DPTQ, jauna pozitīvā dopamīna D1 receptora allosteriskā modulatora, ietekme uz spontānu acu mirkšķināšanas ātrumu un telpisko darba atmiņu primātiem, kas nav cilvēkveidīgie primāti, 1. daļa

Abstrakts

Pamatojums

Dopamīna (DA) signalizācija caur D1 receptoru ir neatņemama daudzu izziņas aspektu sastāvdaļa, tostarp darba atmiņas pamatprocesā. D1 receptoru pozitīvo allosterisko modulatoru (PAM) atklāšana ir ļāvusi izmantot ārstēšanas metodes, kurām var būt alternatīvas priekšrocības ortosteriskajiem D1 agonistiem, kas izriet no darbības sinerģijas ar funkcionālo D1 receptoru signālu pārraidi.

Dopamīns ir neirotransmiters, kas būtiski ietekmē smadzeņu darbību. Tam ir svarīga loma emociju, ēšanas, emociju, mācīšanās, atmiņas un daudzu citu aspektu regulēšanā. Jaunākie pētījumi ir atklājuši ciešu saistību starp dopamīnu un atmiņu.

Pētījumi liecina, ka dopamīns var uzlabot indivīda spēju atcerēties situācijas un notikumus. Tas ir tāpēc, ka dopamīns regulē mijiedarbību starp neironiem smadzenēs, atvieglojot attiecīgās informācijas uzglabāšanu un izguvi. Tajā pašā laikā dopamīns var stiprināt saikni starp neironiem, uzlabot pārraides efektivitāti starp neironiem un vēl vairāk veicināt atmiņas veidošanos un uzturēšanu.

Reālajā dzīvē mēs varam palielināt dopamīna sekrēciju dažādos veidos, lai uzlabotu atmiņu. Piemēram, vingrošana var veicināt dopamīna izdalīšanos, tāpēc regulāri fiziski vingrinājumi ir efektīvs veids, kā uzlabot atmiņu. Turklāt daži pārtikas produkti, piemēram, pupiņas, rieksti, pilngraudu maize utt., var arī palielināt dopamīna sekrēciju un palīdzēt mums uzlabot atmiņu.

Ikdienas mācībās un darbā mēs varam arī uzlabot atmiņu, stimulējot smadzeņu dopamīna sistēmu. Piemēram, mēs varam aktivizēt dopamīna sistēmu, izvirzot mērķus, atalgojot sevi un regulāri sniedzot atgriezenisko saiti, tādējādi uzlabojot atmiņu un izpratni par iegūtajām zināšanām. Turklāt pozitīva attieksme un labs garastāvoklis var arī veicināt dopamīna izdalīšanos un uzlabot atmiņu.

Rezumējot, pastāv cieša saistība starp dopamīnu un atmiņu. Izmantojot zinātniskas metodes un pareizu attieksmi, mēs varam veicināt dopamīna sekrēciju, uzlabot atmiņu un labāk tikt galā ar izaicinājumiem mācībās un darbā. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola var regulēt arī neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni. Šīs vielas ir ļoti svarīgas atmiņai un mācībām. Turklāt gaļa var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekami daudz barības vielu un enerģijas, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz zināt veidus, kā uzlabot smadzeņu darbību

Mērķi

Lai izpētītu šo potenciālu, mēs esam pētījuši jaunā D1 PAM DPTQ ietekmi uz telpiskas aizkavētas reakcijas darba atmiņas uzdevumu rēzus pērtiķiem. Sākotnējie pētījumi liecināja, ka DPTQ saistās ar primātu D1R ar augstu afinitāti un selektivitāti un palielina spontānu acu mirkšķināšanas ātrumu rēzus pērtiķiem atkarībā no devas, kas atbilst plazmas ligandu iedarbībai un centrālajai D1 aktivācijai.

Rezultāti

Pamatojoties uz šiem rezultātiem, DPTQ tika pārbaudīts ar 2,5 mg/kg IM darba atmiņas uzdevumā. Akūts efekts netika novērots 1 stundu pēc devas ievadīšanas, bet veiktspēja tika pasliktināta 48 stundas vēlāk. Jāatzīmē, ka šim defektam uzreiz sekoja ievērojams izziņas uzlabojums nākamo 3 dienu laikā.

Otrajā eksperimentā, kurā DPTQ tika ievadīts 1. un 5. dienā, agrīnie traucējumi bija mazāki un nesasniedza statistisku nozīmīgumu, bet nākamajā nedēļā tika novērota statistiski nozīmīga veiktspējas uzlabošanās. Mazākas devas 0,1 un 1.0 mg/kg arī spēja radīt šo ilgstošo uzlabošanos, neizraisot nekādus pārejošus traucējumus.

Secinājumi

DPTQ ir piemērs D1PAM klasei, kas var nodrošināt ilgtermiņa darba atmiņas uzlabojumus.

Atslēgvārdi

Pozitīvs allosteriskais modulators · Dopamīns · D1 · Acu mirkšķināšana · Darba atmiņa · Telpiskā aizkavētā reakcija · Cikliskais AMP · Plastiskums.

Ievads
Dopamīns (DA) ir kritiski iesaistīts daudzos smadzeņu darbības aspektos, tostarp motoriskajā aktivitātē, nomodā un izziņā. Jo īpaši D1 receptoram ir izšķiroša nozīme, lai primātā uzturētu augstas pakāpes kognitīvās funkcijas, tostarp uzmanību, izpildfunkcijas un darba atmiņu, un šis receptors ir daudz primātu prefrontālajā garozā, kur tā signalizācija ir neatņemama galvenā kognitīvā darba procesa sastāvdaļa. atmiņa (Sawaguchi un GoldmanRakic ​​1991; Goldman-Rakic ​​et al. 2004).

Darba atmiņa ir galvenais iznākuma rādītājs pacientiem ar šizofrēniju, un tās funkcija kļūst vājāka novecošanās un neirodeģeneratīvo traucējumu gadījumā (Bodnar et al. 2008; Rhode and Katz 2017; Zokaei un Husain 2019). Tās ir jomas, kurās ir lielas neapmierinātas medicīniskās vajadzības. Jo īpaši ir zināms, ka dopamīna transmisijas (tostarp D1 receptoru signālu) samazināšanās novecošanas laikā veicina ar vecumu saistītu izziņas pasliktināšanos (Roth and Joseph 1994; Volkow et al. 1998; Karrer et al. 2017).

Līdz ar to D1 receptoru funkcija ir plaši pētīta uzvedības, šūnu un molekulārā līmenī (Muly et al. 1998; Castner et al. 2000; Goldman-Rakic ​​et al. 2000; Dunah un Standaert 2001; Castner un Williams 2007; Liu et al. 2017).

D1 agonistu izstrāde izziņas uzlabošanai ir radījusi sarežģītu izaicinājumu apgrieztas U formas devas atbildes reakcijas dēļ (Williams un Goldman-Rakic ​​1995; Vijayraghavan et al. 2007). Turklāt ilgstoša D1 stimulācija ar augstas afinitātes/ilgstošas ​​darbības agonistiem var izraisīt tolerances attīstību (Asin un Wirtshafter 1993; Lewis et al. 1998; Gulwadi et al. 2001; Smith et al. 2002, Ryman-Rasmussen et al. 2007). ).

Tādējādi klīniskie pētījumi ar pilniem D1 agonistiem ir bijuši ierobežoti (Blanchet et al. 1996; Giardina and Williams 2001; Zang et al. 2009). Ir ieviestas jaunākas pieejas D1 aktivācijai, tostarp daļēji dopamīna D1 agonisti (Roberts et al. 2010; Balice-Gordon et al. 2020; Kozak et al. 2020; Riesenberg et al. 2020).

Alternatīva pieeja būtu izstrādāt pozitīvu alosterisko modulatoru (PAM) D1 receptoram, pamatojoties uz hipotēzi, ka PAM aktivitāte būtu atkarīga no endogēnā dopamīnerģiskā tonusa, pastiprinot dopamīnu, kad un kur tas tiek atbrīvots. Tas piedāvātu fizioloģiskāku pieeju, kas varētu nodrošināt labāku terapeitisko rezervi, iespējams, izvairoties no apgrieztas U formas devas-atbildes reakcijas un tolerances attīstības, kas novērota ar dažiem D1 agonistiem. Nesen tika ziņots par vairākiem selektīviem D1PAM no tetrahidroizohinolīna strukturālās klases, un tie tika raksturoti, un vairākos in vitro un in vivo pētījumos tika noteikta farmakoloģiska diferenciācija no D1 agonistiem (Svensson et al. 2017; Bruns et al. 2018; Hao et al. 2019; Meltzer et al. 2019 un Svensson et al. 2019).

Sakarā ar sugas atšķirībām D1 saistīšanā ar D1PAM, šie neiroķīmiskie un uzvedības pētījumi tika veikti ar transgēnu peli, kurā peles D1 receptors tika aizstāts ar tā ekvivalentu cilvēkam (hD1 pele). Kopumā dati apstiprināja šīs pieejas prokognitīvo potenciālu (Bruns et al. 2018 un Meltzer et al. 2019). Šim pētījumam mēs izvēlējāmies D1PAM DPTQ (Hao et al. 2019), kas ir tuvs strukturālais analogs iepriekš ziņotajam farmakoloģiskajam instrumentam DETQ un klīniskajam kandidātam LY3154207 (ar medaļu; Hao et al. 2019; Wilbraham et al. 2021, Biglan et al. 2022 un McCarthy et al. 2022).

DPTQ EC50 ir 76 nM, lai pastiprinātu dopamīna izraisītu cAMP pieaugumu stabili transfektētās cilvēka D1 klonētās šūnās, un tam ir piemērotas fizikāli ķīmiskās īpašības ar pieņemamu iekļūšanu smadzenēs pēc sistēmiskas dozēšanas (Hao et al. 2019).

Mūsu galvenie šī pētījuma mērķi bija noteikt centrālo farmakodinamisko aktivitāti un izpētīt iespējamo D1PAM izziņas efektivitāti augstākai sugai, rēzus pērtiķiem. Iepriekš tika pierādīts, ka tetrahidroizohinolīna D1PAM sērijas pārstāvjiem ir augsta afinitāte pret šo sugu, līdzīgi kā cilvēkiem (Svensson et al. 2017, Wang et al. 2018 Hao et al. 2019).

Sākotnējai farmakodinamiskai pārbaudei mēs izvēlējāmies spontāna acu mirkšķināšanas ātruma modeli rēzus pērtiķiem, lai noteiktu devas, kas nepieciešamas, lai sasniegtu centrālo D1 reakciju uz DPTQ augstākām sugām. Ir zināms, ka šajā modelī D1 agonisti palielina acu mirkšķināšanas biežumu (Elsworth et al. 1991; Jutkiewicz and Bergman 2004). Turklāt Parkinsona slimības pacientiem ir samazināts spontāna acu mirkšķināšanas biežums (Deuschl un Goddemeier 1998; Karson et al 1982).

Lai gan ir daudzas interaktīvas neirotransmiteru sistēmas, kas iesaistītas spontānā acu mirkšķināšanas ātrumā, šo modeli var izmantot kā centrālo dopamīna D1 receptoru aktivācijas marķieri (Jutkiewicz un Bergman 2004), un tas var arī atspoguļot ietekmi uz izziņu (Taylor et al. 1999; Jongkees un Colzato 2016). Iepriekšējais pētījums ar DETQ uzrādīja pastiprinātu spontānu acu mirkšķināšanas ātrumu, lai gan ar mazāku reakciju nekā tika novērota ar D1 agonistu SKF82958 (Bruns et al., 2018).

Kognitīvajai pārbaudei ar rēzus pērtiķiem mēs izvēlējāmies telpiskās aizkavētās reakcijas uzdevumu (Roberts et al., 2010), kas ir labi izveidots telpiskās darba atmiņas translācijas rādītājs, kas, kā pierādīts, iesaista vienu un to pašu neironu shēmu cilvēku un primātiem, kas nav cilvēkveidīgie primāti (Jonides). et al., 1993; GoldmanRakic, 1996; McCarthy et al., 1996; Postle et al., 2000).

Metodes

In vitro testēšana cAMP testā

Cilvēka, rēzus pērtiķa, suņa vai peles D1 receptors tika klonēts Jump-In vektoru sistēmā (Life Technologies Corp, CA) un īslaicīgi transfekēts HEK293 šūnās. CAMP palielināšanās ar DPTQ (brīvā bāze, Eli Lilly) tika mērīta dopamīna EC20 koncentrācijas klātbūtnē. EC50 vērtības katrai sugai kopā ar % max stimulāciju (kur dopamīna maksimālā stimulācija ir vienāda ar 100%) ir parādītas 1. tabulā. Šie in vitro pētījumi tika veikti Eli Lilly and Company, Indianapolisā, ASV. Sīkāku informāciju par ietekmes mērīšanu uz cAMP uzkrāšanos šajās īslaicīgi transfektētajās šūnās skatiet Hao et al. (2019).

Spontāns acu mirkšķināšanas biežums rēzus pērtiķiem

Dzīvnieki

Pētījumā tika iekļauti vienpadsmit 5–6- gadus veci rēzus pērtiķu tēviņi (Chengdu Ping, An Animal Breeding and Research Base, Sichuan Province, China) ar vidējo svaru 4,83 kg. Dzīvnieki tika nejauši sadalīti trīs grupās, DPTQ lielākas kumulatīvās devas grupā (n=4); DPTQ zemākas kumulatīvās devas grupa (n=3); un nesējs (20% Captisol (CyDex Pharmaceuticals, Inc., KS) NaPO4 buferšķīdumā) grupa (n=4).

D1 agonists SKF82958 tika iekļauts kā pozitīvā kontrole; šī savienojuma rezultāti (šeit nav parādīti) nesen tika publicēti kopā ar datiem par citu D1PAM (DETQ, sk. Bruns et al. 2018). D1 selektīvais antagonists SCH39166 hidrobromīds (Kat. Nr.: 2299, Partijas Nr.: 3A/129719) tika iegādāts no Tocris, MN, un tika pagatavots Millipore tīrā ūdenī ar injekcijas tilpumu 0,2 ml/kg. D1 antagonists tika ievadīts 15 minūtes pirms nesēja vai DPTQ (n=4 dzīvnieki grupā).

Pērtiķi tika izmitināti atsevišķi klimata (22–24 grādi) un mitruma kontrolētā (40–70%) vivārijā. Bija spēkā 12 h gaismas/12 h tumsas cikls (gaisma ieslēgta no plkst. 7:00 līdz 19:00). Pērtiķiem bija neierobežota piekļuve ūdenim, un viņi katru dienu saņēma pērtiķu čau ar augstu olbaltumvielu saturu, ko katru dienu papildināja ar augļiem. Pirms savienojuma ievadīšanas un testa stundu laikā pērtiķi netika baroti ar augļiem vai pārtiku.

Spontānā acu mirgošanas ātruma pētījums tika veikts ChemPartner, Šanhajā, Ķīnā. Pērtiķu novietne Šanhajas ChemPartner lielo dzīvnieku objektā ir pilnībā akreditēta AAALAC. Dzīvnieki tika sociāli izmitināti pa pāriem 2 savstarpēji savienotos būros, kas ļāva vizuāli un verbāli sazināties ar kaimiņu pērtiķiem, kā arī aplūkot sevi no piekārtā spoguļa katrā būrī. Katra pērtiķa būra izmērs bija 0,9 (G) × 0,9 (W) × 2 (H) m, un iekšpusē bija ķirbis, barības meklēšanas bumbiņa vai košļājamā lodziņa.

Papildināšanas programmā bija iekļauti televīzijas šovi 2–3 reizes nedēļā un fona mūzika vairākas stundas katru otro dienu. Dzīvnieku veselības stāvokli periodiski pārbaudīja ārstējošais veterinārārsts un katru dienu dzīvnieku aprūpes personāls pārbaudīja to (1) izskatu, apmatojumu un asti; (2) izkārnījumi un urinēšana; un (3) rupja uzvedība, pārtikas patēriņš un slimības pazīmes. Visus apmācību un testēšanas protokolus apstiprināja Institucionālās dzīvnieku labturības IACUC vadlīnijas un politikas komiteja ChemPartner (Šanhaja, Ķīna).

Aparatūra un eksperimentālais protokols

Spontāna acu mirkšķināšanas biežums tika mērīts novērošanas eksperimentos, kas tika veikti īpaši konstruētā pērtiķu krēslā (Mason et al. 2019). Lai atvieglotu acu mirkšķināšanas ātruma reakcijas novērošanu, tika izmantota U veida kakla plāksne, kas palīdzēja fiksēt galvas orientāciju. Sēdošā pērtiķa priekšā tika novietota kompakta videokamera (Panasonic/wv-cp480/CH) uz statīva. Divus kameru attēlus apvienoja video savācējs (Color QUAD sistēma) un pārsūtīja uz EthoVision programmatūru (Noldus, Leesburg, VA) datorā skatīšanai un ierakstīšanai tiešsaistē.

Divas nedēļas pirms testēšanas pērtiķi katru dienu tika apmācīti sēdēt pērtiķu krēslā divas 2-stundas, saņemot atlīdzību par pārtiku. Pēcapmācības testa sesijās, kas tika veiktas katru dienu no pulksten 9:00 līdz 16:30, katrs pērtiķis tika pētīts deviņus secīgus 15-minūšu komponentus. Katrs 15-minūtes bloks sastāvēja no 10-minūtes pieradināšanas perioda, kam sekoja 5-minūtes periods, kura laikā tika skaitīta acu mirkšķināšana.

The video was displayed on a computer screen to allow continual observation of the subject. Observers blind to the treatment conditions later scored each 5-minute videotaped session. An eye blink was defined as a visible, rapid opening and closing of the eyelid. Two observers independently confirmed the measurement with reliability>90%.

Farmakoloģiskā pārbaude

Dažādu D1 ligandu ietekme uz spontānu acu mirkšķināšanas ātrumu tika pētīta, izmantojot kumulatīvās dozēšanas procedūru (Jutikiewicz un Bergman 2004). Aktīvais savienojums vai nesējs (Captisol 20% w/v NaPO4 buferšķīdums) tika ievadīts pēc divu sākotnējo acu mirkšķināšanas ierakstu iegūšanas. Ligands tika dots nejaušā secībā dažādiem katras grupas pērtiķiem, kā aprakstīts iepriekš. Lai pētītu devas-atbildi un laika gaitu, katras testa sesijas 15-minūšu beigās tika ievadītas pieaugošas DPTQ devas.

Ķimikālijas

DPTQ (brīvā bāze, sk. Hao et al. 2019) piegādāja Eli Lilly Company. Kaptizols (partijas Nr.: NC04A-05034) tika sagatavots šādi: Captisol 20% w/v NaPO4 buferšķīdums 25 mM, pH 8. DPTQ injekcijas tilpums bija 0,5 ml/kg IM. DPTQ 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg un 1 mg/kg tika dozēts kā dzidrs šķīdums, savukārt 5 mg/kg un 10 mg/kg devas tika formulētas kā smalkas suspensijas.

Iepriekš minētais transportlīdzekļa šķīdums tika uzglabāts 4 grādu temperatūrā ledusskapī un pirms lietošanas tika atjaunots līdz istabas temperatūrai. Sagatavojot DPTQ svaigu katru dienu, savienojumam pievienoja daļu nesēja (20% kaptizola) un maisīja līdz mitrai, kam sekoja atlikušā nesēja pievienošana un maisīšana, līdz šķīdums kļuva viendabīgs. Pēc tam suspensiju 40 minūtes apstrādāja ar ultraskaņu ledus vannā, lai samazinātu daļiņu izmēru. Dzīvnieki tika dozēti, atrodoties krēslā.

Datu analīze acu mirkšķināšanas ātrumam

Rezultāti katram pērtiķim tika izteikti kā acu mirkšķināšanas biežums (mirkšķināšanas minūtē), kas aprēķināts vidēji katrā 5-minūtes testēšanas periodā. Transportlīdzekļa un D1 PAM ietekme uz acu mirkšķināšanu tika aprēķināta katrai pērtiķu grupai un izteikta kā vidējais ± SE. DPTQ un nesēja ietekme tika analizēta ar divvirzienu ANOVA (D1 PAM un laiks), kam sekoja Bonferroni post hoc tests (GraphPad Prism, Sandjego, CA).

Telpiskās darba atmiņas uzdevums

Dzīvnieki

Pētījumā (sīkāka informācija sniegta zemāk), kas tika veikts Jēlas universitātē, Ņūheivenas CT, ASV, piedalījās sešpadsmit rēzus un viena stumbra makaka. Dzīvnieki tika izmantoti un aprūpēti pilnībā saskaņā ar Jēlas Universitātes IACUC vadlīnijām un politikām papildus visām ASV federālajām politikām un noteikumiem. Pērtiķi katru dienu tika baroti ar savu parasto uzturu, ieskaitot pienācīgi barojošus cepumus un vairākus augļus un dārzeņus bagātināšanai. Pārbaudes un jebkura apmācība notika tieši pirms viņu galvenā ēdiena gatavošanas.
Šī barība sastāvēja no cepumiem, kas tika piegādāti katru dienu, un visiem dzīvniekiem bija pilna 24-stundu piekļuve ūdenim ad libitum. Dalību kognitīvajā testēšanā nodrošināja vides stimulācijas bagātināšana un dzīvnieku iecienītāko ēdienu kā atlīdzības nodrošināšana uzdevumā, tostarp jogurts, rozīnes, mandeles, vīnogas, augļu cilpas un vairākas citas pārtikas preces (Roberts et al. 2010).

Kognitīvā pārbaude

Telpiskā aizkavētā reakcija ir vispāratzīts telpiskās darba atmiņas translācijas rādītājs, kas ir pierādīts, ka cilvēka un primātiem, kas nav cilvēkveidīgie primāti, iesaista vienu un to pašu neironu shēmu (McCarthy et al. 1996). Šajā reakcijā iesaistītā shēma ir gandrīz tikai "muguras plūsma", kas ietver dorsolaterālo prefrontālo garozu, īpaši 46. apgabalu, un sānu intraparietālo vagu (GoldmanRakic ​​1996). Lai iegūtu pilnu šeit izmantotā uzdevuma aprakstu, skatiet Roberts et al. (2010). Dzīvnieki tika pārbaudīti skaņu vājinātā telpā, kurā bija testēšanas kamera. Šajā uzdevumā viena no vairākām aku vietām tiek iebarota ar dzīvniekam doto barību, un pēc tam akas tiek pārklātas ar identiskām plāksnēm.

Pēc tam necaurspīdīgs aizvars tiek nolaists uz vienu no 5 mainīgiem aizkaves gadījumiem un pēc tam tiek pacelts, lai dzīvnieks varētu reaģēt uz vienu no akas vietām, lai iegūtu barību. Katrs aizkaves ilgums tika atkārtots 4 reizes daļēji nejaušā sadalījumā pa 20 izmēģinājumiem katrā testēšanas sesijā. Katrs dzīvnieks tika stabilizēts pirms jebkādas ievadīšanas, pakāpeniski palielinot iedobumu skaitu (sākot tikai ar 2) un aizkaves ilgumu. 5 mainīgie aizkaves garumi tika iestatīti uz 0, 1, 2, 3 un 4 s, kas reizināti ar koeficientu "N". Tādējādi N tika palielināts par 1 līdz maksimāli 10, līdz subjekts 3 secīgās testa sesijās sasniedza 80% vai vairāk, pēc tam iedobumu skaits tika palielināts par 1.

Šis process tika atkārtots katram indivīdam, līdz viņi sasniedza stabilu veiktspēju (pareizi 65–75% ± mazāka vai vienāda ar 2,5%). Šis normalizētais veiktspējas līmenis ļauj jutīgi noteikt jebkādus eksperimenta apstākļu radītus traucējumus vai uzlabojumus. Šī pētījuma sākuma datiem mēs ņēmām 7 vai vairāk secīgus datu punktus, kas tika savākti iepriekšējās nedēļās un kas ietilpa testa stabilajās robežās. Kopējai 17 dzīvnieku grupai, kas piedalījās šajā pētījumā, vidējais iedobes skaits bija 4 (diapazons 2–7) un vidējā N vērtība bija 3 (diapazons 1–7). Dzīvnieki parasti tika pārbaudīti 2 līdz 3 dienas nedēļā.

Savienojumu ievadīšana

DPTQ (brīvā bāze, Eli Lilly & Co.) tika sagatavots, kā aprakstīts iepriekš spontānas acu mirkšķināšanas testam. Dzīvniekiem (4 tēviņi un 6 mātītes, vidējais vecums =22,1±1,7 gadi) sākotnēji tika piešķirts vai nu nesējs, vai DPTQ 2,5 mg/kg IM daļēji nejaušā veidā. Viens dzīvnieks saņēma nesēju, bet viņam netika dota DPTQ. Šī pati dzīvnieku grupa vēlāk tika izmantota atkārtotas dozēšanas pētījumā ar DPTQ 2,5 mg/kg salīdzinājumā ar nesēju. Pēc vairāku mēnešu ilga izskalošanās perioda mēs pārbaudījām zemākās devas 0,1 mg/kg un 1.{14}} mg/kg augošā secībā.

Šajā 10 dzīvnieku grupā bija 3 no iepriekšējā pētījuma (3 tēviņi un 7 mātītes (tostarp viena veca celmu makaka); vidējais vecums =22,6±1,7 gadi). Jaunākais dzīvnieks šajā pētījumā bija 17,3 gadus vecs. Neviens no dzīvniekiem nebija naivs, un visi tika izmantoti iepriekšējos pētījumos ar citiem savienojumiem. Viņiem tika dota plaša izskalošanās nedēļas vai mēnešus pirms šī pētījuma, un tika noteikts, ka viņiem ir normāla sākotnējā veiktspēja.

Pētījuma laikā dzīvnieki tika izskaloti, pamatojoties uz zināmajām šīs zāles PK īpašībām (pussabrukšanas periodu), kā arī katra dzīvnieka sākotnējo veiktspēju. Tas nozīmē, ka veiktspējai bija jāatgriežas sākotnējā līmenī, pirms sākat jebkuru citu stāvokli, un parasti tika izmantots vismaz divu nedēļu ilgs izskalošanās periods. Kognitīvā pārbaude tika veikta 1 stundu pēc injekcijas, lai atbilstu maksimālā efekta laikam, kas novērots sākotnējā acu mirkšķināšanas pētījumā.

Kognitīvo datu analīze

Transportlīdzekļa un katras DPTQ devas ievadīšanas ietekme tika analizēta, izmantojot 1-dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja post hoc salīdzinājumi, pamatojoties uz viltus atklāšanas biežumu (FDR), izmantojot divpakāpju soli. līdz metodei Benjamini et al. (2006; GraphPad Prism 9.1). Šī metodoloģija tika izvēlēta, ņemot vērā lielo grupu skaitu (dienas) un ierobežoto testu skaitu (dzīvnieki).

Lai noteiktu statistisko nozīmīgumu, tika izmantots līmenis 0,05. Pēc sākotnējās pārbaudes, lai pārliecinātos, ka nesējvielai nav būtiskas ietekmes (sk. "Rezultāti" zemāk), tika veikti salīdzinājumi ar bāzes līniju (vidēji vairāku sesiju laikā) kā kontroli.

Plazmas ligandu iedarbības analīzes

Plazmas paraugi tika savākti EDTA mēģenēs {{0}}, 0.25, 0.50, 1, 2, 4, 8, 12 un 24 stundas pēc bolus ievadīšanas IM injekcija un uzglabāta –70 C temperatūrā līdz turpmākai analīzei ar LC/MS (sīkāku informāciju skatiet Hao et al. 2019). Mazākajai devai 0, 1 mg/kg, IM, plazmas paraugi tika savākti no trim dzīvniekiem, kas piedalījās telpiskās darba atmiņas uzdevumā Jēlas Universitātē, aptuveni 1, 5 h pēc dozēšanas (~ 30 minūtes pēc uzvedības testa sesijas pabeigšanas).

Dzīvnieki tika pieradināti brīvi sēdēt pielāgotā krēslā un turēt vienu kāju apmatojuma apgriešanai (ja nepieciešams), noslaucīt ar 70% spirtu un vēnu punkciju, izmantojot BD Vacutainer caurulīti drošības turētājā. 5 mg/kg IM devai plazmas paraugi tika savākti atsevišķā pētījumā ar trim pieaugušiem makaka pērtiķu tēviņiem Eli Lilly and Company, Indianapolisā, IN. Paraugu vākšana un uzglabāšana notika saskaņā ar iepriekš aprakstīto procedūru, un D1 ligandu līmeņu analīze tika veikta Eli Lilly and Company, Indianapolisā, IN, ASV, izmantojot šķidruma hromatogrāfiju un tandēma masas spektrometriju.

Rezultāti

DPTQ ietekme uz cAMP uzkrāšanos četrās sugās

DPTQ tika pārbaudīts HEK293 šūnās, kas īslaicīgi ekspresē cilvēka, suņa, rēzus pērtiķa un peles dopamīna D1 receptorus. Potenciatora EC50 un Emax vērtības suņu un rēzus pērtiķu D1 receptoriem bija līdzīgas cilvēka D1 receptoru vērtībām (1. tabula). Tomēr peles D1 receptora potenciators EC50 tika nobīdīts pa labi aptuveni 14- līdz 23- reizes, salīdzinot ar attiecīgi rēzus pērtiķiem un cilvēkiem. Turklāt peles D1 receptoru Emax bija tikai 41%, salīdzinot ar 77–88% pārējām trim sugām.

Spontāns acu mirkšķināšanas biežums

Vidējais acu mirkšķināšanas biežums pirms dozēšanas nepārsniedza 10 mirkšķināšanu minūtē, un acu mirkšķināšanas biežums bija relatīvi stabils testa sesijās atsevišķiem subjektiem pēc transportlīdzekļa injekcijas. DPTQ tika pārbaudīts divās kumulatīvās devu shēmās (1. attēls). Lielāka kumulatīvā DPTQ deva (0,5 mg/kg, 5 mg/kg un 10 mg/kg, IM) izraisīja vislielāko acu mirkšķināšanas biežumu. Laika gaitas efekts pēc šīm lielākajām devām parādīja, ka pēc DPTQ acu mirkšķināšanas biežuma ievērojams pieaugums notika 30 minūtēs (p<0.01), 45 min (p<0.001), 60 min (p<0.01), and 75 min (p<0.05) (Fig. 1). The lower cumulative dose of DPTQ (0.1 mg/ kg, 1 mg/kg and 5 mg/kg, resulted in small but significant (p < 0.05) increases in rates of eye blinking only at the 45-min and 60-min time points (Fig. 1). During recording and observation, some vehicle group monkeys fell asleep or became drowsy in the monkey chair as time went by. In contrast, all of the DPTQ-treated monkeys remained alert throughout the test period of close to 2.5 hours.

Gan lielas, gan mazākas kumulatīvās DPTQ devas izraisīja zināmu mutes kustību, piemēram, mēles izvirzījumu (dati nav parādīti). Tomēr tikai lielāka kumulatīvā deva uzrādīja skaidru efektu 30 minūtes pēc DPTQ ievadīšanas, salīdzinot ar nesēja grupu. Tas atbilst mēles kustības aktivizēšanai pēc D1 receptoru stimulācijas, par ko ziņots pērtiķiem (Bédard and Boucher 1989).

Tikai D1 selektīvā antagonista SCH39166 (0,03 mg/kg, IM) ievadīšana izraisīja īsu acu mirkšķināšanas ātruma samazināšanos, un vizuālie novērojumi liecināja, ka dzīvnieki bija nedaudz nomierināti. Šis efekts ilga apmēram 15 minūtes (2. att.). Dzīvniekiem, kas iepriekš apstrādāti ar SCH39166, bija tikai neliels, nenozīmīgs (p<0.05) increase in eye blink rate induced by higher accumulated doses (0.5, 5, 10 mg/kg) of DPTQ (Fig. 2; compare to Fig. 1).

DPTQ līmeņa plazmas analīze pērtiķiem

Pirmajā pētījumā plazmas paraugi tika savākti dažādos laika punktos no trim dzīvniekiem līdz 24 stundām pēc 5 mg/kg devas IM (7. attēls). Augsts kopējais DPTQ līmenis plazmā tika mērīts pirmajās 2 stundās robežās no aptuveni 9000 līdz 1800 nM ar aprēķināto nesaistīto plazmas koncentrāciju no 674 līdz 125 nM. Pamatojoties uz datiem, ka DPTQ nesaistītās smadzeņu un nesaistītās plazmas koncentrācijas attiecība ir aptuveni 0,3 un nesaistīto ligandu frakcija ir 0,068 (J. Cramer, nepublicēti dati), prognozētā nesaistītā smadzeņu koncentrācija DPTQ pēc 5 mg/kg injekcijas tādējādi būtu robežās no 202 līdz 38 nM pirmajās 2 stundās pēc dozēšanas. Šīs koncentrācijas ir robežās no hD1 EC50 vērtības DPTQ cAMP testā, par kuru ziņots, ka tā ir 76 nM (Hao et al. 2019) un ir vai lielāka par pērtiķa D1 EC50 38 nM, kas šeit ziņots, izmantojot īslaicīgi ekspresētas šūnas (1. .

Otrajā pētījumā paraugi tika savākti pēc mazās devas {{0}},1 mg/kg, IM no trim dzīvniekiem ~1,5 h pēc dozēšanas izziņas pētījumā. Kā parādīts 3. attēlā, zemā deva 0,1 mg/kg IM izraisīja aptuveni 50 x zemāku DPTQ līmeni plazmā. Kopējā D1 PAM koncentrācija plazmā bija robežās no 56 līdz 91 nM (7. att.). Izmantojot tos pašus pieņēmumus kā iepriekš attiecībā uz nesaistīto ligandu frakciju un nesaistīto smadzeņu un nesaistīto plazmas attiecību, aprēķinātā nesaistītā ligandu koncentrācija smadzenēs būtu 1–2 nM 1,5 h pēc 0,1 mg/kg IM devas. Šie līmeņi ir daudz zemāki par pērtiķu un cilvēka EC50 vērtībām, kas pastiprina dopamīna izraisītu cAMP aktivāciju vitro testā.

For more information:1950477648nn@gmail.com