. pmid:15078953
  9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. DNS vakcīnas optimizācija pret SARS. DNS šūnu biol. 2007;26(10):721–6. pmid:17665998
  10. 11.Gary EN, Weiner DB. DNS vakcīnas: šobrīd ir labākais laiks. Curr Opin Immunol. 2020;65:21–7. pmid:32259744
  11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J u.c. DNS vakcīnas kandidāta imunogenitāte pret COVID-19. Nat Commun. 2020;11(1):2601. pmid:32433465
  12. 13. Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH u.c. DNS vakcīnas aizsardzība pret SARS-CoV-2 rēzus makakiem. Zinātne. 2020;369(6505):806–11. pmid:32434945
  13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Piegādes metodes, lai palielinātu šūnu uzņemšanu un DNS vakcīnu imunogenitāti. Vakcīna. 2016;34(46):5488–94. pmid:27742218
  14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M u.c. Ātra reakcija uz jaunu infekcijas slimību — mācības, kas gūtas, izstrādājot sintētisku DNS vakcīnu, kas vērsta pret Zikas vīrusu. Mikrobi inficē. 2018;20(11–12):676–84. pmid: 2955534516. Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C u.c. Iedzimts molekulārais un šūnu paraksts ādā pirms ilgstošas ​​T šūnu atbildes reakcijas pēc elektroporācijas DNS vakcinācijas. J Immunol. 2020;204(12):3375–88. pmid:32385135
  15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV u.c. Jauna prototipa ierīce ar elektroporāciju uzlabotai DNS vakcīnas ievadīšanai vienlaikus gan ādā, gan muskuļos. Vakcīna. 2011; 29(39): 6771–80. pmid:21199706
  16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS u.c. Paaugstināta tetravalentās tropu drudža DNS vakcīnas imunogenitāte un aizsardzības efektivitāte, izmantojot elektroporāciju un intradermālu ievadīšanu. Vakcīna. 2019;37(32):4444–53. pmid:31279565
  17. 19. Ramakrishnan MA. 50% galapunkta titra noteikšana, izmantojot vienkāršu formulu. Pasaule J Virol. 2016;5(2):85–6. pmid:27175354
  18. 20.Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK u.c. 2019. gada jaunā koronavīrusa (2019-nCoV) noteikšana ar reāllaika RT-PCR. Euro Surveill. 2020. pmid: 31992387
  19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q u.c. Audu plazminogēna aktivatora (tPA) signālu secība uzlabo uz MVA balstītas vakcīnas pret tuberkulozi imunogenitāti. Immunol Lett. 2017;190:51–7. pmid:28728855
  20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y u.c. 2019-nCoV un saplūšanas inhibitoru saplūšanas mehānisms, kas vērsts uz HR1 domēnu smailes proteīnā. Cell Mol Immunol. 2020;17(7):765–7. pmid:32047258
Jums varētu patikt arī