2-Aminoindāna-2-fosfonskābes apstrādes ietekme uz salidrosīda un četru feniletanoīdu glikozīdu uzkrāšanos Cistanche Deserticola suspensijas šūnu kultūrā

lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

Gao Sheng Hu u.c

Abstrakts

2-Aminoindāna-2-fosfonskābe (AIP), aspecifisks konkurētspējīgs fenilalanīna amonjaka liāzes (PAL) inhibitors, tika uzklāts suspensijas šūnu kultūraiCistanche deserticola. AIP ārstēšanas ietekme uz šūnu augšanu, PAL aktivitāti, saturu un kopējā fenola savienojuma, salidrosīda un četru vielu daudzumuFeniletanoīdu glikozīdi(PheG) tiek izmeklēti. Rezultāti parādīja, ka {{0}},5 un 2,0 lM AIP terapijai bija līdzīga ietekme uz šajā pētījumā pētītajiem mērījumiem. Ārstēšana ar AIP izraisīja ievērojamu PAL aktivitātes samazināšanos, kopējo fenola savienojumu saturu un(feniletanoīdu glikozīdi)PheG saturs. Lineārās regresijas analīze parādīja, ka PAL aktivitātei bija augsts korelācijas koeficients ar kopējo fenola savienojumu saturu un četriem(feniletanoīdu glikozīdi)PheGs saturs. Kopējam PAL aktivitātes laika laukumam zem līknes (AUC) bija augsts korelācijas koeficients ar kopējo fenola savienojumu iznākumu un piecu pārbaudīto savienojumu daudzumu neapstrādātos šūnu paraugos. Ar AIP apstrādātajās šūnās kopējais PAL aktivitātes laika AUC saglabāja augstu korelāciju ar kopējo fenola savienojumu iznākumu un trīs pārbaudīto savienojumu, ehinakozīda, akteozīda un tubulozīda A, bet ne salidrosīda un cistanozīda A iznākumu. Atšķirību var izraisīt katra pārbaudītā savienojuma atšķirīgā biosintētiskā izcelsme. Šie rezultāti parāda PAL svarīgo lomu. biosintēzē(feniletanoīdu glikozīdi)PheG suspensijas šūnu kultūrāCistanche deserticola.

Atslēgvārdi

Cistanche deserticola, Suspensijas šūnu kultūra,Feniletanoīdu glikozīdi, 2-Aminoindāns-2-fosfonskābe (AIP), PAL aktivitāte, biosintēze, salidrozīds

Noklikšķiniet uz Cistanche ekstrakta priekšrocībām un Cistanche produktiem

Ievads

Cistanche deserticolaYC Ma, tradicionāls ķīniešu ārstniecības augs, ir izmantots gadsimtiem ilgi Ķīnā tā barojošās iedarbības dēļ. Tas ir daudzgadīgs un parazitārs ārstniecības augs, kas pieder pie Orobanchaceae dzimtas Cistanche ģints. Augs aug Rietumķīnas tuksnešainajos apgabalos un ir parazīts uz Haloxylosammodendrun saknēm.

Ķīmisko sastāvdaļu izolācijas un struktūras izskaidrošanas pētījumiCistanche deserticolasākās 80. gados (Kobayashi et al. 1984a, b, 1985, 1986; Karasawa et al. 1986; Xiong et al. 1996). Demonstrācija parfeniletanoīdu glikozīdi(PheG) kā efektīvi savienojumi, kas aizsargā neironu šūnas no bojājumiem (Sheng et al. 2002; Puet al. 2003; Geng et al. 2004; Tian and Pu. 2005), ko izraisīja ķīmiskās vielas un novecošanās, veicināja tirgus pieprasījuma pieaugumu pēc komerciāli pieejamās veselīgas pārtikas. un narkotikas. Pārmērīgas ražas novākšanas, biotopu korupcijas un sarežģītā parazītisma dēļ dabas resursiCistanche deserticolaatrodas uz izmiršanas robežas un 2003. gadā tika iekļauta Konvencijā par starptautisko tirdzniecību ar apdraudētajām savvaļas faunas un floras sugām (CITES).

Lai atrisinātu problēmas, kas saistītas ar ierobežotajiem resursiem, Ķīnā tika veiktas šī ārstniecības auga šūnu un audu kultūras. Šajos pētījumos tika pētīta dažādu faktoru, tostarp osmotiskā stresa (Liu un Cheng 2008), prekursoru barošanas (Ouyang et al. 2005; Liu et al. 2007), dažāda viļņa garuma gaismas (Ouyang et al. 2003a), sēnīšu izraisītāju (Lu) ietekme. un Mei 2003; Cheng et al. 2005, 2006), andabiotiskie stimulatori (Ouyang et al. 2003b) par šūnu augšanu un uzkrāšanos.(feniletanoīdu glikozīdi)PheGs. Šie pētījumi sniedza vērtīgu informāciju liela mēroga kultūraiCistanche deserticolaJoprojām nav skaidrs, kā šie savienojumi tiek biosintēzēti Cistanchecells, un ir ziņots par maz ģenētiskās informācijas.

Eksperimentos ar izotopu iezīmētu prekursoru barošanu (Ellis 1983; Saimaru un Orihara 2010) ir pierādīts, ka akteozīda kofeoilgrupa tika iegūta no L-fenilalanīna, bet 3, 4-dihidroksilfeniletanola grupa tika iegūta no L-tirozīna. Hipotētisks biosintētiskais ceļš(feniletanoīdu glikozīdi)PheGs iekšāCistanche deserticolatika ierosināts (1. papildu attēls), pamatojoties uz pašreizējām zināšanām par saistītajiem biosintēzes ceļiem. PAL enzīms katalizēja pirmo soli no fenilalanīna uz kofeoilgrupu. Netieši tika pierādīts, ka PAL ir svarīgs enzīms biosintēzē(feniletanoīdu glikozīdi)PheGs, veicot pētījumus par ārstēšanu ar elicitoruCistanche deserticola(Lu un Mei 2003; Cheng et al. 2005, 2006; Ouyang et al. 2003b), kurā kopsumma(feniletanoīdu glikozīdi)Tika uzlabota PheG uzkrāšanās līdz ar palielinātu PAL aktivitāti. Apstrāde ar elecitoru ne tikai uzlabos PAL ekspresijas līmeni, bet arī uzlabos citu enzīmu līmeni, kas iesaistīti sekundāro metabolītu biosintēzes ceļā. Sakarā ar grūtībām transformācijas sistēmas izveidēCistanche deserticola, tieši pierādījumi par PAL pārmērīgu ekspresiju(feniletanoīdu glikozīdi)Nav ziņots par PheG uzkrāšanos. Citos ražotnēs, kas ražo(feniletanoīdu glikozīdi)PheG, piemēram, Echinacea ģints augi, eksperiments arī nav veikts. Šeit mēs ziņojam par PAL specifiskā inhibitora 2-aminoindāna-2- fosfonskābes apstrādes ietekmi uz šūnu augšanu, kopējo fenola savienojumu daudzumu, PAL aktivitāti un šūnu uzkrāšanos.(feniletanoīdu glikozīdi)PheG suspensijas šūnu kultūrāCistanche deserticola, cenšoties novērtēt PAL funkcionālo lomu PheG biosintēzē. Izpētīt biosintēzes ceļu(feniletanoīdu glikozīdi)PheG molekulārā līmenī mēs esam klonējuši un raksturojuši CdPAL1 gēnu no kallusaCistanche deserticola(Hu et al. 2010). Mēs cenšamies izveidot ehinacejas augu transformācijas sistēmu, ko mediē Agrobacterium rhizogenes, un ievadīt gēnu ehinacejas matainajā saknē, lai izpētītu šī gēna pārmērīgas ekspresijas tiešo ietekmi uz PheG uzkrāšanos. Turklāt mēs esam arī klonējuši vairākus gēnus, kas iesaistīti PheG biosintētiskajā ceļā noCistanche deserticolakallus, izmantojot cDNS bibliotēkas skrīningu un RACE PCR, piemēram, tirozināzi, cinamilalkoholdehidrogenāzi, tirozīna dekarboksilāzi, cinamāta-3-hidroksilāzi, kumarāta-4-hidroksilāzi; UDP-glikoziltransferāze un hidroksilcinamiltransferāze. Mēs veiksim turpmākus eksperimentus, tostarp molekulāro raksturojumu, ekspresijas analīzi, ehinacehairy saknes pārmērīgas ekspresijas līnijas, lai noskaidrotu PheGson biosintēzes ceļu molekulārā līmenī.

materiāli un metodes

C. deserticola suspensijas šūnu kultūra

Suspensijas šūnu kultūra noCistanche deserticolatika uzturēta B5 (Gamborg et al. 1968) šķidrā barotnē, kas papildināta ar 30 g saharozes-l-1, 0,5 mg 6-BA-l-1 , un 2,0 mgNAA l-1 pie 25 ± 1 grāda ar kratīšanu (180 apgr./min). Gaismas periods bija 16 (L)/8 (D), un suspensijas šūnu kultūra tika kultivēta ik pēc 28 dienām. Subkultūras laikā suspensijas šūnu kultūra vispirms tika filtrēta tīrā stendā, izmantojot autoklāvētu Mira audumu, un pēc tam svaigu šūnu granulu nosvēra un inokulēja jaunā barotnē ar koncentrāciju 2 g FW-50 ml-1.

Izaugsmes izmeklēšana

Šūnu augšanu galvenokārt mēra pēc šūnu svaigā svara (FW) un sausā svara (DW). Šūnu kultūru paraugi tika ņemti 2., 4., 8., 12., 17., 22. un 28. dienā un filtrēti ar vakuumfiltrāciju, izmantojot Mira audumu, līdz no piltuves vairs nenokrita šķidrums. Šūnu granula tika nosvērta un reģistrēta kā FW. Pusi no savāktajām svaigajām šūnām uzglabāja -78 C temperatūrā aktivitātes noteikšanai, bet otru pusi žāvēja 60 C temperatūrā 24 stundas, līdz tika novērots nemainīgs svars. Žāvētās šūnas atdzesēja eksikatorā līdz istabas temperatūrai un pēc tam nosvēra. Šis svars tika reizināts ar divi un reģistrēts kā DW. Žāvētie šūnu paraugi tika samalti smalkā pulverī (80 siets cauri 100 procentiem), ievietoti brūnās mēģenēs, noslēgti un uzglabāti -20 grādu temperatūrā turpmākiem eksperimentiem.

Kopējo fenola savienojumu ekstrakcija un satura noteikšana

Trīsdesmit miligramus žāvētu šūnu pulvera no katra parauga ekstrahēja, izmantojot 400 l 80% metanola 37 C temperatūrā 1 stundu ar kratīšanas ātrumu 200 apgr./min, kam sekoja centrifugēšana. Supernatants tika pārnests uz jaunu cauruli, un atliekas tika ekstrahētas vēl divas reizes, izmantojot to pašu procedūru. Supernatants tika apvienots, filtrēts un izmantots kopējā fenola savienojuma satura noteikšanai un HPLC analīzei (Hu 2007).

Kopējo fenola savienojumu saturs tika analizēts, izmantojot modificētu Folin-Ciocalteu metodi (Singletonet al. 1999). Folin-Ciocalteu reaģents tika atšķaidīts ar 1 tilpumu destilēta ūdens. Iegūtais ekstrakts tika atšķaidīts desmit reizes un katrā satura pārbaudē tika izmantots 10 l ekstrakta. Desmit mikrolitri katra atšķaidītā ekstrakta tika pievienoti 200 l svaigi pagatavotam 2 procentu nātrija karbonāta šķīdumam. Maisījumu enerģiski sajauca un pēc tam veica īsu centrifugēšanu. Maisījumu inkubēja istabas temperatūrā 5 minūtes un pēc tam sajauca ar 10 l atšķaidīta Folīna reaģenta. Galīgo maisījumu enerģiski sajauca un inkubēja RT 30 minūtes. OD750 tika mērīts UV/Vis spektrofotometrā un reģistrēts kopējo fenola savienojumu aprēķināšanai. Hlorogēnās skābes sērijveida šķīdums tika izmantots kā standarta savienojums, un tika sagatavota standarta līkne starp hlorogēnskābes daudzumu un OD750, lai aprēķinātu kopējo fenola savienojumu kā hlogēnskābes reprezentatīvo saturu. Izmantojot kopējo fenola savienojumu saturu un paraugu augšanas datus, mēs aprēķinājām kopējā fenola savienojuma iznākumu katrā paraugā un izteicām, cik miligramu kopējā fenola savienojuma veidojas vienā metienā (mg L-1).

AIP ārstēšana

AIP izejas šķīdums tika sagatavots, izmantojot destilētu ūdeni, lai sasniegtu galīgo koncentrāciju 4 mM. Piemērots daudzums izejas šķīduma tika pievienots 50 ml barotnes, lai iegūtu galīgo koncentrāciju 0,5 un 2,0 lM. Barotnes tika autoklāvētas un inokulētas ar svaigi savāktām šūnām. Trīskāršās kolbas tika inokulētas ar šūnām, kas savāktas no vienas pudeles, un tika izmantotas visās grupās, lai samazinātu sistemātisko kļūdu.

HPLC analīze

Ekstrakti, kas iegūti 'Kopējo fenola savienojumu ekstrakcijā un satura noteikšanā', pirms HPLC analīzes tika filtrēti caur 0,5 lm filtru. HPLC analīze tika veikta, izmantojot Hitachi HPLC (L-2130 sūknis, L-2420UV/Vis detektors un L-2200 automātiskais paraugs) ar C18 kolonnu (150 9 4,6 mm, 5). lm, Voters), kustīgā fāze (MeOH/H2O gradienta eluēšana) un noteikšanas viļņa garums 330 un 220 nm, lai noteiktu(feniletanoīdu glikozīdi)PheGs un salidrosīds, attiecīgi. Desmit mikrolitri katra standarta savienojuma atšķaidījuma un parauga ekstrakta tika ievadīti kolonnā. Ehinakozīda, akteozīda, cistanozīda A, tubulozīda A un salidrozīda satura noteikšana tika veikta, izmantojot katra atsauces savienojuma standarta līkni. Salidrosīds un ehinakozīds tika iegādāti no Nacionālā institūta. Farmācijas un bioloģisko produktu kontrole (Pekina, Ķīna) un Dr. Nobuhisa Ezaki no Yomeishu Seizo Company nodrošināja citus atsauces savienojumus. Visu standarta savienojumu tīrība ir augstāka par 95 procentiem. Strukturālā informācija par pieciem pārbaudītajiem savienojumiem ir norādīta 1. tabulā.

PAL aktivitātes tests

Kopproteīns tika ekstrahēts no paraugiem, kas uzglabāti {{0}} grādos. 0,1 g paraugs tika samalts smalkā pulverī ar šķidro slāpekli un 600 l proteīna ekstrakcijas buferšķīduma tika pievienots mēģenei, kurā bija šūnu pulveris, kam sekoja enerģiska virpošana. 5 minūtes pulksten 4grāds. Maisījumu centrifugēja pie 13, 000 apgr./min 4 grādiem 10 minūtes. Supernatants tika definēts kā kopproteīna ekstrakts. Desmit mikrolitri jēlproteīna ekstrakta tika pievienoti Tris-HCl (pH 8,5) buferšķīdumam, kas satur 10 l 5 mM fenilalanīna uz ledus. Maisījums tika inkubēts 55 ° C temperatūrāgrāds20 minūtes un dzēst, pievienojot 50 l 2 M HCl. OD270 izmaiņas tika reģistrētas, lai aprēķinātu kanēļskābes ražošanu, pamatojoties uz trans-kanēļskābes standarta līkni. Kopējais PAL aktivitātes laika laukums zem līknes (AUC) tika aprēķināts, pamatojoties uz šūnu augšanas datiem un PAL aktivitātes testa datiem.

Statistiskā analīze

Visa statistiskā analīze tika veikta, izmantojot Microsoft Excel programmatūru, ieskaitot standarta kļūdu un lineāro regresijas analīzi

rezultāti un diskusija

AIP ārstēšanas ietekme uz šūnu augšanuCistanche deserticolasuspensijas šūnu kultūra

Kā parādīts 1. attēlā, AIP apstrādei abās koncentrācijās nebija inhibējošas ietekmes uz šūnu augšanu, kā norādīts FW un DW.

AIP ārstēšanas ietekme uz PAL aktivitāti

Kā parādīts 2. attēlā, AIP ārstēšana abās koncentrācijās neizraisīja PAL aktivitātes samazināšanos 2. dienā, bet PAL aktivitāte ievērojami samazinājās no 4. līdz 28. dienai. Tajās dienās ar 0,5 lMAIP apstrādāto šūnu PAL aktivitāte bija 80,3, 73,2, 82,7, 68,5, 62,3 un 42,4 procenti no neapstrādātajām šūnām un zem 2 lM AIP.

AIP apstrādes ietekme uz kopējo fenola savienojumu uzkrāšanos

a attēls parādīja, ka AIP apstrāde abās koncentrācijās ievērojami ietekmēja kopējo fenola savienojumu biosintēzi. Līdzīgi kā PAL aktivitātei, kopējais fenola savienojumu saturs nesamazinājās 2. dienā, bet sāka samazināties 4. dienā. AIP inhibējošā iedarbība pie 0,5 un 2 lM uz kopējo fenola savienojumu saturu bija ļoti līdzīga. Satura inhibīcijas līmenis svārstījās no 91,1 līdz 50,1 procentiem un no 89,9 līdz 41,5 procentiem no neapstrādātajām šūnām attiecīgi 0,5 un 2 lM AIP apstrādātajās šūnās. Pamatojoties uz kopējo fenola savienojumu satura noteikšanu un šūnu augšanas datiem, kopējo fenola savienojumu iznākums tika aprēķināts, kā parādīts 3.b attēlā. Nozīmīgas izmaiņas kopējā fenola savienojumu iznākumā dažādos augšanas posmos bija redzamas 0,5 un 2,0 lM AIP apstrādātajās šūnās, salīdzinot ar neapstrādātām šūnām. Kā parādīts zīm. 2. un 3. attēlā, PAL aktivitātes kavēšanai un kopējo fenola savienojumu un ražas samazinājumam bija līdzīgas tendences.

Tika veikta lineāra regresijas analīze starp PAL aktivitāti un kopējo fenola savienojumu saturu, un rezultāti liecināja, ka ar AIP apstrādātajās šūnās PAL aktivitāte bija cieši saistīta ar kopējo fenola savienojumu saturu (4.a attēls). Kopējo fenola savienojumu iznākums paraugā katrā laika posmā ir uzkrāšanās rezultāts; tāpēc tika veikta lineāra regresijas analīze starp kopējo PAL aktivitātes un laika AUC un kopējo fenola savienojumu iznākumu. 2. attēlā redzams, ka PAL aktivitāte katrā laika punktā bija atšķirīga; tādējādi, lai aprēķinātu kopējo PAL aktivitātes laika AUC, mēs šeit pieņemam, ka PAL aktivitāte starp diviem laika punktiem mainās lineāri. Kā parādīts 4.b attēlā, AUC labi korelēja ar kopējo fenola savienojumu iznākumu un uzrādīja korelācijas koeficientus (R2) 0,9788, {{10}},8157 un 0. 0,6981 neapstrādātām, 0.5 lM AIP un 2,0 lM AIP apstrādātām šūnām. Pamatojoties uz šiem rezultātiem, mēs secinājām, ka AIP terapijas izraisītā PALaktivitātes kavēšana izraisīja kopējās fenola savienojumu biosintēzes un uzkrāšanās samazināšanos.Cistanche deserticolasuspensijas šūnu kultūra.

AIP ārstēšanas ietekme uz salidrosīda uzkrāšanos un četriem(feniletanoīdu glikozīdi)PheGs

Izpētīt detalizētu AIP ietekmi uz biosintēzi un uzkrāšanos(feniletanoīdu glikozīdi)PheG, dažādu paraugu ekstrakti tika uzklāti uz HPLC, un katra parauga reprezentatīvā hromatogramma ir parādīta 5. attēlā. Testēto savienojumu standarta formula un to aiztures laiki ir norādīti 2. tabulā. Kā parādīts 5.a attēlā, salidrosīds un pārējie četri PheG ir bāzes līnijas, kas atdalītas saskaņā ar mūsu analītiskajiem nosacījumiem. 5.b–d attēlā redzams, ka salidroside saturs būtiski nemainījās, un 5.f, g attēlā redzams, ka pīķu laukums, kas konstatēts pie 330 nm, ievērojami un nepārtraukti samazinājās ar 0,5 un 2 lM AIP apstrādātiem produktiem. šūnu ekstrakti, salīdzinot ar neapstrādātām šūnām (5.e attēls).

Katra pārbaudītā savienojuma saturs un iznākuma izmaiņas ir parādītas 6. attēlā un 3. tabulā. Saskaņā ar mūsu rezultātiem ehinakozīds un cistanozīds A ir divi galvenie savienojumi, un to saturs ir aptuveni desmit reizes lielāks nekā pārējos trīs savienojumos. Tomēr, reaģējot uz AIP ārstēšanu, katra savienojuma saturs bija ievērojamas. Ehinakozīda gadījumā saturs neapstrādātajās šūnās sāka nepārtraukti pieaugt no 8. dienas līdz 28. dienai (5.a att.), kas bija diezgan atšķirīgs no cistanozīda A modeļa, kas sasniedza augstāko saturu 8. dienā un nedaudz samazinājās līdz 28. diena. Ar AIP apstrādātajās šūnās abu savienojumu saturs ievērojami samazinājās tādā pašā veidā. Akteozīda un tubulozīda saturs bija daudz zemāks nekā ehinakozīda saturs, savukārt mainīgā tendence bija līdzīga ehinakozīdam. Salīdzinot ar neapstrādātām šūnām, ir arī dramatisks katra pārbaudītā savienojuma iznākuma samazinājums 0,5 un 2 lM AIP apstrādātajām šūnām. Saskaņā ar 6. attēlu un 3. tabulu ehinakozīda, cistanozīda, akteozīda, tubulozīda A un salidrosīda iznākums 28. dienā ar AIP apstrādātajās šūnās samazinājās attiecīgi līdz aptuveni 10, 10, 34, 36 un 25 procentiem no neapstrādātām šūnām. koncentrācijas.

Lineārās regresijas analīze starp PAL aktivitātiun(feniletanoīdu glikozīdi)PheG uzkrāšanās

Lai noteiktu, kā katrā grupā korelēja PAL aktivitāte un katra pārbaudītā savienojuma saturs, tika veikta lineārās regresijas analīze (7. att.). Salidrozīda saturam visās grupās bija zemākais korelācijas koeficients (R2), sākot no 0.1651 neapstrādātajā šūnā līdz 0.4753 2.0 lM AIP apstrādātajās šūnās. . Izņemot salidrosīdu, pārējiem pārbaudītajiem savienojumiem bija daudz augstāki korelācijas koeficienti, un to R2 ir norādīts 7. attēlā. Mūsu rezultāti parādīja, ka PAL aktivitāte ir cieši saistīta ar ehinakozīda, akteozīda, cistanozīda A un tubulozīda A saturu visās grupās.

Mēs arī veicām lineāro regresijas analīzi starp kopējo PAL aktivitātes un laika AUC un katru pārbaudīto savienojuma iznākumu savāktajos paraugos (8. att.). Regresijas analīze liecināja, ka katra savienojuma iznākums ar AUC korelē atšķirīgi. Neapstrādātajās šūnās visiem pieciem savienojumiem ir augsts korelācijas koeficients ar kopējo PAL aktivitātes laika AUC. Tomēr ar AIP apstrādātajās šūnās tikai ehinakozīds, akteozīds un tubulozīds A saglabāja augstus korelācijas koeficientus, un pārējiem diviem savienojumiem, cistanozīdam A un salidrozīdam, bija ļoti zemi korelācijas koeficienti ar kopējo PAL aktivitātes laika AUC. Šie rezultāti liecināja, ka PAL aktivitātei bija ļoti atšķirīga ietekme uz šo savienojumu uzkrāšanos. Saskaņā ar 1. tabulu savienojumiem ehinakozīds, akteozīds un tubulozīds A satur kofeoilgrupu un 3, 4-dihidroksilfeniletanola grupu; cistanozīdā A ir feruloilgrupa un 3-metoksi, 4-hidroksilfeniletanola grupa; unsalidrosīdam ir hidroksilfeniletanola grupa. Iemesls, kāpēc šiem savienojumiem ir atšķirīgi korelācijas koeficienti ar kopējo PAL aktivitātes laika AUC ar AIP apstrādātajās šūnās, varētu būt saistīts ar to atšķirīgo biosintētisko izcelsmi.

Kā parādīts 5. attēlā, pēc AIP apstrādes lielākā daļa pīķu nepārtraukti un ievērojami samazinājās, un šajā pētījumā tika identificēti pieci. No šiem pārbaudītajiem savienojumiem tikai salidrosīdam nebija kofeoilgrupas. Pirms šī pētījuma tika uzskatīts, ka svarīgu starpproduktu saturs pirms kofeoilgrupu integrācijas, piemēram, asalidrosīds, palielināsies PAL aktivitātes inhibīcijas dēļ, taču mēs neatradām būtiski palielinātus maksimumus AIP apstrādātajās šūnās. Šis rezultāts var rasties tāpēc,(feniletanoīdu glikozīdi)PheG ir sekundāri C. deseriticola metabolīti un to ražošana(feniletanoīdu glikozīdi)PheG regulē šūnu vides stress. Mūsu eksperimentos ar AIP apstrādātās šūnas netiek apstrādātas ar elicatoru vai citiem spriegumiem, tāpēc PheG un to starpproduktu ražošana netiek aktīvi biosintēzēta ar AIP apstrādātajās šūnās. Ir arī ziņots, ka (Chapple et al. 1986) augu tirozīndekarboksilāzes (TYRDC) aktivitāti var spēcīgi inhibēt La-aminooksi-b-fenilpropionāts, vēl viens PAL specifisks konkurētspējīgs inhibitors. TYRDC ir galvenais enzīms salidrosīda ražošanā no tirozīna. Tomēr saskaņā ar mūsu rezultātiem AIP ārstēšana būtiski neietekmēja salidrosīda saturu, kas liecināja, ka TYRDC aktivitāte nebija stipri ietekmēta. Lai noteiktu AIP ietekmi uz tā aktivitāti, ir nepieciešams īpašs aktivitātes tests, izmantojot TYRDC attīrītu proteīnu vai rekombinanto proteīnu.

Secinājumi

Mūsu rezultāti parādīja, ka AIP apstrādei pie {{0}},5 un 2,0 lM nebija izteiktas ietekmes uz šūnu augšanu, taču tā būtiski kavēja PAL aktivitāti, biosintēzi un kopējā fenola savienojuma uzkrāšanos, un tika pārbaudīts.(feniletanoīdu glikozīdi)PheGsin suspensijas šūnu kultūraCistanche deserticola. Lineārās regresijas analīze liecināja, ka PAL aktivitātei bija augsts korelācijas koeficients ar kopējo fenola savienojumu saturu un(feniletanoīdu glikozīdi)PheG saturs, izņemot salidrozīdu visās šūnu grupās. Kopējo fenola savienojumu un piecu pārbaudīto savienojumu iznākumam bija augsts korelācijas koeficients ar kopējo PAL aktivitātes laika AUC neapstrādātajās šūnās. Attiecībā uz AIP apstrādātajām šūnām tikai ehinakozīds, akteozīds un tubulozīds A saglabāja augstus korelācijas koeficientus ar kopējo PAL aktivitātes laika AUC. Par šo atšķirību var būt atbildīgas dažādas biosintētiskās izcelsmes. Noslēgumā jāsaka, ka mūsu rezultāti liecināja, ka PAL enzīmam bija svarīga loma biosintēzes un uzkrāšanās kontrolē.(feniletanoīdu glikozīdi)PheG suspensijas šūnu kultūrāCistanche deserticola.

Pateicības

Šo darbu atbalstīja Dong-A universitātes pētniecības fonds. Mēs vēlamies pateikties profesoram Džerijam Zonu, kurš strādā Organiskās ķīmijas bioķīmijas un biotehnoloģijas institūtā, Vroclavas Tehnoloģiju universitātē Polijā, par to, ka viņš mums sniedza AIP. Mēs arī vēlamies izteikt atzinību Dr. Nobuhisa Ezaki no Yomeishu Seizo Company Japānā par standarta savienojumu cistanīda A, akteozīda un tubulozīda A piešķiršanu mūsu eksperimentiem.

No: "2-aminoindāna-2-fosfonskābes apstrādes ietekme uz salidrosīda un četru feniletanoīdu glikozīdu uzkrāšanos Cistanche deserticola suspensijas šūnu kultūrā", autorsGao Sheng Hu u.c

---Plant Cell Rep (2011) 30:665–674 DOI 10,1007/s00299-010-0997-3

Atsauces

Chapple CCS, Walker MA, Ellis BE (1986) La-aminooksi-b-fenilpropionāts var spēcīgi inhibēt augu tirozīna dekarboksilāzi. Planta 167:101–105

Cheng XY, Guo B, Zhou HY et al (2005) Atkārtota izvilināšana uzlabofeniletanoīdu glikozīdiuzkrāšanās suspensijas šūnu kultūrāsCistanche deserticola. J Biochem Eng 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X u.c. (2006)feniletanoīdu glikozīdibiosintēze iekšāCistanche deserticolasuspensijas šūnu kultūras ar hitozāna izsaucēju. J Biotechnol 121(2): 253–260
Ellis BE (1983) Hidroksifeniletanola glikozīdu ražošana Syringa vulgaris suspensijas kultūrās. Phytochemistry 22(9):1941–1943
Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Barības prasības sojas sakņu šūnu suspensijas kultūrām. Exp Cell Res 50:151–158
Geng XC, Song LW, Pu XP et al (2004) Neuroprotective Effects ofFeniletanoloīdu glikozīdinoCistancassalsa pret 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridīna (MPTP) izraisītu dopamīnerģisko toksicitāti C57 pelēm. Biol Pharm Bull 27(6):797–801
Hu GS (2007) Pētījumi par suspensijas šūnu kultūru un molekulāro bioloģijuCistanche deserticola. Maģistra darbs, Šeņjanas Farmācijas universitāte Hu GS, Jia JM, Hur YJ, et al (2010) Fenilalanīna amonjaka-lizāzes molekulārais raksturojums no plkst.Cistanche deserticola.Mol Bio Rep. doi: 10.1007/s11033-010-0489-0
Karasawa H, Kobayashi H, Takizawa N et al (1986) Pētījumi par Cistanchis Herba sastāvdaļām. VIII. Yakugaku Zasshi 106(8):721–724
Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T et al (1984a) Pētījumi par Cistanchis Herba sastāvdaļām. IV. Chem Pharm Bull 32(10):3880–3885
Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T et al (1984b) Pētījumi par Cistanchis Herba sastāvdaļām. III. Chem Pharm Bull 32(8):3009–3014
Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T et al (1985) Pētījumi par Cistanchis Herba sastāvdaļām. V. Chem Pharm Bull 33(4):1452–1457
Kobayashi H, Karasawa H, Takizawa N et al (1986) Pētījumi par Cistanchis Herba sastāvdaļām. VII. Yakugaku Zasshi 106(7):562–566
Liu CZ, Cheng XY (2008) Enhancement offeniletanoīdu glikozīdibiosintēze šūnu kultūrāsCistanche deserticolaosmotiskā stresa ietekmē. Plant Cell Rep 27:357–362
Liu JY, Guo ZG, Zeng ZL (2007) Uzlabota uzkrāšanāsfeniletanoīda glikozīdss ar prekursoru barošanu Cistanche salsa suspensijas kultūrā. Biochem Eng J 33:88–93
Lu CT, Mei XG (2003) Improvement offeniletanoīdu glikozīdisēnīšu izsaucēja ražošana suspensijas šūnu kultūrāCistanche deserticola.Biotechnol Lett 25:1437–1439
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, et al (2003a) Gaismas intensitāte un spektrālā kvalitāte, kas ietekmē kallusa augšanuCistanche deserticolaun biosintēzefeniletanoīdu glikozīdi. Plant Sci 165:657–661
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, et al (2003b) Retzemju elementu ietekme uz augšanuCistanche deserticolašūnām un to ražošanaifeniletanoīdu glikozīdi. J Biotechnol 102:129–134
Ouyang J, Wang XD, Zhao B uc (2005) Uzlabota ražošanafeniletanoīdu glikozīdiar prekursoru barošanu ar šūnu kultūruCistanche deserticola. Process Biochem 40:3480–3484
Pu XP, Song ZH, Li YY et al (2003) Cistanche salsas akteozīds kavē apoptozi ar 1, 2-metilfenilpiridīnija jonu smadzenīšu granulu neironos. Planta Med 69:652–666
Saimaru H, Orihara Y (2010) Akteozīda biosintēze kultivētās Olea europaea šūnās. J Nat Med 64:139–145
Sheng GQ, Pu XP, Lei L, et al (2002) Tubulosīds B no Cistanche salsa glābj PC12 neironu šūnas no metilfenilpiridīnija jonu izraisītas apoptozes un oksidatīvā stresa. Planta Med 68:966–970
Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Ravento´s RM (1999) Kopējo fenolu un citu oksidācijas substrātu un antioksidantu analīze, izmantojot Folin-Ciocalteu reaģentu. Method Enzymol 299:152-178
Tian XF, Pu XP (2005)Feniletanoīda glikozīdss no Cistanches salsa inhibē apoptozi, ko neironos inducē 1-metil-4-fenilpiridīnija jons. J Ethnopharmacol 97:59–63
Xiong Q, Kadota S, Tani T, et al (1996) Antioksidatīvā iedarbība feniletanoīdus noCistanche deserticola. Biol Pharm Bull 19(12):1580–1585