Cistanche Tubulosa ekstraktu ietekme uz vīriešu reproduktīvo funkciju streptozotocīna-nikotīnamīda izraisītām žurkām ar diabētu

Atslēgvārdi:cukura diabēts; neauglība;Cistanche tubulosaekstrakts(CTE);ehinakozīds(ECH);pretiekaisumaaktivitāte;antioksidantsaktivitāte;steroidoģenēzeefekti

Lai iegūtu papildinformāciju par cistanche ekstrakta pulvera priekšrocībām

1. Ievads

Cukura diabēts (DM) ir stāvoklis, kad asinīs ir paaugstināts glikozes līmenisaizkuņģa dziedzera neefektivitāte, ražojot pietiekami daudz insulīna, vai ķermeņa nespēja to izmantotefektīvi. Saskaņā ar PVO datiem, cilvēku ar cukura diabētu skaits pieauga no 108 miljoniem 1980. gadālīdz 422 miljoniem 2014. gadā [1]. Ir četras galvenās kategorijas: pirmsdiabēts (stadijā pirms diabēta), 1. tips(kur aizkuņģa dziedzeris nespēj ražot insulīnu), 2. tips (organisms nespēj izmantot insulīnu) un gestācijas periods.cukura diabēts (kas rodas grūtniecības laikā). Oksidatīvais stress rodas nelīdzsvarotības dēļ starpreaktīvo skābekļa sugu (ROS) un antioksidantu ražošana [2] beidzot noved pie diabēta stāvokļa.Cukura diabēta komplikācijas ir nieru mazspēja, nervu bojājumi, aklums, insults, sirdsuzbrukums, augļa nāve un neauglība. [1]. Pētījumi liecina, ka spermas kodoli, dezoksiribonukleīnskābe (DNS),un mitohondriji tika būtiski bojāti vīriešiem ar cukura diabētu [3]. Oksidatīvais stress laikāspermas transportēšana mainīs vīriešu reproduktīvās sistēmas procesu [4,5]. 

Spermatoģenēzes procesu kontrolē hipotalāms-hipofīze-gonāds (HPG)ass. Gonadotropīnu atbrīvojošais hormons (GnRH), ko ražo hipotalāms, stimulēluteinizējošā hormona (LH) un folikulus stimulējošā hormona (FSH) ražošana. Tiek atrastas Leidiga šūnasblakus sēklu kanāliņiem un ražo testosteronu LH kontrolē. FSH izraisītājiantigēnu saistoša proteīna (ABP) ražošana, kas palīdz izvadīt vīrišķo hormonu. Tādējādi neauglībaun citas problēmas galvenokārt rodas traucējumu dēļ, kas rodas HPG asī. Administrēšanastreptozotocīna un nikotīnamīda kombinācija eksperimentālām žurkām izraisa diabētu. Streptozotocīnsir ķīmisks savienojums, kas ir toksisks insulīna ražošanai aizkuņģa dziedzera šūnas un nikotīnamīds ir aūdenī šķīstošs vitamīns, kas aizsargā šūnas no pilnīga bojājuma [6]. Cistanche tubulosair tuksneša augu suga, kas pazīstama arī kā "Rou Cong-Rong" [7]. Tas irnehlorofilisks parazitārs augs, kas aug galvenokārt uz saknesCalotropis procerakoks un irplaši izplatīts Gansu, Qinghai, Sjiņdzjanas, Mongolijas, Irānas un Indijas sausajā zemē. KopējaisvārdsCistanche tubulosair "Tuksneša hiacinte". Tas ir plaši pieņemts ķīniešu tradicionālajā medicīnāun tam dots nosaukums "Tuksneša žeņšeņs". To plaši izmanto medicīnas jomā, lailai ārstētu slimīgu leikoreju, bagātīgu metrorāģiju, hroniskas nieru slimības, aizcietējumus, impotenci unneauglība. Ķīmiskās sastāvdaļasCistanche tubulosasastāv no negaistošiem feniletanoīdu glikozīdiem(PHG), iridoīdi, lignāni, gaistošās eļļas, alditoli, oligosaharīdi un polisaharīdi [8]. Studijasparāda, ka ehinakozīds no šī auga aizsargā bojātos fibroblastus, regulējot ROS līmeni [9]. Šis savienojums kopā arneiroaizsardzība un osteoporozes profilakse [10,11]. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt ietekmiCistanche tubulosaekstraktssatur ECH uzstreptozotocīna-nikotinamīda izraisītas diabēta žurkas reproduktīvā disfunkcija.

2. Materiāli un metodes

2.1. Materiāli

ECH un CTE iegādājās no Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Yilan, Taivāna). Papilduglikācijas galaprodukti (AGE) tika iegādāti no Biovision (Sanfrancisko, CA, ASV). LC-540un TM3 šūnu līnijas tika iegādātas no Pārtikas rūpniecības pētniecības un attīstības institūta(Hsinču, Taivāna). Piecas nedēļas vecas Sprague-Dawley (SD) žurku tēviņi tika iegādāti noNacionālais laboratorijas dzīvnieku centrs (Taipeja, Taivāna). Barības laboratorijas diēta® tika iegādāts no PMINutrition International, Inc. (Taipeja, Taivāna). 2,2-difenil-1-pikrilhidrazils (DPPH) tika iegūtsno Sigma (St. Louis, MO, ASV). Metanols un 4-(2-hidroksietil)-1-piperazīnsulfonskābeskābe (HEPES) arī tika iegādāta no Sigma. Dulbecco modificētais Eagle medium/F12 untripsīns-EDTA tika iegūts no GIBCO (Ņujorka, NY, ASV). 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds (MTT), dihlordihidroflfluoresceīna diacetāts (DCFH-DA), dimetilssulfoksīds (DMSO) un nitroblue tetrazolijs (NBT) tika iegādāti no Sigma. Glikoze fermentatīvā veidākomplekti tika iegūti no Kyokutoseiyaku, Tokija, Japāna. Tika iegādāti insulīna ELISA komplektino Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Upsala, Zviedrija). T-PER audu proteīna ekstrakcijaReaģents tika iegūts no Thermo Scientifific (Čikāga, IL, ASV). Kodols pret cilvēku/pelēm/žurkāmfaktors-kappa B NF-κB poliklonālās antivielas tika iegādātas no Santa Cruz Biotechnology, SantaKrūza, Kalifornija, ASV. Anti-Mouse/Rat receptors uzlabotiem glikācijas galaproduktiem (RAGE) poliklonāliemantivielas, anti-cilvēka/peles/žurkas STAR poliklonālās antivielas un anti-cilvēka/peles/žurkasCitohroma P450 17A1 monoklonālās antivielas tika iegādātas no uzņēmuma Gene Tex (Irvine, CA, ASV).Anti-Cilvēka/Peles/Žurkas CYP11A1 poliklonālās antivielas tika iegūtas no Cell SignalingTehnoloģija (Beverlija, PA, ASV). Easy-Blue reaģents tika iegādāts no Invitrogen, Thermo FisherZinātniskā (Carlsbad, CA, ASV). Agaroze un DNS marķieris 100 bp tika iegūti no Promega,korporācija (Medisona, WI, ASV). RNeasy Lipid Tissue Mini komplekts tika iegādāts no QIAGEN,Hildena, Vācija.

5 procenti CO2 inkubators (CO2 inkubators, Napco 5410, Taivāna). TM3 šūnu līnija tika kultivēta Dulbecco'smodificēta Eagle barotne (DMEM), kas papildināta ar glikozi (4,5 g/l), nātrija piruvātu (0,5 mM),L-glutamīns (2,5 mM), nātrija bikarbonāts (1,2 g/l), 4-(2-hidroksietil)-1-piperazīnsulfonskābeskābe (HEPES, 15 mM) un teļa augļa serums (FCS, 10 procenti) vai zirga serums (5 procenti) pie 37◦C 5 procentosCO2 inkubators.

Ehinakozīda (ECH) šūnu dzīvotspējas noteikšana: 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-Šūnu dzīvotspējas testā tika izmantots difeniltetrazolija bromīda (MTT) reaģents. Šūnu koncentrācijatika pielāgots uz 2× 105šūnas / ml 96-iedobes plāksnē. Tad, 20µL ECH (atšķaidīts ar 2 procentiem barotnes)tika pievienots un inkubēts 24 stundas 37 °C temperatūrā◦C 5% CO2 inkubators. Vēlāk 100µL MTT reaģenta bijapievieno un inkubēja 4 stundas 37 temperatūrā◦C tumšos apstākļos. Absorbcija tika mērīta pie 570 nm(ELISA lasītājs, Dynatech MR5000, Kloten, Šveice).Relatīvā šūnu dzīvotspēja (procentos)=[(Aparaugs pie 570 nm− Atukšs pie 570 nm)]/[(Akontrole pie 570− Atukšs pie 570)] × 100.

Reaktīvo skābekļa sugu (ROS) satura analīze:

Šūnas numurs tika pielāgots2 × 105šūnas/ml12-iedobes plāksnē, kas satur 2 procentus FBS. Tad, 50µL/mL ECH, RES un AGEtika pievienoti plāksnei un inkubēti 37 °C temperatūrā◦C 24 stundas. Pēc 24 stundām, 20 ,70 -dihlorfluoresceīna-diacetāts(DCFH-DA) tika pievienots un inkubēts 37 °C temperatūrā◦C 30 min. Pēc centrifugēšanas (400× g, 5 min),

un AGE tika pievienoti un inkubēti 37 ° C temperatūrā◦C 5% CO2 inkubators 24h. Pēc 400µL no T-PERtika pievienoti, nokasīti no šūnām un centrifugēti pie 125,000× g 20 minūtes (4◦C). Supernatantstika savākts un uzglabāts plkst−80 ◦C (−80 ◦C saldētava, Nuaire, Plymouth, MN, ASV) turpmākai analīzei.

Bicinhonīnskābes (BCA) komplekts tika izmantots olbaltumvielu kvantitatīvai noteikšanai. Tad, 10µL standarta šūnu šķīdumaun 200µL BCA reaģenta tika pievienots 8-iedobju plāksnēm un inkubēts 37 °C temperatūrā◦C 5% CO2 inkubatorsuz 30 min. Absorbcija tika mērīta pie 562 nm. Tika veikta olbaltumvielu identifikācijas analīzear nātrija dodecilsulfāta (SDS)-poliakrilamīda gēla (SDS-PAGE) elektroforēzi. Paraugi bijaSagatavots, pievienojot proteīna lizātu proteīna iekraušanas buferim, un tika veikta Western blot analīzelai noteiktu specifiskus proteīnus.

2.2.2. In vivo analīze

Dzīvnieku modeļa dizains: noNacionālais laboratorijas dzīvnieku centrs (Taipeja, Taivāna). Katra žurka tika atsevišķi izmitināta dezinfekcijas līdzeklīnerūsējošā tērauda būri kontrolētā temperatūrā (23± 1 ◦C) un mitrums (40–60 procenti) ar 12 hgaismas/12 h tumsas cikls. Pārtika un ūdens tika nodrošināti ad libitum. Katra žurka tika pieradināta pirmajānedēļā un kā galveno diētu noteica laboratorijas grauzēju diētu 5001. Visas procedūras atbilst standartamgada Institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas (IACUC apstiprinājuma Nr. 101026)Taivānas okeāna universitāte, Taivāna. Pēc pieradināšanas žurkas tika sadalītas divās grupās: kontrolegrupa (Con), kas tika barota ar laboratorijas diētu 5001, un diabēta grupa, kas tika barota ar diētu ar augstu tauku saturu(HFD, 40 procenti) visam eksperimentam. Pēc 4 nedēļu ilgas barošanas ar HFD, diabēta grupažurkām tika injicēts streptozotocīns (65 mg/kg) (STZ), lai izraisītu cukura diabētu (DM). Iekšā15 minūtes pēc STZ injicēšanas tika injicēts nikotīnamīds (230 mg/kg ķermeņa svara). Nedēļu pēc injekcijas,tika veikts perorālais glikozes tolerances tests (OGTT), lai noteiktu veiksmīgu diabēta ierosināšanu.Mellīts (DM). Pēc tam dzīvnieki tika sadalīti sešās grupās: kontrole (barota ar laboratorijas diētu5001); DM grupa (DM plus 45 procenti HFD); DMR grupa (DM plus rosiglitazons: 0,571 mg/kg ķermeņa masas) plus 45 procenti HFD;DME1 grupa (DM plus CTE: 80 mg/kg ķermeņa masas) plus 45 procenti HFD; DME2 grupa (DM plus CTE: 160 mg/kg ķermeņa masas)plus 45 procenti HFD; un DME4 grupa (DM plus CTE: 320 mg/kg ķermeņa masas) plus 45 procenti HFD. Rosiglitazons (RSG) bijaņemta par pozitīvo kontroli. Tika izmantotas trīs CTE devas (80, 160 un 320 mg/kg) saskaņā arTaivānas Pārtikas un zāļu pārvaldes (TFDA) ieteikums par veselīgu pārtikuvērtēšanas vadlīnijas. Ārstēšana tika veikta līdz eksperimenta beigām. Visas eksperimentālās žurkastika upurēti pēc 6 nedēļām. Asinis tika savāktas no žurkām un tika centrifugētas ar ātrumu 3000 apgr./min15 minūtes pulksten 4◦C. Supernatants tika pārbaudīts, lai veiktu šādu analīzi:Kopējais glikozes, triglicerīdu un holesterīna līmenis

Noteikšana:

Glikozes noteikšana bijaveic ar glikozes enzīmu komplektiem. Tad, 20µL asins plazmas paraugi tika pievienotireaģenti un turēti pie 37◦C 5 min. Kopējā triglicerīdu un kopējā holesterīna koncentrācija bijanosaka, izmantojot triglicerīdu un holesterīna enzīmu komplektus. Tad, 10µL asins plazmas bijapievieno reaģentiem, un eksperiments tika veikts saskaņā ar ražotāja norādījumiem.Absorbcija tika mērīta pie 510 nm.Plazmas kopējā glikoze/triglicerīds/holesterīns (mg/dL)=(Aparaugs− ATukšs)/(Astandarta− ATukšs) × 200. Paraugs: Asins paraugu absorbcija, ATukšs: Absorbcijas vērtība komplektiem bez parauga, Standarta: standarta reaģenta absorbcijas vērtība, 200: standarta reaģenti koncentrācijā200 mg/dl.Insulīna, leptīna un homeostatiskā modeļa novērtēšana – insulīna rezistences (HOMA-IR) noteikšana:Insulīna līmenis tika noteikts ar insulīna ELISA komplektiem. Šeit, 25µL asins plazmas tika pievienotsreaģenti un absorbcija tika mērīta pie 450 nm. Kopējais leptīna saturs tika noteikts, izmantojotleptīna enzīmu imunometriskās analīzes komplekts. Tad 100µTika analizēts L plazmas un absorbcijatika mērīts pie 450 nm, izmantojot ELISA lasītāju. Viss eksperiments tika veikts saskaņā arražotāja norādījumus. HOMA-IR vērtība tika noteikta no homeostāzes modeļanovērtējuma vienādojums=Insulīna koncentrācija plazmā tukšā dūšā (mU/mL)× plazmas glikoze tukšā dūšākoncentrācijas (mmol/L)/22,5.Plazmas lipīdu peroksidācija: šeit 0,5 ml asins plazmas tika sajaukti ar 1 ml reaģenta (15 procenti,w/v trihloretiķskābe {{0}},25 N sālsskābē (HCl) un 0,375 procenti,w/v tiobarbitūrskābe iekšā0,25 N HCl) un ievieto ūdens vannā (Water Bath, BUCHI 461, Cīrihe, Šveice) pie 100◦C par15 min. Pēc atdzesēšanas pievienoja 1 ml n-butanola, enerģiski sakrata un centrifugēja pie 1500× g uz 10 min. Supernatants tika savākts un absorbcija tika mērīta pie 532 nm [12]. Malondialdehīda (MDA) koncentrācija (nM/mL)=[(A paraugspie 532 nm− Atukšs pie 532 nm)/ (Standartapie 532 nm− Atukšs pie 532 nm)] × 5. Testosterona un luteinizējošā hormona (LH) līmeņa noteikšana plazmā: testosteronsLai noteiktu testosterona līmeni asins plazmā, tika izmantots ELISA komplekts. RIA komplekts bija pieradisnoteikt LH koncentrāciju. Tad, 50µTika pievienots L plazmas un tika veikti aprēķinipar hormona LH-RP-3 (standarta) koncentrāciju. Turpmākās darbības tika veiktas atbilstošisaskaņā ar ražotāja norādījumiem.Audzēja nekrozes faktora (TNF) noteikšana – un interleikīna-6 (IL-6) koncentrācija:Noķertā antiviela tika atšķaidīta 250 reizes pārklājuma buferšķīdumā, pievienota 96-iedobes plāksnei (100µL/aka),un paturēja 4◦C uz nakti. Supernatants tika aspirēts un mazgāts piecpadsmit reizes ar mazgāšanubuferis (1 reize PBS, 0,05 procenti Tween 20). Pēc inkubācijas (1 h) ar 200µg testa šķīdinātāja, šūnas bijamazgāts 5 reizes ar mazgāšanas buferi un 100µL no TNF- bija standarta šķīdums vai testa paraugipievieno katrai iedobei un inkubē 2 stundas. Pēc mazgāšanas 100µTika pievienotas L IL-6 konstatētās antivielasun inkubē 1 stundu istabas temperatūrā. Supernatants tika aspirēts un mazgāts 5 reizes. Tad480 µPievienoja L enzīma avidīna-mārrutku peroksidāzes (HRP) un inkubēja 30 minūtes telpā.temperatūra. Supernatants tika aspirēts un piecas reizes mazgāts ar mazgāšanas buferi. Tad 100µL tika pievienots substrāta šķīdums un inkubēts 15 minūtes istabas temperatūrā. Vēlāk, 50µL no pieturaskatrā iedobē tika pievienots šķīdums (1 M fosforskābe), un absorbcija tika mērīta pie 450 nm.Spermas un sēklinieku parametru analīzeSpermas paraugu ņemšana: Spermas paraugu ņemšana tika veikta saskaņā armetode, par kuru iepriekš ziņots [13]. Spermas tika savāktas no supernatanta un izmantotasturpmāka analīze.Spermas skaits, spermas kustīgums un patoloģiskas spermas: Spermas skaits bijaaprēķināts, izmantojot hemocitometru un tripānzilo šķīdumu. Tad 100µL spermas šķidruma bijasajaukts ar tripānzilo šķīdumu, un spermatozoīdu skaits, kustīgums un patoloģiska spermatozoīda bijaaprēķināts, izmantojot hemocitometru un mikroskopu [14]. Nitrozilais tetrazolijs NBT spermas un sēklinieku reducēšana un lipīdu peroksidācija: lipīdsperoksidācija un NBT reducēšana tika analizētas saskaņā ar to pašu plazmas analīzes procedūru.

Superoksīda dismutāzes (SOD) un katalāzes aktivitātes noteikšana: Superoksīda dismutāze(SOD) aktivitāte tika analizēta, izmantojot RANSEL komplektu. Šeit ir 0,05 ml sēklinieku homogenātatika pievienoti 1,7 ml reakcijas šķīduma (0.05 mM ksantīna, 0,025 mM 2-(4-jodfenil)-{{0}}(4-nitrofenols)-5-feniltetrazolija hlorīds (INT)). Pēc sajaukšanas 0,25 ml ksantīna oksidāzes (80 U/L)tika pievienots un reaģēts istabas temperatūrā 30 sekundes istabas temperatūrā. Absorbcija bijamērīts pie 505 nm. Sēklinieku homogenāta olbaltumvielu koncentrāciju noteicaTika aprēķināts Bio-Rad DC proteīna testa komplekts un tā specifiskā aktivitāte (U/mg proteīna). Katalāze(CAT) aktivitāte tika noteikta saskaņā ar iepriekš ziņoto metodi [15]. H&E (hematoksilīna un eozīna) krāsošanaSēklinieku 24 stundas mērcēja 10% formalīna un uzglabāja 4 °C◦C. Sagrieza audusmikro izmēra un piestiprināts pie slaida. Pēc fiksācijas (95 procenti metanola plus 5 procenti etiķskābes) priekšmetstikliņi tikaiegremdē hematoksilīnā 3 minūtes, mazgā ar tekošu ūdeni 5 minūtes un pēc tam iemērc ar50 procenti, 70 procenti un 90 procenti alkohola vienu minūti. Pēc tam priekšmetstikliņus 10 s iekrāsoja ar eozīnu unvienu minūti iemērc 100 procentu spirtā, līdz tas izbalējis. Beidzot priekšmetstikliņu vienam iemērc ksilolāminūte. Vēlāk priekšmetstikliņus izžāvēja gaisā un aizzīmogoja. Krāsotā caurule tika ievietota apgrieztā fāzes kontrastāmikroskops (apgrieztās fāzes atšķirības mikroskops, Olympus CK-2, Tokija, Japāna), lai novērotumorfoloģija.Hipotalāmu analīzePeles KISS1, ar G-proteīnu saistīts receptors (GPR) 54, citokīnu signālu nomācējs 3 (SOCS-3)un sirtuīns 1 (SIRT1)gēnu sekvences tika identificētas no NCBI (Nacionālais biotehnoloģijas centrsInformācija) gēnu datu bāze un īpašs primer tika izstrādāts, izmantojot Primer 5.0 PREMIER Biosoft,Palo Alto, Kalifornija, ASV). Eksperimentā izmantotie grunti ir norādīti tabulā1.

Ribonukleīnskābes (RNS) ekstrakcija no hipotalāma. RNS ekstrakcija nosmadzeņu hipotalāmu veica, izmantojot RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. IegūtaismRNS tika kvantitatīvi mērītas ar reverso transkripciju (RT) un polimerāzes ķēdes reakciju(PCR). Komplimenta DNS, kas iegūta no RT analīzes, tika glabāta plkst−20 ◦C vēlākai lietošanai.Ekstrahētā DNS tika pakļauta polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) analīzei, izmantojot Taq polimerāzi.Tad 5-10µTika ņemts L PCR produkta un analizēts ar elektroforēzi uz 1,5 procentu agarakoloīds. Attēls tika uzņemts UVP BioDoc-It attēlveidošanas sistēmā. Reversi transkribēts komplementārsTika ņemta dezoksiribonukleīnskābe (cDNS) un veikta PCR, izmantojot IQ SYBR Green Supermix.Komplekts. Vēlāk tas tika analizēts ar iQTM 5 Optical System Software. Olbaltumvielas tika ekstrahētas, izmantojot aproteīna ekstrakcijas reaģents (T-PER). Pēc tam 400 pievienoja 20 mg sēklinieku homogenātaµL T-PER un centrifugēta (ātrgaitas centrifūga, Hettich CR-12, Tuttlingen, Vācija) pie 4◦C (125,000× g) 20 minūtes. Sekojošā metode bija līdzīga "identifikācijai un kvantitatīvai noteikšanai".olbaltumvielu analīze" in vitro analīzē.2.3. Statistiskā analīzeEksperimenta rezultāti tika izteikti kā vidējie± standarta novirze (vid± SD) undati tika analizēti, izmantojot Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0 programmatūru, IBM, Armonk,Ņujorka, NY, ASV. Atšķirības starp grupām tika analizētas ar vienvirziena analīzidispersija (ANOVA). Vairāki dažādu grupu salīdzinājumi tika analizēti ar Dankana testuvērtībap < 0.05="" as="" the="" signifificant="">

3. Rezultāti

3.1. In vitro analīze

3.1.1. ECH, CTE un RES antioksidantu aktivitāšu salīdzinājums

Ilgstošs augsts oksidatīvais stress un hronisks iekaisums ir galvenie diabēta cēloņikomplikācijas [16]. CTE satur dažādus feniletanoīdu glikozīdus, piemēram, ehinakozīdu(ECH) un akteozīds ar potenciālu antioksidantu aktivitāti [17]. DPPH radikāļu attīrīšanatests tika veikts, lai novērtētu ECH antioksidantu aktivitāti. Trolox un resveratrol(3,5,4'-trihidroksistilbēns, RES) tika ņemti attiecīgi par standarta un pozitīvo kontroli. Kā parādītsattēlā1, ECH uzrādīja labāku radikāļu attīrīšanas aktivitāti, un aktivitāte bija ievērojami augstākanekā pozitīvās kontroles (RES).

3.1.2. ECH šūnu dzīvotspēja LC-540 un TM3 Leydig šūnāsMTT tests tika veikts, lai novērtētu dažādu ECH koncentrāciju šūnu dzīvotspēju.LC-540 Leidiga šūnas un TM3 Leidiga šūnas uzrādīja vairāk nekā 80 procentu dzīvotspēju pēc ārstēšanas arECH (attēls2). Salīdzinot ar citām koncentrācijām, 100-µM koncentrācija (atšķaidījumi 100µM 2 procentos FBS) ECH uzrādīja labāku šūnu dzīvotspēju TM3 Leydig šūnās. Rezultāts norādīja, kapaaugstināta ECH koncentrācija neveicina būtisku toksicitāti šūnām.

3.1.3. ECH ietekme uz AGE izraisītu superoksīda veidošanos ar NBT testu LC-540 un TM3Leidiga šūna

AGE izraisa oksidatīvus bojājumus organismā glikozes oksidēšanās un veidošanās dēļbrīvie radikāļi, piemēram, O2-, hidroksilgrupas un karbonilgrupas [18]. Pēc stimulēšanas ar50 µg/mL AGE, LC-540 (attēls3a) un TM3 (attēls3b) šūnas tika apstrādātas ar ECH un RES(5 µM un 10µM katrs). Rezultāti parādīja, ka tika palielināta superoksīda anjona ražošanakontroles grupā (stimulēti AGE), bet pēc tam superoksīda anjonu ražošana tika samazinātaārstēšana ar ECH un RES. No attēla3, tika saprasts, ka ECH un RES samazina līmeniveicina superoksīda veidošanos un aizsargā šūnas no oksidatīviem bojājumiem. LC-540 šūnu gadījumā10 µM ECH uzrādīja gandrīz līdzīgu aktivitāti ar parasto grupu. Superoksīda ražošana abāsšūnas tika samazinātas, palielinoties gan ECH, gan RES koncentrācijai.3.1.4. ECH ietekme uz H2O2 Ražošana AGE-stimulētās LC-540 Leydig šūnāsLai noteiktu oksidatīvo sugu klātbūtni, tika veikts DCFH-DA tests. Pēc iestāšanāsšūnas, FL fluorescējošā krāsviela DCFH-DA tiek oksidēta ar intracelulāro H2O2 un veido dihlorfluoresceīnu(DCF). Kā parādīts attēlā4, ievērojami palielinājās intracelulārā H2O2 ražošanaAGE stimulēta grupa (kontrole), savukārt pievienojot 10µM ECH un RES ievērojami samazinātsH2O2 ražošana šūnās. 10 administrācijaµM ECH radīja tikai aptuveni 47,1 procentus H2O2 produkciju, ievērojami zemāka nekā kontroles grupā.

3.1.5. ECH ietekme uz RAGE un NF-κB proteīna ekspresijas līmeņi vecuma stimulētā LC-540Leidiga šūnas

Tika veikta Western blot analīze, lai apstiprinātu RAGE klātbūtni LC-540 Leydigšūnas. ECH ietekme uz RAGE (attēls5a) un NF-κB (attēls5b) olbaltumvielu ekspresijas līmeņiAGEs stimulētās Leidiga šūnās tika parādītas attēlā5. Rezultāti parādīja, ka 50µg/mlAGE koncentrācija izraisīja augstāku RAGE un NF-κB izteiksme LC-540 Leidiga šūnās un10 µECH un RES M koncentrācija ir ievērojami samazinājusi RAGE un NF- ekspresijuκB. NF izpausmeκB bija ievērojami zemāks RES un ECH nekā RAGE antagonistiem. Tātad, rezultātiapstiprināja, ka ECH samazināja iekaisuma līmeni, samazinot RAGE un NF- līmeniκB.

.1.6. ECH ietekme uz testosterona sintēzes ceļu AGE-stimulētās LC-540 Leydig šūnās.

Spermatoģenēzes un vīriešu neauglības process ir atkarīgs no testosterona klātbūtnes.Kā parādīts attēlā6, StAR izteiksmes (attēls6a), CYP11A1 (attēls6b), CYP17A1 (attēls6c), un HSD17 3 (attēls6d) AGE stimulētā LC-540 Leydig olbaltumvielas bija ievērojami samazinātasšūnas (kontroles grupa). StAR, CYP11A1, CYP17A1 un HSD17 izpausmes 3 proteīni bijaievērojami palielinājās, pievienojot RAGE antagonistu, RES un ECH. PalielinātsStAR un CYP11A1 proteīnu ekspresija tika novērota gan ar ECH, gan ar RES ārstētajās grupās.CYP17A1 ekspresijas līmenis bija gandrīz līdzīgs RES un ECH grupās. Izteicieni parHSD17 3 proteīns ECH apstrādātajās Leydig šūnās bija daudz augstāks nekā RES un RAGEar antagonistiem apstrādātas šūnas. Paaugstināta StAR, CYP11A1, CYP17A1 un HSD17 ekspresija 3 olbaltumvielasliecina par normālu testosterona veidošanos.

5šūnas/mL un apstrāde ar RES un ECH(10µM) tika ievadīts 24 stundas. - aktīns tika ņemts par iekšējo kontroli. Parasta grupa (Nor)tika apstrādāta ar barotni, un kontroles grupa (Con) tika apstrādāta ar AGE (50µg/ml).

Rezultātitika parādīti kā vidēji±SD (n = 3). Būtiskas atšķirības (p < 0.05)="" were="" represented="" by="" letters="">analizēts ar Dankana vairāku diapazonu testu.