Cistanche Deserticola ietekme uz krūts vēža šūnu līnijas T-47D proliferāciju, apoptozi un migrāciju, regulējot LncRNS LIFR-AS1

[Abstract]Mērķis Izpētīt Cistanche deserticola ietekmi uz krūts vēža šūnu līnijas T-47D proliferāciju, apoptozi un migrāciju un tās regulēšanu uz garās ķēdes nekodējošās (Lnc) RNS leikēmijas inhibējošā faktora receptoru antisense RNS-1 (LIFR-AS1). Metode T-47D šūnas tika kultivētas dažādās koncentrācijās (100, 200, 400 μ Cistanche deserticola ūdens ekstraktu kultivējiet barotnē g/ml 24 stundas, sadalot zemas, vidējas un lielas devas grupās Cistanche deserticola. Tajā pašā laikā kā kontroles grupa tika izmantotas normālas kultivētas šūnas. Transfektējiet si-NC un si-LIFR-AS1 T-47D šūnās un pievienojiet 400 μ Kultivējiet ar g/ml Cistanche deserticola kultūru barotne 24 stundas, ieskaitot Cistanche deserticola lielas devas plus si-NC grupu un Cistanche deserticola lielas devas plus si-LIFR-AS1 grupu. Lai noteiktu ekspresiju, tika izmantota reālā laika fluorescences kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija (qRT PCR). LIFR-AS1 līmenis; Šūnu proliferācijas spējas noteikšana, izmantojot plākšņu klonēšanas testu; Plūsmas citometrijas izmantošana šūnu cikla un apoptozes ātruma noteikšanai; Šūnu migrācijas spēja tika pārbaudīta ar skrāpējuma testu. Rezultāti Salīdzinot ar kontroles grupu, ekspresijas līmenis un apoptozes ātrums LIFR-AS1 vidējas un lielas devas Cistanche deserticola grupās ievērojami palielinājās, klonu skaits tika ievērojami samazināts, G0-G1 šūnu īpatsvars ievērojami palielinājās, kā arī S šūnu un skrāpējumu dzīšanas īpatsvars. likme tika ievērojami samazināta (P<0 05); Compared with Cistanche deserticola high-dose+si NC group, the number of clones formed in Cistanche deserticola high-dose+si LIFR-AS1 group was significantly increased, the proportion of G0-G1 cells and the apoptosis rate were significantly reduced, and the proportion of S cells and the scratch healing rate were significantly increased (P<0 05). Conclusion Cistanche deserticola can induce cell cycle arrest by up-regulating the expression of LIFR-AS1, thereby reducing the proliferation of breast cancer cells, inducing apoptosis, and inhibiting cell migration.

[Atslēgvārdi] Cistanche deserticola; Garās ķēdes nekodējoša (Lnc) RNS leikēmijas inhibējošā faktora receptoru antisense RNS-1 (LIFR-AS1); Krūts vēzis; Izplatīšana; Apoptoze; nodošana

Krūts vēzis ir viens no izplatītākajiem ļaundabīgajiem audzējiem klīnikās. Saslimstības līmenis ar krūts vēzi Ķīnā ir pat 12,5 procenti 2 procenti, agrīna krūts vēža izārstēšanas līmenis ir pat vairāk nekā 86 procenti, taču joprojām nav efektīva marķiera agrīnai krūts vēža diagnosticēšanai. krūts vēzis. Radiochemical · 624 · Chinese Journal of Gerontology Vol.43, 2023. gada janvāris un citas visaptverošas ārstēšanas metodes var uzlabot pacientu ārstēšanas efektu, taču pacientu prognoze ir slikta. Pašlaik krūts vēža patoģenēze nav noskaidrota. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka hiperozīdam, apigenīnam un citām zālēm ir pret krūts vēzi vērsta iedarbība, tomēr konkrēts to darbības mehānisms vēl nav noskaidrots [1-4].

Cistanche-Antitumor ietekme

Cistanche deserticola pieder pie Rubiaceae dzimtas daudzgadīgajiem vīnogulājiem, kas tonizē nieru jangu un izkliedē vēju un mitrumu. Pētījumi liecina, ka Cistanche deserticola piemīt farmakoloģiska iedarbība, piemēram, pretaudzēju un antioksidanta iedarbība [5]. Tomēr Cistanche deserticola terapeitiskā iedarbība uz krūts vēzi un tās iespējamais mehānisms nav noskaidrots. Garās ķēdes nekodēšanas (Lnc) RNS leikēmijas inhibējošā faktora receptoru antisense RNS-1 (LIFR-AS1) ir zema ekspresija krūts vēža gadījumā un var regulēt šūnu proliferāciju un migrāciju [6]. Tomēr nav zināms, vai LIFR-AS1 var izmantot kā Cistanche deserticola terapeitisko mērķi pret krūts vēzi. Šī pētījuma mērķis bija noskaidrot, vai Cistanche deserticola varētu ietekmēt krūts vēža šūnu T-47D proliferāciju, apoptozi un migrāciju, regulējot LIFR-AS1.

1 Materiāls un metodes

1.1 Materiāli un reaģenti

Cistanche deserticola (20190203) tika iegādāta no Bozhou Baichuan Pharmaceutical Co., Ltd; Krūts vēža šūna T-47D tika iegādāta no Guangzhou Saiku Biotechnology Co., Ltd.; Lipofectamine2000 (20190412) un apoptozes noteikšanas komplekts (20181223) tika iegādāti no Beijing Solaybao Technology Co., Ltd; Trizola reaģents (20181203) tika iegādāts no Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd; Reversās transkripcijas (20181103) un fluorescences kvantitatīvās polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) noteikšanas reaģenti (20181116) tika iegādāti no Beijing Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd; Si-NC un si-LIFR-AS1 tika iegādāti no Shanghai Jima Pharmaceutical Technology Co., Ltd; Trušu anti-cilvēka B-šūnu limfomas (Bcl) -2 un Bcl-2 saistītās X proteīna (Bax) antivielas tika iegādātas no Santa Cruz Company Amerikas Savienotajās Valstīs; Kazas anti-trušu IgG sekundārā antiviela, kas marķēta ar mārrutku peroksidāzi (HRP), tika iegādāta no Wuhan Doctor Bioengineering Co., Ltd. StepOnePlus reāllaika fluorescences kvantitatīvā PCR instruments tika iegādāts no ABI Corporation Amerikas Savienotajās Valstīs; FACS Calibur plūsmas citometrija tika iegādāta no Beckman Kurt Company Amerikas Savienotajās Valstīs.

Cistanche pulvera ieguvumi veselībai - pretaudzēju

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1.2. Eksperimentālā grupēšana

Cistanche deserticola ūdens ekstrakts [7]: nosver 100 g Morinda officinalis zāļu, iemērc ūdenī 30 minūtes un pēc tam novāra 60 minūtes. Filtrējiet ūdens novārījumu un vēlreiz novāriet 45 minūtes. Divreiz savāc filtrātu un koncentrē pazeminātā spiedienā līdz 160 ml tilpumam. Atdzesē un inkubē ledusskapī 24 stundas. Pēc centrifugēšanas ar ātrumu 3000 apgr./min ņem supernatantu ar zāļu koncentrāciju 2 g/ml. Kultūras šķīdumu atšķaida līdz vajadzīgajai koncentrācijai 100, 200 un 400 μg/ml. T-47D šūnas tika kultivētas dažādās koncentrācijās (100, 200, 400 μ Cistanche deserticola ūdens ekstraktu kultivējiet barotnē g/ml 24 stundas, sadalot zemas, vidējas un lielas devas grupās). Cistanche deserticola. Tajā pašā laikā kā kontroles grupa tika izmantotas normālas kultivētas šūnas. Transfektējiet si-NC un si-LIFR-AS1 T-47D šūnās un pievienojiet 400 μ Cistanche deserticola barotnes g/ml tika kultivēts 24 stundas, ieskaitot lielas devas Cistanche deserticola plus si-NC grupu un lielas devas Cistanche deserticola plus si-LIFR-AS1 grupu.

1.3. LIFR AS1 ekspresijas līmeņa noteikšana, izmantojot reāllaika fluorescences kvantitatīvo noteikšanu (qRT) — PCR

Kopējā T-47D šūnu RNS katrā grupā tika ekstrahēta, izmantojot Trizol metodi, un reversā transkribēta, lai sintezētu cDNS. DeRNA enzīms (DEPC) tika pievienots un 20 reizes atšķaidīts ūdenī pirms uzglabāšanas -20 grādu ledusskapī. qRT-PCR sistēma un reakcijas procedūra tika darbināta saskaņā ar fluorescences kvantitatīvās noteikšanas komplekta norādījumiem, un tika noteikta LIFR-AS1 (iekšējā atsauces GAPDH) relatīvā ekspresija šūnās.

1.4. Plākšņu klonēšanas eksperiments

Inokulējiet T-47D šūnas katrā grupā uz 6-iedobes plāksnes (1 × 103 šūnas/iedobē) un pēc tam ievietojiet tās inkubatorā turpmākai kultivēšanai 14 dienas. Nomazgājiet ar iepriekš atdzesētu fosfāta buferšķīdumu (PBS) un pievienojiet metanolu (500 μl). Ievietojiet to -20 grādu ledusskapī uz 20 minūtēm, izmetiet metanolu un pievienojiet 1% kristālvioletas krāsošanas šķīdumu (400 μl). Inkubējiet istabas temperatūrā 15 minūtes un mazgā ar destilētu ūdeni. Pēc žāvēšanas novērojiet izveidoto klonu skaitu.

1.5. Šūnu cikla noteikšanas eksperiments

T-47D šūnas katrā grupā (1 × inokulēt 105 gab./ml uz 96 iedobju plāksnēm (100 μl/iedobē), centrifugēt ar ātrumu 3000 apgr/min 5 minūtes, izmest supernatantu un pievienot iepriekš - atdzesētas PBS atkārtoti suspendētas šūnas (500 μl) Pievienojiet iepriekš atdzesētu etanolu (70 procenti) šūnu suspensijai, izmetiet supernatantu un pievienojiet RNaseA (50 μl). Pievienojiet propīdija jodīda (PI) krāsošanas šķīdumu (450) pēc { {13}}minūšu ūdens vanna 37 grādi μ l) Inkubējiet to 4 grādu ledusskapī 30 minūtes un analizējiet šūnu ciklu proporciju katrā grupā, izmantojot FACS Calibur plūsmas citometriju un Flowjoy programmatūru.

Tuksneša dzīvo cistanche

1.6. Šūnu apoptozes ātruma noteikšana ar plūsmas citometriju

Pievienojiet iepriekš atdzesētu PBS T-47D šūnām mazgāšanai, izmetiet supernatantu un pievienojiet 500 šūnu nogulsnēm μ Resuspensējiet šūnas ar buferšķīdumu, rīkojieties saskaņā ar apoptozes noteikšanas komplektu un nosakiet šūnu apoptozes ātrumu.

1.7. Skrāpējumu pārbaude

Inokulēt T{{0}}D šūnas uz 6-iedobes plāksnes (1 × 103/iedobē), pēc katras grupas apstrādes novelciet līniju horizontālā virzienā plkst. kultūras plāksnes apakšdaļa kā atsauce. Pēc 48 stundu kultivēšanas vēlreiz novelciet līniju un novērojiet skrāpējumu platumu divos punktos, lai aprēķinātu skrāpējumu dzīšanas ātrumu [(skrāpējuma platums 0 h - skrāpējuma platums 48 h)/skrāpējuma platums 0 h × 100 procenti 〕.

1.8. Bax un Bcl-2 proteīna ekspresijas noteikšana ar Western blot metodi

Pēc T{{0}}D šūnu kopējā proteīna ekstrahēšanas nosakiet proteīna koncentrāciju un paņemiet atbilstošu proteīna paraugu daudzumu SDS PAGE reakcijai. Pēc membrānas pārnešanas un blīvēšanas pievienojiet pirmo antivielu šķīdinātāju (1:1000) un otro antivielu šķīdinātāju (1:5000) un izmantojiet automātisko gēla attēlveidošanas sistēmu, lai analizētu katras proteīna joslas pelēko vērtību. 1.9. Statistiskā apstrāde, izmantojot SPSS 21 Veiciet t-testu un vienvirziena ANOVA, izmantojot programmatūru 0.

Eksperimentāls pētījums par Cistanche deserticola

2 Rezultāti

2.1. Cistanche deserticola ietekme uz T-47D proliferāciju un LIFR-AS1 ekspresiju

Salīdzinot ar kontroles grupu, LIFR-AS1 ekspresijas līmenis Cistanche deserticola vidējās un lielās devas grupās bija ievērojami augstāks, klonu skaits bija ievērojami samazināts, G0-G1 fāzes šūnu īpatsvars bija ievērojami augstāks. , un S fāzes šūnu īpatsvars bija ievērojami mazāks, un katra indeksa atšķirības starp Cistanche deserticola deserticola vidējās un lielās devas grupām bija statistiski nozīmīgas (visi P<0. 01) 05), but there was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells among the groups (P>0 05), skatiet 1. tabulu.

2. 2 Cistanche deserticola ietekme uz T-47D apoptozi

Salīdzinot ar kontroles grupu, apoptozes ātrums un Bax proteīna līmenis Cistanche deserticola vidējas un lielas devas grupās ievērojami palielinājās, bet Bcl-2 proteīna līmenis ievērojami samazinājās. Dažādu rādītāju atšķirības starp vidējo un lielo Cistanche deserticola devu grupām bija statistiski nozīmīgas (visi P<0. 05) 05), as shown in Table 1, Figure 1, and Figure 2

1. tabula Cistanche deserticola ietekme uz T-47D šūnu cikla klonu veidošanos, LIFR-AS1 ekspresiju un šūnu apoptozi (x ± s, n=3)

Salīdzinot ar kontroles grupu: 1) P<0 05; Compared with the low-dose group of Cistanche deserticola: 2) P<0 05; Compared with the medium and low dose group of Cistanche deserticola: 3) P<

1. attēls: Cistanche deserticola ietekme uz T-47D apoptozi katrā grupā

1-4: kontroles grupa, mazas devas Cistanche deserticola grupa, vidējas devas Cistanche deserticola grupa, lielas devas Cistanche deserticola grupa

2. attēls Cistanche deserticola ietekme uz T-47D apoptotiskā proteīna ekspresiju

2.3. Morinda officinalis ietekme uz T-47D migrāciju

Salīdzinot ar kontroles grupu [({0}} ± 1, 39) procentu salīdzinājums, vidējas devas Cistanche deserticola [(43 56 ± 1.00 procenti) un Cistanche deserticola lielas devas grupas skrāpējumu dzīšanas ātrums [(23 87 ± 0,72 procenti ]) ievērojami samazinājās, un lielas Cistanche deserticola devas grupai bija ievērojami zemāks nekā vidējas Cistanche deserticola devas grupai (P<0 05).

2.4 Ietekme notraucēt LIFR-AS1 T-47D proliferāciju, kas ārstēta ar Cistanche deserticola

Salīdzinot ar Cistanche deserticola lielas devas plus si NC grupu, Cistanche deserticola lielas devas plus si LIFR-AS1 grupā izveidoto klonu skaits ievērojami palielinājās, G0-G1 šūnu īpatsvars ievērojami samazinājās, un S šūnu īpatsvars palielinājās (P<0 There was no statistically significant difference in the proportion of G2-M phase cells between the two groups (P>0. 05) 05), skatiet 2. tabulu.

2. tabula Interferences LIFR-AS1 ietekme uz T-47D šūnu ciklu, klonoģenēzi, apoptozi un migrāciju Cistanche deserticola ārstēšanā (x ± s, n=3)

2. 5 Traucējošās LIFR-AS1 ietekme uz T-47D apoptozi, ko izraisa ārstēšana ar Cistanche Deserticola

Salīdzinot ar Cistanche deserticola lielas devas plus si-NC grupu, Cistanche deserticola lielas devas plus si-LIFR-AS1 grupas apoptozes ātrums, Bax proteīna līmenis un Bcl-2 proteīna līmenis bija ievērojami samazināts. (P<0 05), see Table 2, Figure 3, and Figure 4.

LIFR-AS1 2.6 traucējumu ietekme uz T-47D migrāciju un LIFR-AS1 ekspresiju Cistanche deserticola apstrādātās šūnās

Salīdzinot ar Cistanche deserticola lielas devas plus si-NC grupu, Cistanche deserticola lielas devas plus si-LIFR-AS1 grupas skrāpējumu dzīšanas ātrums tika ievērojami palielināts, un LIFR-AS1 ekspresija tika ievērojami samazināta (P<0 05), see Table 2.

3. attēls. Traucējošās LIFR-AS1 ietekme uz T-47D apoptozi Cistanche deserticola ārstēšanā

1-2, Cistanche deserticola lielas devas plus si-NC grupa, Cistanche deserticola liela deva plus si-LIFR-AS1 grupa

4. attēls. Traucējošās LIFR-AS1 ietekme uz T-47D apoptozes proteīna ekspresiju Cistanche deserticola ārstēšanā

3 Diskusija

Ķīniešu augu izcelsmes zālēm ir pretinfekcijas, pretaudzēju un citi efekti. Tas ir viegls un var efektīvi mazināt dažus simptomus pacientiem, taču krūts vēža patoģenēze ir sarežģītāka. Ķīniešu augu izcelsmes zāļu pret krūts vēzi molekulārais mehānisms vēl nav noskaidrots [8–10]. Cistanche deserticola uzlabo imunitāti, antioksidāciju un efektīvu osteoporozes ārstēšanu, taču tās specifiskais darbības mehānisms vēl nav zināms [11,12]. Šī pētījuma rezultāti liecina, ka Cistanche deserticola var samazināt krūts vēža šūnu proliferāciju, izraisot šūnu cikla apstāšanos, un tas var veicināt krūts vēža šūnu apoptozi un kavēt krūts vēža šūnu migrāciju.

Cistanche tubulosa-Antitumor priekšrocības

LIFR-AS1 ekspresijas pazemināšanās ir saistīta ar sliktu izdzīvošanu kuņģa vēža gadījumā [13]. LIFR-AS1 inhibē nesīkšūnu plaušu vēža invāziju un metastāzes caur miR-942-5p/cinka pirkstu proteīna (ZNF) 471 asi [14]. Šie rezultāti liecina, ka iejaukšanās LIFR-AS1 ekspresijā var būtiski mainīt Cistanche deserticola ietekmi uz krūts vēža šūnu proliferāciju, apoptozi un migrāciju.

Rezumējot, Cistanche deserticola var izraisīt šūnu cikla apstāšanos, vājināt krūts vēža šūnu proliferācijas spēju, veicināt šūnu apoptozi un kavēt šūnu migrāciju. Tās mehānisms ir saistīts ar LIFR-AS1 ekspresijas regulēšanu.

Ķīniešu herb cistanche-Antitumor

4 Atsauces

1 Si L, Fu J, Liu W u.c. Silibinīns kavē krūts vēža MDA-MB-231 šūnu migrāciju un invāziju, inducējot mitohondriju saplūšanu〔J〕．Mol Cell Biochem, 2020; 463( 1-2) : 189-201．

2 Qiu J, Zhang T, Zhu X, et al. Hiperozīds inducē krūts vēža šūnu apoptozi, izmantojot ＲOS mediētu NF-κB signalizācijas ceļu〔J〕．Int J Mol Sci, 2019; 21(1): 131-41.

3 uzvarēja YS, SEO KI. Lupiwighteone inducē no kaspāzes atkarīgu un neatkarīgu apoptozi uz cilvēka krūts vēža šūnām, inhibējot PI3K/Akt/mTOＲ ceļu〔J〕． Food Chem Toxicol, 2020; 135 (1) : 110863-9.

4 Bauer D, Mazcio E, Soliman KFA. Visa apigenīna transkriptomiskā analīze uz TNF imūnaktivētām MDA-MB-231 krūts vēža šūnām〔J〕．Cancer Genomics Proteomics, 2019; 16(6) : 421-31．

5 Lai Manxiang, Ruan Zhiyan, Xu Yiping Pētījumu progress par nieru tonizējošās tradicionālās ķīniešu medicīnas Cistanche deserticola [J] farmakoloģisko ietekmi. Āzijas Klusā okeāna tradicionālā medicīna, 2017; 13(1) : 63-4.

6 Xu F, Li H, Hu C. LIFＲ-AS1 modulē Sufu, lai kavētu šūnu proliferāciju un migrāciju ar miＲ-197-3p krūts vēža gadījumā〔J〕．Biosci Ｒep, 2019; 39(7): 1-9.

7 Ilizati Khalifu Cistanche deserticola ūdens ekstrakta ietekme uz EGFR un HER-2 proteīnu ekspresiju osteosarkomas šūnās in vitro [D]. Pekina: Pekinas Medicīnas universitāte, 2019

8 Kushwaha PP, Vardhan PS, Kapewangolo P uc 234(1): 116783-9.

9 Zhao Z, Jin G, Ge Y utt. Naringenīns kavē krūts vēža šūnu migrāciju, izmantojot iekaisuma un apoptozes šūnu signalizācijas ceļus 〔J〕．Inflammopharmacology, 2019; 27(5): 1021-36.

10 Zan L, Chen Q, Zhang L utt. Epigallokatehīna gallāts (EGCG) nomāc augšanu un audzēju ģenēzi krūts vēža šūnās, samazinot miＲ-25〔J〕．Bioengineered, 2019; 10(1) : 374-82．

11 Zhang Xuexin, Xiao Liuying, Pan Jingqiang Cistanche deserticola ietekme uz peles audzēja šūnu proliferāciju un Bax un Bcl-2 proteīnu ekspresiju [J]. Tradicionālā ķīniešu medicīna, 2011; 34(4) : 598-601．

12 Li Yimin, Chen Jian, He Jianquan, et al. Cistanche deserticola ārstnieciskā seruma ietekme uz proto onkogēna un kodola saistošā faktora 1 mRNS ekspresiju osteoblastu osteoklastu kopkultūras sistēmā ［ J ］. Ķīniešu gerontoloģijas žurnāls, 2015; 35(9) : 2328-31．

13 Wang HF, Lv JQ, Li HH, et al. Augsta gara nekodējoša LIFＲ-AS1 ekspresija korelē ar sliktu izdzīvošanu kuņģa karcinomas gadījumā〔J〕． Eur Ｒev Med Pharmacol Sci, 2020; 24(10) : 5378-84．

14 Wang Q, Wu J, Huang H, et al．lncＲNA LIFＲ-AS1 nomāc nesīkšūnu plaušu vēža invāziju un metastāzes caur miＲ-942- 5p /ZNF471 asi〔J〕．Cancer Cell Int,2020; 20(1): 180190.