Flavonoīdu ietekme uz ādu atbilstoši to strukturālajām īpašībām: pārskats

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstract:Priekšvēsture: Miokarda infarkta (MI) laikā tiek zaudēti miljardi kardiomiocītu. Optimālajai terapijai vajadzētu efektīvi aizstāt bojātos kardiomiocītus, iespējams, ar cilmes šūnām, kas spēj pārtvert un diferencēties pieaugušo funkcionālos kardiomiocītos. Kā tādas, sirds priekškambaru piedēkļu cilmes šūnas (CASC) ir piemērotas kandidātes. Tomēr paaugstināts uzlaboto glikācijas gala produktu (AGE) līmenis sirds reģionos, kur tiek transplantēti CASC, var ietekmēt to reģeneratīvo potenciālu. Šajā pētījumā mēs pārbaudām, vai un kā AGE maina CASC īpašības in vitro. Metodes un rezultāti: CASC kultūrā tika pakļauti dažādām AGE koncentrācijām (no 50 ug/mL līdz 400 ug/mL). CASC izdzīvošana, proliferācija un migrācijas spēja ievērojami samazinājās pēc 72 stundu ilgas AGE iedarbības. Apoptoze ievērojami palielinājās, palielinoties AGE koncentrācijai. Šo AGE kaitīgo ietekmi daļēji mazināja iepriekšēja inkubācija ar AGE receptoru (RAGE) inhibitoru (25 μM FPS-ZM1), kas norāda uz RAGE iesaistīšanos novērotajā negatīvajā ietekmē. Secinājums: AGE ir no laika un koncentrācijas atkarīga negatīva ietekme uz CASC izdzīvošanu, proliferāciju, migrāciju un apoptozi in vitro, ko daļēji veicina RAGE aktivācija. Neatkarīgi no tā, vai anti-AGE terapija ir efektīva ārstēšana cilmes šūnu terapijas apstākļos pēc MI, ir nepieciešama turpmāka pārbaude.

Atslēgvārdi:cilmes šūnas; aldehīda dehidrogenāze; CASC; glikētie proteīni; uzlaboti glikācijas gala produkti; izplatīšana; apoptoze; migrācija; RAGE inhibīcija

1. Ievads

Koronārā sirds slimība (KSS) joprojām ir galvenais mirstības un saslimstības cēlonis visā pasaulē, un miokarda infarkts (MI) ir visizplatītākā KSS forma [1]. MI rodas pilnīgas vai daļējas koronārās artērijas oklūzijas rezultātā. Išēmiskajā zonā skābeklis un barības vielas ir ierobežotas, izraisot miokarda šūnu nāvi. Infarkta lielums ir atkarīgs no vairākiem faktoriem, piemēram, riskam pakļautās išēmiskās zonas lieluma, koronārās oklūzijas atrašanās vietas un ilguma, kā arī atlikušās asins plūsmas apjoma [1,2]. Tā kā pieaugušajiem kardiomiocītiem ir minimālas reģeneratīvās īpašības, bojāto audu iekšējā atjaunošana joprojām ir nenotverama. Terapeitiskās pieejas atrašana, kas efektīvi aizvieto miokarda rētu ar funkcionāliem saraušanās audiem, ir vienīgā iespēja atgūt zaudētos sirds audus.cik daudz cistanche jāņemIr ieguldīts daudz pētījumu, lai atklātu šūnu terapijas ar kaulu smadzeņu šūnām (BMC) terapeitisko potenciālu un mehānismus. Kaulu smadzenes satur hematopoētiskās cilmes šūnas (HSC), endotēlija cilmes šūnas (EPC) un mezenhimālās cilmes šūnas (MSC) [3]. Klīniskie pētījumi ar mononukleāriem BMC un MSC nespēja nodrošināt ievērojamus sirdsdarbības uzlabojumus pēc MI. Tā kā mononukleārie BMC un MSC nediferencējas kardiomiocītos, novērotie ierobežotie uzlabojumi, visticamāk, ir saistīti ar parakrīnajiem mehānismiem [4, 5]. Lai būtiski uzlabotu sirds darbību pēc MI, pētījumu uzmanība tika pievērsta pastāvīgajām sirds cilmes šūnām (CSC), piemēram, c-kit plus, Sca-1 plus, Isl-1 plus -šūnām un kardiosfērām, kuri, visticamāk, ir iepriekš ieprogrammēti kļūt par kardiomiocītiem. Tomēr viņu panākumi sirds reģenerācijā ir slikti [6].

lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Pēdējos gados mūsu pētniecības grupa atklāja jauna veida sirds cilmes šūnas ar nosaukumu “sirds priekškambaru cilmes šūnas” (CASC). Atšķirībā no citām cilmes šūnām, CASC piemīt ārkārtējas kardiomiogēnas diferenciācijas īpašības, padarot tās par daudzsološu kandidātu sirds reģenerācijai [4]. Šīs cilmes šūnu populācijas izolēšana no priekškambaru piedēkļiem ir balstīta uz augstu aldehīda dehidrogenāzes (ALDH) aktivitāti. Par augstu ALDH aktivitāti tika ziņots arī citos cilmes šūnu veidos, piemēram, MSC, HSC un nervu un vēža cilmes šūnās, cita starpā[7-9]. Tā kā ALDH ir izrādījies kardioprotektīvs un veicina šūnu izdzīvošanu stresa apstākļos, ALDH plus cilmes šūnu populācijas izmantošana išēmiskos apstākļos šajā kontekstā var būt izdevīga [4,10]. CASC var paplašināt līdz klīniski nozīmīgiem skaitļiem, nezaudējot pamatīpašības, piemēram, ALDH aktivitāti, virsmas antigēna profilu un kardiomiogēnās diferenciācijas spēju [11]. Tas ir ļoti svarīgi šīs terapeitiskās pieejas tulkošanai klīnikā. Turklāt mēs esam parādījuši, ka autologo CASC transplantācijas rezultātā tiek uzlabota kreisā kambara funkcija, kas izriet no adekvātas cilmes šūnu transplantācijas un turpmākas CASC diferenciācijas [4,12].

MI pacientiem ir paaugstināts progresīvo glikācijas galaproduktu (AGE) līmenis [13]AGE ir olbaltumvielas un/vai lipīdi, kurus neatgriezeniski bojā glikācija — process, kurā reducējošie cukuri neenzimātiski reaģē ar aminogrupām lipīdos vai proteīnos. . Papildus glikācijai oksidatīvais stress izraisa arī AGE veidošanos, oksidējoties olbaltumvielām un/vai lipīdiem [14]. AGE veidojas endogēni un dabiski uzkrājas organismā līdz ar novecošanos vai patoloģiskās situācijās, piemēram, MI, kad tiek paaugstināts oksidatīvā stresa līmenis [15-17].kas ir cistancheTurklāt iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka AGE ietekmē dažāda veida cilmes šūnas in vitro [18-20]. AGE samazina cilmes šūnu spēju vairoties, un pēc AGE lietošanas palielinās apoptozes ātrums. Šos efektus var īstenot, izmantojot vairākus mehānismus, tostarp apoptotiskā ceļa aktivizēšanu, RAGE vai pārmērīgu ROS veidošanos [20]. Nav zināms, vai AGE ietekmē arī CASC īpašības. Šie atklājumi rada jautājumu par to, vai AGE var negatīvi ietekmēt CASC terapeitisko efektivitāti, ko izmanto kā MI ārstēšanu. Tāpēc šī pētījuma mērķis ir izpētīt AGE ietekmi in vitro un tā receptora RAGE iespējamo aktivāciju uz CASCS proliferāciju, izdzīvošanu un migrāciju.

2. Materiāli un metodes

2.1. Eksperimenti ar dzīvniekiem

Pētījumi ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar ES direktīvu 2010/63/ES par izmēģinājumiem ar dzīvniekiem, un to apstiprinājusi Vietējā ētikas komiteja dzīvnieku eksperimentiem (UHasselt, Beļģija, Diepenbeek; ID 201919K). Visi dzīvnieki tika turēti vidē ar kontrolētu temperatūru (21 grāds, 60 procentu mitrums) ar 12 h-12h gaismas-tumsas ciklu. Viņi tika baroti ar standarta granulu diētu ar ūdeni, kas bija pieejams ad libitum. Kopumā tika izmantotas 62 Sprague-Dawley žurku mātītes (Janvier Labs, Le Genest-Saint-Isle, Francija).

2.2.Žurku CASC izolēšana un paplašināšana

CASC tika iegūti no labās priekškambaru piedēkļiem, kā aprakstīts iepriekš [4]Īsumā, žurkām tika injicēts heparīns (1000 vienības/kg, intraperitoneāli (ip) un tika eitanāzēts, pārdozējot nātrija pentobarbitāls (Dolethal, Vetoquinol, Aartselar Belgium, 200 mg/kg, ip). Sirdis tika novāktas, perfūzētas ar parasto Tyrode šķīdumu (137mMNaCl,5.4mMKCl,0.5mMMgClz,1mMCaClz,taurīns,naurīns ,pH7,4), un tika savākti labā priekškambara piedēkļi. Ekstrahētos labā priekškambaru piedēkļu audus sasmalcina ~ 1 mm³ gabaliņos, mazgā ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) un 30 minūtes fermentatīvi disociēja Henka līdzsvarotajā sāls šķīdumā. kas satur 0,6 WU/ml kolagenāzes NB 4 (Serva, Heidelberga, Vācija) un 20 mM Carly.bioflavonoīdiALDHt šūnas tika iekrāsotas saskaņā ar Aldefluor komplektu (STEMCELL Technologies, Evergem, Beļģija). ALDHt šūnas tika definētas kā CASC un tika sakārtotas pēc plūsmas (BD FACS Aria) X-VIVO 15 barotnē (Lonza, Bāzele, Šveice), kas papildināta ar 20 procentiem teļa augļa seruma (FCS) un 2 procentiem penicilīna/streptomicīna (P/S). . Izolēti CASC tika iesēti 6-iedobju plāksnēs ar blīvumu 60,000 šūnas vienā iedobē un inkubēti 37 grādos mitrinātā inkubatorā ar 5% CO2 atmosfēru. Barotne tika mainīta ik pēc 2 līdz 3 dienām. Kad CASC sasniedza 80 procentu saplūšanu, tie tika novākti, izmantojot tripsīnu. Visiem eksperimentiem tika izmantoti 1. fragmenta CASC.

Cistanche var novērst novecošanos

2.3. AGEs sagatavošana

AGE tika sagatavoti, kā aprakstīts iepriekš [21]. Īsumā, liellopu seruma albumīns (BSA; 7 mg/ml) tika inkubēts ar glikolaldehīda dimēriem (90 mM; Sigma-Aldrich, Diegem, Beļģija) sterilā PBS (pH 7,4) 5 dienas 37 grādu temperatūrā. Šo šķīdumu dializēja pret PBS, divas reizes 2 stundas un nakti 4 grādos, lai noņemtu neizreaģējušo glikolaldehīdu (3,4 kDa robežvērtība. AGE tika filtrētas (0,2 um filtrs, Sarstedt, Antverpene, Beļģija). BSA inkubēja PBS (7 mg/mL). ) tika izmantots kā kontroles šķīdums.

2.4.Izplatīšanās un izdzīvošanas tests

Tika veikti proliferācijas un izdzīvošanas testi, izmantojot propīdija jodīda (PI) testu, kā iepriekš aprakstīja Gervois et al. un Lo Monaco et al.[22,23]. Īsumā, CASC tika iesēti 96-iedobes plāksnē X-VIVO barotnē ar 10 procentiem FCS un 2 procentiem P/S. Proliferācijas testos tika iesētas 5000 šūnas katrā iedobē. Izdzīvošanas testos tika iesētas 100 šūnas katrā iedobē. Pēc 24 stundām barotnei tika pievienoti pieci dažādi apstākļi: 400 ug/ml BSA, 50 ug/mL, 100 ug/mL, 200 ug/mL un 400 ug/mL AGE. Lai izmērītu proliferāciju, X-VIVO barotnei ar 2 procentiem FCS un 2 procentiem P/S tika pievienoti BSA vai AGE.nopirkt cistancheLai noteiktu dzīvildzi, BSA vai AGE tika pievienoti X-VIVO barotnei ar 0 procentiem FCS un 2 procentiem P/S. Pēc trim dažādiem laika punktiem (24, 48 un 72 h) barotne tika aizstāta ar Līzes buferi A100 (ChemoMetec, Kaiserslautern, Vācija), kam sekoja vienāds daudzums stabilizācijas bufera B (ChemoMetec), kas papildināts ar PI (10 ug/). ml, Sigma). Pēc 15 minūšu inkubācijas perioda tumsā fluorescence tika mērīta, izmantojot Fluostar Optima plates lasītāju (BMG Labtech, Ortenberga, Vācija) pie ierosmes 540 nm, emisijas viļņa garuma 612 nm un pastiprinājumu 2000. Tika veikti eksperimenti. trīs eksemplāros. Dati tika normalizēti atbilstoši datiem, kas iegūti ar 400 ug/ml BSA.

2.5. Migrācijas tests

CASC tika iesēti {{0}}iedobes plāksnē ar blīvumu 5000 šūnas vienā iedobē X-VIVO barotnē ar 10 procentiem FCS un 2 procentiem P/S. Barotnei tika pievienoti pieci nosacījumi: 400 ug/ml BSA, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml un 400 ug/mL AGE. Pēc 72 stundu inkubācijas perioda kondicionētie CASC tika novākti, izmantojot tripsīnu, un izmantoti transwell migrācijas testam. ThinCerts (Greiner Bio-One, Vilvoorde, Beļģija) ar porainu membrānu ar poru izmēru 8 um, 100 000 šūnu katrā stāvoklī tika iesētas X-VIVO barotnē ar 0 procentiem FCS un 2 procentiem P/S. ThinCerts tika ievietotas 24-iedobju plāksnēs, kas satur X-VIVO barotni ar 2 procentiem FCS un 2 procentiem P/S. Pēc 24 h migrācijas ThinCerts 15 minūtes fiksēja ar 4 procentiem paraformaldehīdu (PFA) un inkubēja ar 0,1 procentiem. procentos kristālvioleti 30 minūtes. Šūnas, kuras nemigrēja, tika noņemtas ThinCerts augšējā pusē, pēc tam transmigrēto CASC daudzums tika kvantificēts ar AxioVision 4.6 programmatūru (Carl Zeiss, Zaventem, Beļģija). Dati tika normalizēti atbilstoši datiem, kas iegūti ar 400 ug/ml BSA.

2.6.Apoptozes tests

CASC tika iesēti 96-iedobes plāksnē ar blīvumu 10,00 šūnas vienā iedobē X-VIVO barotnē ar 2% FCS un 2% P/S. Lai pētītu apoptozi, tika veikts kaspāzes tests, izmantojot IncuCyte8 Caspase{7}}/7 Green Apoptosis Assay Reagent (atšķaidīts 1/100, Sartorius, Schaarbeek, Beļģija). Barotnei tika pievienoti pieci nosacījumi: 400 ug/mL BSA, 50 ug/ml, 100 ug/mL, 200 ug/mL un 400 ug/mL AGEs. CASC, kas kultivēti X-VIVO barotnē bez FCS un 2 procentiem P/ S tika izmantoti kā pozitīva kontrole. Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Attēli tika uzņemti pēc 24, 48 un 72 h inkubācijas, izmantojot IncuCyte@S3Live-Cell Analysis System (Sartorius, Schaarbeek, Beļģija). Apoptotisko šūnu aizņemtā laukuma analīze tika veikta, izmantojot IncuCyte* SX1 dzīvu šūnu analīzes sistēmu (Sartorius, Schaarbeek, Beļģija). Dati tika normalizēti uz pozitīvo kontroli (plus X-VIVO barotne bez FCS).

2.7. In vitro RAGE inhibīcija

RAGE tika inhibēts, lai novērtētu RAGE aktivācijas ieguldījumu CASC proliferācijā, izdzīvošanā un migrācijā. Īsumā, CASC tika iepriekš inkubēti 37 grādos 5 procentu CO2 inkubatorā ar RAGE antagonistu FPS-ZM1 (10 un 25 uM, Calbiochem/Merck, Overijse, Beļģija). Pēc 2 stundu iepriekšējas inkubācijas tika pievienoti 400 ug/ml AGE.cistanche AustrālijaPēc 24 48 un 72 stundām proliferācija un izdzīvošana tika novērtēta, kā aprakstīts iepriekš. Pēc 72 h inkubācijas iepriekš kondicionēti CASC tika novākti un izmantoti transwell migrācijas testam, kā aprakstīts iepriekš.

2.8.Statistika

Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism 9.0.0 programmatūru.cistančsDatu normālais sadalījums tika novērtēts ar Shapiro-Wilk testu. Parasti sadalītie dati tika pakļauti vienvirziena ANOVA testam ar atkārtotiem mērījumiem, kam sekoja Holm-Sidak vairāku salīdzināšanas tests. Ja dati netika parasti izplatīti, tika izmantots neparametriskais Frīdmena tests, kam sekoja Danna daudzkārtējās salīdzināšanas tests. Visi dati ir izteikti kā vidējā ± vidējā standarta kļūda (SEM). Vērtība p<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultāti

3.1. AGEs iedarbība negatīvi ietekmē CASC izplatību un izdzīvošanu

Kā parādīts 1. attēlā, AGE laika gaitā ievērojami un pakāpeniski samazināja CASC proliferāciju. AGE negatīvā ietekme uz CASC proliferāciju bija arī atkarīga no koncentrācijas. Pēc 72 stundām koncentrācija 100 ug/ml, 200 ug/ml un 400 ug/mL AGE ievērojami samazināja CASC proliferāciju, salīdzinot ar BSA (1C attēls; 80 procenti ±7n100 ug/ml, 74 procenti ±3in 200 ug/m). un 65 procenti ±4 in 400 ug/mL AGE). Tikai BSA lietošana neietekmēja CASC proliferācijas spēju (attēls Sl papildu materiālos). Kā parādīts 2. attēlā, pieaugošā AGE koncentrācija negatīvi ietekmēja CASC izdzīvošanu laikā. Ievērojama AGE ietekme tika novērota pēc 48 (attēls 2B) un 72 stundām (2C attēls; 85 procenti ±3 100 ug/ml, 73 procenti ±3 200 ug/ml un 64 procenti ±4 in 400 ug/mL AGE) .BSA lietošana vien neietekmēja CASC izdzīvošanas spēju (S1. attēls).

3.2. Paaugstināta AGE koncentrācija Palielināta CASC apoptoze

Lai noskaidrotu dažādu AGE koncentrāciju (50, 100, 20 un 400 ug/ml) ietekmi uz CASC apoptozi, tika veikts kaspāzes tests. To šūnu procentuālais daudzums, kas ekspresē kaspāzi 3/7, tika mērīts dažādos laika punktos: 24 (3.A attēls), 48 (3.B attēls) un 72 (3.C attēls) h. Apoptozes ātrums pakāpeniski palielinājās laika gaitā, palielinoties AGE koncentrācijai (3.C attēls, 72h; 77 procenti ±17 400 ug/ml AGE pretstatā 18 procentiem ±3in BSA).

3.3. AGEs iedarbība samazina CASC migrācijas spēju

CASC migrācijas spēja tika novērtēta ar transwell migrācijas testu pēc 72 stundu inkubācijas ar dažādām AGE koncentrācijām. Attēlā 4-E ir parādīti CASC migrācijas reprezentatīvi piemēri pēc inkubācijas ar BSA un dažādām AGE koncentrācijām (50 100, 200 un 400 ug/ml). Migrācijas kvantitatīvā noteikšana ir parādīta 4.F attēlā. Salīdzinot ar BSA, tika novērots ievērojams migrācijas samazinājums, kad CASC tika inkubēti ar 400 ug/mL AGE (4. E, F attēls; 75 procenti ±5 in 400 ug/ml AGE).

3.4. AGE kaitīgo ietekmi CASC izraisa RAGE aktivizēšana

Lai novērtētu RAGE aktivācijas ieguldījumu novērotajā AGE kaitīgajā iedarbībā, pēc inkubācijas ar RAGE antagonistu FPS-ZM1 tika novērtēta CASC proliferācija, izdzīvošana un migrācija. Pirms 400 ug/mL AGE iedarbības CASC tika iepriekš inkubēti 2 stundas ar 10 vai 25 uM FPS-ZM1. Tikai FPS-ZMl (10 un 25 uM) lietošana neietekmēja CASC proliferācijas spēju vai izdzīvošanu (S2 attēls). CASC proliferācija (5A–C attēls) tika novērtēta pēc 24 (A), 48 (B) un 72 (C) stundām. Kā parādīts 1. attēlā, AGE negatīvā ietekme uz CASC proliferāciju ir ievērojami vājināta pēc iepriekšējas inkubācijas ar 25 uM FPS-ZM1 (5A-C attēls). Patiešām, pēc 24 un 48 stundām CASC proliferācija tika ievērojami uzlabota ar 400 ug/mL AGE iedarbību (24h, 5A attēls; 104 procenti 士8 25 μM FPS-ZM1 pret 79 procentiem ±5 400 ug/mL AGEs; 48h, 5.B attēls; 95 procenti ±5 collas 25 μM FPS-ZM1 pret 70 procentiem ±4 collas 400 ug/mL AGE. Pēc 72 stundām tika novērota tāda pati tendence. Proliferācijai bija tendence uzlaboties, kad RAGE tika inhibēts (attēls: 80 procenti ±8in25μMFPS-ZM1 pret 67 procentiem ±5in 400 ug/mL AGE, p=0.06). Izdzīvošana (6.A–C. attēls) tika novērtēta pēc 24 (A), 48 (B) un 72 (C) stundām. AGE negatīvā ietekme uz CASC izdzīvošanu (2. attēls) ir ievērojami uzlabojusies pēc iepriekšējas inkubācijas ar 25 uM FPS-ZM1 (6.A-C attēls). Pēc 24 stundām dzīvildze ievērojami uzlabojās (6.A attēls; 104 procenti ±7 25 μM FPS- ZM1 pret 91 procentiem ±4 400 ug/mL AGES. Šī tendence tika novērota arī pēc 48 stundām (6.B attēls; 91 procenti ±5 25 μM FPS-ZM1 pret 81 procentiem ±5 in 400 ug/mL AGES, p. =0.07). Reprezentatīvi CASC migrācijas piemēri pēc 72 h inkubācijas ar 400 ug/mL AGE un FPS-ZMl ir parādīti attēlā un kvantitatīvi izteikti attēlā. CASC iepriekšēja inkubācija ar 25 uM FPS-ZMI varētu novērst CASC migrācijas kapacitātes samazināšanos, kas novērota ar AGE iedarbību ( 7.B attēls; 98 procenti ±6 25 uM FPS-ZM1 pretstatā 7 procentiem ±8 collas 400 ug/mL AGEs, p=0.07）.

4. Diskusija

Mūsu pētījums ir pirmais, kas parāda, ka AGE ietekmē CASC īpašības, proti, izdzīvošanu, proliferāciju, migrāciju un apoptozi in vitro. Mūsu dati liecina, ka šīs sekas daļēji ir saistītas ar RAGE aktivāciju atkarībā no devas.

4.1. AGE loma MI

Asinsrites AGE līmenis ir ievērojami paaugstināts pacientiem ar akūtu MI [24,25] Tomēr joprojām nav skaidrs, kā viņi ir iesaistīti MI patofizioloģijā. Reaktīvās skābekļa sugas (ROS) ir galvenie AGE sintēzes veicinātāji. Oksidatīvais stress var izraisīt reaktīvu karbonilsavienojumu veidošanos un Amadori produktu glikoksidāciju Maillard reakcijā. Tādējādi AGE neatgriezeniski veidojas un uzkrājas sirdī pēc MI, un tiek uzskatīts, ka tie var vēl vairāk pasliktināt nelabvēlīgo sirds fenotipu [26, 27]. Turklāt neitrofīli un aktivētie makrofāgi, kas ir iesaistīti MI iekaisuma procesā, ir galvenie AGE sintēzes veicinātāji [28, 29]. Šīs imūnās šūnas izdala AGE un tiek ziņots kā galvenie AGE veidošanās induktori MI. 4.2. AGE koncentrāciju fizioloģiskā nozīme

Mūsu pētījumā mēs pārbaudījām plašu AGE koncentrāciju diapazonu (50 līdz 400 ug/mL). Citos in vitro pētījumos, kuros pētīja AGE ietekmi uz cilmes šūnām, AGE koncentrācija ir robežās no 15 līdz 500 ug/ml 【20】. Izmantotās koncentrācijas ievērojami atšķiras, bet augstāks AGE līmenis parasti atspoguļo fizioloģisko līmeni plazmā, kas konstatēts pacientiem, kuri cieš no vairākām slimībām. Patiešām, AGEs-albumīna koncentrācija diabēta pacientiem ir robežās no 50 līdz 400 ug/ml[30]. AGE līmenis var paaugstināties līdz koncentrācijai līdz 200 ug/ml pacientiem, kuri cieš no sirds un asinsvadu slimībām [31,32]. Pacientiem ar Alcheimera slimību agrīnā stadijā ziņots arī par zemāku AGE koncentrāciju nanomērogā [33]. Tomēr AGE mērīšanai izmantoto atšķirīgo analītisko metožu un dažādu AGE veidu neviendabīguma dēļ ticamas AGE koncentrācijas noteikšana in vivo joprojām ir tehniski sarežģīta un, iespējams, ir nepietiekami novērtēta [34].

4.3. AGE negatīvi ietekmē CASC rekvizītus

Pat ja CASC transplantācija parāda daudzsološu sirds reģenerācijas potenciālu pēc MI, šūnu izdzīvošana un reģenerācijas spēja joprojām ir problēma. Ir zināms, ka išēmiskās zonas ir naidīga vide ar paaugstinātu oksidatīvā stresa, iekaisuma un fibrozes līmeni kopā ar paaugstinātu AGE audu līmeni. Tas, vai AGE ietekmēs CASC reģeneratīvo spēju, nebija zināms, taču tās varētu būt svarīgas zināšanas saistībā ar sirds reģenerāciju un CASC daudzsološajām reģeneratīvajām spējām[12]. Mūsu pētījumā mēs parādām, ka AGE pasliktina CASC izdzīvošanu, proliferāciju un migrāciju in vitro. no koncentrācijas un laika atkarīgā veidā. Turklāt AGE iedarbība izraisa pakāpenisku CASC apoptozes palielināšanos. Mūsu dati saskan ar pētījumiem, kuros pētīta AGE ietekme uz vairākiem citu veidu cilmes šūnām, kurās tiek mainīta proliferācijas spēja un palielināta apoptoze [20]. Patiešām, Zhu et al. parādīja ievērojamu EPC proliferācijas samazināšanos pēc dažādu AGE koncentrāciju iedarbības[16]. To pašu efektu novērtēja Sun et al. arī EPC, kur apoptozes ātruma palielināšanos izraisīja p38 MAPK ceļa aktivācija [35]. NSC, kas pakļauti AGE iedarbībai, izraisīja no devas atkarīgu cilmes šūnu proliferācijas samazināšanos, ko izraisīja PPARy ceļš [36]. No taukaudiem iegūtās cilmes šūnās (ADSC) kaspāzes 3 aktivācijas palielināšanās izraisa palielinātu apoptozes ātrumu [37]. Yang et al. ziņoja par zemākām proliferācijas un migrācijas spējām MSC, atkarībā no AGE koncentrācijas. Šo efektu izraisīja pārmērīga ROS ražošana[18]. Joprojām ir jānosaka, vai kaitīgo ietekmi uz CASC, ļoti atšķirīgu sirds izcelsmes cilmes šūnu populāciju, izraisa arī pārmērīga ROS ražošana.

Ir pierādīts, ka pamatā esošie mehānismi, kuros AGE īsteno savu negatīvo ietekmi uz orgānu darbību, ir atkarīgi un/vai neatkarīgi no RAGE receptoru aktivācijas [15]. Pētījumi ar daudziem cilmes šūnu veidiem liecina, ka AGE ietekmē to iedarbību galvenokārt caur RAGE vai citu apoptotisku ceļu aktivāciju[20]. RAGE aktivācija ar AGE izraisa MAPK aktivāciju, kas izraisa JNK un p38 fosforilēšanos] Šie fosforilētie proteīni palielina dažādu proapoptotisko transkripcijas faktoru transkripciju kodolā, izraisot apoptozes palielināšanos. Papildus tam var aktivizēt kaspāzes ceļus, izraisot AGE izraisītu apoptozi [39]. Joprojām ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai atklātu molekulāros mehānismus, ar kuriem CASC tiek izraisīta AGE pakārtotā ietekme. Tomēr mēs esam parādījuši, ka pēc RAGE bloķēšanas ar FPS-ZM1 novērotā AGE ietekme uz CASC tika vājināta. Tāpēc mūsu dati stingri norāda, ka AGE ietekmē to ietekmi uz CASC, iespējams, saistoties un aktivizējot RAGE. Joprojām ir jāprecizē, vai ir iesaistīti Jak/STAT, PI3K/Akt, MAPK, pārmērīga ROS ražošana vai citi signalizācijas ceļi. Mūsu dati atbilst arī Zhang et al. aprakstītajam darbam, kur FPS-ZMl arī mainīja AGE negatīvo ietekmi ADSC, bloķējot RAGE, vēl vairāk apstiprinot RAGE aktivācijas nozīmīgo lomu kā starpnieka kaitīgo ietekmi, ko izraisa AGES[40].

4.4. Sirds un asinsvadu slimību anti-AGE terapijas nākotnes perspektīvas un pašreizējie ierobežojumi

In vivo apstiprinājums par anti-AGE terapiju izmantošanu un to potenciālo pievienoto vērtību cilmes šūnu transplantācijai pēc MI ir jāapstiprina dzīvnieku modelī, pirms to var izmantot klīnikā. Vairākos in vitro pētījumos ir pierādīts, ka PPARy inhibitors rosiglitazons [41,42], MAPK inhibitori [18,35,43] vai antioksidanti [4] var vājināt AGEs izraisīto ietekmi uz cilmes šūnām. Tomēr līdz šim nekad nav aplūkota to ietekme in vivo kā terapeitiska iejaukšanās kombinācijā ar cilmes šūnu transplantāciju. Ir vairākas stratēģijas, lai pazeminātu AGE līmeni organismā. Piridoksamīns (PM) ir AGE veidošanās inhibitors, samazinot Amadori pārvēršanos par AGE un attīrot karbonila savienojumus. PM ārstēšanas efektivitāte, kā arī drošība ir pierādīta klīniskajos pētījumos ar cukura diabēta pacientiem [45]. Tomēr 2014. gadā veiktais NephroGenex klīniskais pētījums, kurā tika pārbaudīts piridorīns [(ti, PM) kā pretdiabēta terapija, tika pārtraukts finansiālu problēmu dēļ [46]. Nevienā citā klīniskajā pētījumā pašlaik netiek pētīta PM kā terapija. Tomēr AGE veidošanās kavēšana ar PM varētu būt stratēģija, lai uzlabotu cilmes šūnu potenciālu sirds reģenerācijas nolūkos. Turklāt, lai pazeminātu AGE līmeni pēc MI, nākotnē varētu izmantot citus AGE veidošanās inhibitorus, piemēram, aminoguanidīnu. ACTION II klīniskais pētījums parādīja aminoguanidīna efektivitāti diabēta pacientiem. Lai gan aminoguanidīns nespēja būtiski samazināt primāro mērķa kritēriju, proti, dubultot laiku, lai sasniegtu maksimālo kreatinīna līmeni serumā šiem pacientiem, tika parādīta cita klīniski nozīmīga ietekme uz diabēta komplikācijām, piemēram, proteīnūrijas un asinsrites lipīdu koncentrācijas samazināšanās. Tomēr atgriezeniskas nelabvēlīgas ietekmes dēļ, piemēram, autoantivielu indukcijas, gripai līdzīgu simptomu un anēmijas dēļ, šis pētījums tika pārtraukts, un tulkošana klīnikā joprojām ir ierobežota [47, 48]. Turklāt, izmantojot antioksidantus, piemēram, N-acetil-L-cisteīnu (NAC) vai glutationu kā papildinājumu mūsu uzturam, var nodrošināt dažus labvēlīgus rezultātus cilmes šūnu terapijai, jo tie palielina genoma stabilitāti, uzlabo adhēziju un stimulē cilmes šūnu proliferāciju [ 49]. Tomēr šūnām raksturīgās darbības atšķiras atkarībā no cilmes šūnu tipiem, un ir nepieciešami klīniskie pētījumi par devu un atbildes reakciju, lai novērtētu to terapeitisko efektivitāti, ja tos lieto kopā ar cilmes šūnu transplantāciju. Vēl viena iespēja ir sadalīt AGE ar ALT-71 terapiju. ALT-711 spēj sašķelt oglekļa-oglekļa saites starp karbonilgrupām, tādējādi pārtraucot šķērssaites AGE molekulās. Tomēr vairāki klīniskie pētījumi nevarēja apstiprināt ALAT-711 labvēlīgo ietekmi, kas novērota pētījumos ar dzīvniekiem. Turklāt RAGE inhibitori (piemēram, FPS-ZM1) vai pakārtoto molekulu inhibitori RAGE ceļā var traucēt AGEs/RAGE šūnu signalizācijas asi, tādējādi bloķējot AGEs mediētos efektus cilmes šūnās. Dažādu veidu mazu molekulu un inhibitoru efektivitāte, lai bloķētu AGE cilmes šūnās, ir pierādīta vairākos in vitro eksperimentos [18, 35, 44], bet nekad iepriekš nav pārbaudīta dzīvnieku modeļos. Tāpēc mēs varam tikai pieņemt hipotēzi, ka šie inhibitori ir efektīvi, bloķējot AGE in vivo situācijā, taču ir nepieciešami pierādījuma koncepcijas eksperimenti. Visbeidzot, vēl viena iespēja bloķēt AGE kombinācijā ar cilmes šūnu terapiju ir pašas cilmes šūnas ģenētiski modificēt. Ir zināms, ka sRAGE pārmērīga ekspresija uzlabo AGE (un citu RAGE ligandu, piemēram, amiloīda) attīrīšanu, lai uzlabotu šūnu terapijas efektivitāti. Tas ir pierādīts sRAGE izdalošos MSC kā Alcheimera slimības [50, 51], artrīta [52] un Parkinsona slimības [53] terapiju. sRAGE izdalošie MSC izdzīvoja ilgāk, tiem bija uzlabota migrācijas spēja, tie bija labāk aizsargāti pret apoptozi un tiem bija pretiekaisuma īpašības. Arī RAGE pazemināšana, tādējādi desensibilizējot cilmes šūnas pret AGE, varētu būt risinājums šūnu funkcionalitātes uzlabošanai. Joprojām ir jāizpēta, vai šīs stratēģijas varētu būt piemērojamas arī MI un sirds atjaunošanas noteikšanā. Rezumējot, visu šo stratēģiju mērķis ir novērst AGE, lai uzlabotu cilmes šūnu funkcionalitāti un saglabāšanu. Tomēr šīs terapeitiskās iespējas joprojām ir hipotētiskas, un tās ir jāizpēta in vivo kombinācijā ar CASC terapiju, pirms tās var pārvērst klīniskajā vidē. 5. Secinājumi

Mēs noskaidrojām, ka AGE bija no laika un koncentrācijas atkarīga, pakāpeniska ietekme uz CASC īpašībām, palielinot apoptozi un samazinot izdzīvošanu, proliferāciju un migrāciju in vitro. Šo efektu darbības mehānismi joprojām ir jāturpina pētīt, lai gan mēs esam parādījuši, ka RAGE aktivācija ir svarīgs šo ar AGE saistīto negatīvo efektu veicinātājs. Joprojām ir jāturpina pētīt, vai mērķauditorijas atlase pēc AGE in vivo varētu uzlabot CASC terapeitisko spēju pēc MI.

Šis raksts ir izvilkts no J. Clin. Med. 2021, 10, 2964. https://doi.org/10.3390/jcm10132964 https://www.mdpi.com/journal/jcm