Cistanche: ehinakozīds nomāc aizkuņģa dziedzera adenokarcinomas šūnu augšanu, izraisot apoptozi caur mitogēnu aktivētu proteīna kināzes ceļu

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WAN, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG un XINFENG LI

Abstrakts.

No tradicionālās ķīniešu medicīnas iegūto dabisko produktu klīniskais pielietojums ir ieguvis uzmanību vēža ķīmijterapijas līdzekļos.Ehinakozīds(ECH), viens no feniletanoīdiem, izolēts no kātiemCistanche(ķīniešu augu izcelsmes zāles) ir audus aizsargājoša un antiapoptotiska iedarbība uz centrālo nervu sistēmu. Tomēr joprojām nav skaidrs, vai ECH piemīt audzēju nomācoša darbība. Šajā pētījumā tika pierādīts, ka ECH var ievērojami kavēt aizkuņģa dziedzera adenokarcinomas šūnu proliferāciju, izraisot reaktīvo skābekļa sugu veidošanos un mitohondriju membrānas potenciāla traucējumus un tādējādi izraisot apoptozi. Turklāt tika noskaidrots, ka ECH(Ehinakozīds)nomāc audzēja šūnu augšanu, modulējot MAPK aktivitāti. Visbeidzot, šis pētījums atklāj jaunu ECH (Ehinakozīds), lai novērstu vēža attīstību, un tas nozīmē, ka ECH lietošana varētu būt potenciāla vēža ķīmijterapijas stratēģija.

Ievads

P53 audzēja supresora ceļš, indukējot audzēja supresoru ARF, mazina onkogēnās E3-ligāzes peles dubultminūtes (MDM)2-mediēto p53 degradāciju (3). Tas ir automātiski regulējams pašaizsardzības mehānisms, kas novērš šūnu ļaundabīgu transformāciju. Proti, p53 var apspiest Myc aktivitāti, transkripcijas ceļā aktivizējot, piemēram, miR-145, kas ir vērsta uzMycmRNS tulkošanas klusināšanai (4,5), tādējādi veidojot negatīvas atgriezeniskās saites regulējošo cilpu.

Visvienkāršākā un efektīvākā vēža ārstēšanas stratēģija ir vēža šūnu iznīcināšana. Ir pierādīts, ka parasti lietotās pretvēža zāles, piemēram, cisplatīns (6), aktinomicīns D (7) un adriamicīns (8), kavē audzēja augšanu, veicinot apoptozi. Nesen arvien vairāk pierādījumu liecina, ka vairākiem dabiskiem produktiem un augu atvasinājumiem, jo ​​īpaši no tradicionālajā ķīniešu medicīnā (TCM) izmantotajiem ārstniecības augiem, piemīt audzēju nomācoša funkcija, izraisot vēža šūnu apoptozi, un tiem ir potenciāls klīniskai lietošanai. vēža terapijā (9). Piemēram, dabiskais antrahinona emodīns ir izolēts no daudziem vēža šūnu veidiem (10, 11). Kamptotecīns, kas iegūts no ķīniešu "laimīgā koka",Camptotheca asināt, ir vērtīgs dabisks produkts, kas inhibē DNS ligāciju pēc topo I izraisītas virknes pārtraukumiem (12). Citā retrospektīvā uz populāciju balstītā kohortas pētījumā, kurā kopumā piedalījās 729 pacienti ar progresējošu krūts vēzi, tika ierosināts, ka TCM terapija var veicināt vēža ārstēšanu. No šīs kohortas 115 pacienti bija TCM lietotāji, savukārt 614 pacienti nelietoja TCM. Daudzfaktoru analīze parādīja, ka salīdzinājumā ar nelietotājiem TCM lietošana bija saistīta ar ievērojami samazinātu visu iemeslu mirstības risku (13). Visi iepriekš minētie atklājumi norādīja, ka TCM ir svarīga papildu un alternatīva medicīna, ko var izmantot vēža ārstēšanā.

pelēm ar akūtu plaušu bojājumu (16, 17). Arī ECH(Ehinakozīds)Ir pierādīts, ka tam ir aizsargājoša iedarbība uz nervu audiem un uzlabo uzvedības traucējumus Parkinsona slimības peļu modeļos (18). Jo īpaši ir konstatēts, ka ECH veicina šūnu proliferāciju un inhibē apoptozi peles zarnu epitēlija MODE-K šūnās (19). Tomēr līdz šim mazāk uzmanības ir pievērsts ECH potenciālajai lomai vēža profilaksē.

Šajā pētījumā tika pētīts, vai ECH ārstēšana ietekmē audzēja šūnu augšanu un proliferāciju un vai ECH(Ehinakozīds)inducē apoptozi, paaugstina reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos un samazina mitohondriju membrānas potenciālu (MMP), un attiecīgi nomāc audzēja šūnu augšanu. Turklāt šī pētījuma mērķis bija identificēt molekulāros mehānismus, kas ir atbildīgi par ECH mediētu šūnu augšanas kavēšanu.

Materiāli un metodes

Šūna līnija, reaģents, un antivielas.SW1990 aizkuņģa dziedzera adenokarcinomas šūnas (ATCC, Manasasa, VA, ASV) tika kultivētas Dulbecco modificētajā Eagle barotnē, kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu, 50 V/ml penicilīna un 0,1 mg/ml streptomicīna 37 ˚C temperatūrā. 5 procenti CO2 mitrināta atmosfēra. ECH(Ehinakozīds)tika iegādāts no Jrdun Biotechnology Corp. (Šanhaja, Ķīna). Antivielas pret AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 un GAPDH tika iegādātas no Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ASV); anti-Bax un anti-Bcl-2 tika iegādāti no Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santakrusa, Kalifornija, ASV); un anti-Caspase{10}} tika iegādāts no Abcam (Šanhaja, Ķīna).

Šūna dzīvotspējutests. Lai novērtētu audzēja šūnu augšanas ātrumu, saskaņā ar ražotāja norādījumiem tika izmantots šūnu skaitīšanas komplekts{{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, ASV). Šūnu suspensijas iesēja 5,000 šūnas vienā iedobē ar ECH apstrādi 0, 12, 24, 48 vai 72 stundas 96 -iedobju kultūras plāksnēs. Šūnu augšanas kavēšana tika noteikta, katrā iedobē pievienojot WST-8 reaģentu no CCK-8 komplekta ar galīgo koncentrāciju 10 procenti, un paraugu absorbcija tika mērīta pie 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ASV).

Hoechst 33342 krāsošana.Šūnas (60 procentu saplūšana) apstrādāja ar Hoechst 33342 (Beyotime Biotehnoloģijas institūts, Haimena, Ķīna) ar galīgo koncentrāciju 1µg/ml, inkubēts 37˚C inkubatorā 15 minūtes, divreiz mazgāts ar fosfātu buferšķīdumu, fiksēts 4% paraformaldehīdā 30 minūtes istabas temperatūrā un uzstādīts uz priekšmetstikliņiem. Šūnu kodolu morfoloģiskās izmaiņas tika novērotas fluorescences mikroskopā (Olympus BX51, Melville, NY, ASV). Normālie kodoli bija apaļi un nokrāsoti gaiši zilā krāsā, savukārt apoptotiskie kodoli bija sarukuši un iekrāsojušies spilgti zilā krāsā.

Aktivizēta ar fluorescenci šūna šķirošana (FACS) analīzes.Apoptozes novērtēšanai saskaņā ar ražotāja norādījumiem tika izmantots fluoresceīna izotiocianāta (FITC)-Annexin V apoptozes noteikšanas komplekts (BD Biosciences, Šanhaja, Ķīna). Īsumā, 5x104 šūnas tika mazgātas ar ledusaukstu PBS, atkārtoti suspendētas 0,1 ml saistīšanas buferšķīdumā (Beyotime Institute of Biotechnology) un iekrāsotas ar 10 ml FITC konjugētā aneksīna V (10 mg/ml) un 10 ml propīdija jodīda (PI) (50 mg/ml). Pēc 15 minūšu inkubācijas istabas temperatūrā tumsā un 400 ml saistīšanas bufera pievienošanas šūnas tika analizētas ar plūsmas citometru (C6; BD Biosciences, Šanhaja, Ķīna).

Mērīšana no reaktīvs skābeklis sugas (ROS).Lai novērtētu ROS ražošanu, saskaņā ar ražotāja norādījumiem tika izmantots Reactive Oxygen Species Assay komplekts (Vigorous Biotechnology, Pekina, Ķīna). Īsumā, šūnas (80 procentu saplūšana) tika novāktas un mazgātas ar PBS pirms krāsošanas ar dihidroetīdija (DHE) šķīdumu (Beyotime Biotehnoloģijas institūts). Pēc tam šūnas tika analizētas, izmantojot plūsmas citometriskās analīzes.

Mērīšana no mitohondriju membrāna potenciāls (MMP).

Lai noteiktu MMP izmaiņas, tika izmantots tetrametilrodamīna metilestera (TMRM) testa komplekts (ImmunoChemistry Technologies, Blūmingtona, MN, ASV). Īsumā, šūnas (80 procentu saplūšana) tika novāktas, mazgātas ar PBS un krāsotas ar TMRM 15–20 minūtes 37 °C inkubatorā. Pēc tam šūnas vienu reizi nomazgāja ar PBS un tika pakļautas plūsmas citometriskām analīzēm.

Imūnblotēšanaanalīzes. Šūnas (80 procentu saplūšana) tika novāktas un lizētas RIPA buferšķīdumā (Jrdun Biotechnology), kas sastāv no 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% nātrija deoksiholskābes un 0,1% SDS un svaigi pievienoti proteasomu inhibitori. Imunoblotēšanas analīzei tika izmantoti vienādi daudzumi skaidra šūnu lizāta, kā aprakstīts iepriekš (20).

Statistikas analīze.Kvantitatīvos datus izsaka kā vidējo ± standartnovirzi. Statistiskās atšķirības tika novērtētas ar nesapārotu Studenta t-testu, izmantojot statistisko SPSS 15.0 programmatūru. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Rezultāti

ECH (Ehinakozīds)nomāc audzējs šūnaizaugsmi. Lai gan ir ziņots, ka ECH(Ehinakozīds)piemīt aizsargājoša loma, inhibējot apoptozi un iekaisuma signālus somatiskajās šūnās, piemēram, neironu un zarnu epitēlija šūnās (16-19), joprojām nav skaidrs, vai ECH kontrolē vēža šūnu augšanu un proliferāciju. Lai to pārbaudītu, tika veikts šūnu izdzīvošanas tests, apstrādājot SW1990 šūnas, kas iegūtas no II pakāpes aizkuņģa dziedzera adenokarcinomas, ar titrētām ECH devām, kā parādīts 1. attēlā. Proti, tika pierādīts, ka ECH devā ievērojami kavē audzēja šūnu proliferāciju. -atkarīgā veidā 5-dienas kultūras periodā (1. att.).ECH trigeriapoptoze. Tā kā apoptozes zudums ir viens no galvenajiem aizkuņģa dziedzera vēža šūnu nekontrolētas proliferācijas cēloņiem (21), šajā pētījumā tika veikts eksperimentu kopums, lai noteiktu, vai ECH izraisa apoptozi. Pirmkārt, krāsojot audzēja šūnu kodolus ar Hoechst 33342, tika pierādīts, ka ECH izraisa apoptozi atkarībā no devas (2.A attēls). Turklāt FACS analīzes tika veiktas, izmantojot aneksīna V/PI krāsošanu, lai vēl vairāk apstiprinātu ty ECH apoptotisko efektu (2.B att.). Vidējais apoptotisko šūnu procentuālais daudzums normālos kultivēšanas apstākļos bija 1,1 procents, savukārt šis procents būtiski palielinājās līdz 10,6, 21,4 un 51,3 procentiem, reaģējot uz ECH ārstēšanu atkarībā no devas (2. att. C). Šie rezultāti kopā ar šūnu dzīvotspējas testu, kas parādīts 1. attēlā, parāda, ka ECH ārstēšana nomāc audzēja šūnu proliferāciju, izraisot apoptozi.

radīt etidiju, kas interkalējas ar DNS, šajā pētījumā tika izmantots, lai novērtētu ROS veidošanos. Tika konstatēts, ka, tāpat kā citas pretvēža zāles, ECH arī stimulē ROS veidošanos atkarībā no devas, par ko liecina paaugstināta fluorescences intensitāte, ārstējot ar ECH (3. att.).

ECH (Ehinakozīds)samazina MMP.Ir pierādīts, ka mitohondriju disfunkcija ir saistīta ar apoptozes indukciju. Ir pierādīts, ka mitohondriju caurlaidības pārejas poru atvēršana izraisa transmembrānas potenciāla depolarizāciju un proapoptotisko faktoru izdalīšanos (23). Tāpēc tika pārbaudīts, vai ECH var izraisīt MMP zudumu audzēja šūnās, veicot TMRM testu, kas ir vispāratzīta pieeja, jo TMRM fluorescences intensitāte ir proporcionāla membrānas potenciālam. Tika pierādīts, ka ECH terapija būtiski samazina MMP atkarībā no devas (4. att.).ECH vadīklas audzējs šūna izaugsmi caur mitogēnu aktivēts proteīnsTika pārbaudīts ECH mediētās audzēja šūnu nāves molekulārais pamats, vairāku svarīgu signalizācijas ceļu, piemēram, MAPK un AKT (24, 25), kas kontrolē šūnu izdzīvošanu un nāvi, aktivitāte. MAPK ir evolucionāri konservētas, uz prolīnu virzītas Ser/Thr proteīna kināzes, tostarp ārpusšūnu signālu regulētās kināzes (ERK), c-Jun NH2- termināla kināze (JNK) un p38 ģimenes locekļi, kas tiek aktivizēti, izmantojot trīs līmeņa kināzes signalizācijas kaskādes (26,27). Šajā pētījumā tika novērtēta MAPK un AKT, kā arī to aktivēto fosforilēto formu ekspresija un atklājās, ka ECH izteikti nomāc JNK un ERK1/2 aktivitāti, bet pastiprina p38 aktivitāti (5. att.). Konkrēti, tika pierādīts, ka AKT aktivitāte, kas arī ir ļoti svarīga šūnu proliferācijai, neietekmē ECH ārstēšanu (5. att.). Turklāt tika parādīts, ka ECH apstrāde paaugstina Baksa un Kaspāzes -3 ekspresiju, vienlaikus samazinot Bcl-2 ekspresiju (5. att.), kas atbilst 2. att.. Tādējādi rezultāti liecina, ka ECH izraisa audzēja šūnu apoptozi caur MAPK ceļu.

Diskusija

Cik mums ir zināms, šis ir pirmais pētījums, kas parāda, ka ECH ir audzēju nomācoša funkcija, izraisot apoptozi (2. att.), veicinot ROS veidošanos (3. att.) un izraisot mitohondriju membrānas potenciāla depolarizāciju (4. att.). , tādējādi izraisot audzēja šūnu augšanas kavēšanu (1. att.). Turklāt tika pierādīts, ka ECH mediētās audzēja šūnu nāves molekulārā bāze notiek, regulējot MAPK signalizācijas ceļus (5. att.). Šie atklājumi parāda jaunu ECH funkciju audzēja ģenēzes novēršanā un tādējādi liecina, ka tas var būt vēža terapijas kandidāts.

Lielākā daļa pretvēža zāļu var izraisīt audzēja šūnu apoptozi, novecošanos un/vai šūnu cikla apstāšanos, kas izraisa audzēja šūnu augšanas un proliferācijas kavēšanu. Šūnu cikla apstāšanās ir šūnu reakcija uz viegliem stresa signāliem, kas ļauj šūnām atjaunot bojāto DNS pirms replikatīvas DNS sintēzes vai mitozes uzsākšanas, savukārt apoptoze un novecošanās (pastāvīgs šūnu cikla apstāšanās) notiek, reaģējot uz stresa signāliem, kas iznīcina nelabojamās vai ļaundabīgās šūnas ( 28,29). Tāpēc šajā pētījumā tika novērtēta tikai ECH apoptotiskā ietekme uz audzēja šūnām, jo ​​vēža šūnu nogalināšana ir galvenais kritērijs pretvēža līdzekļa iedarbības novērtēšanai. Jo īpaši tika pierādīts, ka ECH izraisa ekspresijuBakss(5. att.), proapoptotisks gēns, ko transkripcijas veidā aktivizē audzēja nomācējs p53 (30). Tādējādi ir vērts pārbaudīt, vai ECH var aktivizēt p53 signalizācijas ceļu. Ja tā, ECH var izraisīt arī p53-atkarīgu šūnu cikla apstāšanos, novecošanos, apoptozi vai autofagiju. Šajā pētījumā tika noskaidrota ECH audzēju nomācošā funkcija SW1990 aizkuņģa dziedzera adenokarcinomas šūnu līnijā. Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai novērotu vairāk aizkuņģa dziedzera vēža šūnu līniju. Ir pierādīts, ka onkogēnā proteīna RAS un audzēja supresora p53 mutācijas ir saistītas ar aizkuņģa dziedzera vēža attīstību (31); tomēr, saskaņā ar IARC p53 datubāzi (//p53.iarc.fr/CellLines.aspx) SW1990 šūnu līnija nesatur nekādu p53 mutāciju. Tāpēc ir svarīgi izpētīt, vai ECH var ietekmēt citu aizkuņģa dziedzera vēža šūnu līniju augšanu un proliferāciju ar dažādām p53 mutācijām. Turklāt būtu interesanti noteikt, vai ECH spēj veicināt apoptozi un kavēt cita veida audzēju augšanu.

Ir pierādīts, ka ROS paaugstināšanās un MMP samazināšanās, ko izraisīja ECH ārstēšana, ir būtiskas apoptozes indukcijā (22). Turklāt ir konstatēts, ka ROS var izraisīt mitohondriju poru oksidēšanos, veicinot citohroma izdalīšanosc, apoptozes starpprodukts MMP darbības traucējumu dēļ (22). Tādējādi vēl ir jānosaka, vai ECH izjauc MMP netieši, indukējot ROS. Turklāt ir pierādīts, ka ROS izraisītais oksidatīvais stress ir iesaistīts neskaitāmu šūnu augšanu kontrolējošu signālu, tostarp p53, NF-κB, HIF un PI3K, modulēšanā (32). Joprojām ir jānosaka, vai un, ja jā, kā ECH regulē šos svarīgos signalizācijas ceļus. Proti, oksidatīvais stress izraisa dažādas neirodeģeneratīvas slimības augstā skābekļa patēriņa, vājo antioksidantu sistēmu un centrālās nervu sistēmas terminālās diferenciācijas īpašību dēļ (33). Tomēr vairāki pētījumi ir parādījuši, ka ECH ir aizsargājoša un anti-apoptotiska iedarbība uz nervu audiem. Šajā sakarā ir saprātīgi izvirzīt hipotēzi, ka ECH var samazināt ROS veidošanos termināli diferencētajās nervu šūnās. Tāpēc vēl ir jānosaka, vai ECH ROS ražošanas regulēšana ir atkarīga no šūnu diferenciācijas statusa. Tādējādi pašreizējie rezultāti kopā ar citiem pētījumiem atklāj, ka ECH, plaši izmantotais TCM, var būt svarīga ķīmijterapijas stratēģija ne tikai neirodeģeneratīvo slimību, bet arī ļaundabīgo karcinomu ārstēšanai.

Pēdējā laikā arvien lielāka uzmanība tiek pievērsta TCM izmantošanai vēža terapijā. TCM izmantoto ārstniecības augu dabisko produktu potenciālu ir atzinusi zinātnieku aprindas pat rietumu pasaulē (9). Ir jāpieliek pūles, lai noskaidrotu šo dabisko produktu darbības pamatā esošos mehānismus, kas galu galā var novest pie efektīvu un drošu vēža terapijas zāļu izstrādes.

Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums parādīja ECH audzēju inhibējošo funkciju un arī izstrādā ECH mediētās audzēja nomākšanas molekulāro bāzi, tādējādi liekot domāt par ECH iespējamo klīnisko pielietojumu vēža terapijā.

Pateicības

Šo pētījumu finansēja un atbalstīja FMU galvenā zinātniskās pētniecības programma (granta Nr. 09ZD014). Autori vēlas pateikties Biomedworld (Šanhaja, Ķīna) par palīdzību manuskripta rediģēšanā.

Atsauces

1. Hanahan D un Weinberg RA: Vēža pazīmes: nākamā paaudze. 144. šūna: 646-674, 2011. gads.

2. Alderton GK: Transkripcija: MYC transkripcijas efekti. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ un Roussel MF: Myc signalizācija, izmantojot ARF audzēja nomācēju, regulē p53-atkarīgo apoptozi un iemūžināšanu. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K un Mo YY: p53 nomāc c-Myc, inducējot audzēja supresoru miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X un Lu H: jauns ieskats p53 funkcijās, izmantojot tās mērķa mikroRNS. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB un Lippard SJ: Cisplatīns un DNS labošana vēža ķīmijterapijā. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H un Korc M: Actinomycin D inducē apoptozi un kavē aizkuņģa dziedzera vēža šūnu augšanu. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P un Dass CR: Doksorubicīns: Atjauninājums par pretvēža molekulāro darbību, toksicitāti un jaunām zāļu piegādes sistēmām. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS un Kaina B: no tradicionālās ķīniešu medicīnas līdz racionālai vēža terapijai. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.